Artykuł metodologiczny

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

DOI:

10.3791/58061

⸱

29 lipca 2018

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Research Division of Immunology, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mieloidalne komórki progenitorowe, które wytwarzają neutrofile, monocyty i komórki dendrytyczne (DC), mogą być zidentyfikowane i wyizolowane ze szpiku kostnego myszy do analiz hematologicznych i immunologicznych. Na przykład badania właściwości komórkowych i molekularnych populacji przodków szpiku mogą ujawnić mechanizmy leżące u podstaw transformacji białaczki lub pokazać, jak układ odpornościowy reaguje na ekspozycję na patogeny. Wcześniej opisane strategie cytometrii przepływowej do identyfikacji progenitorów szpiku umożliwiły znaczne postępy w wielu dziedzinach, ale zidentyfikowane przez nie frakcje są bardzo niejednorodne. Najczęściej stosowane strategie bramkowania definiują frakcje szpiku kostnego, które są wzbogacone dla pożądanych populacji, ale zawierają również dużą liczbę "zanieczyszczających" komórek progenitorowych. Nasze ostatnie badania rozwiązały wiele z tej niejednorodności, a protokół, który tutaj prezentujemy, pozwala na izolację 6 subpopulacji oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku z 2 wcześniej opisanych frakcji szpiku kostnego. Protokół opisuje 3 etapy: 1) izolację komórek szpiku kostnego, 2) wzbogacenie komórek progenitorowych hematopoetycznych poprzez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (zubożenie linii przez MACS) oraz 3) identyfikację podzbiorów progenitorów szpiku za pomocą cytometrii przepływowej (w tym sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, FACS, w razie potrzeby). Podejście to pozwala na ilościową identyfikację i izolację progenitorów dla różnych zastosowań in vitro i in vivo, a także dostarczyło już nowych informacji na temat szlaków i mechanizmów różnicowania neutrofili, monocytów i DC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyty, neutrofile i komórki dendrytyczne (DC) to komórki mieloidalne, które powstają z hematopoetycznych komórek progenitorowych, głównie w szpiku kostnym, w procesie zwanym mielopoezą. Powszechne komórki progenitorowe szpiku (CMP) mają potencjał do wytwarzania komórek szpikowych, a także megakariocytów i erytrocytów, ale nie komórek limfoidalnych. Progenitorzy granulocytów-monocytów (GMP), które pochodzą z CMP, wytwarzają granulocyty i monocyty, ale utraciły potencjał megakariocytów i erytrocytów. Uważa się również, że monocyty oraz klasyczne i plazmocytoidalne DC (cDC/pDC) powstają z powszechnych komórek progenitorowych znanych jako progenitorzy monocyte-DC (MDP), które są wytwarzane przez CMP. Stopniowe ograniczanie potencjału linii ostatecznie prowadzi do powstania progenitorów zaangażowanych w linię: progenitorów granulocytów, progenitorów monocytów i progenitorów komórek dendrytycznych (Rysunek 1).

Weissman i współpracownicy poinformowali, że CMP znajdują się we frakcji Lin- c-Kit+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRlo szpiku kostnego myszy, podczas gdy GMP są zawarte w LKS- CD34+ FcγRhi fraction1. Jednak te frakcje "CMP" i "GMP" są bardzo niejednorodne. Na przykład frakcja "GMP" zawiera również progenitorów granulocytów zaangażowanych w linię i progenitorów monocytów1,2. MDP zostały oddzielnie zgłoszone jako przodki CX3CR1 + Flt3 + CD115 +, które również wyrażają CD34 i FcγR3,4. MDP powodują powstawanie wspólnych progenitorów DC wytwarzających cDC/pDC (CDP), które, jak doniesiono, wyrażają niższe poziomy c-Kit (CD117) i nie są uwzględnione w LKS- fraction<sup class="xref">5.

Wcześniej zakładano, że monocyty powstają za pośrednictwem pojedynczego szlaku (CMP-GMP-MDP-monocyte). Zgodnie z tym modelem, progenitorzy zaangażowani w monocyty wytwarzani przez GMP (nazwane progenitorami monocytów, MPs) 2 i MDPs (nazwane wspólne progenitory monocytów, cMoPs)6 wydają się być tymi samymi komórkami na podstawie wyrażenia wspólnego markera powierzchniowego. Jednak ostatnio wykazaliśmy, że monocyty są wytwarzane niezależnie przez GMP i MDP i byliśmy w stanie odróżnić MP i cMoP za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki7.

Niedawno zmodyfikowaliśmy strategię bramkowania "CMP" i "GMP" Weissmana, aby zidentyfikować 6 podfrakcji szpiku kostnego myszy C57BL/6J, zawierających różne oligopotencjalne i zaangażowane w linię przodki szpiku frakcjonitory szpiku. Po raz pierwszy poinformowaliśmy, że barwienie Ly6C i CD115 pozwala na izolację oligopotencjalnych GMP, a także progenitorów granulocytów (GP) i progenitorów monocytów (zarówno MP, jak i cMoP, których obecnie nie jesteśmy w stanie oddzielić) od frakcji "GMP" < klasy sup = "xref">2 (LKS-CD34+ FcγRhi gate; Rysunek 1). Następnie wykazaliśmy, że MDP znajdują się głównie we frakcji "CMP" (LKS-CD34+ FcγRlo gate), która zawiera również podzbiory Flt3+ CD115lo i Flt3-7 (Rysunek 1). Frakcjalo CMP-Flt3+ CD115 daje zarówno GMP, jak i MDP po transferze adoptacyjnym. Podzbiór CMP-Flt3- zawiera komórki progenitorowe, które wydają się być produktami pośrednimi między komórkamilo CMP-Flt3 + CD115 a GMP. W przeciwieństwie do MDP, zarówno frakcje CMP-Flt3+ CD115lo, jak i CMP-Flt3- mają również potencjał megakariocytów i erytrocytów.

Ważne jest jednak, aby zauważyć, że obecnie nie jest jasne, czy frakcje "CMP" zawierają progenitory, które są naprawdę oligopotencjalne (np. pojedyncze komórkiwe frakcji CMP-Flt3+ CD115, które posiadają potencjał neutrofili, monocytów, DC, megakariocytów i erytrocytów), czy też alternatywnie, zawierają mieszaninę progenitorów o bardziej ograniczonym potencjale linii. Testy tworzenia kolonii (hodowle metylocelulozy) wykazały komórki o potencjale granulocytów (neutrofili), erytrocytów, monocytów i megakariocytów (komórki GEMM) we frakcjach "CMP", CMP-Flt3+ CD115lo i CMP-Flt3-1,7, ale nie pozwalają na ocenę potencjału DC. W przeciwieństwie do tego, testy tworzenia kolonii wykazały istnienie oligopotencjalnych GMP (progenitorów o potencjale zarówno neutrofilów, jak i monocytów) we frakcji "GMP"1,2, co jest poparte niedawną analizą transkryptomiczną pojedynczej komórki8. Obecnie nie wiadomo jednak, czy te oligopotencjalne GMP wytwarzają również inne granulocyty (eozynofile, bazofile i komórki tuczne).

Na podstawie tych badań, pokazujemy teraz, jak 7 markerów powierzchniowych (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C i CD115) może być użytych do identyfikacji i izolacji tych 6 podzbiorów oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku. Opisany tutaj protokół może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo na myszach oraz analizy molekularnej (sekwencjonowanie RNA masowo i jednokomórkowo, Western blotting itp.).

Protokół składa się z 3 etapów: 1) przygotowanie pojedynczej zawiesiny komórek szpiku kostnego, 2) wzbogacenie dla hematopoetycznych komórek progenitorowych (sortowanie komórek aktywowane magnetycznie), oraz 3) identyfikacja i izolacja, jeśli jest to pożądane, podzbiorów progenitorów za pomocą cytometrii przepływowej (przy użyciu analizatora lub sortera, w zależności od potrzeb). Pierwszym krokiem jest izolacja komórek szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych myszy poddanych eutanazji i jest ona podobna do innych wcześniej opisanych protokołów9. Następnie próbka jest wzbogacana o komórki macierzyste i progenitorowe za pomocą koktajlu przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym komórek erytrocytów, neutrofili, monocytów, limfocytów itp., w celu zubożenia zróżnicowanych komórek. Nie jest to obowiązkowe, ale zdecydowanie zalecane w celu optymalizacji wykrywania podzbiorów progenitorów oraz zmniejszenia ilości przeciwciał potrzebnych do identyfikacji progenitorów i czasu wymaganego do cytometrii przepływowej. Poniższy protokół zubożenia linii opisuje sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) przy użyciu zestawu do zubożania komórek linii myszy (który zawiera biotynylowane przeciwciała przeciwko CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 i Ter-119 oraz mikrogranulki antybiotyny) i automatyczny separator magnetyczny. Ostatnim krokiem jest identyfikacja (i sortowanie, w razie potrzeby) podzbiorów progenitorowych za pomocą cytometrii przepływowej. Panel przeciwciał opisany poniżej (patrz również tabela 1) został zaprojektowany do stosowania w cytometrze przepływowym (analizatorze lub sortowniku) z 4 laserami (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

figure-introduction-1
Rycina 1: Neutrofile, monocyty i DC progenitory oraz szlaki różnicowania. Niedawno poprawiony model mielopoiesis7 jest zilustrowany, z nałożonymi bramkami Weissmana dla "CMPs" (niebieski) i "GMPs" (zielony)1. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Yáñez et al. 20177. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Medycznego Cedars-Sinai.

1. Izolacja szpiku kostnego myszy i przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki

  1. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  2. Umieść uśpioną mysz na plecach i spryskaj ją 70% etanolem (EtOH). Wykonaj małe (3 - 5 mm) nacięcie w każdej kończynie tylnej na wysokości kostki za pomocą ostrych, spiczastych nożyczek i pociągnij skórę w kierunku ciała, aby usunąć ją z nóg i odsłonić mięśnie i kości.
  3. Usuń mięśnie (mięsień czworogłowy, ścięgna podkolanowe itp.) z kości, przycinając je nożyczkami, zgodnie z kierunkiem kości. Uważaj, aby nie uszkodzić kości.
  4. Zwichnij kości udowe ze stawów biodrowych i odetnij tkankę łączną i mięśnie, aby odłączyć nogi, uważając, aby nie przeciąć kości.
  5. Usuń stopy, zwichając kostki od piszczeli, umieść kości w probówce ze sterylnym PBS lub pożywką i przetransportuj je na lodzie do pomieszczenia do hodowli tkankowych.
    UWAGA: W przypadku niektórych innych zastosowań (np. wyprowadzanie makrofagów z całkowitych komórek szpiku kostnego) możliwe jest pozostawienie kości na lodzie na jakiś czas, ale w przypadku izolacji progenitorów ważne jest, aby postępować tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć regulacji w dół ważnych markerów powierzchniowych (zwłaszcza CD115).
  6. W komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń wszelkie pozostałe tkanki miękkie z kości, pocierając je bibułą.
    Uwaga: Protokół należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego, jeśli do hodowli komórkowej lub testów in vivo po sortowaniu FACS wymagana jest sterylna próbka. Jeśli sterylne komórki nie są wymagane, cały proces można przeprowadzić na stole laboratoryjnym.
  7. Krótko zanurz kości w 70% EtOH w celu ich dezynfekcji, a następnie w sterylnym PBS, aby je umyć.
  8. Oddziel kości udowe od piszczeli i strzałkowych, przecinając kolano, i odrzuć kości strzałkowe.
  9. Odetnij końce kości ostrymi nożyczkami.
  10. Pobierać szpik kostny za pomocą zimnego sterylnego PBS w następujący sposób, aż kości staną się białe:
    1. Chwyć każdą kość kleszczami i włóż igłę 26G podłączoną do strzykawki o pojemności 10 ml zawierającej zimny sterylny PBS do trzonu kości na jednym końcu.
    2. Trzymaj kość powyżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przepłucz 2-5 ml PBS przez kość, aby pobrać szpik.
    3. Zbierz szpik ze wszystkich 4 kości na mysz (2 kości udowe i 2 piszczelowe).
  11. Delikatnie pipetować w górę i w dół pipetą o pojemności 1 ml, aby zdezagregować szpik kostny i utworzyć zawiesinę komórek.
  12. Przefiltruj zawiesinę szpiku kostnego przez kawałek siatki nylonowej o grubości 30 μm, aby wyeliminować kawałki kości i agregaty komórek, generując w ten sposób zawiesinę pojedynczej komórki.
  13. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o sile 280 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w sterylnym buforze do barwienia (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), używając 5 ml buforu barwiącego na mysz (np. 10 ml dla komórek zebranych z kości udowych i piszczelowych 2 myszy).
  14. Pobrać 10 μl podwielokrotności próbki, wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego i załadować 10 μl otrzymanej próbki znakowanej błękitem trypanowym do hemocytometru. Policz komórki za pomocą mikroskopu świetlnego.
    UWAGA: Jeśli komórki są zbyt skoncentrowane, aby można było je wiarygodnie policzyć, należy rozcieńczyć próbkę przed dodaniem błękitu trypanowego.

2. Wzbogacanie progenitorów przez magnetyczne sortowanie komórek (MACS)

  1. Odwirować całą zawiesinę pojedynczej komórki (lub tyle komórek, ile jest potrzebnych do uzyskania pożądanej wydajności) przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C i ponownie zawiesić osad komórek w 40 μl buforze barwiącym (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) na 107 komórek.
    UWAGA: Możliwe jest również użycie bufora MACS od producenta zestawu do zmniejszania pochodzenia (patrz Tabela materiałów) jako alternatywy dla bufora do barwienia.
  2. Wykonaj zubożenie linii zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z zestawem do zmniejszania linii. Poniższe instrukcje dotyczą zestawu widocznego w tabeli materiałów. Jeśli używany jest inny zestaw, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przejdź do kroku 2.3.
    1. Dodać 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał na 10-7 komórek, wymieszać pipetując i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Dodaj 30 μl buforu barwiącego/buforu MACS na 107 komórek i wymieszaj.
    3. Dodaj 20 μl mikrogranulek antybiotyny na 10-7 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Zwiruj mikrogranulki przed dodaniem ich do komórek, aby upewnić się, że są całkowicie rozproszone.
    4. Dodać 1 ml buforu barwiącego/buforu MACS na 107 komórek, odwirować komórki przy 280 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforze barwiącym/buforze MACS dla maksymalnie 108 komórek. W przypadku więcej niż 108 komórek odpowiednio zwiększ objętość buforu do barwienia/buforu MACS.
    5. Automatyczny separator magnetyczny należy przygotować zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Umieść probówkę zawierającą oznaczone komórki w separatorze i wybierz program selekcji negatywnej.
    7. Zbierz frakcję ujemną, która zawiera komórki ujemne (Lin) wzbogacone w komórki progenitorowe. Odrzuć frakcję dodatnią, która zawiera znakowane magnetycznie komórki dodatnie pod względem linii.
  3. Odwirować komórki Lin przy 280 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu barwiącego/buforze MACS na mysz (np. 4 ml, jeśli szpik kostny został połączony od 2 myszy).
    Uwaga: Osadka powinna być teraz biała, a nie czerwona, ponieważ erytrocyty zostały wyczerpane.
  4. Pobrać 10 μl podwielokrotności komórek Lin-, wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego i załadować 10 μl otrzymanej próbki znakowanej błękitem trypanowym do hemocytometru. Policz komórki za pomocą mikroskopu świetlnego.
    UWAGA: Jeśli komórki są zbyt skoncentrowane, aby można było je wiarygodnie policzyć, należy rozcieńczyć próbkę przed dodaniem błękitu trypanowego.

3. Identyfikacja i izolacja mieloidalnych progenitorów za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

  1. Oznaczyć 9 probówek do mikrowirówek (1,5 lub 2 ml) dla: 1) komórek niebarwionych, 2-8) komórek pojedynczo barwionych przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem przeciwko FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C i CD115 do wyboru napięcia i kompensacji koloru oraz 9) komórek próbki, które mają być wybarwione wszystkimi 7 przeciwciałami w celu identyfikacji i sortowania progenitorów.
  2. Rozprowadź 100 000 komórek do każdej z probówek kontrolnych (probówki 1 - 8), a wszystkie pozostałe komórki (lub mniej, jeśli jest to pożądane) do probówki z próbką (probówka 9).
    UWAGA: Jeśli objętość próbki jest większa niż 1,5 - 2 ml, może być konieczne rozprowadzenie komórek próbki do probówki o pojemności 15 ml, odwirowanie ich i ponowne zawieszenie osadu (krok 3.3 poniżej), a następnie przeniesienie komórek do probówki mikrowirówkowej w celu przeprowadzenia kolejnych etapów barwienia.
  3. Odwirować komórki przy 1 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić granulki probówki kontrolnej w 100 μl buforze barwiącym (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), a osad z probówki z próbką w 100 μl buforu barwiącego na 5 x 106 komórek (np. 200 μl dla 1 x 107 komórek).
  4. Dodać 2 μg/ml anty-CD16/CD32-APC-Cy7 do probówki z pojedynczym barwnikiem FcγR i probówki na próbkę. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ważne jest, aby wybarwić próbki komórek przeciwciałem FcγR (CD16/32) przed dodaniem innych przeciwciał, aby zapobiec konkurencji spowodowanej niespecyficznym wiązaniem przeciwciał za pośrednictwem Fc. Nie inkubować komórek z odczynnikiem blokującym FcγR.
  5. Dodaj pozostałe przeciwciała do odpowiednich pojedynczych probówek barwiących (po 1 przeciwciałie każda) i probówki z próbką (wszystkie 6 przeciwciał): 10 μg/ml c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/ml Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/ml CD34-FITC, 10 μg/ml Flt3-APC, 2 μg/ml Ly6C-PerCP-Cy5,5 i 4 μg/ml CD115-PE. Delikatnie przetrząsać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Dodać 900 μl buforu barwiącego do probówek kontrolnych i 1 ml buforu barwiącego na 10-7 komórek do probówki z próbką. Odwirować komórki przy 1 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórek w buforze do barwienia: 200 μl na probówkę kontrolną i 500 μl na 25 x 106 komórek w probówce z próbką. Przenieś zawieszone komórki do probówek FACS o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Jeśli objętość próbki jest większa niż 1,5 - 2 ml, może być konieczne przeniesienie komórek do probówki o pojemności 15 ml w celu odwirowania.
  7. Przygotuj cytometr przepływowy (analizator lub sorter) zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Przepuść niebarwione i pojedynczo barwione komórki kontrolne przez cytometr przepływowy, aby ustawić napięcia i kompensacje kolorów.
  9. Uruchom próbki komórek, bramkują podzbiory progenitorów, jak opisano poniżej i podsumować w Rysunek 2, a jeśli to konieczne, wykonaj sortowanie FACS, aby wyizolować odpowiednie podzbiory progenitorów.
    UWAGA: Zazwyczaj konieczne jest pozyskanie około 200 000 komórek, aby uzyskać co najmniej 1 000 zdarzeń w każdej bramie progenitorowej.
    1. Utwórz wykres punktowy wszystkich komórek, wyświetlając FSC-A (oś x) i SSC-A (oś y) oraz bramkę, aby wykluczyć zanieczyszczenia i martwe komórki => "żywe" komórki.
    2. Utwórz wykres punktowy komórek "na żywo", wyświetlając FSC-H (oś x) i FSC-W (oś y) oraz bramkę, aby wykluczyć dublety => bramkę na żywo/singlet (FSC).
    3. Utwórz wykres punktowy komórek na żywo/singlet (FSC), wyświetlając SSC-H (oś x) i SSC-W (oś y) oraz bramkę, aby wykluczyć dublety => bramka na żywo/singlet (FSC)/singlet (SSC).
    4. Utwórz wykres punktowy komórek live/singlet (FSC)/singlet (SSC), wyświetlając Sca-1 (oś x) i c-Kit (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać komórki c-Kit+ Sca-1- => LKS-.
    5. Utwórz wykres punktowy komórek LKS-, wyświetlając CD34 (oś x) i FcγR (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać komórki CD34+ FcγR lo => "CMPs" i komórki hi CD34+ FcγR => "GMPs".
      > Uwaga: Ważne jest, aby jak najdokładniej określić "CMPs" i "GMPs". Pomocne jest użycie wykresu gęstości pseudokoloru lub wykresu konturowego w celu dokładnego bramkowania.
    6. Utwórz wykres punktowy "CMPs", wyświetlając CD115 (oś x) i Flt3 (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać:
      Komórki lo Flt3+ CD115 => CMP-Flt3+ komórki lo CD115,
      Komórki Flt3>- CD115lo => CMP-Flt3- komórki,
      Komórki>hi Flt3 + CD115 => MDP.
    7. Utwórz wykres punktowy "GMPs", wyświetlając Ly6C (oś x) i FcγR (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać komórki Ly6C => "GMP-Ly6C- komórki" i komórki Ly6C+ => "komórki GMP-Ly6C+".
    8. Utwórz wykres punktowy "GMP-Ly6C- cells", wyświetlając CD115 (oś x) i Flt3 (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać:
      Komórki Lo Flt3-CD115 => GMP.
    9. Utwórz wykres punktowy "komórek GMP-Ly6C+", wyświetlając CD115 (oś x) i Flt3 (oś y), a następnie bramkę, aby wybrać:
      Komórki lo Flt3- CD115 => GPs,
      Flt3>- CD115hi komórki => MPs+cMoPs.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, możliwe jest uzyskanie ~100 milionów komórek (w tym czerwonych krwinek lub ~50 milionów komórek jądrzastych) zarówno z kości udowych, jak i piszczeli (2 nogi) jednej myszy C57BL/6J (6 - 8 tygodni, mężczyzna lub samica). 1 - 2 miliony komórek Lin można wyizolować na mysz poprzez zmniejszenie liczby komórek Lin + metodą MACS.

Każdy z 6 podzbiorów przodków szpiku stan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategia bramkowania Weissmana do identyfikacji progenitorów szpiku myszy1 jest złotym standardem dla immunologów i hematologów od prawie 20 lat, ale obecnie jest oczywiste, że bramki "CMP" i "GMP" są bardzo niejednorodne i potrzebne są bardziej precyzyjne strategie bramkowania. Protokół, który tutaj opisaliśmy, pozwala na identyfikację podzbiorów oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię u myszy C57BL / 6J w celu bardziej precyzyjnej kwantyfikacji specyficznych przodków szpiku i mapowania szla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został opracowany przy użyciu funduszy z Board of Governors Regenerative Medicine Institute w Cedars-Sinai Medical Center (dla HSG), stypendium Careers in Immunology od American Association of Immunosts (dla AY i HSG) oraz Scholar Award od American Society of Hematology (dla AY). Dziękujemy Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej w Centrum Medycznym Cedars-Sinai za pomoc w sortowaniu FACS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysz: typ dziki C57BL/6J (CD45.2)The Jackson LaboratoriesCat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, myszMiltenyi BiotecCat#130-090-858
Szczur anty-mysz CD34 (klon RAM34) FITCBD BiosciencesCat#553733
Szczur anty-mysz CD16/CD32 (Fcγ R; klon 93) APC-Cy7BioLegendCat#101327
Szczur anty-mysz Ly6A/E (Sca-1; klon 108113) PE-Cy7BioLegendCat#108114
Szczur anty-mysz CD117 (c-Kit; klon 2B8) Pacific BlueBioLegendCat#105820
Szczur anty-mysz Ly6C (klon HK1.4) PerCP-Cy5.5BioLegendCat#128012
Szczur anty-mysz CD115 (klon AFS98) PEBioLegendKot#135506
Szczur anty-mysz CD135 (Flt3; klon A2F10.1) APCBD BiosciencesCat#560718
CountBright Absolutne koraliki do liczeniaThermo Fisher ScientificCat#C36950
AutoMACS SeparatorMiltenyi BiotecN/AUżyj programu "zubożenie"
BD LSRFortessaBD BiosciencesN/A5 laserów, 15 kolorów
Sortownik komórek BD FACS Aria IIIBD BiosciencesN/A5 laserów, 13 kolorów
FlowJoFlowJo, LLChttps://www.flowjo.comDo dalszej analizy plików .fcs

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
  2. Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
  3. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
  4. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
  5. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
  6. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
  7. Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
  8. Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
  9. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
  10. Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
  11. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowamagnetyczne sortowanie kom rek MACSdeplekcja linii kom rkowychprogenitorzy hematopoetyczniizolacja kom rekprzeciwcia a przeciwko markerom powierzchniowymsortowanie FACSidentyfikacja progenitor w

Powiązane artykuły