Method Article

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

DOI:

10.3791/58116

⸱

October 4th, 2018

 ,  , 
1Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, 2Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staje się coraz bardziej jasne, że astrocyty modulują funkcje neuronów nie tylko na poziomie synaptycznym i pojedynczych komórek, ale także na poziomie sieci. Astrocyty są silnie połączone ze sobą za pomocą połączeń szczelinowych, a sprzężenie przez te połączenia jest dynamiczne i wysoce regulowane. Wyłaniającą się koncepcję jest to, że funkcje astrocytarne są wyspecjalizowane i przystosowane do funkcji obwodu neuronalnego, z którym są związane. W związku z tym potrzebne są metody pomiaru różnych parametrów sieci astrocytowych, aby lepiej opisać zasady rządzące ich komunikacją i sprzężeniem oraz lepiej zrozumieć ich funkcje.

Tutaj, korzystając z oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJFIJI), opisujemy metodę analizy obrazów konfokalnych sieci astrocytowych ujawnionych przez sprzężenie barwnikowe. Metody te pozwalają na: 1) zautomatyzowane i bezstronne wykrywanie znakowanych komórek, 2) obliczanie wielkości sieci, 3) obliczanie preferencyjnej orientacji rozprzestrzeniania się barwnika w sieci oraz 4) repozycjonowanie sieci w obszarze zainteresowania.

Ta analiza może być wykorzystana do scharakteryzowania sieci astrocytowych określonego obszaru, porównania sieci różnych obszarów związanych z różnymi funkcjami, lub porównania sieci uzyskanych w różnych warunkach, które mają różny wpływ na sprzężenie. Obserwacje te mogą prowadzić do ważnych rozważań funkcjonalnych. Na przykład, analizujemy sieci astrocytarne jądra trójdzielnego, gdzie wcześniej wykazaliśmy, że sprzężenie astrocytów jest niezbędne dla zdolności neuronów do przełączania swoich wzorców odpalania z tonicznego na rytmiczne bursting1. Mierząc wielkość, ograniczenie i preferencyjną orientację sieci astrocytarnych w tym jądrze, możemy budować hipotezy na temat domen funkcjonalnych, które one opisują. Kilka badań sugeruje, że kilka innych obszarów mózgu, w tym kora beczkowata, boczna górna oliwka, kłębuszki węchowe i jądra czuciowe we wzgórzu i korze wzrokowej, by wymienić tylko kilka, może skorzystać z podobnej analizy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele badań opisało, jak dialog neuron-astrocyt na poziomie subkomórkowym lub synaptycznym może mieć wpływ na funkcje neuronalne i transmisję synaptyczną. Powszechnie wiadomo, że astrocyty są wrażliwe na otaczającą aktywność neuronalną; w rzeczywistości mają receptory dla wielu neuroprzekaźników, w tym glutaminianu, GABA, acetylocholiny i ATP (zobacz wcześniej opublikowane recenzje2,3,4). W zamian procesy astrocytowe obejmują elementy synaptyczne i wpływają na aktywność neuronów zarówno tam, jak i w miejscach pozasynaptycznych, regulując zewnątrzkomórkową homeostazę jonową i ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury są zgodne z zasadami Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Montrealu.

1. Przygotowanie plastrów mózgu szczura

  1. Przygotować 1 l roztworu na bazie sacharozy (Tabela 1) i 1 l standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (Tabela 2).
  2. Roztwór na bazie sacharozy z mieszaniną 95%O2 i 5% CO2 (karbogenu) należy rozpylać przez 30 minut, a następnie umieścić w temperaturze -80 °C na około 30 minut, aż roztwór będzie zimny, ale nie całkowicie zamrożony. Uż....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sprzężenie między komórkami w mózgu nie jest statyczne, ale raczej dynamicznie regulowane przez wiele czynników. Opisane metody zostały opracowane w celu analizy sieci astrocytarnych ujawnionych w różnych warunkach i zrozumienia ich organizacji w NVsnpr. Te wyniki zostały już opublikowane1. Przeprowadziliśmy wypełnianie biocytyną pojedynczych astrocytów w grzbietowej części NVsnpr w trzech różnych warunkach: w spoczynku (w warunkach kontrolnych przy braku jakiejkol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele metod elektrofizjologicznych do oceny funkcjonalnego sprzężenia między astrocytami23,24. Metody te nie dostarczają jednak informacji o anatomicznym układzie sieci astrocytowych. Szereg badań wykazało już, że "sprzężenie barwnikowe lub znacznikowe", jak to ma miejsce tutaj, występuje tylko we frakcji sprzężonych komórek, które są wykrywane metodami elektrofizjologicznymi 25,26,27, co sugeruje, że liczba komórek wykrytych tą metodą jest niedoszacowan.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest finansowana przez Canadian Institutes of Health Research, numer grantu/nagrody: 14392.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NaClFisher ChemicalsS671-3
KClFisher ChemicalsP217-500
KH2PO4Fisher ChemicalsP285-500
MgSO4Fisher ChemicalsM65-500
NaHCO3Fisher ChemicalsS233-500
C6H12O6 Dekstroza bezwodnaFisher ChemicalsD16-500
CaCl2 dwuwodnistySigmaC70-500
SacharozaSigmaS9378
Sól potasowa kwasu D-glukonowegoSigmaG45001
MgCl2 bezwodnySigmaM8266
HEPESSigmaH3375
EGTASigmaE4378
ATPTris SaltSigmaA9062
GTPTris SaltSigmaG9002
BiocytinSigmaB4261
Karbenosolon sól disodowaSigmaC4790
kompleks awidyny-biotyny: zestaw ABCLaboratoria VestorPK-4000
Streptavidine-alexa 594Sondy molekularneS11227
TritonFisher ChemicalsBP151-500
KsylenFisher ChemicalsX5-1
Wodne medium montażowe 1 : Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
Medium montażowe z żywicy syntetycznej na bazie toluenu: PermountFisher ChemicalsSP15-100
Ławka do suszenia szkiełekFisherbrand11-474-470
VibratomeLeicaVT 1000S
Szkło osłonowe mikroskopuFisherbrand12-544A Szkiełko
mikroskopowe ColorFrostFisherbrand12-550-413
PFAFisherchemicals04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Mikroskop konfokalnyOlympus
40X Soczewka zanurzeniowaOlympusLUMPLFLN40XW
20X Soczewka zanurzeniowaOlympusXLUMPLFL20XW
4XMikropipeta OlympusXLFLUOR4X/340
ściągaczSutter InstrumentP97
MikromanipulatorSutter InstrumentMP 225
Kamera CCDSonyCX-ST50
Czarno-biały monitorSonySSM-125
DigidataUrządzenia molekularne1322A Wzmacniacz zaciskowy
AxoninstrumentMulitclamp 700A
Oprogramowanie do akwizycji elektrofizjologiiUrządzenia molekularnepClamp 8
Oprogramowanie do analizy elektrofizjologicznejUrządzenia molekularneClampfit 8
Oprogramowanie do analizy obrazowaniaImageJFIJIOprogramowanie open source. Wersja FIJI wraz z pakietem wtykowym.
Edytor obrazów wektorowychAdobeIllustrator CS4
Aplikacja arkusza kalkulacyjnegoMicrosoft OfficeExcel 2010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
  2. Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and sign....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Astrocyte Network AnalysisImageJ FIJIConfocal Image AnalysisDye Coupling DetectionNetwork Size CalculationPreferential Orientation MeasurementCell Detection AutomationROI Tracing MethodVector Normalization TechniqueTrigeminal Nucleus Study

Related Articles