Artykuł metodologiczny

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

DOI:

10.3791/58081

⸱

30 października 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne i makrofagi są kluczowymi komórkami, które stanowią pierwszą linię obrony przed patogenami. Odgrywają również ważną rolę w inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Prace eksperymentalne z tymi komórkami są dość trudne. Ich obfitość w narządach i tkankach jest stosunkowo niska. W rezultacie nie można ich izolować w dużych ilościach. Są one również trudne do transfekcji za pomocą konstruktów cDNA. W modelu mysim problemy te można częściowo przezwyciężyć poprzez różnicowanie in vitro od komórek progenitorowych szpiku kostnego w obecności M-CSF dla makrofagów lub GM-CSF dla komórek dendrytycznych. W ten sposób możliwe jest uzyskanie dużych ilości tych komórek od bardzo niewielu zwierząt. Co więcej, progenitorzy szpiku kostnego mogą być transdukowani za pomocą wektorów retrowirusowych przenoszących konstrukty cDNA na wczesnych etapach hodowli, przed ich różnicowaniem w komórki dendrytyczne i makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego. W ten sposób transdukcja retrowirusowa, po której następuje różnicowanie in vitro, może być wykorzystana do ekspresji różnych konstruktów cDNA w tych komórkach. Zdolność do ekspresji białek ektopowych znacznie rozszerza zakres eksperymentów, które można przeprowadzić na tych komórkach, w tym obrazowanie żywych komórek białek fluorescencyjnych, oczyszczanie tandemowe do analiz interaktomowych, analizy strukturalno-funkcyjne, monitorowanie funkcji komórkowych za pomocą biosensorów i wiele innych. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół transdukcji retrowirusowej mysich komórek dendrytycznych i makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego z wektorami kodującymi białka znakowane fluorescencyjnie. Na przykładzie dwóch białek adaptorowych, OPAL1 i PSTPIP2, demonstrujemy jego praktyczne zastosowanie w cytometrii przepływowej i mikroskopii. Omawiamy również zalety i ograniczenia tego podejścia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki mieloidalne stanowią nieodzowną część naszych mechanizmów obronnych przed patogenami. Są w stanie szybko wyeliminować drobnoustroje, a także umierające komórki. Ponadto są również zaangażowane w regulację rozwoju i naprawy tkanek oraz w utrzymanie homeostazy1,2,3. Wszystkie komórki szpikowe różnicują się od zwykłych mieloidalnych komórek progenitorowych w szpiku kostnym. Ich różnicowanie się w wiele funkcjonalnie i morfologicznie odrębnych podzbiorów jest w dużym stopniu kontrolowane przez cytokiny i ich różne kombinacje4. Do najintensywniej badanych podzbiorów komórek szpikowych należą granulocyty neutrofilowe, makrofagi i komórki dendrytyczne. Defekty w którejkolwiek z tych populacji prowadzą do potencjalnie zagrażających życiu konsekwencji i powodują poważne dysfunkcje układu odpornościowego u ludzi i myszy1,2,3,5,6.

W przeciwieństwie do granulocytów neutrofilowych, komórki dendrytyczne i makrofagi są komórkami rezydującymi w tkankach, a ich obfitość w narządach odpornościowych jest stosunkowo niska. W rezultacie izolacja i oczyszczanie pierwotnych komórek dendrytycznych i makrofagów do eksperymentów wymagających dużej liczby tych komórek jest kosztowne i często niemożliwe. Aby rozwiązać ten problem, opracowano protokoły umożliwiające uzyskanie dużych ilości jednorodnych makrofagów lub komórek dendrytycznych in vitro. Podejścia te opierają się na różnicowaniu mysich komórek szpiku kostnego w obecności cytokin: czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) dla makrofagów i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub liganda Flt3 dla komórek dendrytycznych7,8,9,10,11,12. Komórki generowane tą metodą są powszechnie opisywane w literaturze jako makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) i komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BMDC). Mają więcej właściwości fizjologicznych wspólnych z pierwotnymi makrofagami lub komórkami dendrytycznymi niż z odpowiadającymi im liniami komórkowymi. Kolejną dużą zaletą jest możliwość pozyskania tych komórek z genetycznie zmodyfikowanych myszy13. Badania porównawcze między komórkami typu dzikiego a komórkami pochodzącymi od genetycznie zmodyfikowanych myszy mają często kluczowe znaczenie dla odkrycia nowych funkcji genów lub białek będących przedmiotem zainteresowania.

Analiza subkomórkowej lokalizacji białek w żywych komórkach wymaga sprzężenia znacznika fluorescencyjnego z interesującym białkiem in vivo. Najczęściej osiąga się to poprzez ekspresję genetycznie kodowanego konstruktu fuzyjnego składającego się z analizowanego białka sprzężonego (często za pomocą krótkiego łącznika) z białkiem fluorescencyjnym (np. białkiem zielonej fluorescencji (GFP))14,15,16. Ekspresja znakowanych fluorescencyjnie białek w komórkach dendrytycznych lub makrofagach jest trudna. Komórki te są na ogół trudne do transfekcji za pomocą standardowych procedur transfekcji, a wydajność jest zwykle bardzo niska. Co więcej, transfekcja jest przejściowa, generuje stres komórkowy, a osiągnięta intensywność fluorescencji może być niewystarczająca dla mikroskopii17. W celu uzyskania rozsądnej frakcji tych komórek o wystarczającym poziomie ekspresji transgenu, zakażenie komórek progenitorowych szpiku kostnego wektorami retrowirusowymi, a następnie ich różnicowanie w BMDM lub BMDC stało się bardzo skutecznym podejściem. Pozwoliło to na analizę białek pochodzenia szpikowego w ich natywnym środowisku komórkowym, zarówno w stanie stacjonarnym, jak i podczas procesów krytycznych dla odpowiedzi immunologicznej, takich jak fagocytoza, tworzenie synaps immunologicznych lub migracja. W tym miejscu opisujemy protokół, który umożliwia stabilną ekspresję fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania w makrofagach i komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet Ekspertów ds. Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych Instytutu Genetyki Molekularnej oraz przez Akademię Nauk Republiki Czeskiej.

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotować bufor amonowo-chlorkowo-potasowy (ACK). Dodać 4,145 g NH4Cl i 0,5 g KHCO3 do 500 ml ddH2O, następnie dodać 100 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i wysterylizować filtrem.
  2. Przygotować roztwór polietyleniminy (PEI). Dodać 0,1 g PEI do 90 ml ddH2O. Mieszając, dodawaj kroplami 1 M HCl, aż pH spadnie poniżej 2,0. Mieszać do 3 godzin, aż PEI się rozpuści, a następnie dostosować pH do 7,2 za pomocą 1 M NaOH. Dostosuj objętość do 100 ml za pomocą ddH2O i sterylizuj filtrem. Przygotować 1–2 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Po rozmrożeniu PEI można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni, ale nie należy go ponownie zamrażać.
  3. Przygotować supernatanty do hodowli komórkowych zawierające M-CSF lub GM-CSF. Supernatanty te mogą być wytwarzane z wyprzedzeniem i przechowywane w temperaturze -80 °C. Aby wytworzyć te supernatanty, hoduj komórki wytwarzające cytokiny (komórki J558 dla GM-CSF 18 lub komórki CMG 14-12 dla M-CSF 19) na 10-centymetrowej szalce Petriego w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do zbiegu. Następnie przenieść wszystkie komórki do 200 ml pożywki w kolbie do hodowli tkankowej T150 i hodowli przez dodatkowe 4 dni w temperaturze 5% CO2/37 °C. Zebrać supernatant i przefiltrować przez filtr sterylizacyjny 0,2 μm. Sporządzić porcje i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  4. Przygotować 100 ml pożywki do hodowli komórkowych: DMEM uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS i supernatantami do hodowli komórkowych z komórek wydzielających GM-CSF (do różnicowania BMDC) lub M-CSF (do różnicowania BMDM).
    UWAGA: Ilość cytokin w tych supernatantach może się różnić, a stężenie robocze musi być określone empirycznie. Zazwyczaj stosuje się 2–3% supernatant z linii komórkowych wytwarzających GM-CSF (zalecane stężenie wyjściowe to 2%) lub 5–10% supernatant z komórek CMG 14–12 wytwarzających M-CSF (zalecane stężenie wyjściowe to 10%). Alternatywnie, oczyszczony, komercyjnie dostępny M-CSF w stężeniu 10 ng / ml i GM-CSF w stężeniu 20 ng / ml mogą być stosowane z wynikami praktycznie identycznymi jak w przypadku supernatantów zawierających cytokiny, tj. bez żadnego wpływu na szybkość różnicowania, wydajność infekcji i lokalizację subkomórkową konstruktów znakowanych EGFP. Antybiotyki, w tym penicylina G (100 j.m./ml), streptomycyna (100 μg/ml) i gentamycyna (40 μg/ml), mogą być stosowane do hodowli komórkowej na każdym etapie protokołu, chyba że określono inaczej.

2. Produkcja retrowirusa

UWAGA: Chociaż wektory retrowirusowe są względnie bezpieczne w porównaniu do innych typów wektorów wirusowych, nadal stanowią potencjalne zagrożenie dla bezpieczeństwa. Dlatego tak ważne jest, aby pracować z najwyższą starannością i odpowiednim sprzętem ochronnym oraz przestrzegać wszystkich przepisów bezpieczeństwa i wymogów prawnych dotyczących pracy z cząsteczkami wirusa.

  1. Zawiesinę pojedynczych komórek opakowania Platinum-Eco (Plat-E) umieścić na 10-centymetrowej szalce Petriego i hodować w 15 ml DMEM zawierającej 10% FBS aż do 50-60 % zlewania (24 godziny). Komórki powinny rosnąć w jednej warstwie i nie powinny tworzyć grudek w hodowli.
  2. Odpipetować 20 μg konstruktu retrowirusowego (np. konstruktu wyrażającego fluorescencyjnie znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania w wektorze pMSCV) i 10 μg wektora pakującego pCL-Eco20 do 1 ml DMEM (bez surowicy i antybiotyków) i delikatnie wymieszać.
  3. Do drugiej probówki dodać 75 μl PEI w 1 ml DMEM (bez surowicy i antybiotyków). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie wymieszać zawartość obu probówek i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Dodanie pCL-Eco jest opcjonalne. Koduje ekotropowy receptor wirusowy i może zwiększać miano wirusa.
  4. Ostrożnie zastąp pożywkę na komórkach Plat-E 8 ml świeżego DMEM uzupełnionego 2% FBS. Przed użyciem podgrzej podłoże do temperatury 37 °C. Nie należy stosować antybiotyków podczas transfekcji, ponieważ antybiotyki mogą zmniejszyć skuteczność transfekcji.
  5. Ostrożnie dodać (kroplami) mieszaninę przygotowaną w kroku 2.3 na komórki Plat-E i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  6. Po inkubacji wymienić pożywkę na komórkach Plat-E na 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM zawierającego 10% FBS i hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Podczas tej inkubacji komórki Plat-E będą wytwarzać wirusa w pożywce.
  7. Po 24 godzinach zebrać pożywkę zawierającą cząstki retrowirusowe z komórek Platinum Eco za pomocą pipety o pojemności 5 ml i przenieść ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml (= "supernatant 1" zawierający ekotropowe cząstki retrowirusowe).
  8. Aby uniknąć zanieczyszczenia komórkami Plat-E w supernatantach wirusowych, należy wirować zebrany wirus w temperaturze 1250 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wirus powinien być natychmiast użyty do infekcji.
    UWAGA: Podwielokrotności wirusa mogą być również przechowywane w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Spowoduje to jednak pewne zmniejszenie wydajności transdukcji. Unikaj powtarzającego się zamrażania/rozmrażania wirusa, ponieważ prowadzi to do degradacji wirusa.
  9. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM z 10% FBS do komórek Plat-E i hodować przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  10. Powtórzyć kroki 2.7 i 2.8 w celu uzyskania "supernatantu 2".

3. Izolacja komórek szpiku kostnego myszy

  1. Poświęć mysz za pomocą zwichnięcia szyjki macicy lub innej zatwierdzonej metody. Spryskaj mysz 70% etanolem.
  2. Za pomocą pęsety i nożyczek usuń skórę oraz część mięśni z tylnych nóg. Ostrożnie usuń panewkę ze stawu biodrowego, nie łamiąc kości udowej. Przeciąć łapę w stawie skokowym. Spryskaj kości (kość udową połączoną z piszczelem) 70% etanolem i usuń resztę mięśni za pomocą ręcznika papierowego.
  3. Umieść kości na 5-centymetrowej szalce Petriego zawierającej sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 2% FBS (PBS-FBS).  Jeśli przygotowujesz więcej kości, trzymaj szalkę Petriego na lodzie, aż zostanie przetworzona.
  4. Aby zapewnić sterylność uprawy, należy wykonać wszystkie poniższe czynności w kapturze do hodowli tkankowych.
  5. Oddziel kość udową od kości piszczelowej bez łamania końców kości (zegnij w stawie kolanowym i ostrożnie przetnij nożyczkami).
  6. Przetwarzaj kości jedna po drugiej. Odetnij bardzo małą część nasad (około 1–2 mm) nożyczkami, trzymając kość w pęsetze.
  7. Za pomocą igły 30 G i strzykawki o pojemności 2 lub 5 ml wypełnionej PBS-FBS należy przepłukać komórki szpiku kostnego z obu końców kości do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przesuń igłę wewnątrz kości podczas płukania, aby usunąć wszystkie komórki. Jeśli igła zostanie zatkana, zmień ją.
    UWAGA: Podczas zaczerwienienia kości powinny zmienić kolor z czerwonego na biały. Oznacza to, że większość komórek została usunięta z kości. Użyj około 2-3 ml PBS-FBS na kość.
  8. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Odrzucić supernatant i poddać lizie czerwone krwinki, ponownie zawieszając osad w 2,5 ml buforu ACK na 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Podczas lizy przefiltruj komórki szpiku kostnego przez sitko o pojemności 100 μm do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przywróć toniczność, dodając 12 ml PBS-FBS.
    UWAGA: Nie należy przekraczać 5 minut hipotonicznej lizy z buforem ACK, aby uniknąć śmierci komórki.
  10. Odwirować natychmiast przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

4. Różnicowanie komórek szpiku kostnego w makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

  1. Zawiesić osad komórek szpiku kostnego w DMEM uzupełnionym 10 % FBS i antybiotykami (patrz uwaga po kroku 1.4. w celu uzyskania stężenia antybiotyku) i policzyć komórki. W celu różnicowania do makrofagów pochodzących z BM, płytkę 5–10 x10 6 komórek szpiku kostnego na 10 cm szalce Petriego poddanej działaniu kultury nietkankowej z 10 ml wstępnie przygotowanej pożywki DMEM z surowicą i M-CSF z kroku 1.4.
    UWAGA: Wydajność komórek szpiku kostnego wynosi około 4 x 107 na 6-8 tygodniową mysz C57BL/6J.
  2. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 3 dni w temperaturze 5% CO2, 37 °C.
    UWAGA: W ciągu pierwszych 2 dni komórki nie wyglądają na bardzo żywotne, ponieważ obecna jest duża liczba komórek apoptotycznych (komórki niezdolne do różnicowania się w komórki szpikowe i komórki ostatecznie zróżnicowane).
  3. Po 3 dniach hodowla komórek szpiku kostnego zaczyna wyglądać na żywotną i tworzą się skupiska dzielących się komórek. Już teraz można zaobserwować pierwsze przylegające komórki. W tym momencie uzupełnij komórki świeżymi pożywkami cytokinowymi.
  4. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM z surowicą i M-CSF (z kroku 1.4) do każdej 10 cm szalki Petriego i umieścić ją w inkubatorze do hodowli komórkowych. Na tym etapie nie ma potrzeby usuwania starego nośnika.
    UWAGA: Makrofagi szpiku kostnego są w pełni zróżnicowane po 5–7 dniach w hodowli. Najlepszym momentem na zbiór jest 6–8 dzień, kiedy większość komórek przylega, a szalka Petriego jest całkowicie pokryta.
  5. W 5 dniu przenieś szalkę Petriego do okapu do hodowli komórkowej i pochyl szalkę, aż pożywka prawie dotrze do krawędzi szalki. Ostrożnie wyjmij 15 ml pożywki z powierzchni w pobliżu krawędzi, a komórki mają tendencję do pozostawania na środku naczynia. Dodać taką samą objętość wstępnie podgrzanego podłoża z M-CSF i umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze.
    UWAGA: Jeśli pożywka jest zasysana powoli i ostrożnie, prawie żadne komórki nie zostaną utracone. Możliwe jest jednak również odwirowanie zasysanej pożywki i dodanie komórek z powrotem do hodowli, aby zapewnić, że żadne nieprzylegające (tj. nie w pełni zróżnicowane) komórki nie zostaną utracone.
  6. Do eksperymentów używa się tylko komórek przylegających (makrofagów). Aby zebrać komórki, w 6 lub 7 dniu usuń wszystkie pożywki i komórki pływające. Umyj naczynie raz podgrzanym PBS bez serum.
  7. Dodać 5 ml 0,02% EDTA do PBS i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
  8. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml usunąć komórki z naczynia za pomocą strumienia PBS-EDTA i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 25 ml PBS. W razie potrzeby zbierz razem więcej potraw.
  9. Odwirować natychmiast przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Ponownie zawiesić osad makrofagów w pożywce DMEM i policzyć komórki. Sprawdzić ekspresję markerów różnicowania powierzchni makrofagów (CD11b i F4/80) za pomocą cytometrii przepływowej.
  11. W przypadku eksperymentów wymagających obecności komórek w zawiesinie, np. eksperymentów z cytometrią przepływową, qPCR lub analizy western blot, należy użyć makrofagów bezpośrednio. W przypadku eksperymentów z przylegającymi makrofagami należy umieścić komórki na płytce do hodowli tkankowej zgodnie z konfiguracją doświadczalną.
  12. Komórki są już w pełni zróżnicowane. Przechowywać je w pożywce odpowiedniej do planowanego eksperymentu lub w oryginalnej pożywce do wzrostu i różnicowania z M-CSF.
    UWAGA: W przypadku pracy z przylegającymi makrofagami należy przenieść je na nową płytkę co najmniej 6 godzin przed użyciem (najlepiej na noc), aby umożliwić pełne przyleganie do nowej powierzchni. Niewielką frakcję pływających komórek można usunąć przed eksperymentem.

5. Różnicowanie komórek szpiku kostnego w komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

  1. Postępuj zgodnie z protokołem dla BMDM z regulacjami specyficznymi dla BMDC opisanymi poniżej w krokach 5.2–5.4.
  2. Ponownie zawiesić uzyskany osad komórek szpiku kostnego w DMEM uzupełnionym 10% FBS i antybiotykami i policzyć komórki (postępując zgodnie z krokiem 4.1 protokołu makrofagów). W celu różnicowania w komórki dendrytyczne należy umieścić 1–1,5 x 107 komórek szpiku kostnego na 10-centymetrowej szalce Petriego poddanej działaniu kultury nietkankowej w 10 ml wstępnie przygotowanej pożywki DMEM z surowicą i GM-CSF (od kroku 1.4.).
  3. Postępuj zgodnie z tymi samymi krokami uprawy, co w protokole BMDM (kroki 4.3–4.5. protokołu makrofagów). Używaj pożywek DMEM z surowicą i GM-CSF zamiast M-CSF. Ponieważ w przypadku BMDC czas uprawy jest dłuższy (zwykle 10–12 dni), należy dodać 1–2 dodatkowe karmienia w odstępach 3-dniowych (poprzez usunięcie supernatantu i dodanie nowego podłoża hodowlanego, jak opisano w kroku 4.5.).
  4. Ta część protokołu jest praktycznie taka sama, jak odpowiadająca jej część protokołu makrofagów (kroki 4.6–4.12. protokołu makrofagów). Do eksperymentów używaj tylko przylegających komórek. W dniach 10-12 zbierz komórki za pomocą EDTA, policz je i umieść na nowej powierzchni. Sprawdzić ekspresję markerów różnicowania powierzchniowego komórek dendrytycznych (CD11c+, CD11b+, F4/80-) za pomocą cytometrii przepływowej.

6. Produkcja BMDM i BMDC wyrażających interesujące białko oznaczone znacznikiem EGFP

  1. Zawiesić osad komórek szpiku kostnego otrzymanych w kroku 3.10. w DMEM uzupełnionym 10 % FBS i antybiotykami i policzyć komórki. W przypadku infekcji należy użyć 2–5 x 106 komórek BM na dołek na 6-dołkowej płytce poddanej hodowli tkankowej.
  2. Umieścić komórki w 1 ml przygotowanej pożywki DMEM na basenik, uzupełnionej M-CSF w celu różnicowania w BMDM lub GM-CSF w celu różnicowania w BMDC. Przechowywać komórki przez 4–6 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  3. Dodać 2 ml świeżo zebranego wirusa ("supernatant 1") uzupełnionego polibrenem (12 μg/ml, stężenie końcowe 8 μg/ml po dodaniu do komórek).
    UWAGA: Można również użyć zamrożonej podwielokrotności supernatantu zawierającego wirusa, ale skuteczność będzie niższa.
  4. Odwirować płytkę przy 1 250 x g przez 90 minut w temperaturze 30 °C (z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem). Następnie inkubować przez 4 godziny z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  5. Fakultatywnie: Zastąp 2 ml pożywki hodowlanej świeżą pożywką zawierającą odpowiednią cytokinę (M-CSF lub GM-CSF) i kulturę z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Drugiego dnia usunąć 2 ml pożywki hodowlanej i powtórzyć całą procedurę infekcji (krok 6.3–6.4) z 2 ml świeżo pobranego wirusa ("supernatant 2").
    UWAGA: Ten krok może zwiększyć skuteczność infekcji. Poprawa po drugiej infekcji zależy od typu komórki i białka docelowego, a z naszego doświadczenia wynika, że może wahać się od 30% wzrostu skuteczności do całkowitej poprawy.
  6. Zebrać nieprzylegające komórki, przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut (4 °C). Odrzucić supernatant.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej z M-CSF lub GM-CSF, umieścić komórki na 10-centymetrowej szalce Petriego poddanej działaniu kultury nietkankowej i wyhodować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Optymalna liczba komórek na 10-centymetrowej szalce wynosi 5–10 x 106 dla makrofagów pochodzących z BM i 10–15 x 106 dla komórek dendrytycznych pochodzących z BM.
    UWAGA: Można używać mniejszych naczyń lub talerzy, ale numery komórek muszą być odpowiednio dostosowane.
  8. Postępuj zgodnie z protokołem hodowli i różnicowania makrofagów i komórek dendrytycznych opisanym w krokach 4 i 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka adaptorowe sygnalizacyjne to zazwyczaj małe białka bez żadnej aktywności enzymatycznej. Posiadają różne domeny lub motywy interakcji, które pośredniczą w wiązaniu z innymi białkami zaangażowanymi w transdukcję sygnału, w tym kinazami tyrozynowymi, fosfatazami, ligazami ubikwityny i innymi21. Do zademonstrowania funkcjonalności tego protokołu wybrano adaptery komórek szpikowych PSTPIP2 i OPAL1. PSTPIP2 jest dobrze scharakteryzowanym białkiem biorącym udział w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja interesującego nas białka w komórkach docelowych jest kluczowym krokiem w wielu typach badań biologicznych. Zróżnicowane makrofagi i komórki dendrytyczne są trudne do transfekcji za pomocą standardowych technik transfekcji i transdukcji retrowirusowej. Ominięcie transfekcji tych zróżnicowanych komórek za pomocą transdukcji retrowirusowej komórek progenitorowych szpiku kostnego, a następnie różnicowania, gdy są już nosicielami pożądanego konstruktu, jest krytycznym krokiem umożliwiającym ekspresję ektopowych cDN...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Czeską Fundację Naukową (GACR) (numer projektu 16-07425S), przez Agencję Grantów Uniwersytetu Karola (GAUK) (numer projektu 923116) oraz przez finansowanie instytucjonalne z Instytutu Genetyki Molekularnej Akademii Nauk Republiki Czeskiej (RVO 68378050).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270Do suplementacji pożywki
KHCO3Lachema, Brno, Republika CzeskaN/A
NH4ClSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)A9434
PenicylinaBB Pharma AS, Praga, Republika CzeskaN/APENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
StreptomycinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137Sól siarczanu streptomycyny w proszku
GentamycynaDr. Kulich Pharma, Hradec Krá lové, CzechyNie dotyczy
Polietylenomina, liniowa, MW 25,000Polyscience, Warrington, PA, USA23966
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)H9268
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
PBSPrzygotowane we własnym zakresie przez media facility IMG ASCR, Praga, CzechyNie dotyczy
Przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD11b APC, klon M1/70BioLegend (San Diego, CA, USA)101212analiza cytometrii przepływowej
PE przeciwciało przeciw mysim F4/80, klon BM8BioLegend (San Diego, CA, USA)123110analiza cytometrii przepływowej
APC anty-mysie przeciwciało CD11c, klon N418BioLegend (San Diego, CA, USA)117310analiza cytometrii przepływowej
M-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)315-02
GM-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)315-03
Hoechst 33258Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAH1398przy 1-2 i mikro; g/ml
Zastosowanie analizy cytometrii przepływowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960(2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766(2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Makrofagi pochodz ce z szpiku kostnegoprotok transdukcji retrowirusowejanaliza cytometrii przep ywowejobrazowanie mikroskopowekom rki Platinum Eco packagingizolacja szpiku kostnegor nicowanie indukowane M CSFr nicowanie indukowane GM CSF

Powiązane artykuły