Method Article

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

DOI:

10.3791/58068

⸱

July 1st, 2018

 ,  , 
1Department of Biosciences, Rice University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczba nowych leków zidentyfikowanych przez tradycyjne badania in vitro zmalała, zmniejszając sukces tego podejścia w poszukiwaniu nowych broni do walki z wieloraką opornością na leki. Doprowadziło to do wniosku, że naukowcy muszą nie tylko znaleźć nowe leki, ale także opracować nowe sposoby ich poszukiwania. Do najbardziej obiecujących metod kandydujących należą testy in vivo na całym organizmie, które wykorzystują wysokoprzepustowe, fenotypowe odczyty i gospodarzy, od Caenorhabditis elegans do Danio rerio. Gospodarze ci mają kilka potężnych zalet, w tym radykalne zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich, ponieważ związki, które są toksyczne dla gospodarza i/lub bioniedostępne, są zwykle umieszczane na początkowym ekranie, przed kosztowną obserwacją.

Tutaj pokazujemy, jak nasz test został wykorzystany do zbadania zmienności gospodarza w dobrze udokumentowanym patosystemie zabijania płynów C. elegans - Pseudomonas aeruginosa. Pokazujemy również kilka rozszerzeń tej dobrze opracowanej techniki. Na przykład jesteśmy w stanie przeprowadzić wysokoprzepustowe genetyczne badania przesiewowe przy użyciu RNAi w formatach płytek 24- lub 96-dołkowych, aby zbadać czynniki gospodarza w tej interakcji gospodarz-patogen. Korzystając z tego testu, badania przesiewowe całego genomu można wykonać w ciągu zaledwie kilku miesięcy, co może znacznie uprościć zadanie identyfikacji celów leków, potencjalnie bez konieczności pracochłonnego oczyszczania biochemicznego.

Przedstawiamy tutaj również odmianę naszej metody, która zastępuje Gram-dodatnią bakterię Enterococcus faecalis patogenem Gram-ujemnym P. aeruginosa. Podobnie jak w przypadku P. aeruginosa, zabijanie przez E. faecalis jest zależne od czasu. W przeciwieństwie do poprzednich testów C. elegans—E. faecalis, nasz test na E. faecalis nie wymaga wstępnej infekcji, co poprawia jego profil bezpieczeństwa i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia sprzętu do obsługi cieczy. Test jest bardzo solidny, wykazując ~95% śmiertelności 96 godzin po zakażeniu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja i rozwój skutecznych antybiotyków o szerokim spektrum działania, teraz prawie sto lat temu, doprowadziły do przełomowego momentu w zdrowiu publicznym, gdzie szeroko rozpowszechniło się przekonanie, że choroby zakaźne będą plagą przeszłości. W ciągu kilku krótkich dekad ten optymizm zaczął słabnąć, ponieważ patogen po patogenie rozwijał mechanizmy oporności, które ograniczały te niegdyś cudowne terapie. Przez pewien czas wyścig zbrojeń między wysiłkami na rzecz odkrywania leków a patogenami wydawał się zrównoważony. Jednak niewłaściwe stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych doprowadziło ostatnio do pojawienia się lekoopornych szczepów Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens i P. aeruginosa1,2,3,4.

P. aeruginosa to oportunistyczny, Gram-ujemny, wielogospodarzowy patogen, który stanowi poważne zagrożenie dla pacjentów z ciężkimi oparzeniami, z obniżoną odpornością lub z mukowiscydozą. Jest również coraz częściej identyfikowany jako czynnik wywołujący ciężkie zakażenia szpitalne, szczególnie ze względu na ciągłe nabywanie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Aby zacząć radzić sobie z tym zagrożeniem, użyliśmy dobrze udokumentowanego systemu infekcji C. elegans-P. aeruginosa 5. Nasze laboratorium wykorzystało ten system do opracowania opartej na płynach, wysokowydajnej i wysokiej zawartości platformy przesiewowej w celu identyfikacji nowych związków, które ograniczają zdolność patogenu do zabijania hosta6. Co ciekawe, związki te wydają się należeć do co najmniej trzech ogólnych kategorii, w tym środków przeciwdrobnoustrojowych7 i inhibitorów wirulencji8. Inne testy odkrywania leków o wysokiej zawartości u C. elegans zostały zgłoszone między innymi dla Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans i Enterococcus faecalis9,10,11,12,13, 14,15,16. Tego typu testy mają kilka dobrze znanych zalet, takich jak ograniczenie wyników fałszywie dodatnich, które mogą być toksyczne zarówno dla gospodarza, jak i patogenu, zwiększone prawdopodobieństwo biodostępności w porównaniu z chemicznym badaniem przesiewowym oraz możliwość identyfikacji trafień wykraczających poza zwykłe ograniczenie wzrostu drobnoustrojów, takich jak leki przeciwwirusowe, cząsteczki stymulujące układ odpornościowy lub związki, które w przeciwnym razie przechylają równowagę interakcji gospodarz-patogen na korzyść tych pierwszych. Ponadto związki odkryte w tych badaniach przesiewowych są często skuteczne u gospodarzy ssaków.

Warto zauważyć, że co najmniej dwa inne testy17,18 są dostępne do przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych w C. elegans w cieczy. Jednak każdy z tych testów jest modyfikacją, która pozwala na wykonanie prototypowego testu kolonizacji jelit, znanego jako powolne zabijanie, w cieczy, zwiększając przepustowość i umożliwiając łatwiejsze badanie przesiewowe związków. Staranna charakterystyka wykazała jednoznacznie, że mechanizmy zjadliwości bakterii różnią się między tymi testami a naszym płynnym screen7. Ponieważ oba typy wirulencji obserwuje się w systemach ssaków, ważne jest, aby rozważyć, który determinant wirulencji jest najbardziej istotny dla zainteresowań eksperymentatora przed selekcją testu.

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną wersję płynnego testu C. elegans-P. aeruginosa. Informujemy również o dostosowaniu naszej metody testu płynnego do uwzględnienia Gram-dodatniego patogenu bakteryjnego Enterococcus faecalis. Podobnie jak P. aeruginosa, E. faecalis jest coraz częściej identyfikowany jako poważne zagrożenie szpitalne z rosnącym uzbrojeniem szlaków oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe1. Chociaż istnieje poprzednia metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych E. faecalis14, wymaga ona wstępnego zakażenia patogenem, co komplikuje procedurę i zwiększa prawdopodobieństwo skażenia sprzętu, takiego jak COPAS FlowSort. Nasz protokół eliminuje konieczność wstępnej infekcji, poprawiając profil bezpieczeństwa. Na koniec przedstawiamy sposób, za pomocą którego każdy z tych testów można połączyć z podawaniem RNAi, umożliwiając użytkownikowi poszukiwanie czynników gospodarza, które odgrywają rolę w ustaleniu infekcji lub odporności na nią.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: P. aeruginosa i E. faecalis są patogenami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 i należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, aby zapobiec przypadkowemu zakażeniu i zminimalizować zanieczyszczenie powierzchni. Wszystkie media i materiały, które mają kontakt z patogenami, muszą zostać wysterylizowane i/lub wyrzucone. Dalsze wytyczne są dostępne w publikacji CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), wydanie 5.

1. Przygotowanie i utrzymanie P. aeruginosa

  1. Smugi P. aeruginosa z zamrożonego wywaru na płytce agarowej LB (Lysogeny Broth). Inkubować przez 16 do 24 godzin w temperaturze 37 °C
    Uwaga: Przeprowadzaj eksperymenty z P. aeruginosa w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2, aby zapewnić sterylność. Stosuj odpowiednie środki ostrożności, aby zminimalizować ryzyko infekcji patogennej lub zanieczyszczenia.
  2. Przenieść tę płytkę do temperatury 4 °C. Płytka ta może być przechowywana w temperaturze 4 °C i używana do inokulacji kultur przez okres do jednego tygodnia. Po tygodniu odkaż i wyrzuć płytkę, a następnie wykonaj nową płytkę smugową LB.
    Uwaga: Zjadliwość P. aeruginosa zmniejsza się po dłuższym przechowywaniu.
  3. Dwa dni przed ustawieniem płytek testowych zaszczepić 3 - 5 ml sterylnego bulionu LB pojedynczą kolonią P. aeruginosa z płytki wykonanej w 1.1. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12–16 h.
    Uwaga: Nie inkubować dłużej niż 16 godzin. W bogatych kulturach płynnych P. aeruginosa PA14 zaczyna ulegać lizie.
  4. Przygotuj sterylne płytki o średnicy 10 cm z pożywką Slow Kill (3 g NaCl, 3,5 g peptonu, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 ml buforu fosforanowego (ilość na litr: 132 ml K2HPO4 (1 M) i 868 ml KH2PO4 (1 M)) i 18 g agaru/L).
    Uwaga: Przygotuj talerze z wyprzedzeniem. Można je przechowywać do 3 tygodni w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 °C.
  5. Wysiewaj każdą 10 cm płytkę Slow Kill (płytkę SK) 350 μl P. aeruginosa ze świeżej kultury LB przez noc. Za pomocą sterylnego rozsiewacza bakteryjnego równomiernie rozprowadź bakterie na powierzchni podłoża i pozostaw do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2.
  6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

2. Przygotowanie bakterii RNAi

  1. Usunąć lub przenieść pożądane szczepy bakterii zawierających RNAi na płytki agarowe LB zawierające odpowiednie antybiotyki (karbenicylinę w stężeniu 100 μg/ml i tetracyklinę w stężeniu 15 μg/ml dla bibliotek Ahringer i Vidal) z zamrożonego wywaru.
    Uwaga: Podczas pracy z bakteriami niepatogennymi należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego BSL-2 A/B lub okapu z przepływem laminarnym BSL-1, aby zapewnić sterylność kultur i zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego biblioteki.
  2. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
    1. Po dwóch tygodniach wyrzuć talerze i zastąp je świeżo przygotowanymi talerzami.
  4. Przetestuj wiele szczepów RNAi równolegle, indywidualnie inokulując pojedynczą kolonię z każdego klonu do 4 ml LB uzupełnionego karbenicyliną w jednym dołku 24-dołkowej płytki głębokiej lub w sterylnej probówce.
    Uwaga: Doniesiono, że tetracyklina zmniejsza wydajność RNAi. Nie używaj go w tym nośniku.
  5. Umieścić 24-dołkowe płytki głębinowe w inkubatorze do wytrząsania zoptymalizowanym dla płytek wielodołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, wytrząsając z prędkością 950 obr./min.
    Uwaga: Trudno jest uzyskać równomierny wzrost bakterii na płytkach wielodołkowych przy użyciu konwencjonalnego inkubatora z wytrząsaniem. Inkubator z wytrząsaniem musi być w stanie wytrząsać z prędkością co najmniej 750 obr./min, aby kultury mogły prawidłowo rosnąć. W przypadku braku specjalistycznego shakera możliwe jest wyhodowanie każdej kultury w indywidualnej tubie. W razie potrzeby kultury można przenieść na płytkę 24-dołkową w celu późniejszego odwirowania.
  6. Zebrać bakterie, wirując przez 5 minut przy 2,000 x g.
  7. Zdekantować supernatant, odwracając płytkę i energicznie potrząsając. Ponownie zawiesić bakterie RNAi w 100 μl S Basal (5,85 g NaCl, 1 gK2HPO4, 6 g KH2PO4 rozpuszczone w 1 l ultraczystej wody i wysterylizowane w autoklawie).
  8. Pipetą zawiesić bakterie w odpowiedniej liczbie dołków wielodołkowej płytki NGM (pożywka do hodowli nicieni, 3 g NaCl, 2,5 g peptonu, 1 mM CaCl2, 1 mMMgSO4, 25 ml buforu fosforanowego (ilość na litr: 132 mlK2HPO4 (1M) i 868 ml KH2PO4 (1M)), i 18 g agaru na litr wody) uzupełnione IPTG (1 mM stężenie końcowe) i karbenicylina (stężenie końcowe 100 μg/ml).
    1. Użyj 3,5 ml pożywki NGM na dołek płytki 6-dołkowej, 1 ml na dołek płytki 24-dołkowej lub 150 μl na dołek płytki 96-dołkowej.
    2. Użyj 100 μl/basenik bakterii na płytkę 6-dołkową; 50 μl/basenik na płytkę 24-dołkową; lub 20 μl/basenik na płytkę 96-dołkową. Pozostawić do wyschnięcia.
      Uwaga: Suszenie odbywa się zwykle w sterylnym okapie przepływowym, aby zapewnić szybkie, równomierne suszenie. Równomierne suszenie jest bardzo ważne. Unikaj nadmiernego suszenia, ponieważ pęknięcia w agarze sprzyjają zakopywaniu się robaków. Prowadzi to do strat ślimaków i potencjalnego zatkania systemów obsługi cieczy.
  9. Przygotowane płytki należy zużyć natychmiast lub przechowywać je w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni w celu późniejszego wykorzystania.
    Uwaga: Aby zapobiec wysychaniu talerzy, można je uszczelnić plastikową folią parafinową lub umieścić w szczelnie zamkniętym pojemniku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi.

3. Utrzymanie i przygotowanie C. elegans

Uwaga: Zanim rozpoczniesz eksperymenty, wygeneruj zsynchronizowaną populację grawencyjnych, dorosłych hermafrodytycznych robaków w następujący sposób.

  1. Umyj gravidy dorosłe osobniki (tj. z wieloma zarodkami widocznymi w gonadzie) z 4 - 6 10-centymetrowych płytek NGM do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dodając 4 ml S Basal do płytki, delikatnie obracając, a następnie wlewając do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Robaki granulowane przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 30 sekund.
  3. Odessać supernatant, uważając, aby nie zakłócić osadu robaka.
  4. Dodaj 3,5 ml roztworu wybielacza robaków (końcowe stężenie 0,5 M NaOH, 1% podchloryn sodu, w sterylnej wodzie) do osadu robaka i mieszaj przez odwrócenie przez 1 minutę.
  5. Krótko wirować i odwirowywać przy 1 000 x g przez 30 sekund.
  6. Odessać lub zdekantować supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu robaka.
  7. Dodaj 3,5 ml świeżego roztworu wybielacza do robaków.
  8. Energicznie wymieszaj robaki w roztworze wybielacza. Okresowo (mniej więcej co dziesięć sekund) sprawdzaj wzrokowo robaki pod mikroskopem preparacyjnym. Uważaj, czy skórki robaków pękają, uwalniając jaja. Gdy większość dorosłych robaków zostanie rozpuszczona (~ 95%), rozcieńczyć wybielacz do 15 ml z S Basal, aby zatrzymać trawienie.
    Uwaga: Skorupki jaj są bardziej odporne na wybielanie niż tkanki dorosłe, ale mogą się rozpuścić podczas długotrwałej ekspozycji. Aby uniknąć rozpuszczenia jaj, nie wystawiaj jaj na działanie roztworu wybielacza z robakami dłużej niż 7 minut. Jeśli skorupki jaj są nadmiernie uszkodzone, zarodki umrą.
  9. Osadzaki osadzać w stężeniu 1 000 x g przez 30 sekund i odsysać lub dekantować supernatant bez usuwania osadu z zarodków.
  10. Ponownie zawiesić robaki w S baseal do końcowej objętości 15 ml, aby rozcieńczyć pozostały roztwór wybielacza.
  11. Powtórz kroki prania (3.9 - 3.10) jeszcze trzy razy, w sumie 4 kolejne prania.
  12. Po czwartym przemyciu odessać supernatant i dodać do 5 lub 6 ml sterylnego S Basal do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Celem jest ponowne zawieszenie zarodków do stężenia ~50 robaków na μL,
    Uwaga: Ilość S Basal zależy od wielkości granulki jaja; im większa granulka, tym więcej S Basal jest potrzebne.
  13. Rurkę stożkową inkubować przez noc na rotatorze stołowym w temperaturze pokojowej lub 48 godzin w temperaturze 15 °C. Larwy wykluwają się, ale rozwój larw zostanie zatrzymany w stadium L1 (diapauza L1) z powodu niedoboru składników odżywczych.
  14. Zbadaj zarodki pod mikroskopem preparacyjnym, aby sprawdzić, czy większość z nich wykluła się i zatrzymała na etapie rozwoju L1.
  15. Określ liczbę robaków, biorąc 20 μl preparatu do robaków i rozcieńczając go 80 μl S Basal. Odpipetować 10 μl rozcieńczonego roztworu robaka bezpośrednio na ślepą płytkę NGM. Powtórz jeszcze 2 razy.
    1. Policz larwy w każdym miejscu i określ średnią liczbę. Podziel tę średnią przez 2, aby uzyskać przybliżoną liczbę robaków na μl w przygotowaniu do robaków. Preparaty robakowe mogą być następnie używane do płytek rozmnożeniowych lub do eksperymentów.
      Uwaga: Po 4-5 dniach wygłodzone larwy zaczną umierać; W tym momencie wyrzuć preparat.
  16. Aby rozmnożyć szczep, należy odpipetować odpowiednią liczbę robaków L1 (5 000 - 6 000) na 3 - 4 10-centymetrowe płytki NGM nakrapiane skoncentrowanym OP50 E. coli – "superfood" (E. coli OP50 zauważone przy 25-krotnym stężeniu (tj. 1 l nocnej kultury OP50 wyhodowanej w LB daje 40 ml 25-krotnego białka OP50); 2 ml tej skoncentrowanej zawiesiny bakteryjnej są nakrapiane na każdą 10-centymetrową płytkę NGM).
  17. Aby przygotować płytki do eksperymentów, wykonaj jedną z następujących czynności (dla "Protokołu podstawowego" użyj konfiguracji 3.17.1, dla "Konfiguracji ekranu RNAi" użyj odpowiednio kroków 3.17.2 - 3.17.4):
    1. Pipeta ~ 5 000 robaków/10 cm płytka wysiana RNAi lub OP50 superfood.
    2. Odpipetować ~ 500 robaków/studzienkę w 6-dołkowej płytce wysianej RNAi.
    3. Pipeta ~300 robaków/studzienka w 24-dołkowej płytce wysianej RNAi.
    4. Odpipetować ~100 robaków/studzienkę w 96-dołkowej płytce wysianej RNAi.
      Uwaga: Aby uzyskać instrukcje dotyczące sposobu wysiewu RNAi, zapoznaj się z krokami 2.7 - 2.9 w Przygotowanie bakterii RNAi.
  18. Jeśli używany jest płodny szczep robaków, inkubuj robaki w temperaturze 25 °C przez ~44 - 48 godzin. Użyj tych robaków tak szybko, jak to możliwe, po osiągnięciu przez populację odpowiedniego wieku. Minimalizuje to wpływ wylęgu się jaj w robakach podczas testu.
  19. Jeśli używany szczep jest sterylny temperaturowo (np. fer-15(b26); FEM-1(HC17) lub GLP-4(BN2)), inkubować robaki w temperaturze 15 °C przez ~ 16 godzin, a następnie przenieść do 25 °C przez 44 godziny, aby zakończyć rozwój i zapobiec embriogenezie.

4. Konfiguracja testu zabijania płynów (protokół podstawowy)

Uwaga: To jest protokół dla jednego szczepu bakterii i jednego źródła robaków.

  1. Za pomocą skrobaka do komórek usuń P. aeruginosa z płytki SK i ponownie zawieś w ~ 5 ml S Basal. W razie potrzeby zwiększ skalę. Zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej za pomocą spektrofotometru (OD600)
  2. Przygotować 24 ml rozcieńczonego bulionu P. aeruginosa w S Basal przy OD600 ≈ 0,09 (3X stężenie końcowe). Patrz 4.6.2 dla końcowej zawartości na studzienkę i odpowiednio zwiększyć objętość rozcieńczenia bakteryjnego.
  3. Dodać 21 ml płynnej pożywki Slow Kill (3 g NaCl, 3,5 g peptonu/L uzupełnione CaCl2 iMgSO4 do końcowego stężenia 1 mM). Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 45 μl bakterii i pożywki do każdego dołka płytki 384-dołkowej.
  4. Umyj robaki od ich źródła (tj. Krok 3.17.1) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i pozwól robakom osiąść pod wpływem siły grawitacji. Odessać supernatant do 5 ml. Zawiesić w sumie 50 ml S base.
  5. Powtórz krok 4.4 dwa razy.
  6. Za pomocą sortera robaków posortuj około 22 robaki do każdego dołka płytki 384-dołkowej.
    Uwaga: Zestaw upuszcza każdego robaka w ~ 1,1 μl płynu. 22 robaki będą miały 25 μl, co zwiększy całkowitą objętość testu do 70 μl/studzienkę.
    1. Ostateczny skład każdej studzienki składa się z 70 μL. 45 μL tej objętości dodaje się jako pożywkę bakteryjną (0,03 OD600 bakterii w 24 μl S Basal i 21 μL SK uzupełnione CaCl2 i MgSO4). Pozostałe 25 μl dodaje się wraz z 22 robakami.
    2. Jeśli używany tutaj sorter (patrz Tabela materiałów) jest niedostępny, robaki można rozcieńczyć do końcowego stężenia 1 robaka/μl w S Basal i odpipetować 25 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Jednak wyniki mogą wykazywać zwiększoną zmienność. Alternatywnie można użyć dozownika płynu perystaltycznego, zgodnie z opisem Leunga i współpracowników19.
  7. Po posortowaniu robaków na płytkę 384-dołkową, należy uszczelnić płytkę folią przepuszczającą gaz i inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 24-48 godzin.
  8. W żądanym czasie za pomocą myjki do mikropłytek umyć płytkę 384-dołkową preparatem S Basal w sumie 5 razy.
    1. Po drugim płukaniu odessać większość pożywki, pozostawiając ~20 μL. Energicznie potrząsaj płytkami za pomocą wirownika do mikropłytek przez co najmniej 30 sekund, aby poluzować wszelkie zanieczyszczenia z dna studzienek).
  9. Po ostatnim płukaniu odessać supernatant do 20 μL. Dodać 50 μl 0,98 μM barwienia kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów)/studzienkę płytki 384-dołkowej, aby uzyskać końcowe stężenie 0,7 μM.
  10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 12 - 16 godzin. Ten barwnik poplami tylko martwe robaki. Po pożądanym okresie inkubacji umyj płytki za pomocą myjki do mikropłytek, aby usunąć nadmiar plam (minimum 3 prania).
  11. Do zbierania danych należy użyć spektrofotometru lub mikroskopu automatycznego, aby zobrazować zarówno światło przechodzące, jak i fluorescencję (wzbudzenie 531 nm i emisja 593).
    1. Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby umożliwić uchwycenie obrazu całej studni.
    2. Alternatywnie można zastosować wermimetrię przepływową. Technika ta wykorzystuje cytometr przepływowy dużego obiektu jako fluorymetr ślimakowy, mierząc wielkość i fluorescencję całego organizmu (tj. C. elegans) w sposób bardzo podobny do cytometrii przepływowej.
  12. Użyj oprogramowania do automatycznej analizy obrazu (takiego jak CellProfiler, bezpłatne studio do analizy obrazu oparte na MatLab http://cellprofiler.org/), aby obliczyć fluorescencyjną i całkowitą powierzchnię robaków na studzienkę w bezstronny sposób.
    Uwaga: Iloraz tych liczb reprezentuje ułamek śmierci dla każdej studni. Jeśli w jednej studni znajduje się 7 poplamionych robaków na 20 ogółem, to śmierć frakcji wynosi 0,35 lub 35%.
    1. Przed pierwszym użyciem zautomatyzowany potok przetwarzania obrazu musi zostać zweryfikowany przez ręczną punktację. Odbywa się to poprzez porównanie wyników z automatycznego potoku z wynikami uzyskanymi przez wizualną inspekcję obrazów i rejestrowanie frakcji martwych robaków dla każdego z nich. Proces walidacji zapewnia, że parametry automatycznego przetwarzania obrazowania są dokładne i prawidłowo reprezentują dane.

5. Adaptacja do badania przesiewowego wielu szczepów C. elegans lub knockdownów (konfiguracja ekranu RNAi)

Uwaga: To jest ekran RNAi opisany dla konfiguracji z płytkami 24-dołkowymi.

  1. Dodać 1 ml S Basal na zagłębienie 24-dołkowej płytki (patrz krok 3.17.3). Delikatnie poruszyć robaki, potrząsając płytką, a następnie przenieść robaki do pustej, sterylnej płytki z 24 głębokownikami. Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie (~5 minut).
  2. Odessać supernatant, pozostawiając około 1 ml. Dodaj 7 ml S Basal do każdej studzienki.
  3. Powtórz kroki 5.1 - 5.2 co najmniej 2 razy więcej. Po końcowym umyciu odessać supernatant, pozostawiając około 400 μL.
  4. Korzystając z funkcji Resampler sortera robaków, posortuj 22 robaki z 24-dołkowej zawiesiny robaków płytkowych do każdego dołka płytki 384-dołkowej (każda studzienka płytki 24-dołkowej daje 8-12 dołków płytki 384-dołkowej).
    1. Aby uniknąć głodu, przed sortowaniem należy pipetować bakterie do płytek 384-dołkowych (szczep służący wyłącznie jako pokarm, taki jak OP50, lub szczep chorobotwórczy).
      Uwaga: Patogeny można dodawać, wykonując kroki 2.3 - 2.5 lub 6.4 - 6.5, a bakterie pochodzące z pożywienia można rozcieńczać i dodawać, postępując zgodnie z tym samym schematem, co w przypadku P. aeruginosa.
  5. Po posortowaniu robaków na płytkę 384-dołkową, dodaj małe cząsteczki lub inne materiały specyficzne dla eksperymentu.

6. Adaptacja dla E. faecalis

Uwaga: Opisano tylko różnice w stosunku do testu P. aeruginosa.

  1. Przygotować świeże źródło E. faecalis, rozsypując bakterie z zamrożonego wywaru na płytkę agarową BHI (Brain Heart Infusion) i inkubując przez 16 do 24 godzin w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Przeprowadzaj eksperymenty z E. faecalis w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2, aby zapewnić sterylność. Stosuj odpowiednie środki ostrożności, aby zminimalizować ryzyko infekcji patogennej lub zanieczyszczenia.
  2. Talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Po tym okresie wymień na nowy talerz.
  3. W noc poprzedzającą sortowanie robaków zaszczepij 3 - 5 ml sterylnego BHI pojedynczą kolonią E. faecalis. Inkubować przez 12 - 16 godzin w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
  4. Dodaj bakterie do studzienek jak dla P. aeruginosa (3x bakterie w S Basal, OD600≈0,09).
    Uwaga: W przypadku E. faecalis ostateczny skład studzienki to: E. faecalis (OD600≈0,03), BHI = 10% v/v, przy czym pozostała objętość składa się z S baseal. Pamiętaj, że 25 μl S baseal zostanie dostarczone z robakami.
    Uwaga: E. faecalis wytwarza grube biofilmy, które pochłaniają plamę fluorescencyjną, powodując rozmyte obrazy. Dokładne mycie może być niewystarczające do usunięcia tego biofilmu. W takim przypadku robaki można przenieść na pustą płytkę za pomocą pipety wielokanałowej. Aby ułatwić przenoszenie, Tween 20 można dodać do S Basal do końcowego stężenia 0,1% (v/v) Tween 20 w S Basal. Pomaga to w usuwaniu robaków z biofilmu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ważne parametry dla wydajności testu

Właściwe zrozumienie biologii leżącej u podstaw tego testu jest niezbędne do rozwiązywania problemów i optymalizacji testu. W tym celu odnosimy się najpierw do kilku kluczowych artykułów wyjaśniających mechanizmy patogenezy zabijania za pośrednictwem P. aeruginosa w cieczy7,20. Pod warunkiem, że zostaną wykonane krok...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test (lub podobne testy, w których inne patogeny są zastępowane P. aeruginosa lub E. faecalis) jest przydatny do różnych celów, w tym do odkrywania leków. Jest również przydatny do rozwiązywania podstawowych problemów biologicznych, takich jak identyfikacja czynników wirulencji, wyjaśnienie szlaków obronnych gospodarza i określenie mechanizmerii regulacyjnej zaangażowanej w interakcję gospodarz-patogen.

Chociaż test zabijania płynem P. aeruginosa jest solidny, is...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 oraz przez National Institutes of Health K22 AI110552 przyznany NVK. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
COPAS FP BioSorterUnion BiometricaCytometr przepływowy/sortownik ślimakowy do dużych obiektów
Cytacja 5BioTek
EL406 Dozownik do spryskiwaczyBioTek
Multitron ProInfors HT
24 Głęboka studnia RB BlockThermo Fisher ScientificCS15124
384-dołkowa płytkaGreiner Bio-OneMPG-781091
Pożywka do hodowli nicieni (NGM)Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy NaCl, 2,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml płytek
powolnego zabijania wody mili-Q (SK)Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy NaCl, 3,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml pożywki
powolnej do zabijaniaIlość na litr:   3 gramy NaCl, 3,5 grama peptonu, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml bulionu lizogennego wody mili-Q
(LB)USBiological Life SciencesL1520
Bulion do naparu serca Briana (BHI)Research Products International Corp50-488-526
Roztwórwybielacza robakówIlość na 100 ml: 10 ml 5 M roztworu NaOH, 20 ml 5% roztworu podchlorynu sodu i 70 ml sterylnej wody
S Podstawowailość na litr: 5,85 grama NaCl, 6 gramów KH2PO4, 1 gram K2HPO4, i 1 litr wody mili-Q
AgarUSBiological Life SciencesA0930
NaClUSBiological Life SciencesS5000
PeptonUSBiological Life SciencesP3300
CaCl2USBiological Life Sciences
MgSO4Fisher ScientificM63-500
Ilość buforuna litr: 132 ml K2HPO4 (1M) i 868 ml KH2PO4 (1M)
KH2PO4Acros Organics7778-77-0
K2HPO4USBiological Life SciencesP5100
5% roztwór podchlorynu soduBICCA7495.5-32
Roztwór NaOHFisher ScientificSS255-1
Oddychający łatwy w oddychaniuZróżnicowany biotechBEM-1
SYTOX Pomarańczowe barwienie kwasami nukleinowymiFisher ScientificS11368
szczepy bakteryjne
P. aeruginosa (PA14)
< em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi eksprymujące bakterie (HT115)
Szczepy robaków
glp-4(bn2) (Beanan i Strome, 1992, PMID: 1289064)PINK-1
::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)
wody mili-Q (SK) fosforanowego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167(2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189(2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921(2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C Elegans PathosystemLiquid Killing AssayHigh throughput ScreeningRNAi Genetic ScreenPseudomonas AeruginosaEnterococcus FaecalisWorm SortingSpectrophotometer AnalysisMulti well PlateBiosafety Cabinet

Related Articles