Artykuł metodologiczny

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58110

⸱

17 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Streszczenie

Wirus Zika (ZIKV) może wywołać stan zapalny w organach o podwyższonym statusie immunologicznym (np. mózgu i jądrach), prowadząc do zespołu Guillaina-Barrégo i uszkadzając jądra. Wykazano, że podczas zakażenia wirusem ZIKV komórki odpornościowe przenikają do tkanek. Jednak mechanizmy komórkowe, które definiują ochronę i/lub immunopatogenezę tych komórek odpornościowych podczas infekcji ZIKV, są nadal w dużej mierze nieznane. W niniejszym artykule opisujemy metody oceny specyficznej dla wirusa funkcjonalności limfocytów T w tych immunologicznie uprzywilejowanych narządach myszy zakażonych ZIKV. Metody te obejmują: a) zakażenie ZIKV i inokulację szczepionką u myszy Ifnar1-/-; b) badania histopatologiczne, immunofluorescencyjne i immunohistochemiczne w celu wykrycia infekcji wirusowej i stanu zapalnego w mózgu, jądrach i śledzionie; c) przygotowanie tetrameru epitopów limfocytów T pochodzących z ZIKV; d) wykrywanie limfocytów T specyficznych dla ZIKV w monocytach wyizolowanych z mózgu, jąder i śledziony. Dzięki tym metodom możliwe jest wykrycie limfocytów T specyficznych dla antygenu, które przeniknęły do narządów z uprawnieniami immunologicznymi, oraz ocena funkcji tych limfocytów T podczas infekcji: potencjalna ochrona immunologiczna poprzez usuwanie wirusa i/lub immunopatogenezę w celu zaostrzenia stanu zapalnego. Odkrycia te mogą również pomóc w wyjaśnieniu udziału limfocytów T indukowanych przez szczepienie przeciwko ZIKV.

Wprowadzenie

ZIKV to flawiwirus przenoszony przez komary, który po raz pierwszy został wyizolowany w 1947 roku w Ugandzie od gorączkującego makaka rezusa. Ostatnio ZIKV stał się zagrożeniem dla zdrowia publicznego ze względu na jego szybkie rozprzestrzenianie się w obu Amerykach i nieoczekiwany związek z małogłowiem i zespołem Guillaina-Barrégo1,2,3. Na podstawie danych epidemiologicznych podejrzewa się, że ZIKV jest przyczyną zespołu Guillaina-Barrégo u około 1 na 4 000 zakażonych dorosłych4. Ponadto wykazano korelację między ZIKV a infekcją/uszkodzeniem jąder w modelu mysim, co sugeruje, że zakażenie ZIKV w pewnych okolicznościach może ominąć barierę krew-jądro i ostatecznie prowadzić do niepłodności męskiej5. Wyniki te podkreślają znaczenie pełnego zrozumienia indukcji ochronnych lub patologicznych odpowiedzi immunologicznych podczas infekcji ZIKV.

Wiele pozostaje do nauczenia się o komórkowych odpowiedziach immunologicznych na ZIKV. Odpowiedzi limfocytów T CD4+ i CD8+ na kapsyd, otoczkę i białko niestrukturalne 1 (NS1) zaobserwowano u małp i ludzi zakażonych ZIKV6,7,8. U myszy kilka badań wykazało, że limfocyty T CD8 + odgrywają ochronną rolę w kontrolowaniu replikacji ZIKV 9,10,11. Co ważne, Jurado i wsp. wykazali, że zakażenie ZIKV powoduje uszkodzenie bariery krew-mózg i okołonaczyniowy naciek efektorowych limfocytów T CD8 + w jądrach myszy Ifnar1-/-. Co więcej, wykazali, że limfocyty T CD8+ wywołują paraliż związany z ZIKV i wydają się odgrywać rolę w immunopatologii mózgu noworodków. W poprzednim badaniu przygotowaliśmy tetramer ZIKV-E294-302 i wykazaliśmy, że specyficzne dla ZIKV limfocyty T CD8 + istnieją w mózgach i rdzeniach kręgowych myszy Ifnar1-/- zakażonych ZIKV, co może mieć ważne implikacje dla projektowania i rozwoju szczepionek ZIKV10.

W odpowiedzi na pilną potrzebę szczepień zapobiegających zakażeniu ZIKV, kilka szczepionek jest w fazie przedklinicznej, w tym szczepionki RNA, szczepionki oparte na rekombinowanych wektorach i szczepionki z oczyszczonymi podjednostkami białkowymi. Szczepionka plazmidowego DNA jest w fazie 1 badań klinicznych 12. W związku z tym ważna jest ocena bezpieczeństwa i skuteczności szczepionek przeciwko ZIKV. Jedną z zalet szczepionek jest ich zdolność do wywoływania specyficznych odpowiedzi limfocytów T, co może być ważne dla ochrony przed ZIKV. Stosując tetramery związane z epitopami komórek T pochodzącymi z ZIKV, immunoreaktywność komórek T indukowaną przez szczepionkę ZIKV opartą na wektorze adenowirusowym można było wykryć u immunizowanych myszy, a wykazano, że zarówno glikoproteiny M, jak i E indukują silną immunoreaktywność limfocytów T CD8 + specyficzną dla antygenu 13.

Podczas infekcji wirusowej, rozpoznawanie antygenów peptydowych prezentowanych przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) do receptora limfocytów T (TCR) jest ważnym mechanizmem ochrony gospodarza, w którym pośredniczą limfocyty T14. Opierając się na tej teorii, technologia tetramerów jest unikalnym narzędziem do wyjaśnienia ról, jakie odgrywają limfocyty T specyficzne dla antygenu w regulacji odpowiedzi immunologicznej15. Protokół ten opisuje ustanowienie mysiego modelu Ifnar1-/- dla zakażeń ZIKV oraz wykrywanie reaktywnych limfocytów T w śledzionie, mózgu i jądrach myszy przy użyciu technologii tetramerów. Dodatkowo użyliśmy tetrameru ZIKV-E294-302 do wykrywania i oceny immunoreaktywności limfocytów T indukowanej przez szczepionkę ZIKV (AdC7-M / E) u immunizowanych myszy. Badanie to dostarcza wskazówek do badania odpowiedzi limfocytów T w narządach z uprawnieniami immunologicznymi i stanowi odniesienie do potencjalnych zastosowań w łożysku lub mózgu płodu.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Kontroli i Prewencji Chorób Wirusowych, Chiny CDC. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami na zwierzętach zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Infekcja wirusowa

  1. Dorosłe myszy (w wieku od 6 do 8 tygodni) Ifnar1-/- (50% samców i 50% samic) należy przechowywać w standardowych warunkach wolnych od patogenów (SPF) i zapewnić im regularny dostęp do pożywienia i wody.
  2. Zakażone myszy Ifnar1-/- wirusem ZIKV poprzez retroorbitalną inokulację 100 μl ZIKV w buforze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) zawierającym 1 x 104 jednostki tworzące ognisko (FFU) wirusa. Podobnie podaj myszom kontrolnym równą objętość PBS.
    UWAGA: Zakażon myszy w warunkach ABSL2 i wykonaj te procedury na myszach zakażonych wirusem w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Monitoruj masę ciała i objawy kliniczne (drżenie, rozłożony w czasie marsz, obustronna wiotka kończyna tylna) myszy codziennie przez 15 dni.

2. Szczepienie szczepionką ZIKV

  1. Używaj myszy Ifnar1-/- (50% samców i 50% samic) w wieku od 6 do 8 tygodni. Trzymaj myszy w standardowych warunkach SPF 18–29 °C i 12-godzinnym cyklu światła/ciemności z dostępem do pożywienia i wody.
  2. Uodpornić myszy Ifnar1-/- szczepionką ZIKV: wstrzyknąć 100 μl AdC7-M/E [4 x 1010 (cząsteczki wirusa)] do buforu PBS przez wstrzyknięcie domięśniowe (drogą domięśniową) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 23-G.
  3. Podobnie, wstrzyknij myszom kontrolnym równą objętość PBS.

3. Izolacja monocytów od śledziony

UWAGA: Izolacja monocytów od śledziony jest opisana tak, jak wspomniano wcześniej16.

  1. Znieczulenie uodpornionych i zakażonych ZIKV myszy 7 dni po inokulacji, stosując 5% stężenie izofluranu w 100% tlenu (przy natężeniu przepływu 1 l / min). Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Następnie natychmiast zanurz całą mysz w 75% etanolu.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie procedury eksperymentalne powinny być wykonywane aseptycznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Za pomocą igieł przymocuj kończyny myszy (poddanych eutanazji, wcześniej zakażonych/uodpornionych) na piankowej płytce z brzuchem skierowanym do góry.
  3. Przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej brzucha do klatki piersiowej sterylnym skalpelem, przeciąć mięśnie brzucha nożyczkami, odsłonić jamę brzuszną i delikatnie usunąć wątrobę.
    UWAGA: Długim, ciemnoczerwonym narządem po lewej stronie żołądka jest śledziona.
  4. Usuń śledzionę, opłucz ją 3x w PBS, aby usunąć krew i umieść ją w 1,5 ml lodowatego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Trzymaj śledzionę na lodzie.
  5. Aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową ze śledziony, umieść narząd (narządy) na sterylnym sitku do komórek o siatku 40 μm na probówce o pojemności 50 ml i dodaj 2 ml lodowatej pożywki RPMI zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml rozgnieć mechanicznie narząd (narządy) i dodawać pożywkę, aż narząd zostanie całkowicie zmielony przez siatkę.
  6. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  7. Ponownie zawiesić komórki z 5 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) (NH4Cl, Na2EDTA i KHCO3; patrz tabela materiałów) i inkubować reakcję lizy w temperaturze pokojowej przez 5–6 minut.
  8. Zatrzymać lizę RBC za pomocą 10 ml lodowatej pożywki RPMI/FBS i odwirować probówkę o stężeniu 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  9. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml kompletnej pożywki RPMI (RPMI z 10% obj. / obj. FBS i 100 U / ml penicyliny-streptomycyny). Przenieść 10 μl zawiesiny komórek do małej probówki, wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego o stężeniu 0,4% wag./obj. i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.

4. Izolacja monocytów od mózgu i jąder

  1. Znieczulenie samców myszy zakażonych ZIKV 7 dni po inokulacji, używając 5% izofluraneiny 100% tlenu (o natężeniu przepływu 1 l / min). Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Następnie natychmiast zanurz całą mysz w 75% etanolu.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie procedury eksperymentalne muszą być wykonywane w aseptyce w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Izolacja monocytów od mózgu i jąder jest opisana, jak wspomniano wcześniej17.
  2. Unieruchomij (uśpionego, wcześniej zarażonego) samca myszy w pozycji leżącej na desce do krojenia.
  3. Zabezpiecz skórę głowy prostymi kleszczami o wymiarach 1 x 2 zęby i użyj nożyczek do tęczówki, aby wykonać nacięcie w linii środkowej na skórze głowy, aby odsłonić czaszkę.
  4. Zaciśnij obie strony oczodołów ostrymi pęsetami i napraw mózg. Umieść jedną końcówkę ostrych nożyczek tęczówki w otworze wielkim i naciąć bocznie w czaszce. Powtórz ten krok dla drugiej strony.
  5. Użyj ostrych nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie wyciąć z tej samej jamy, w górę linii środkowej, w kierunku nosa. Staraj się, aby koniec nożyczek był jak najbardziej powierzchowny, aby uniknąć zranienia mózgu.
  6. Podnieś mózg kleszczami i użyj ostrych nożyczek tęczówki, aby dokładnie wypreparować włókna nerwowe czaszki. Usuń mózg za pomocą kleszczy i umieść go w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml lodowatej pożywki RPMI/10% FBS.
  7. Chwyć skórę brzucha kleszczami i użyj ostrych nożyczek tęczówki, aby wykonać podłużne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha i odsłonić najniższą część brzucha. Popchnij jądra do nacięcia. Delikatnie pociągnij warstwę tłuszczu pęsetą i odsłoń kuliste jądro po obu stronach.
  8. Użyj ostrych nożyczek do tęczówki, aby dokładnie wypreparować warstwę tłuszczu i najądrza. Umieść jądra w 15 ml probówce zawierającej 5 ml lodowatej pożywki RPMI/10% FBS za pomocą kleszczy.
  9. Aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową z mózgu lub jąder, umieść narząd na sterylnym sitku do komórek z siatką 100 μm na probówce o pojemności 50 ml i dodaj 2 ml lodowatej pożywki RPMI/10% FBS. Używając tłoka strzykawki o pojemności 5 ml, rozgnieć narząd i dodawać pożywkę, aż narząd zostanie całkowicie zmielony przez siatkę.
  10. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  11. Ponownie zawiesić komórki z 5 ml pożywki o gradinie gęstości 30%, a następnie dodać je bardzo powoli do 2 ml pożywki o gradiencie gęstości 70% w probówce o pojemności 15 ml.
  12. Wyłączyć hamulec i odwirować probówki w temperaturze 4 °C przy 800 x g przez 30 min. Pobrać limfocyty ze środkowej warstwy.
  13. Przenieść interfazę do świeżej probówki o pojemności 15 ml, dodać 10 ml zimnej pożywki RPMI/10% FBS i odwirować probówkę przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  14. Zawiesić komórki w 10 ml lodowatej pożywki RPMI/FBS i odwirować je przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  15. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml kompletnej pożywki RPMI i policzyć liczbę komórek jak w kroku 3.9.

5. Przygotowanie tetrameru

  1. Skonstruuj plazmidy wyrażające zewnątrzkomórkowe domeny H-2Db z biotynylowanym znacznikiem miejsca na C-końcu domeny α3 i β2m, używając wektora pET28a z miejscem restrykcyjnym NdeI i XohI18.
  2. Wyraź i przygotuj ciała inkluzyjne H-2Db i β2m, jak opisano wcześniej20.
  3. Renaturyzacja i oczyszczanie kompleksu MHC/peptyd H-2Db-E 294-302.
    1. Przygotuj 200 ml roztworu do ponownego składania [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM L-argininy, 2 mM EDTA-Na, 5 mM GSG i 0,5 mM GSSG]. Dodaj inhibitory proteazy: 2 ml fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF, zapas 100 mM), 100 μl pepstatyny (zapas 2 mg / ml) i 100 μl leupeptyny (zapas 2 mg / ml). Schłodzić bufor w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    2. Dodaj H-2Db, β2m i peptyd do roztworu do ponownego składania.
      1. Wstrzyknąć 500 μl β2m rozpuszczonych w roztworze guanidyny (30 mg/ml bulionu) za pomocą strzykawki. W tym celu należy użyć igły 23 G ze strzykawką o pojemności 5 ml i stopniowo wstrzykiwać β2m do roztworu do ponownego składania. Utrzymywać roztwór stale i powoli mieszając z prędkością 150 obr./min w temperaturze 4 °C.
      2. Po rozpuszczeniu β2m w roztworze do ponownego fałdowania, rozpuść 2 mg peptydu E294-302 w 200 μl DMSO i szybko wstrzyknij go do roztworu do ponownego składania za pomocą pipety. Powoli mieszać roztwór przy 150 obr./min w temperaturze 4 °C przez 15 min.
      3. Wstrzyknąć 1,5 ml H-2Db rozpuszczonego w roztworze guanidyny. Utrzymuj mieszadło obracające się z prędkością 150 obr./min w celu ponownego złożenia H-2Db w temperaturze 4 °C przez 8–10 godz.
        UWAGA: Roztwór umieszczono w zamkniętym pudełku w chłodni.
    3. Skoncentrować ponownie złożone białko w komorze ciśnieniowej z membraną o masie 10 kDa. Wymienić bufor [20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl] do komory i zagęścić go do końcowej objętości 30–50 ml.
    4. Przenieść roztwór do ponownego składania do probówki wirówkowej i wirować w temperaturze 2 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Ostrożnie przenieść supernatant do filtra odśrodkowego o stężeniu 10 kDa i dalej zagęszczać go do końcowej objętości 500 μl przy 2 500 x g przez 30 minut.
    6. Przenieść supernatant do świeżej probówki i wirować w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut. Oczyścić białko za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej S200 10/300 GL.
    7. Zebrać pik kompleksu MHC i zagęścić go do końcowej objętości 350 μl.
  4. Aby wytworzyć objętość reakcyjną 500 μl do biotynylacji, dodaj regentów w następującej kolejności: 100 μL roztworu A [0,5M bicine (pH 8,3)], 100 μL roztworu B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 μΜ biotyny), 100 μL dodatkowej d-biotyny (500 μΜ biotyny), 20 μL enzymu BirA (60 μg), 0,5 μl pepstatyny (2 mg/ml) i 0,5 μl leupeptyny (2 mg/ml). Inkubować probówkę reakcyjną przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nie dodawaj żadnego EDTA do reakcji biotynylowania.
  5. Oczyść MHC za pomocą żelowej kolumny filtracyjnej S200 10/300 GL, aby usunąć nadmiar biotyny.
  6. Określ skuteczność biotynylacji za pomocą testu przesunięcia streptawidyny18.
    1. Przygotuj trzy próbki, A, B i C, na lodzie przez 30 minut. Następnie przeanalizuj wyniki według 10% SDS-PAGE. Próbka A składa się z 8 μl biotynylowanych cząsteczek MHC i 2 μl buforu wymiennego, próbki B zawierającej 8 μl biotynylowanych cząsteczek MHC i 2 μl streptawidyny (20 mg/ml) oraz próbki C zawierającej 2 μl streptawidyny (20 mg/ml) i 8 μl buforu wymiennego.
      UWAGA: Nie gotuj próbki.
  7. Tworzą multimery biotynylowanych cząsteczek MHC.
    1. Wytwarzać tetramer przez zmieszanie biotynylowanego kompleksu peptydów E294-302-H 2Db ze streptawidyną znakowaną fikoerytryną w stosunku molowym 1:5, aby zapewnić całkowite związanie wszystkich biotynylowanych cząsteczek MHC.
    2. Oblicz ilość sprzężonego streptawidyny potrzebną do tetrameryzacji.
      1. Określić liczbę moli kompleksów MHC/peptyd odpowiadających stężeniu białka i masie molowej (przykład: 1,8 mg białka całkowitego = 40 nmol).
      2. Obliczyć mole koniugatu streptawidyny potrzebne do podzielenia moli MHC/peptydu przez 5 (przykład: 40/5 = 8 nmol koniugatu streptawidyny).
      3. Obliczyć potrzebną ilość streptawidyny (w μg) w zależności od koniugatu streptawidyny (przykład: streptawidyna-PE [300 000 g/M] → potrzebne 8 nmol = 2 400 g).
    3. Podzielić streptawidynę-fikoerytrynę na 10 próbek. Dodać każdą próbkę do probówki zawierającej biotynylowany kompleks peptydów E294-302 H2Db w odstępie 20 minut. Po załadowaniu ostatniej próbki, inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 4 °C przez noc w ciemności.
  8. Umieścić multimeryzowane odczynniki w probówce wirowej o masie 100 kDa i zagęścić przez odwirowanie w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C do objętości <100 μl.
  9. Rozcieńczyć próbkę w probówce wirowej do objętości 4 ml przy użyciu PBS (pH 8,0) i ponownie zagęścić do <100 μl.
  10. Powtórzyć etap wymiany buforu w PBS (pH 8,0) 4x.
  11. Ponownie uzupełnić całkowitą objętość do 500 μl za pomocą PBS (pH 8,0). Zagęścić próbkę do szacowanego stężenia 2–2,5 mg/ml w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C. Przechowywać próbkę w ciemności w temperaturze 4 °C.

6. Cytometria przepływowa

  1. Zawiesiny komórkowe inkubować (od etapu 3.9 i/lub kroku 4.15) w temperaturze 4 °C z 0,1 μl odczynnika blokującego receptor Fc CD16/CD32 na 20 μl (współczynnik rozcieńczenia 1:200) przez 10 minut, aby zapobiec jakiemukolwiek niespecyficznemu wiązaniu.
  2. Odwirować probówkę tetramerową o stężeniu 20 000 x g przez co najmniej 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 20 μl zawiesiny komórkowej do 96-dołkowej płytki zawierającej 1 x 106 komórek każda.
  4. Przygotować wystarczającą ilość mieszanki tetramerów E294-302 do wybarwienia wszystkich probówek doświadczalnych. Przygotować nadmiar 15% całkowitej objętości tej mieszanki, aby uwzględnić błędy pipetowania. Rozcieńczyć tetramery E294-302 (2 mg/ml, 1 μl/badanie) w buforze FACS (PBS, 0,5% FBS) tak, aby do każdego badania dodać 20 μl mieszaniny tetramerów E294-302.
  5. Dodać 20 μl mieszaniny tetramerów E294-302 do płytki 96-dołkowej. Pod koniec tego etapu końcowa objętość w każdym studzience powinna wynosić 40 μl. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe (anty-CD3 sprzężone z FITC lub APC-sprzężone z APC), anty-CD8 sprzężone z PerCP (0,2 mg/ml)) w dawce 1 μl/test do zawiesiny komórek, a następnie inkubować ją w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
  7. Przemyć komórki 2x 2 ml buforu FACS i odwirować je przy 600 x g przez 5 minut. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl buforu FACS.
  8. Przechowywać próbki tymczasowo w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.
  9. Do analizy cytometrii przepływowej należy zastosować następującą strategię bramkowania.
    1. Utwórz bramkę na ukośnie zgrupowanych pojezielach, wykreślając obszar rozproszenia do przodu (FSC) w stosunku do obszaru rozrzutu bocznego (SSC).
    2. Następnie bramka na komórkach CD3+ przez rozproszenie boczne (SSC) w porównaniu z CD3; następnie bramka na komórkach CD3+ CD8+; na koniec obrysuj komórki tetrameru CD8++ 19.

7. Histopatologia, immunofluorescencja i test immunohistochemiczny

  1. Test histopatologiczny
    1. Zbierz tkanki mózgu i jąder zakażonych ZIKV myszy Ifnar1-/- 7 d po inokulacji i utrwal je w 4% neutralnie buforowanym formaldehydzie.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    2. Zanurz tkankę w parafinie.
    3. Przeciąć tkankę na głębokości 5 mm za pomocą wibratomu.
    4. Wybarwić tkankę hematoksyliną i eozyną (H&E).
  2. Test immunohistochemiczny
    1. Deparafinizacja, ponowne nawodnienie i antygen - pobranie skrawków tkanki, w oparciu o procedury opisane wcześniej21.
    2. Traktować skrawki tkanek 3%H2O2 w PBS (pH 7,6) przez 10 minut i blokować je 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 10 minut.
    3. Inkubować skrawki tkanek z przeciwciałem anty-mysim CD3 (rozcieńczenie: 1/1 000) przez 8 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Przepłukać tkanki PBS, a następnie inkubować je z 3 kroplami biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczenie: 1/1 000) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie 3 krople peroksydazy awidyno-biotyny (rozcieńczenie: 1/200) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    5. Zwiąż, z 3 kroplami 30, tetrachlorowodorek 30-diaminobenzydyny (rozcieńczenie: 1/1 000), jak opisano wcześniej22.
    6. Przeciwbarwić skrawki tkanek hematoksyliną Mayera.
  3. Test immunofluorescencyjny
    1. Zamrożone skrawki jądra (6 mm) suszyć na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przymocuj je lodowatym acetonem na 10 minut.
    3. Przemyć sekcje PBS przez 3x i zablokować je buforem blokującym (1% BSA, 0,3% Triton, 1x PBS) w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    4. Inkubować skrawki tkanki z przeciwciałem pierwszorzędowym (Z6) (20 μg/ml) w temperaturze 4 °C przez noc.
    5. Przepłukać tkanki PBS i zastosować przeciwciało drugorzędowe (współczynnik rozcieńczenia: 1/200) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    6. Przemyć skrawki tkanek PBS i wybarwić je przeciwpod kątem jąder za pomocą 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (współczynnik rozcieńczenia: 1/1 000), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

Kierując się tymi metodami, opracowaliśmy mysi model infekcji ZIKV. Myszy Ifnar1-/- w wieku 6–8 tygodni zainfekowano dawką 1 x 104 jednostek tworzących ogniska (FFU) ZIKV poprzez wstrzyknięcie okołopodbyrkowe. Po zakażeniu ZIKV u myszy Ifnar1-/- zaobserwowano objawy i oznaki patologiczne (Rycina 1A), a także zmiany masy ciała (Rycina 1B). W mózgach myszy stwierdzono wyraźny obrzęk i przekrwienie (Rycina 1C). Jednocześnie jądra stopniowo uległy zmniejszeniu (Rycina 1D). Ponadto w mózgu i jądrach stwierdzono zmiany patologiczne oraz destrukcję tkanek (Rycina 2A). Przeprowadzono badanie immunofluorescencyjne w celu wykrycia ZIKV w mózgu i jądrach (Rycina 2B). Za pomocą barwienia immunologicznego w mózgu i jadrach wykryto wysoką wiremię (Rycina 2B). Immunohistochemia wykazała silną infiltrację limfocytów T CD3+ do mózgu myszy po zakażeniu ZIKV (Rycina 2C).

Aby wykryć i ocenić odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla ZIKV, przygotowano tetramer MHC-I H-2Db-E294-302 mysi. Peptyd E294-302 wspomaga prawidłową renaturację H-2Db, co pozwala na uzyskanie wysokiej ilości rozpuszczalnego MHC-I (Rysunek 3A). W teście przesunięcia zaobserwowano wysoką wydajność biotynylacji (Rysunek 3B). Następnie, w celu wykrycia limfocytów T specyficznych dla ZIKV, wytworzono trzy tetramery pMHC-I znakowane fluorescencyjną streptawidyną (APC, PE oraz BV421) (Rysunek 3C). Tetramer znakowany PE wykazał wyższą skuteczność w wykrywaniu specyficznych limfocytów T CD8+ w porównaniu do tetramerów znakowanych APC i BV421, choć różnica ta nie była istotna statystycznie.

Wykorzystując tetramer E294-302, wykryliśmy za pomocą cytometrii przepływowej limfocyty T specyficzne dla ZIKV w śledzionach zakażonych myszy w 7. dniu po inokulacji ZIKV (3,49 ± 0,45%). Ponadto, analogicznie do metody opisanej w sekcji 3 niniejszego protokołu, w 4. tygodniu po immunizacji szczepionką AdC7-M/E, w śledzionie wykryto limfocyty T specyficzne dla ZIKV (6,89 ± 1,36%) (Rysunek 4).

Ponadto wykryliśmy limfocyty infiltrujące organy immunuprzywilejowane, takie jak mózg i jądra, po infekcji ZIKV. Bramki ustawiono tak, aby wyselekcjonować komórki T CD3+CD8+ w całkowitej populacji limfocytów mózgu i jąder. Wysoki stosunek limfocytów T specyficznych dla tetrameru E294-302 można było wykryć w mózgu (42,2% w komórkach T CD3+CD8+) oraz w limfocytach jąder (26,4% w komórkach T CD3+CD8+) (Rysunek 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Charakterystyka infekcji ZIKV u myszy Ifnar1-/-). Myszy Ifnar1-/- w wieku od 6 do 8 tygodni zainfekowano 104 jednostkami tworzącymi ogniska (FFU) wirusa ZIKV poprzez wstrzyknięcie drogą retroorbitalną; jako niezinfekowane kontrolę wykorzystano myszy wstrzyknięte PBS. Monitorowano (A) morfologię oraz (B) zmiany masy ciała zainfekowanych myszy Ifnar1-/-. Czerwone strzałki wskazują myszy Ifnar1-/-, u których po infekcji wystąpiła mieloparaliż oraz niedowład kończyn dolnych. (C) Pobrano mózgi w 7. dniu po inokulacji oraz (D) jądra w 0, 7, 14 i 30. dniu po inokulacji. Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia mózgów i jąder myszy z linijką wskazującą ich rozmiary. Słupki błędów reprezentują średnią ± SEM. n = 10 myszy na grupę w każdym eksperymencie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Detekcja ZIKV i limfocytów w mózgu i jądrach myszy Ifnar1-/- zakażonych ZIKV. (A) Ten panel przedstawia zmiany histopatologiczne w mózgu i jądrach myszy zakażonych ZIKV w porównaniu z kontrolami negatywnymi 7 dni po inokulacji. Pasek skali = 25 µm (lewy panel) i 50 µm (prawy panel). (B) Przeprowadzono test immunofluorescencyjny z użyciem przeciwciała anty-ZIKV Z6 (kolor zielony). Wszystkie próbki tkanek pobrano od myszy zakażonych ZIKV 7 dni po inokulacji. Jądra komórkowe barwiono DAPI (kolor niebieski). Pasek skali = 50 µm. (C) Immunohistochemia wykazuje intensywną infiltrację komórek T CD3+ do mózgu i jąder. Pasek skali = 25 µm (lewy panel) i 50 µm (prawy panel). Kolor fioletowy oznacza hematoksylinę, kolor brązowy reprezentuje przeciwciało CD3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Przygotowanie tetramerów pMHC-I specyficznych dla ZIKV. (A) Wiązanie E294-302 z H-2Db wyjaśniono za pomocą refoldingu in vitro. Kolor niebieski oznacza białko H-2Db-E294-302. Kolor pomarańczowy reprezentuje kontrolę negatywną bez peptydu. (B) Ten panel przedstawia test przesunięcia H-2Db-E294-302. (C) Mock reprezentuje kontrolę PBS. Do wykrywania limfocytów T specyficznych dla ZIKV użyto trzech tetramerów pMHC-I znakowanych fluorescencyjnie streptawidyną (APC, PE i BV421). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Analiza cytometryczna wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ w śledzionach myszy zakażonych ZIKV oraz myszy immunizowanych szczepionką. Myszy Ifnar1-/- w wieku 6-8 tygodni zostały zakażone 104 jednostkami tworzącymi ogniska (FFU) ZIKV lub otrzymały jednorazową dawkę 4 x 1010 cząsteczek wirusowych AdC7-M/E lub PBS jako kontrolę negatywną. Po 7 dniach od zakażenia lub 4 tygodniach od szczepienia pobrano splenocyty myszy i przeanalizowano je za pomocą cytometrii przepływowej. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (brak istotności: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Strategia bramkowania i reprezentatywne wyniki dla wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ w mózgu i jądrach myszy zakażonych ZIKV. Reprezentatywne wykresy przedstawiono dla limfocytów naciekających w (A) mózgu i (B) jądrach. Zastosowano sekwencję bram w celu wyselekcjonowania zdarzeń lymphoid-scatter+ oraz CD3+. Z tej grupy wyselekcjonowano zdarzenia CD8+ do analizy epitopowo-specyficznych limfocytów T. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Immunogenny epitop limfocytów T odgrywa znaczącą rolę w odporności komórkowej przeciwko patogenom23. W związku z tym wykrywanie limfocytów T specyficznych dla ZIKV w narządach z uprawnieniami immunologicznymi jest kluczową metodologią zrozumienia odpowiedzi limfocytów T na naturalne zakażenie ZIKV. Tymczasem wykrywanie odpowiedzi limfocytów T jest doskonałym narzędziem do badania skuteczności szczepionki wirusowej. Tutaj pokazujemy kompleksowy protokół wizualizacji eksperymentów, który obejmuje izolację limfocytów ze śledziony, mózgu i jąder myszy zakażonych ZIKV, przygotowanie immunodominującego tetrameru epitopu E294-302 oraz rozpoznanie specyficznych dla ZIKV limfocytów T CD8 + w narządach z uprawnieniami immunologicznymi myszy zakażonych ZIKV.

Poprzednie badanie wykazało, że żywy ZIKV lub jego RNA można wykryć w nasieniu pacjentów płci męskiej, co wskazuje, że ZIKV może ominąć barierę krew-jądro i replikować się w układzie rozrodczym24. Wcześniej wykazaliśmy również, że ZIKV może powodować uszkodzenie jąder i prowadzić do niepłodności męskiej u myszy25. Zakażenie ZIKV może prowadzić do wiremii u małp rezusów, a wirusowe RNA można wykryć w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), a także w narządach trzewnych. Immunohistochemia wykazała, że antygeny specyficzne dla ZIKV były obecne w OUN i wielu narządach obwodowych26. Również w modelach mysich zakażenie ZIKV może indukować silną przeciwwirusową odpowiedź limfocytów T CD8 + w śledzionie i OUN26.

W porównaniu z poprzednimi pracami, badanie to ustanawia systematyczne metody wykrywania odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla ZIKV w mózgu i jądrach, które są miejscami immunouprzywilejowanymi. Ważne jest, aby ocenić funkcjonalność limfocytów T specyficznych dla wirusa w narządach z upośledzoną odpornością myszy zakażonych ZIKV. Zastosowanie tetramerów do wykrywania specyficznych dla ZIKV odpowiedzi limfocytów T CD8 + w narządach z upośledzoną odpornością znacznie poszerzyłoby naszą wiedzę na temat zakażeń ZIKV i ich odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Za pomocą tetrameru E294-302 można wyizolować specyficzne dla wirusa limfocyty T w mózgu i jądrach za pomocą cytometrii przepływowej w celu zbadania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy podczas infekcji ZIKV. Tymczasem pomocne jest dla naukowców dalsze badanie funkcji limfocytów T CD8 + w celu kontrolowania ZIKV lub wzmacniania immunopatogenezy w tych narządach podczas infekcji ZIKV.

Aby przeanalizować specyficzne dla antygenu odpowiedzi mysich limfocytów T CD8 + w narządach z uprawnieniami immunologicznymi, przygotowaliśmy tetramer H-2Db-E 294-302 i wykryliśmy limfocyty T CD8 + za pomocą cytometrii przepływowej. Tetramery są potężnym narzędziem do wykrywania limfocytów T specyficznych dla antygenu. W tym przypadku wygenerowano trzy typy streptawidyny sprzężonej z fluorochromem (APC, PE i BV421). Chociaż nie ma statystycznie istotnych różnic w tetramerach znakowanych APC, BV421 i PE do wykrywania limfocytów T specyficznych dla antygenu, tetramery pMHC-I znakowane PE dały najlepsze wyniki. W związku z tym w całym tym badaniu zastosowano tetramer znakowany PE. Co ciekawe, w oparciu o tetramer H-2Db-E 294-302 znakowany PE, wykryliśmy wysokie proporcje limfocytów T specyficznych dla antygenu zarówno w mózgu, jak i jądrach, co wskazuje na zdolność migracji limfocytów T specyficznych dla wirusa z krwi do narządów o podwyższonej odporności.

Istnieją jednak pewne ograniczenia dotyczące protokołu. Tetramer H-2Db-E 294-302 nie jest przydatny do wykrywania ludzkich komórek T, ponieważ wykrywanie tetramerów zależy od ograniczenia MHC. Nadal potrzebne są badania przesiewowe w kierunku immunodominujących peptydów o ograniczonym poziomie HLA. Poza tym infekcja zaoczodołowa jest skuteczna w przypadku infekcji ZIKV, ale może nie być wygodną operacją dla niektórych badaczy. Dlatego zalecane są również inne drogi infekcji, w tym otrzewnowa, podskórna lub dożylna.

W opisanym tutaj protokole krytycznym krokiem jest izolacja monocytów z mózgu i jąder. Ważne jest, aby pozyskać wysokiej jakości limfocyty; Dlatego ważne jest, aby zwrócić uwagę na przykład na prędkość odśrodkową, wytrzymałość tkanki mielącej oraz rozwarstwienie tkanki mózgu i jąder. Poza tym w przygotowaniu tetrameru pomocne są inhibitory proteazy (PMSF, pepstatyna, leupeptyna) w ochronie białka przed degradacją. Dlatego sensowne jest dodanie inhibitora proteazy do buforu fałdującego i wymiana buforu podczas procesu przygotowania tetrameru.

Podsumowując, przedstawiono metody wykrywania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych modelu myszy Ifnar1-/- dla zakażenia ZIKV. Platforma ta może być szeroko stosowana do badania mechanizmów immunologicznych pojawiających się i ponownie pojawiających się wirusów, które mogą omijać bariery między krwią a narządami o podwyższonej odporności. Co więcej, badanie to może utorować drogę do przyszłego rozwoju potencjalnych szczepionek i immunoterapii.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Podziękowania

Autorzy dziękują Gary'emu Wongowi za korektę w języku angielskim. Prace te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (grant 2017YFC1200202), Major Special Projects for Infectious Disease Research of China (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao jest głównym badaczem Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chińskiej Grupy Badawczej (grant 81621091).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Z6nasze laboratoriumMa W, Li S, Ma S, et al. Wirus Zika powoduje uszkodzenie jąder i prowadzi do niepłodności męskiej u myszy. Komórka, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3Santa Cruzsc-1127; RRID: AB_631128
Sprzężone z fluoresceiną Affinipure Goat anty-ludzkie IgG(H+L)ZSGB-BIOZF-0308
IgG przeciw kozom króliczym, FITC SprzężoneCWBIOCW0115
FITC anty-mysie CD3Biolegend17A2
APC anty-mysie CD3Biolegend100236
PerCP anty-mysie CD8aBiolegend100732
PercollGE HealthcareP8370
PMSFAmeresco0754-5GOdczynnik toksyczny i.
Zachowaj ostrożność
StreptadivinBDS4762-FZDaje klarowny roztwór w dawce 10mg/ml w PBS i  przechowywany w temperaturze -20 & C
PepstatinSigmaP4265-5MG5 mg w 2,5 ml DMSO, podwielokrotności przechowywane w temperaturze -20 º C
LeupeptinSigmaL85115 mg w 2,5 ml dH2O, podwielokrotności przechowywane w temperaturze -20 º
C PeptidesScilight-peptideMusi być ponownie zawieszony w DMSO i przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
Hydragon RPMI 1640SH30809.01Musi być przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
DMSOMPPrzechowywać w temperaturze pokojowej.
APC-StreptadivinBD554067Musi być przechowywany i utrzymywany w temperaturze
4 & st. C. Nie zamrażać.
FITC-StreptadivinBD554060Musi być przechowywany i konserwowany w temperaturze
4 & deg;C. Nie zamrażać.
PE-StreptadivinBD554061Musi być przechowywany i utrzymywany w temperaturze
4 & st. C. Nie zamrażać.
BV421-StreptadivinBD563259Musi być przechowywany i konserwowany w temperaturze
4 & st. C. Nie zamrażać.
PageRuler Niebarwiona drabinka białkowaThermo Fisher Scientific 26614Musi być przechowywany w temperaturze 4 & deg; C
Sitka do komórekBFBF10-5040Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Amicon Ultra 100 kDaMilliporeUFC510024Przechowywać w temperaturze pokojowej.
UltrawirówkaThermo Fisher Scientific 
FACS Cantolmusi zawierać lasery i filtry, które są kompatybilne z zastosowanym panelem barwienia.
Superdex 200 Wzrost 10/300 GL GE healthcare28990944
AKTA PUREGE medyczny
bufor do lizy czerwonych krwinekSolarbioR1010Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
219605590 Cytometr przepływowy

Bibliografia

  1. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
  4. Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
  5. Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
  6. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204(2016).
  7. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
  8. Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  9. Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
  10. Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
  11. Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
  12. Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
  13. Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
  14. Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257(2014).
  15. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420(2012).
  16. Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256(2015).
  17. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658(2016).
  18. Altman, J. ohnD., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  19. Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
  20. Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
  21. Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
  22. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293(2015).
  23. Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
  24. Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
  25. Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
  26. Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Barwienie tetrameramicytometria przepływowamózgjądraśledzionazakażenie wirusoweimmunizacja szczepionkowalimfocyty T swoiste dla antygenu
Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.