Operacja wszczepienia implantu ślimakowego i elektrycznie wywołane nagrania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy C57BL/6

Podsumowanie

Zwierzęce modele implantów ślimakowych mogą poszerzyć wiedzę na temat technologicznych podstaw leczenia trwałego odbiorczego ubytku słuchu za pomocą stymulacji elektrycznej. W badaniu przedstawiono protokół chirurgiczny ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także ocenę funkcjonalną z odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Streszczenie

Implanty ślimakowe (CI) to neuroprotezy, które mogą zapewnić zmysł słuchu osobom niesłyszącym. Jednak implant ślimakowy nie jest w stanie przywrócić wszystkich aspektów słuchu. Udoskonalenie technologii implantów jest konieczne, jeśli użytkownicy implantów ślimakowych mają odbierać muzykę i występować w bardziej naturalnych środowiskach, takich jak słyszenie głosu z rywalizującymi rozmówcami, odbiciami i innymi dźwiękami. Taka poprawa wymaga od zwierząt doświadczalnych lepszego zrozumienia mechanizmów stymulacji elektrycznej w ślimaku i jej reakcji w całym układzie słuchowym. Mysz jest coraz bardziej atrakcyjnym modelem ze względu na wiele dostępnych modeli genetycznych. Jednak ograniczone zastosowanie tego gatunku jako modelu implantu ślimakowego wynika głównie z trudności w implantowaniu małych matryc elektrod. Więcej szczegółów na temat procedury chirurgicznej jest zatem bardzo interesujące dla rozszerzenia zastosowania myszy w badaniach nad implantami ślimakowymi.

W tym raporcie szczegółowo opisujemy protokół leczenia ostrego ogłuszenia i wszczepienia ślimaka w matrycy elektrod u myszy C57BL/6. Wykazujemy funkcjonalną skuteczność tej procedury za pomocą elektrycznie wywołanej słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (eABR) i pokazujemy przykłady stymulacji nerwu twarzowego. Na koniec omawiamy również znaczenie włączenia procedury ogłuszającej w przypadku korzystania ze zwierzęcia normalnie słyszącego. Ten mysi model daje potężną okazję do zbadania mechanizmów genetycznych i neurobiologicznych, które będą istotne dla użytkowników implantów ślimakowych.

Wprowadzenie

1. Urządzenie ma jednak wady. Po pierwsze, korzyści, jakie zapewnia urządzenie, różnią się znacznie w zależności od odbiorcy. Po drugie, mowa w hałaśliwym otoczeniu i muzyka są nadal słabo odbierane przez większość użytkowników implantów ślimakowych.

Przez wiele lat, modele zwierzęce były wykorzystywane do lepszego zrozumienia tych problemów w badaniach nad implantami ślimakowymi oraz do ciągłej poprawy bezpieczeństwa i skuteczności urządzeń. Modele dostarczyły cennych informacji na temat kilku zjawisk, takich jak zmiany plastyczne w mózgu zachodzące po implantacji implantu implantu ślimakowego², efekt zastosowania terapii genowej w celu zachowania szczątkowego słuchu³ oraz właściwości biofizyczne stymulowanego elektrycznie nerwu słuchowego⁴, wśród wielu innych przykładów.

Myszy są potężnym organizmem modelowym ze względu na dużą dostępność genetycznych modeli głuchoty. Inne zalety to możliwość manipulowania genomem myszy (np. za pomocą systemu CRISPR-Cas), możliwość wykorzystania zaawansowanych technik obrazowania do badania mechanizmów, szczególnie w mózgu, wysoki wskaźnik reprodukcji, szybki rozwój oraz łatwa hodowla i obsługa. Głównymi wyzwaniami technicznymi w wykonywaniu operacji implantu ślimakowego u myszy są mały rozmiar ślimaka i obecność dużej tętnicy strzemiączkowej (SA). SA zwykle zanika podczas rozwoju embrionalnego u ludzi, ale utrzymuje się przez całe życie u wielu gryzoni, w tym myszy, szczurów i myszoskoczków. SA biegnie poniżej okrągłej wnęki okiennej, co komplikuje dostęp do ślimaka i zwiększa ryzyko operacji.

Poprzednie badania wykazały możliwość implantacji implantu implantu ślimakowego u myszy^5,6,7. Irving i wsp. wykazali, że przewlekła stymulacja elektryczna wewnątrzślimakowa może być osiągnięta przez okres do jednego miesiąca. Wykonano również stymulację ostrą, ale nagrania nie zostały przedstawione. Wykazali, że kauteryzacja tętnicy strzemiączkowej nie miała znaczącego wpływu na próg słyszenia ani liczbę neuronów spiralnego zwoju oraz że miejscowe stosowanie aminoglikozydu neomycyny, leku ototoksycznego, było skuteczną procedurą ogłuszania u myszy⁵. Soken i wsp. opisali zmodyfikowane grzbietowe podejście do ślimaka myszy przez okrągłe okienko, aby lepiej zachować status słuchu⁶. Po wprowadzeniu drutu platynowo-irydowego zaobserwowano znaczny słuch szczątkowy ze zwiększonym progiem słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) wynoszącym 28 dB. Emisje otoakustyczne (OAE) zostały utracone u zwierząt z dużymi przesunięciami progu ABR⁶. Mistry i wsp. przetestowali funkcjonalne i histopatologiczne efekty implantacji przy braku stymulacji elektrycznej⁷. Mimo że słuch został zachowany zarówno u 3, jak i 6-miesięcznych myszy z implantami o niskich częstotliwościach, implantacja spowodowała tkankę podobną do zwłóknienia wokół implantu i osteoneogenezę wokół pęcherza moczowego⁷.

Krótko mówiąc, z trzech badań nad implantami ślimakowymi u myszy, tylko jedno wykazuje funkcjonalny zapis stymulacji implantu ślimakowego. Irving i współpracownicy przeprowadzili zarówno ostre, jak i przewlekłe zapisy eABR, ale pokazali tylko dane z przewlekłej stymulacji CI⁵. Jednak model przewlekły z w pełni wszczepialnym urządzeniem opracowanym przez Irvinga i wsp. jest technicznie trudny. Nie wiadomo jeszcze, czy ostra stymulacja implantu ślimakowego, zarówno mniej wymagająca, jak i szybsza, może przynieść podobne rezultaty.

CI są używane przez osoby z ciężkim i głębokim ubytkiem słuchu, które już nie korzystają z aparatów słuchowych. Modele zwierzęce dla użytkowników implantów ślimakowych powinny zatem obejmować procedurę ogłuszania, gdy wykorzystuje się normalnie słyszące zwierzęta. Innym powodem ogłuchania słyszących zwierząt jest to, że stymulacja elektryczna ślimaka niesłyszącego lub słyszącego wywołuje różne reakcje neuronalne^{4,8,9,10,11,12}. Stymulacja elektryczna ślimaka osoby niesłyszącej bezpośrednio aktywuje włókna nerwowe słuchowe i generuje odpowiedź elektroneuronalną (α). Charakteryzuje się krótkim opóźnieniem i małym zakresem dynamiki na peryferiach^8,10. Z drugiej strony, stymulacja elektryczna ślimaka słuchowego pobudza również komórki rzęsate w odpowiedzi elektrofonicznej (β), która charakteryzuje się dłuższymi opóźnieniami i większym zakresem dynamiki^4,11. Odpowiedź elektrofoniczną przypisuje się normalnemu pobudzeniu włókien nerwowych przez wewnętrzne komórki rzęsate, elektrycznie indukowanemu skurczowi zewnętrznych komórek rzęsatych i generowaniu fali rozchodzącej się⁴. Reakcje elektroneuronalne i elektrofoniczne skutkują również dwoma różnymi wzorcami aktywności w ośrodkowym układzie nerwowym⁹. Sato i wsp. zarejestrowali neurony śródmózgowia świnki morskiej z implantem ślimakowym przed i po ogłuszeniu neomycyną, co eliminuje wkład elektrofoniczny. Wykazali, że nachylenie funkcji poziomu szybkości było bardziej strome, a szybkość wyzwalania wyższa w stanie ogłuszenia w porównaniu ze stanem słuchu⁹. Dlatego, w zależności od postawionego pytania badawczego, ważne jest, aby rozważyć włączenie ogłuszania do oddzielnych reakcji elektrofonicznych i elektroneuronalnych na elektryczną stymulację nerwu słuchowego.

Tutaj opisujemy procedurę ostrego ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także funkcjonalny zapis wewnątrzślimakowej stymulacji elektrycznej z elektrycznie wywołaną reakcją słuchową pnia mózgu (eABR).

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Uniwersytetem w Bazylei, Szwajcarią, opieką nad zwierzętami i wytycznymi. Posiadali licencję Urzędu Weterynaryjnego Kantonu Bazylea w Szwajcarii.

UWAGA: w tym badaniu wykorzystano dorosłe myszy C57BL/6 w wieku 8–12 tygodni (waga 20–30 g).
Lewe ucho jest używane jako ucho eksperymentalne. Prawe ucho służy jako kontrola wewnątrzzwierzęca i nie jest zmieniane chirurgicznie.

1. Procedury przedoperacyjne

1. Znieczulić zwierzę 30 minut przed zabiegiem poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (80 mg/kg ketaminy, 16 mg/kg ksylazyny, i.p., objętość wstrzyknięta przy 10 μl/g masy ciała).
   1. W razie potrzeby uzupełnij znieczulenie, oceniane na podstawie dodatniego odruchu pedałowania i palpebrału (szczypanie palców) oraz ruchu wąsów, niższą dawką ketaminy (45 mg/kg i.p., wstrzykiwana w dawce 10 μl/g masy ciała). Czynniki i schematy dawkowania mogą być zastępowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
      Uwagi: Ogólnie rzecz biorąc, zwierzę będzie potrzebowało wstrzyknięcia co 45–60 minut tego środka i schematu dawkowania. Średni czas od początkowego nacięcia do zamknięcia wokół wszczepionego układu elektrod wynosi zwykle 1-1,5 godziny.
2. Sprawdź, czy zwierzę jest w pełni uspokojone, co charakteryzuje się regularnym oddechem i brakiem odruchów szczypania palców. Utrzymuj ten poziom znieczulenia.
3. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 36,6 °C za pomocą poduszki grzewczej z zamkniętą pętlą. Zastosuj maść do oczu, aby uniknąć odwodnienia rogówki. Stłumi to również odruch mrugania zwierzęcia, który może dodać szum do kodowania.
4. Miejscowy środek przeciwbólowy należy podawać przez wstrzyknięcie podskórne (s.c.) bupiwakainy/lidokainy (0,1 mg/ml bupiwakainy i 0,4 mg/ml lidokainy, 0,1 ml podawanej s.c.) wzdłuż zamierzonej linii nacięcia, aby zminimalizować dyskomfort chirurgiczny. Czynniki i schematy dawkowania mogą być zastępowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
5. Antagonistę muskaryny atropinę (aminosiarczan atropiny, 0,1 mg/ml, 20 μl podawany s.c., rozpuszczony w PBS) podawać w szyję w celu zmniejszenia wydzielania śluzu i ułatwienia oddychania. Czynniki i schematy dawkowania mogą być zastępowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

2. Pre-deafening Acoustic Auditory Brainstem Response (aABR)

UWAGA: aABR służy do pomiaru stanu słuchu przed i po ogłuszaniu. Badanie wykonuje się na lewym uchu oraz w dźwiękoszczelnej, ekranowanej elektrycznie kabinie. Zalecamy przetestowanie, a następnie wszczepienie implantu lewego ucha osobie praworęcznej. Więcej szczegółów na temat ABR u myszy można znaleźć w^13,14. Sprzęt i oprogramowanie Tucker Davis Technologies (TDT) (BioSig) są używane do rejestrowania ABR, ale można użyć innych systemów.

1. Zablokuj ucho przeciwległe (prawe) pianką akustyczną, aby odizolować odpowiedź ABR od ucha ipsilateralnego (lewego). Umieść piankę w strzykawce o pojemności 1 ml i wstrzyknij ją do prawego kanału słuchowego myszy, aby pokryć cały kanał słuchowy pianką (0,1–0,2 ml piany). Upewnij się, że strzykawka przylega ściśle do ucha, tak aby piana dostała się do przewodu słuchowego.
2. Umieść głośnik w odległości 10 cm od lewego ucha.
   UWAGA: Głośnik dla tej konfiguracji został skalibrowany przy użyciu mikrofonu PCB, zgodnie z opisem w refefence¹⁵.
3. Oczyść elektrody ABR 70% roztworem etanolu. Umieść elektrody pod skórą: aktywne (Ch1) na wierzchołku, odniesienie (-) poniżej małżowiny usznej ucha ipsilateralnego i szlifowane w tylnej nodze (Rysunek 1).
4. Podłącz stopień główny i przedwzmacniacz do procesora słuchowego przez port światłowodowy.
5. Sprawdź impedancję elektrody aktywnej i referencyjnej.
   1. Jeśli impedancja przekracza 3 Ohm, ułóż je ponownie i ponownie wykonaj pomiar. Najlepsze nagrania uzyskuje się, gdy elektrody mają taką samą impedancję. Zamknij dźwiękoszczelną kabinę.
6. Prezentuj stymulację kliknięć i rejestruj ABR w stanie swobodnego pola za pomocą złożonego procesora słuchowego i oprogramowania. Standaryzacja bodźca kliknięcia w oprogramowaniu: jednokanałowe kliknięcia jednofazowe 0,1 ms są prezentowane z częstotliwością 21 Hz; Poziom kliknięcia spada z 90 dB SPL do 10 dB SPL w krokach co 10 dB; Okno nagrywania 10 ms. Uśrednij łącznie 512 odpowiedzi na każdym poziomie dB.
7. Zastosuj filtr dolnoprzepustowy 2,000 Hz i filtr górnoprzepustowy 300 Hz w trybie offline, aby zredukować szumy w nagraniu za pomocą niestandardowego skryptu Matlab.
8. Określ próg ABR jako najniższy poziom dB z rozpoznawalną odpowiedzią fali ABR (Rysunek 2, Rysunek 3).

3. Chirurgia

UWAGA: Typowe używane narzędzia to nożyczki, skalpel, para metalowych kleszczyków z prostymi lub zakrzywionymi końcówkami, narzędzie do zwijania tkanek, kilka klinów ssących i chłonne papierowe punkty. Operacja wykonywana jest na lewym uchu.

1. Połóż mysz na prawym boku. Unikaj nadmiernego obciążenia skrętnego kręgów szyjnych. Upewnij się, że ciało jest wyprostowane, aby drogi oddechowe były otwarte.
2. Przytnij futro za lewym uchem nożyczkami (lub ogol je golarką), aby odsłonić skórę. Wysterylizuj skórę 70% roztworem etanolu i betadyną (powidon/jod).
3. W powiększeniu mikroskopowym (16x) należy wykonać skalpelem 1–1,5 cm nacięcie po małżowinie usznej.
4. Przełącz się na większe powiększenie mikroskopowe (25x).
5. Wykonaj rozwarstwienie przez podskórną warstwę tłuszczu, która może mieć różną grubość, za pomocą kleszczy.
   UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas sekcji, ponieważ zewnętrzna żyła szyjna przechodzi przez ten obszar. Uszkodzenie tej struktury może powodować nadmierne krwawienie.
6. Cofnij mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, aby odsłonić okostną pęcherza bębenkowego. Użyj nerwu twarzowego jako kluczowego anatomicznego punktu orientacyjnego, aby pomóc w identyfikacji pęcherza słuchowego. Nerw twarzowy owija się wokół tylnej/grzbietowej krawędzi mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego i biegnie wzdłuż kanału słuchowego w kierunku małżowiny usznej. Delikatnie umieść samozabezpieczające się narzędzie zwijacza w nacięciu, aby ułatwić dostęp do bulli (Rysunek 4).
7. Usuń tkankę pokrywającą przyśrodkowo-grzbietowy obszar pęcherza, aby umożliwić wyraźną wizualizację grzbietu między pęcherzem a wyrostkiem sutkowatym.
8. Delikatnie obróć igłę 30 G, aby przebić pęcherz i zrobić otwór (pęcherzykowa) po tylnej górnej stronie grzbietu (kość jest cieńsza po tej stronie). Alternatywnie użyj wiertła dentystyczno-chirurgicznego.
   UWAGA: Ten i kolejne kroki można wykonać przy jeszcze większym powiększeniu mikroskopowym (40x), jeśli jest to preferowane. W razie potrzeby zmień również położenie mikroskopu. Ważne jest, aby zmaksymalizować widok chirurgiczny przestrzeni ucha środkowego.
9. Poszerz pęcherzową jamę, ściskając małe kawałki kości za pomocą kleszczy z cienką końcówką, aby odsłonić jamę ucha środkowego. Przedłuż pęcherzową stopę grzbietowo w kierunku wyrostka sutkowatego, aż wnęka okrągłego okna będzie wolna od leżącej nad nią kości. Tętnica strzemiączkowa, gałąź tętnicy szyjnej wewnętrznej, biegnie brzusznie do niszy okrągłego okna.
   1. Należy uważać, aby nie uszkodzić naczynia, ponieważ nadmierne krwawienie może być śmiertelne. Małe krwawienia można zatamować, naciskając mały kawałek spongostanu w jamie ucha wewnętrznego.
   2. Przedłuż pęcherzową stopę osadzenia w kierunku przednim górnym, aby uwidocznić strzemiączko, kość ucha środkowego połączoną z okienkiem owalnym.
10. Usuń strzemiączko za pomocą kleszczy, aby odsłonić owalne okienko.

4. Okrągłe okno aplikacji środka ototoksycznego

1. Delikatnie przebić okrągłe i owalne membrany okienne za pomocą igły 30 G. Sprawdź, czy kończy się perylimfa.
2. Powoli perfundować 0,05% wagowo-objętościowo neomycyny rozpuszczonej w PBS (dostosowanej do pH 7,4) przez owalne okienko. Płyn powinien wypłukać się z okrągłego okienka. Powtórz tę samą procedurę na okrągłym oknie. Należy uważać, aby nie uszkodzić struktur kostnych okienka za pomocą igły używanej do perfuzji.
3. Umieść mały kawałek (1 mm²) spongostanu nasączonego neomycyną w okrągłej niszy okiennej i owalnej
.
4. Wyjmij zwijacz, zamknij nacięcie i odczekaj 30 minut.

5. Akustyczny ABR po ogłuchnięciu

1. Rejestruj aABR w podobny sposób, jak przed ogłuszaniem (kroki od 2.2 do 2.8) (Rysunek 2b, Rysunek 3).

6. Wstawienie zestawu elektrod CI

UWAGA: Układ elektrod wewnątrzślimakowych składa się z czterech platynowych pasm (Ø0,2 mm) z drutem izolowanym platynowo-irydowym parylenem w silikonowej rurce (Rysunek 5).

1. Umieść narzędzie zwijacza w nacięciu, aby ponownie uzyskać dostęp do pęcherza.
2. Włóż matrycę elektrod do okrągłego okienka (scala tympani) na głębokość, na której^4-ty platynowy pierścień znajduje się tuż wewnątrz okrągłego okienka. Daje to głębokość wsunięcia ~2 mm, co odpowiada położeniu wewnątrz ślimaka przy ~30 kHz¹⁶.
3. Zwiń drut ołowiany wewnątrz bulli i przyklej drut do tkanki nad bullą. Zwijanie drutu pomaga utrzymać matrycę na miejscu przez cały czas trwania eksperymentu.
4. Ostrożnie wyjmij retraktor i zamknij wkłucie klejem tkankowym.
5. Wykonaj małe nacięcie (0,5 mm) na szyi prostopadłe do linii między miejscem, w którym będą znajdować się aktywne i referencyjne elektrody ABR, za pomocą nożyczek do tkanek. Umieść platynową kulkę mieloną w kieszeni podskórnej i zamknij małe nacięcie klejem tkankowym (Rysunek 6).
6. Podłącz płytkę matrycy elektrod do platformy stymulatora zwierząt.

7. Elektryczna słuchowa odpowiedź pnia mózgu (eABR)

UWAGA: Platforma Stymulatora Zwierząt (ASP) służy do elektrycznej stymulacji układu elektrod. Można korzystać z innych źródeł prądu i systemów oprogramowania.

1. Umieść elektrody ABR jak poprzednio (kroki od 2.3 do 2.5) (Rysunek 6).
2. Otwórz oprogramowanie ASP i zdefiniuj paradygmat stymulacji impulsami elektrycznymi. Używamy impulsów dwufazowych o zrównoważonym ładunku z 50 μs/fazę i przerwą międzyfazową 10 μs prezentowaną na poziomie 23,3 impulsów na sekundę (pps). Stymulacja elektryczna jest dostarczana w konfiguracji elektrod monopolarnych wraz ze wzrostem natężenia prądu. Na każdym bieżącym poziomie uśrednianych jest łącznie 400 odpowiedzi.
3. Przedstaw elektryczne ciągi impulsów i rejestruj wywołaną odpowiedź eABR w sposób ciągły za pośrednictwem stopnia głównego TDT, przedwzmacniacza i procesora słuchowego.
4. Wykreśl i przeanalizuj dane eABR za pomocą niestandardowego skryptu matlab (Rysunek 7). Scenariusz i przykład nagrania znajdują się w Suplemencie.

8. Koniec eksperymentu

1. Pod koniec eksperymentu poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Ostrożnie otwórz nacięcie i usuń implant.
3. Ultra-soniczny układ elektrod w wodzie destylowanej przez 10 minut w celu usunięcia resztek tkanek.
   UWAGA: Implant może być ponownie użyty kilka razy, jeśli elektrody są nienaruszone i prawidłowo przewodzące. Aby to sprawdzić, zmierz impedancję elektrod za pomocą multimetru, gdy matryca jest sucha.
4. Przechowuj matrycę elektrod w suchym miejscu.

Wyniki

Celem tego badania było opisanie wiarygodnego modelu ostrej stymulacji CI u głuchoty myszy. Progi słyszenia przed i po operacji służyły jako funkcjonalny odczyt procedury ogłuszającej. Miejscowe stosowanie 0,05% neomycyny w owalnym i okrągłym okienku znacznie zwiększyło progi słyszenia wywołane kliknięciem o 46 dB ± 6 (przed i po neomycynie: 30,0 dB ± 3,8 vs 75,7 dB ± 3,7, p = 0,0003, sparowany test t, n = 7) (Rysunek 3). Układ elektrod wielkości myszy został następnie umieszczony w okrągłym okienku (Rysunek 4, Rysunek 5). Symulacja elektryczna elektrody wewnątrzślimakowej może niezawodnie generować aktywność eABR. (Rysunek 7). W niektórych przypadkach stymulacja implantu ślimakowego aktywowała nerw twarzowy i wytwarzała falę o wysokiej amplitudzie z krótkim lub długim opóźnieniem (Rysunek 8A i Rysunek 8B, odpowiednio). Krótka odpowiedź latencyjna charakteryzowała się szybkim wzmocnieniem fali IV około 3 ms i prawdopodobnie jest to bezpośrednia odpowiedź nerwu twarzowego. Długa odpowiedź latencyjna pojawiła się około 5-6 ms i prawdopodobnie jest to reakcja mięśni niesłuchowych (miogennych) wywoływana pośrednio przez nerw twarzowy. Reakcje nerwu twarzowego są rzadko opisywane w badaniach na zwierzętach w literaturze, ale są dobrze znanym powikłaniem u użytkowników implantów ślimakowych u ludzi^17,18,19. W Rysunek 8, stymulacja nerwu twarzowego pojawiła się na stosunkowo średnim poziomie prądu (150–200 μA) i u dwóch różnych zwierząt. W innych przypadkach obie reakcje mogą pojawić się u tego samego zwierzęcia przy bardzo wysokich poziomach prądu (nie pokazano). Zalecamy ograniczenie obecnego poziomu do poziomów poniżej wyglądu stymulacji nerwu twarzowego.

Rycina 1: Konfiguracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR). Elektrody podskórne umieszcza się w wierzchołku (aktywny/kanał 1 [Ch1]), za uchem ipsilateralnym (odniesienie [Ref]) i na tylnej nodze (uziemienie [Gnd]) znieczulonej myszy. Sygnały elektrod są wzmacniane, a następnie rejestrowane przez system TDT. Stymulacja akustyczna i elektryczna są prezentowane odpowiednio za pomocą mikrofonu i platformy stymulatora dla zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne fale aABR do stymulacji kliknięcia przez mysz typu dzikiego przed i po ogłuszeniu 0,05% neomycyny. (A) Wzorzec aABR dla normalnego słyszenia charakteryzuje się falami oznaczonymi jako I-V i niskim progiem słyszenia, tutaj 30 dB SPL (strzałka). (B) Ogłuszony wzorzec aABR pokazuje zwiększony próg słyszenia, tutaj 70 dB SPL (strzałka). Fale mają dłuższe opóźnienie i bardziej czasowe drżenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Próg aABR przed i po ogłuszeniu. Zastosowanie neomycyny istotnie podniosło progi aABR o 46 dB ± 6. Pre- vs post-neomycyna: 30,0 dB ± 3,8 vs 75,7 dB ± 3,7, p = 0,0003, sparowany test t, n = 7. Błędy są standardowym błędem średnich. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Operacja. (A) Narażenie na pęcherz słuchowy. Pęcherzykową operację wykonuje się (białe kółko przerywane) wzdłuż grzbietu na pęcherzu bębenkowym (linia przerywana). (B) Pęcherzykowa stopa osadowa umożliwia wizualizację okrągłego okna, tętnicy strzemiączkowej i okienka owalnego. Neomycynę delikatnie przepłukuje się najpierw przez okienko owalne, a następnie przez okrągłe okienko. (C) Układ elektrod jest wkładany aż^4-ta elektroda znajdzie się tuż wewnątrz okrągłej niszy okiennej. Drut elektrody jest zwinięty wewnątrz pęcherza, aby utrzymać matrycę na miejscu przed zamknięciem nacięcia. CN VII = nerw czaszkowy VII (nerw twarzowy), OW = okienko owalne, RW = okno okrągłe, SA = tętnica strzemiączkowa, SCM = mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, TB = pęcherz bębenkowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Implant ślimakowy u myszy. (A) Układ elektrod wewnątrzślimakowych składa się z czterech platynowych pasm rozmieszczonych w odstępie 0,4 mm o średnicy d: 0 [końcówka] (d = 0,21), 1 (d = 0,23), 2 (d = 0,25), 3 (d = 0,27). Szerokość każdej elektrody wynosi 0,2 mm. Cztery druty w izolacji platynowo-irydowej (90/10) parylenu są ekranowane w silikonowej rurce. (B) Powiększenie końcówki matrycy elektrod (czerwony kropkowany kwadrat). Układ elektrod i platynowa kulka referencyjna są połączone z płytką drukowaną. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Elektrycznie wywoływana konfiguracja ABR (eABR). Platynową kulkę mieloną CI (Gnd, czerwona) umieszcza się w podskórnej kieszeni w szyi myszy. Linia między aktywnymi (Ch1 (+) w wierzchołku) a referencyjnymi (Ref (-) w uchu ipsilateralnym) elektrodami ABR jest prostopadła do linii między układem elektrod a ziemią w celu uzyskania najlepszej odpowiedzi eABR. Elektroda uziemiająca eABR (Gnd,) jest umieszczona w tylnej nodze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 7: Reprezentatywne fale eABR do stymulacji implantu ślimakowego u głuchotej myszy. Dwufazowy ciąg impulsów jest prezentowany elektrodzie #1 w konfiguracji monopolarnej z prędkością 23,3 impulsów na sekundę (pps) przy 400 powtórzeniach. Poziom bodźca 0-175 μA jest pokazany w krokach co 25 μA (patrz szczegóły stymulacji w kroku 7.2). Cyfry rzymskie oznaczają numer fali eABR. Amplitudy i opóźnienia fal rosną i maleją odpowiednio wraz ze wzrostem poziomu prądu. W tym przykładzie fala II pojawiła się około 1 ms, fala III około 2 ms, fala IV około 3 ms, fala V około 4 ms. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Przykład stymulacji nerwu twarzowego. W niektórych przypadkach stymulacja CI może aktywować nerw twarzowy i wywołać bezpośrednią reakcję z krótkim opóźnieniem (A) (strzałka) lub odpowiedź pośrednią z dłuższym opóźnieniem (B) (strzałka). Pokazane przykłady pochodzą od dwóch zwierząt z implantem implantu ślimakowego, stymulowanych dwufazowym ciągiem impulsów przy użyciu 0–300 μA w krokach co 50 μA (patrz szczegóły stymulacji w kroku 7.2). Cyfry rzymskie oznaczają numery fal eABR. * oznacza przecięcie fali eABR spowodowane nasyceniem wzmacniacza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W artykule opisano podejście chirurgiczne do ostrego ogłuszenia i wszczepienia implantu ślimakowego u myszy, a także funkcjonalną ocenę stymulacji implantu ślimakowego z reakcją słuchową pnia mózgu. Chociaż ślimak myszy jest mały, a operacja trudna, mysi model implantu ślimakowego jest wykonalny i służy jako cenne narzędzie w badaniach słuchowych.

Tętnica strzemiączkowa znajduje się w uchu środkowym myszy. Tętnica wchodzi do pęcherza tylno-przyśrodkowego i biegnie niżej do okrągłej niszy okiennej, a następnie wyżej do owalnej niszy okiennej. We początkowym rozwoju modelu mysiego doświadczyliśmy śmiertelnego krwawienia śródoperacyjnego po urazie tętnicy strzemiączkowej, głównie podczas dostępu do pęcherza. W związku z tym dostosowaliśmy bardziej ograniczone podejście i uzyskaliśmy dostęp do bulli w mniejszych, wyrafinowanych krokach preparacji. Nie zaobserwowano dalszych powikłań spowodowanych krwawieniem. Pomimo tego, że kauteryzacja tętnicy strzemiączkowej nie ma znaczącego wpływu na próg słyszenia ani liczbę neuronów zwoju spiralnego u myszy⁵, naszym zdaniem jest niepotrzebna, o ile podczas operacji zostanie zachowana duża ostrożność i uwaga. Sugerujemy poświęcenie czasu potrzebnego na rozwinięcie umiejętności psychomotorycznych i osiągnięcie biegłości technicznej. Średni czas od pierwszego nacięcia do zamknięcia wokół wszczepionego układu elektrod wynosi zwykle 1–1,5 godziny.

Opisana ostra operacja CI u myszy jest podobna do procedury "brzusznej" i założenia okrągłego okienka stosowanej u innych gryzoni, w tym szczurów i myszoskoczków 20,21,22. W innych badaniach na gryzoniach stosowano "podejście grzbietowe" z podstawową skrętem ślimaka zamiast wstawiania okrągłego okienka, całkowicie unikając SA i wprowadzając matrycę głębiej ^6,23,24. Implantacja zespołu stymulacji przewlekłej u myszy przebiega zgodnie z tymi samymi krokami, które opisano w niniejszym protokole, z dodatkiem siatki Dacron w celu zamocowania implantu i opieki pooperacyjnej⁵.

Głównymi wyzwaniami technicznymi podczas wykonywania operacji implantu ślimakowego u myszy są mały rozmiar ślimaka w porównaniu ze ślimakiem szczurów i myszoskoczków oraz obecność dużego SA. SA występuje również u szczurów, ale nie u myszoskoczków. Ponadto, ponieważ myszy są mniejsze niż szczury i myszoskoczki, są bardziej podatne na zabiegi chirurgiczne.

Aby wyeliminować reakcje elektrofoniczne w zapisach eABR i naśladować utratę komórek rzęsatych występującą u większości użytkowników implantów ślimakowych, ogłuszyliśmy zwierzęta przed wprowadzeniem implantu ślimakowego. Myszy są trudne do ogłuszenia ototoksycznie in vivo²⁵ , ponieważ ogólnoustrojowe stężenia aminoglikozydów wymagane do wywołania ototoksyczności mają wąskie okno dawkowania: niższe dawki podawane przez kilka dni powodują brak utraty komórek rzęsatych, podczas gdy pojedyncze wstrzyknięcie wyższej dawki może być śmiertelne²⁶. Również podatność na aminoglikozydy jest zależna od szczepu²⁶. Wykazano jednak, że pojedyncza dawka aminoglikozydów w połączeniu z diuretykiem pętlowym może powodować nadmierną utratę zewnętrznych komórek rzęsatych u myszy CBA/CaJ bez śmiertelnych konsekwencji²⁷. Opóźnioną śmierć wewnętrznych komórek rzęsatych stwierdzono u połowy wszystkich badanych ślimaków²⁷.

W tym manuskrypcie zastosowaliśmy miejscowe stosowanie aminoglikozydów neomycyny inspirowane protokołem niedawno ustalonym dla myszy C57BL / 6⁵. Ostre zastosowanie neomycyny istotnie podniosło próg słyszenia wywołanego kliknięciem o 46 dB ± 6,1. Chociaż wzrost ten jest większy niż wzrost o 35 dB zgłoszony przez Irvinga i wsp. (przed i po operacji: 41,6 dB ± 3,3 vs 76,6 dB ± 4,4, p = 0,02, n = 3)⁵, osiągnęliśmy ten sam próg po ogłuszaniu (75,7 dB ± 3,7 vs 76,6 dB ± 4,4). Uważa się, że 0,05% neomycyny powoduje częściową utratę słuchu, głównie poprzez szybką zewnętrzną śmierć komórek rzęsatych, ponieważ utrata wewnętrznych komórek rzęsatych trwa dłużej²⁷. Jest zatem możliwe, że odpowiedź elektrofoniczna, która jest generowana zarówno przez wewnętrzne, jak i zewnętrzne komórki rzęsate 4,8,9,10,11,12, jest tylko częściowo eliminowana u ogłuszonych zwierząt z resztkami słuchu. Mimo, że 0,05% (waga/objętość) neomycyny nie zmniejsza liczby neuronów spiralnych zwojowych 4 tygodnie po ogłuszającym⁵, nie wiadomo jeszcze, czy neomycyna w naszym ostrym ustawieniu wpływa na włókna nerwowe słuchowe, czy też sprzyja synaptopatii (utracie synaps między wewnętrznymi komórkami rzęsatymi a słuchowymi włóknami nerwowymi typu I). Kolejną niewiadomą jest to, że miejscowe leczenie neomycyną może nie powodować równomiernego rozkładu utraty komórek rzęsatych na całej długości ślimaka. Aby odpowiedzieć na te pytania, potrzebne są dalsze badania.

Podsumowując, rosnąca liczba modeli genetycznych ludzkiej głuchoty oraz dostępne narzędzia biochemiczne sprawiają, że mysz jest atrakcyjnym modelem zwierzęcym do badań słuchowych, w tym w dziedzinie implantów ślimakowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
< mocny>Sprzęt< / mocny>
dźwiękoszczelna kabina	IAC Acoustics, Winchester, Wielka Brytania	Obudowa Mac-2 Skrzynka ekranowana RF 2A
MF1 Głośnik	Tucker Davis Technologies (TDT), FL, USA
Płytka drukowana mikrofonu PCB	Piezotronics, Inc, NY, USA	Model 378C01
Scena czołowa o niskiej impedancji	TDT, FL, USA	Przedwzmacniacz RA4LI
RZ6 procesor słuchowy	TDT, FL, USA
Platforma stymulatora zwierząt	ASP, Oticon Medical, Nicea, Francja
Multimetr	Fluks	#115
Sprzęt chirurgiczny
Poduszka grzewcza z zamkniętą pętlą	FHC, Inc. ME, USA
Maść do oczu	Alcon, CH	Lacrinorm Augengel
Pianka akustyczna	Otoform Ak, Dreve Otoplastik GmbH#	464
Jednorazowe podskórne elektrody igłowe	Horizon, Rochester Electro-Medical Inc.	S83018-R9, 27G
Samozabezpieczające się narzędzie do zwijania (Mini Collibri Retraktor)	Fine Science Tools	#17000-01
Kliny ssące	Agnthos, SE	#42-886-460
Absorbowalny papierowy punkt (średni)	WPI, FL,	USA#504182
Wewnątrzślimakowa matryca elektrod	Bionics Institute, Melbourne, Australia	4-kanałowy
Spongostan Standard	Ferrosan Medical Devices	#MS0002
Klej tkankowy. Loctite 4161 Superbond	Henkel	nr części 19743
Platforma stymulatora zwierząt (ASP)	Oticon Medical, Nicea, Francja
Drugs/chemicals
Ketamine (Narketan)	Provet AG, CH	100mg/mL, #VQ_320265
Xylazine (Rompun)	Provet AG, CH	Inj Diss 2%, # 1315
Kompendium bupiwakainy	, CH	Bupivacain Sintetica inj Diss 0,5%
Atropina (Atropinesulfat Amino)	Amino AG, CH	1 mg / ml
Betadine (Powidon / jod)	Provedic, CH
Neomycyna (sól trisiarczanu neomycyny)	Sigma	N1876-25G, Lot# WXBB7516V
Software
BioSigRZ	TDT, FL, USA
Matlab	MathWorks, MA, Stany Zjednoczone
Oprogramowanie ASP	Oticon Medical, Nicea, Francja