Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Liczba nowych leków zidentyfikowanych przez tradycyjne badania in vitro zmalała, zmniejszając sukces tego podejścia w poszukiwaniu nowych broni do walki z wieloraką opornością na leki. Doprowadziło to do wniosku, że naukowcy muszą nie tylko znaleźć nowe leki, ale także opracować nowe sposoby ich poszukiwania. Do najbardziej obiecujących metod kandydujących należą testy in vivo na całym organizmie, które wykorzystują wysokoprzepustowe, fenotypowe odczyty i gospodarzy, od Caenorhabditis elegans do Danio rerio. Gospodarze ci mają kilka potężnych zalet, w tym radykalne zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich, ponieważ związki, które są toksyczne dla gospodarza i/lub bioniedostępne, są zwykle umieszczane na początkowym ekranie, przed kosztowną obserwacją.
Tutaj pokazujemy, jak nasz test został wykorzystany do zbadania zmienności gospodarza w dobrze udokumentowanym patosystemie zabijania płynów C. elegans - Pseudomonas aeruginosa. Pokazujemy również kilka rozszerzeń tej dobrze opracowanej techniki. Na przykład jesteśmy w stanie przeprowadzić wysokoprzepustowe genetyczne badania przesiewowe przy użyciu RNAi w formatach płytek 24- lub 96-dołkowych, aby zbadać czynniki gospodarza w tej interakcji gospodarz-patogen. Korzystając z tego testu, badania przesiewowe całego genomu można wykonać w ciągu zaledwie kilku miesięcy, co może znacznie uprościć zadanie identyfikacji celów leków, potencjalnie bez konieczności pracochłonnego oczyszczania biochemicznego.
Przedstawiamy tutaj również odmianę naszej metody, która zastępuje Gram-dodatnią bakterię Enterococcus faecalis patogenem Gram-ujemnym P. aeruginosa. Podobnie jak w przypadku P. aeruginosa, zabijanie przez E. faecalis jest zależne od czasu. W przeciwieństwie do poprzednich testów C. elegans—E. faecalis, nasz test na E. faecalis nie wymaga wstępnej infekcji, co poprawia jego profil bezpieczeństwa i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia sprzętu do obsługi cieczy. Test jest bardzo solidny, wykazując ~95% śmiertelności 96 godzin po zakażeniu.
Wprowadzenie
Identyfikacja i rozwój skutecznych antybiotyków o szerokim spektrum działania, teraz prawie sto lat temu, doprowadziły do przełomowego momentu w zdrowiu publicznym, gdzie szeroko rozpowszechniło się przekonanie, że choroby zakaźne będą plagą przeszłości. W ciągu kilku krótkich dekad ten optymizm zaczął słabnąć, ponieważ patogen po patogenie rozwijał mechanizmy oporności, które ograniczały te niegdyś cudowne terapie. Przez pewien czas wyścig zbrojeń między wysiłkami na rzecz odkrywania leków a patogenami wydawał się zrównoważony. Jednak niewłaściwe stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych doprowadziło ostatnio do pojawienia się lekoopornych szczepów Klebsiella p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: P. aeruginosa i E. faecalis są patogenami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 i należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, aby zapobiec przypadkowemu zakażeniu i zminimalizować zanieczyszczenie powierzchni. Wszystkie media i materiały, które mają kontakt z patogenami, muszą zostać wysterylizowane i/lub wyrzucone. Dalsze wytyczne są dostępne w publikacji CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), wydanie 5.
1. Przygotowanie i utrzymanie P. aeruginosa
- Smugi P. aeruginosa z zamrożonego wywaru na płytce agarowej LB (Lysogeny Broth). Inkubować przez 16 do 24 g....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ważne parametry dla wydajności analizy
Właściwe zrozumienie biologii leżącej u podstaw tego testu jest niezbędne do rozwiązywania problemów i optymalizacji metody. W tym celu odwołujemy się najpierw do kilku kluczowych publikacji wyjaśniających mechanizmy patogenezy zabijania wywoływanego przez P. aeruginosa w środowisku ciekłym7,20. Przy założeniu, że .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten test (lub podobne testy, w których inne patogeny są zastępowane P. aeruginosa lub E. faecalis) jest przydatny do różnych celów, w tym do odkrywania leków. Jest również przydatny do rozwiązywania podstawowych problemów biologicznych, takich jak identyfikacja czynników wirulencji, wyjaśnienie szlaków obronnych gospodarza i określenie mechanizmerii regulacyjnej zaangażowanej w interakcję gospodarz-patogen.
Chociaż test zabijania płynem P. aeruginosa jest solidny, is.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 oraz przez National Institutes of Health K22 AI110552 przyznany NVK. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Cytometr przepływowy/sortownik ślimakowy do dużych obiektów | |
| Cytacja 5 | BioTek | ||
| EL406 Dozownik do spryskiwaczy | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Głęboka studnia RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-dołkowa płytka | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Pożywka do hodowli nicieni (NGM) | Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy NaCl, 2,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml płytek | ||
| powolnego zabijania wody mili-Q (SK)Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy NaCl, 3,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml pożywki | |||
| powolnej do zabijania | Ilość na litr: 3 gramy NaCl, 3,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml bulionu lizogennego wody mili-Q | ||
| (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Bulion do naparu serca Briana (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Roztwór | wybielacza robakówIlość na 100 ml: 10 ml 5 M roztworu NaOH, 20 ml 5% roztworu podchlorynu sodu i 70 ml sterylnej wody | ||
| S Podstawowa | ilość na litr: 5,85 grama NaCl, 6 gramów KH2PO4, 1 gram K2HPO4, i 1 litr wody mili-Q | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Pepton | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Ilość buforu | na litr: 132 ml K2HPO4 (1M) i 868 ml KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% roztwór podchlorynu sodu | BICCA | 7495.5-32 | |
| Roztwór NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Oddychający łatwy w oddychaniu | Zróżnicowany biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Pomarańczowe barwienie kwasami nukleinowymi | Fisher Scientific | S11368 | |
| szczepy bakteryjne | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| < em>E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi eksprymujące bakterie (HT115) | |||
| Szczepy robaków | |||
| glp-4(bn2) (Beanan i Strome, 1992, PMID: 1289064)PINK-1 | |||
| ::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
Bibliografia
- Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
- Hsueh, P. R., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
