Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58116

⸱

4 października 2018

 ,  , 
1Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, 2Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Streszczenie

Staje się coraz bardziej jasne, że astrocyty modulują funkcje neuronów nie tylko na poziomie synaptycznym i pojedynczych komórek, ale także na poziomie sieci. Astrocyty są silnie połączone ze sobą za pomocą połączeń szczelinowych, a sprzężenie przez te połączenia jest dynamiczne i wysoce regulowane. Wyłaniającą się koncepcję jest to, że funkcje astrocytarne są wyspecjalizowane i przystosowane do funkcji obwodu neuronalnego, z którym są związane. W związku z tym potrzebne są metody pomiaru różnych parametrów sieci astrocytowych, aby lepiej opisać zasady rządzące ich komunikacją i sprzężeniem oraz lepiej zrozumieć ich funkcje.

Tutaj, korzystając z oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJFIJI), opisujemy metodę analizy obrazów konfokalnych sieci astrocytowych ujawnionych przez sprzężenie barwnikowe. Metody te pozwalają na: 1) zautomatyzowane i bezstronne wykrywanie znakowanych komórek, 2) obliczanie wielkości sieci, 3) obliczanie preferencyjnej orientacji rozprzestrzeniania się barwnika w sieci oraz 4) repozycjonowanie sieci w obszarze zainteresowania.

Ta analiza może być wykorzystana do scharakteryzowania sieci astrocytowych określonego obszaru, porównania sieci różnych obszarów związanych z różnymi funkcjami, lub porównania sieci uzyskanych w różnych warunkach, które mają różny wpływ na sprzężenie. Obserwacje te mogą prowadzić do ważnych rozważań funkcjonalnych. Na przykład, analizujemy sieci astrocytarne jądra trójdzielnego, gdzie wcześniej wykazaliśmy, że sprzężenie astrocytów jest niezbędne dla zdolności neuronów do przełączania swoich wzorców odpalania z tonicznego na rytmiczne bursting1. Mierząc wielkość, ograniczenie i preferencyjną orientację sieci astrocytarnych w tym jądrze, możemy budować hipotezy na temat domen funkcjonalnych, które one opisują. Kilka badań sugeruje, że kilka innych obszarów mózgu, w tym kora beczkowata, boczna górna oliwka, kłębuszki węchowe i jądra czuciowe we wzgórzu i korze wzrokowej, by wymienić tylko kilka, może skorzystać z podobnej analizy.

Wprowadzenie

Wiele badań opisało, jak dialog neuron-astrocyt na poziomie subkomórkowym lub synaptycznym może mieć wpływ na funkcje neuronalne i transmisję synaptyczną. Powszechnie wiadomo, że astrocyty są wrażliwe na otaczającą aktywność neuronalną; w rzeczywistości mają receptory dla wielu neuroprzekaźników, w tym glutaminianu, GABA, acetylocholiny i ATP (zobacz wcześniej opublikowane recenzje2,3,4). W zamian procesy astrocytowe obejmują elementy synaptyczne i wpływają na aktywność neuronów zarówno tam, jak i w miejscach pozasynaptycznych, regulując zewnątrzkomórkową homeostazę jonową i uwalniając kilka czynników lub przekaźników, takich jak glutaminian, D-seryna i ATP5,6,7.

Pojawił się pomysł, że astrocyty mogą również modulować funkcje neuronów na poziomie sieci, z dowodami, że sprzężenie astrocytów jest regulowane przestrzennie i odpowiada segmentacji neuronów w obszarach charakteryzujących się wyraźnym anatomicznym podziałem (jak obszary z reprezentacjami sensorycznymi), co wskazuje, że astrocyty będą łączyć się z innymi astrocytami pełniącymi tę samą funkcję, a nie tylko z tymi, które są blisko. Na przykład w bocznej górnej oliwce większość sieci astrocytowych jest zorientowana prostopadle do osi tonotopowej8, podczas gdy w korze beczkowatej lub kłębuszkach olfactoty komunikacja między astrocytami jest znacznie silniejsza w beczkach lub kłębuszkach nerkowych i słabsza między sąsiednimi9,10. W obu przypadkach sieci astrocytarne są zorientowane w kierunku środka glomerrule lub barrel9,10.

Niedawno wykazaliśmy, że aktywność astrocytów moduluje odpalanie neuronów poprzez zmniejszenie stężenia zewnątrzkomórkowego Ca2+ ([Ca2+]e), przypuszczalnie poprzez uwalnianie S100β, białka wiążącego Ca2+11. Efekt ten, który wykazano w populacji neuronów rytmicznych trójdzielnych w grzbietowej części głównego jądra czuciowego nerwu trójdzielnego (NVsnpr, uważanego za odgrywający ważną rolę w generowaniu ruchów żucia), wynika z faktu, że rytmiczne odpalanie w tych neuronach zależy od stałego prądu Na+, który jest promowany przez spadki [Ca2+]e11, 12. Rytmiczne odpalanie w tych neuronach może być wywołane "fizjologicznie" przez stymulację ich danych wejściowych lub sztuczne zmniejszenie [Ca2+]e. Wykazaliśmy ponadto, że sprzężenie astrocytarne jest wymagane do rytmicznego odpalania neuronów1. To podniosło możliwość, że sieci astrocytarne mogą tworzyć ograniczone domeny funkcjonalne, w których aktywność neuronalna może być zsynchronizowana i skoordynowana. Aby ocenić tę hipotezę, musieliśmy najpierw opracować metodę rygorystycznego dokumentowania organizacji tych sieci w ramach NVsnpr.

Poprzednie badania nad sieciami astrocytarnymi opisywały głównie zakres sprzężenia pod względem liczby komórek oraz gęstości i obszaru, który obejmował. Próby oceny kształtu sieci astrocytarnych i kierunku sprzężenia barwników przeprowadzono głównie poprzez porównanie wielkości sieci wzdłuż dwóch osi (x i y) w korze beczkowatej 9, hippocampus13,14,15, barykowate pola wzgórza16, lateral superior olive8, glomeruli10, oraz cortex14. Opisane tutaj metody umożliwiają bezstronne zliczanie oznakowanych komórek w sieci i oszacowanie obszaru, który obejmują. Opracowaliśmy również narzędzia do definiowania preferowanej orientacji sprzężenia w sieci oraz do oceny, czy preferowana orientacja jest skierowana do środka jądra, czy w innym kierunku. W porównaniu z poprzednio stosowanymi metodami, protokół ten zapewnia środki do opisania organizacji i orientacji sieci astrocytarnych w strukturach takich jak grzbietowe trójdzielne główne jądro czuciowe, które nie mają znanego wyraźnego anatomicznego podziału na przedziały. W powyższych badaniach orientacja sieci jest opisana jako związek z kształtem samej struktury, który jest już udokumentowany (np. beczkowata we wzgórzu, beczki w korze, warstwy w hipokampie i korze, kłębuszki w opuszce węchowej itp.). Ponadto analiza wektorowa pozwala na porównanie orientacji sprzężeń ujawnionych w różnych warunkach. Aby przeanalizować, czy parametry te zmieniają się w zależności od położenia sieci w jądrze, opracowaliśmy również metodę wymiany każdej sieci w odniesieniu do granic jądra. Narzędzia te można łatwo zaadaptować do innych obszarów badania sieci sprzężonych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury były zgodne z zasadami Canadian Institutes of Health Research i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Montrealu.

1. Przygotowanie skrawków mózgu szczura

  1. Przygotować 1 L roztworu na bazie sacharozy (Tabela 1) oraz 1 L standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (Tabela 2).
  2. Napowietrzać roztwór na bazie sacharozy mieszanką 95% O2 i 5% CO2 (karbogenem) przez 30 min, a następnie umieścić go w temperaturze -80 °C na około 30 min, aż roztwór zostanie schłodzony, ale nie zamarznie całkowicie. Tę lodowatą sacharozę należy wykorzystać jako bufor do cięcia podczas przygotowywania skrawków mózgu. Po wyjęciu z zamrażarki przechowywać ją w lodzie.
  3. Napowietrzać aCSF karbogenem przez cały czas trwania eksperymentu. Roztwór ten należy wykorzystać do przechowywania skrawków oraz jako bufor perfuzyjny do rejestracji patch-clamp i wypełniania astrocytów biocytyną. Przygotować komorę regeneracyjną do odkładania skrawków mózgu niezwłocznie po ich wycięciu.
    Uwaga: Komora regeneracyjna może być wykonana na zamówienie i składa się zasadniczo z jednej małej studzienki z siatką na dnie, zawieszonej w większej studzience wypełnionej aCSF, do której włożona jest rurka doprowadzająca karbogen z dołu.
  4. Wykorzystać szczury rasy Sprague-Dawley w wieku od 15 do 21 dni, bez względu na płeć lub specyfikę linii. Znieczulić zwierzę izofluranem (1 mL izofluranu w komorze indukcyjnej do znieczulania). Sprawdzić głębokość znieczulenia, delikatnie uszczypiając tylną łapę lub ogon zwierzęcia.
  5. Zgłowić szczura za pomocą gilotyny, przeciąć czaszkę nożyczkami i szybko wyjąć mózg z czaszki za pomocą płaskiej szpatułki.
  6. Zanurzyć mózg w lodowatym roztworze na bazie sacharozy na około 30 s i przenieść go (wraz z roztworem) do szalki Petriego. Jeśli skrawki mają być wycinane w płaszczyźnie poprzecznej, usunąć żyletką części położone przednio i tylnie względem obszaru do sekcjonowania.
  7. Przykleić pozostały blok tkanki mózgowej od strony rostralnej i przystąpić do wycinania skrawków mózgu (o grubości 350 µm) w medium na bazie sacharozy przy użyciu wibratomu. Następnie przenieść zebrane skrawki do komory regeneracyjnej wypełnionej nasyconym karbogenem aCSF w temperaturze pokojowej (RT) do momentu ich użycia (pozostawić co najmniej 1 godzinę na regenerację).
    Uwaga: Ostatnie osiągnięcia w tej dziedzinie pozwalają na przedłużoną inkubację skrawków mózgu w warunkach in vitro do 24 h17.

2. Znakowanie astrocytów sulforodaminą 101 (SR-101)

  1. Podgrzać kąpiel wodną do 34 °C i umieścić w niej dwie komory inkubacyjne do skrawków. Jedną z komór inkubacyjnych napełnić roztworem aCSF zawierającym 1 μM SR-101, a drugą wypełnić samym aCSF.
  2. Inkubować skrawki w komorze zawierającej 1 µM SR-101 przez 20 min, a następnie przenieść je do drugiej komory inkubacyjnej, aby wypłukać nadmiar SR-101 z tkanki. Inkubować przez 20 min lub dłużej w temperaturze 34 °C, a następnie przechowywać komorę inkubacyjną ze skrawkami w RT do momentu ich wykorzystania18.

3. Patch-clamp astrocytów i wypełnianie biocytyną

  1. Wybierz przekrój i umieść go w komorze rejestracyjnej mikroskopu. Do patch-clampowania astrocytów użyj elektrod o oporności 4-6MΩ wypełnionych roztworem na bazie glukonianu potasu (patrz Tabela 3).
  2. Pod kontrolą wizualną i przy użyciu mikromanipulatora skieruj elektrodę rejestrującą w stronę astrocytu znakowanego SR-101, jak pokazano na Ryc. 1. Unikaj komórek znajdujących się na powierzchni przekroju, ponieważ są one bardziej podatne na uszkodzenia lub mogły utracić połączenia z sąsiednimi komórkami.
  3. Aby zapobiec wyciekowi biocytyny do tkanki, zminimalizuj dodatnie ciśnienie przykładane do pipety patch i stosuj je tylko wtedy, gdy znajduje się ona blisko astrocytu, który ma zostać poddany rejestracji (0,1-0,4 mL w strzykawce 1 mL).
  4. Przed rozpoczęciem patchowania dostrój offset pipety oraz jej pojemność. Skoryguj potencjały złącza cieczowego, ponieważ dokładne i precyzyjne polecenia napięcia są kluczowe dla eksperymentów19.
  5. Przesuń pipetę wystarczająco blisko astrocytu, aby zaobserwować ugięcie spowodowane dodatnim ciśnieniem. Następnie usuń dodatnie ciśnienie i powoli przyłóż niewielkie ciśnienie ujemne. Ustaw clamp astrocytu na -70 mV, gdy oporność uszczelnienia osiągnie 100 MΩ. Czekaj, aż uszczelnienie osiągnie 1-3 GΩ. Kontynuuj przykładanie ciśnienia ujemnego aż do przebicia błony komórkowej. Zachowaj ostrożność podczas przykładania ciśnienia ujemnego, ponieważ astrocyty są bardzo delikatne.
  6. Oceń właściwości elektrofizjologiczne spatchowanej komórki. W trybie clamp napięciowy (voltage-clamp) przeprowadź protokół prądowo-napięciowy dla całej komórki (whole-cell) z rampą napięcia o czasie trwania 600 ms w zakresie od -120 do +110 mV. W trybie clamp prądowy (current-clamp) przeprowadź protokół step IV, w którym wstrzykiwane są skoki prądu o czasie 1000 ms i wartości 100 pA w zakresie od -1 do 1 nA; częstotliwość próbkowania rejestracji whole-cell wynosi 10 kHz.
    Uwaga: Astrocyty wykazują liniowy profil prądowo-napięciowy bez żadnego rodzaju prostowania (jak pokazano na Ryc. 1B) i nie generują potencjałów czynnościowych podczas depolaryzacji błony (Ryc. 1C). Spoczynkowy potencjał błonowy (RMP) powinien być stabilny i nie może być wyższy niż -60mV. W niektórych obszarach mózgu RMP astrocytów jest bardziej hiperpolaryzowany niż w NVsnpr.
  7. Pozostaw biocytynę do dyfuzji wewnątrz astrocytu przez 30 min, wykonując protokół step IV co 5 min.
  8. Ostrożnie wycofaj i odłącz pipetę patch, nie uszkadzając spatchowanego astrocytu, i natychmiast zanotuj offset pipety przed wyjęciem jej z komory rejestracyjnej. Odejmij tę wartość od rejestrowanych potencjałów błonowych.
  9. Pozostaw przekrój mózgu w komorze rejestracyjnej w celu odpoczynku przez minimum 15 min (dodatkowo do 30 min na iniekcję), aby umożliwić rozprzestrzenienie się znacznika ze spatchowanego astrocytu na całą sieć sprzężonych komórek.
    Uwaga: Aby ujawnić sieć sprzężonych komórek, w interesującym nas jądrze należy spatchować tylko jedną komórkę. Jeśli do pomyślnego patchowania wymagane są wielokrotne próby, odrzuć ten przypadek i spróbuj spatchować komórkę po stronie przeciwległej lub w innym przekroju mózgu.
  10. Zrób oznaczenie lub nacięcie w tkance, aby zidentyfikować, która strona przekroju jest skierowana do góry, a następnie przenieś przekrój najpierw do szalki Petriego zawierającej zwykły aCSF, a następnie do roztworu 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubuj przekrój w temperaturze 4 °C przez noc.
    OSTRZEŻENIE: PFA jest niezwykle szkodliwe. Używaj sprzętu ochronnego w wentylowanej komorze. Upewnij się, że wszystkie materiały (pędzle, probówki itp.), które miały kontakt z PFA, nie mają kontaktu z komorą holdingową, komorą inkubacyjną ani innymi materiałami używanymi do rejestracji świeżej tkanki.

4. Wykrywanie biocytyny

  1. Wizualizacja z użyciem fluorescencyjnej streptawidyny
    1. Przemyć skrawki mózgu 2 x 10 min w 0,1 M buforze fosforanowym z solą (PBS) w RT. Następnie uwidocznić biocytynę, inkubując skrawki mózgu ze streptawidyną sprzężoną z fluorophorem w rozcieńczeniu 1/200 w PBS z 4% niejonowym detergentem przez 4 h w RT.
    2. Przemyć skrawki mózgu 3 x 10 min w 0,1 M PBS w RT, a następnie zamontować preparaty na szkiełkach przedmiotowych, używając wodnego medium montażowego. Umieścić strony, w które wstrzykiwano substancje, stroną górną, przykryć szkiełka lamellkami i uszczelnić je lakierem do paznokci.
  2. Wizualizacja z użyciem DAB
    Uwaga: Wizualizacja DAB (3,3-diaminobenzydyną) może być stosowana, gdy nie można użyć fluorescencji. W takim przypadku do celów porównawczych należy zastosować tylko jedną metodę wizualizacji.
    1. Przemyć skrawki mózgu 3 x 10 min w PBS w RT. Inkubować skrawki w PBS + H2O2 0,5% przez 1 godzinę w RT.
    2. Przepłukać skrawki 3 x 10 min w PBS w RT. Następnie inkubować skrawki w roztworze barwiącym z kompleksem awidyna-biotyna, składającym się z PBS i 0,1% niejonowego detergentu + odczynników ze standardowego zestawu barwiącego z peroksydazą i kompleksem awidyna-biotyna w rozcieńczeniu 1/100 przez 24 godziny w RT.
    3. Przepłukać skrawki 3 x 10 min w PBS w RT, inkubować je w roztworze PBS + DAB 0,05% przez 20 min w RT, a następnie przenieść do roztworu PBS + DAB 0,05% + H2O2 0,5%.
      UWAGA: DAB jest substancją niezwykle szkodliwą. Należy używać sprzętu ochronnego w wentylowanej komorze wyciągowej. Reakcja barwna zostaje zatrzymana w momencie przeniesienia skrawków do PBS.
    4. Przepłukać skrawki 5 x 10 min w PBS w RT, zamontować preparaty na szkiełkach przedmiotowych (strony wstrzykiwane skierować do góry) i pozostawić do wyschnięcia na suszarce do szkiełek przez noc w 34 °C.
    5. Zanurzyć szkiełka przedmiotowe na 1 min w kilku kąpielach alkoholowych o stężeniach 70%, 95% i 100%, a na koniec w kąpieli ksylenu przez 1 min.
    6. Zamontować preparaty na szkiełkach przedmiotowych, używając syntetycznej żywicy montażowej na bazie toluenu. Nałożyć lamellki na szkiełka i uszczelnić je lakierem do paznokci.

5. Obrazowanie sieci

  1. Wizualizację sieci astrocytarnych należy przeprowadzić za pomocą skanującego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy 20X i 4X (lub inny odpowiedni obiektyw umożliwiający wizualizację całego jądra, w którym znajduje się sieć) oraz laser do detekcji fluoroforu (w tym przypadku zastosowano Alexa-594).
  2. Przy powiększeniu 20X należy wykonać stos obrazów (z-stack) sieci znakowanych komórek. Należy zastosować rozdzielczość 800 x 800 pikseli oraz prędkość skanowania 12.5 μs/pixel.
    Uwaga: W celu obrazowania całej sieci zazwyczaj wymagane jest wykonanie wielu stosów, a ich liczba powinna być dostosowana do każdej sieci. Rozdzielczość i prędkość skanowania mogą ulec zmianie, jednak należy upewnić się, że dla wszystkich danych zastosowano te same ustawienia.
  3. Przy powiększeniu 4X należy wykonać obrazy sieci oraz obszaru zainteresowania.
    Uwaga: Obrazowanie 4X służy do określenia położenia sieci w obrębie badanego jądra. Zawsze należy obrazować to samo pole w świetle przechodzącym. Obraz ten będzie pomocny w przypadku trudności z określeniem granicy jądra na konfokalnym obrazie fluorescencyjnym.

6. Analiza obrazów

  1. Przygotowanie danych
    1. Użyj oprogramowania ImageJFIJI (pobierz je ze strony https://fiji.sc/). Otwórz plik i kliknij OK w oknie „Bio-Formats Import Options”.
    2. Aby zredefiniować stos obrazów (z-stack), który będzie zawierał tylko przekroje optyczne niezbędne do końcowego stosu (Rycina 2A), kliknij przycisk „Stack” na pasku narzędzi (aby go znaleźć, wybierz najpierw stk | Z Project). W ustawieniach typu projekcji wybierz „Max Intensity” (Rycina 2A). Zapisz plik pod nazwą „stack file”.
    3. Jeśli plik obrazu zawiera kilka kanałów, rozdziel go, aby zachować tylko kanał z obrazowaniem sieci astrocytarnej (Image | Color | Split Channels).
    4. Sprawdź ustawienia pikseli obrazu [Image | Properties | Pixel (z wartością „1” dla wymiaru piksela)].
    5. Użyj narzędzia do odejmowania tła (Process | Subtract Background), aby usunąć tło znakowania biocytyną. Użyj funkcji podglądu, aby ustawić promień toczącej się kulki (rolling ball radius), który zazwyczaj wynosi 50 pikseli (Rycina 2B).
    6. Użyj narzędzia do usuwania wartości odstających (Process | Noise | Remove Outliers), jeśli jest to wymagane po etapie odejmowania tła. W ustawieniu „Which Outliers” wybierz „Bright” (Rycina 2C). Użyj funkcji podglądu, aby ustawić promień i próg. Zachowaj ostrożność przy używaniu tego narzędzia, ponieważ może ono rozmyć dane, co pokazano na Rycini 2D.
      Uwaga: Narzędzie to usuwa małe punkty spowodowane niespecyficznymi osadami streptawidyny (co pokazują białe strzałki na Rycini 2B i 2C odpowiednio przed i po zabiegu).
    7. Dostosuj próg (Image | Adjust | Threshold). Wybierz tryb „Default” i „B&W” (Rycina 2E). Kliknij „Apply”.
      Uwaga: Można użyć automatycznego dostrajania, ale zaleca się ręczne dostrajanie za pomocą dwóch suwaków. Celem tego kroku jest maksymalne ograniczenie szumów bez utraty żadnych znakowanych komórek.
    8. Przekształć obraz w obraz binarny za pomocą narzędzia do procesu binarnego (Process | Binary | Make Binary), jak pokazano na Rycini 2F. Zapisz plik jako plik TIFF pod nazwą „binary file”.
  2. Zliczanie komórek
    1. Sprawdź ustawienia funkcji pomiaru (Analyze | Set measurement). Wybierz opcję „Centroid”.
    2. Użyj narzędzia „Analyze Particles” na „binary file” (Rycina 3A) utworzonym w poprzednim kroku (Analyze | Analyze Particle) (Rycina 3C po lewej stronie). W ustawieniu „Show” wybierz „Outlines” (Rycina 3C). Tworzy to nowy plik pokazujący wynik detekcji (Rycina 3B).
    3. Dostosuj parametry: rozmiar (aby wykryć tylko komórki, użyj wartości od 30 do 6000) oraz kolistość (aby określić przedział od 0 do 1, gdzie „1” definiuje idealne koło, a „0” kształt przypadkowy), aby doprecyzować detekcję (Rycina 3C, lewa część). Uruchom detekcję, klikając „OK”.
      Uwaga: Po detekcji pojawią się dwie tabele: 1) tabela zatytułowana „Summary”, która podaje liczbę wykrytych komórek, oraz 2) tabela zatytułowana „Results” (Rycina 3C, prawa część), która podaje współrzędne x i y każdej komórki.
    4. Skopiuj wartości i wklej je do aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Zapisz tę tabelę pod nazwą „detection table”. Pojawi się również plik z wykresem wykrytych komórek (Rycina 3B). Zapisz ten plik jako plik TIFF pod nazwą „detection file”.
    5. Jeśli grupa 2 lub więcej znakowanych komórek w sieci zostanie wykryta jako jedna komórka za pomocą narzędzia analyze particles, ponieważ znajdują się zbyt blisko siebie, użyj narzędzia watershed (Process | Binary | Watershed) na obrazie binarnym przed zastosowaniem narzędzia analyze particles, a następnie powtórz kroki analizy cząstek.
      Uwaga: Narzędzie watershed tworzy rozgraniczenie o szerokości 1 piksela między ekstremalnie bliskimi komórkami. Można użyć wtyczki do zliczania komórek, gdy znakowanie jest jednoznaczne i może być przeprowadzone ręcznie.
  3. Pomiar powierzchni sieci astrocytarnej
    1. Aby zmierzyć powierzchnię sieci, użyj pliku detekcji w programie Image J.
    2. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów (kliknij lewym przyciskiem myszy przycisk na pasku narzędzi, aby go wybrać), aby nakreślić wielokąt łączący wszystkie komórki znajdujące się na zewnętrznej peryferii sieci (Rycina 4A). Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby rozpocząć kreślenie wielokąta, i prawym, aby go zamknąć.
      Uwaga: Wielokąt ten zostanie zdefiniowany jako obszar zainteresowania (ROI), a jego powierzchnia zostanie zmierzona w celu określenia powierzchni sieci.
    3. Otwórz okno ustawień pomiaru (Analyze | Set Measurement) i wybierz opcję „Area”. Otwórz ROI Manager (Analyze | Tools | ROI Manager) (Rycina 4B). Następnie dodaj nakreślony wielokąt do ROI Manager, klikając „Add” (Rycina 4B), i wykonaj pomiar, klikając „Measure” w ROI Manager.
      Uwaga: Pomiar powierzchni pojawi się w tabeli i będzie wyrażony w pikselach. Nie zapomnij przeliczyć tej wartości za pomocą współczynnika konwersji dla użytego mikroskopu, aby uzyskać wartość w μm2.
  4. Wyznaczenie głównego wektora kierunkowego
    1. Wyznaczenie komórki patchowanej
      1. Otwórz plik stosu w ImageJFIJI i zidentyfikuj komórkę patchowaną w pliku stosu na podstawie jej silniejszej intensywności znakowania (Rycina 4C). Następnie otwórz plik o nazwie „detection table” w aplikacji arkusza kalkulacyjnego i znajdź numer przypisany do komórki patchowanej oraz jej odpowiadające współrzędne.
      2. Jeśli nie można dokładnie określić komórki patchowanej, otocz obszar, w którym osad biocytyny jest gęstszy w obrazowanej sieci sprzężonych komórek, używając narzędzia Polygon w ImageJFIJI, i przyjmij tę pozycję jako pozycję komórki patchowanej (Rycina 4D).
      3. Użyj ROI Manager (Analyze | Tools | ROI Manager). Następnie narysuj ROI w miejscu komórki patchowanej i dodaj go do ROI Manager (patrz Rycina 4B).
      4. Ustaw pomiar (Analyze | Set Measurement) i wybierz opcję „Centroid”.
      5. W ROI Manager kliknij „Measure”, aby uzyskać współrzędne centroidu nakreślonego obszaru. Użyj tych współrzędnych jako punktu odniesienia dla tej konkretnej sieci.
    2. Translacja referencyjna
      1. Oblicz współrzędne każdej komórki w odniesieniu do astrocytu patchowanego, korzystając z następującego wzoru:
        Równanie transformacji współrzędnych 2D, wyrażenie matematyczne, treść edukacyjna. 
        Gdzie: Współrzędne Kartezjańskie 2D, symbol (x, y), diagram matematyczny, osie wykresu. to współrzędne danej komórki; Diagram równowagi statycznej; równanie ΣFx=0; wektory sił w punkcie obrotu do analizy. to współrzędne komórki patchowanej (lub punktu odniesienia sieci); a Symbol współrzędnych 2D, kontekst równań, diagram edukacyjny, analiza równowagi statycznej. to współrzędne danej komórki w nowym układzie odniesienia.
        Uwaga: Wyrażenie współrzędnych każdej komórki w odniesieniu do astrocytu patchowanego jest ważnym krokiem w obliczaniu wektorów od astrocytu patchowanego. Pamiętaj, korzystając z ImageJFIJI, że układ odniesienia dla każdego obrazu znajduje się w lewym górnym rogu obrazu.
    3. Wyznaczenie głównego wektora preferencyjnej orientacji
      1. Oblicz współrzędne głównego wektora preferencyjnej orientacji za pomocą następującego wzoru:
        Równania równowagi statycznej, ΣFx=0, diagram analizy równowagi cząsteczek, użytek edukacyjny.
        Gdzie: (Notacja matematyczna xp yp reprezentująca zmienne w równaniu statystycznym lub analizie modelu.) to współrzędne głównego wektora preferencyjnej orientacji; a Wzór na wykres par (x', y') w sekwencji, przydatny w analizie geometrii współrzędnych. to współrzędne każdej komórki sieci uzyskane z komórką patchowaną jako punktem odniesienia.
        Uwaga: Dla każdej komórki w sieci wyznaczany jest wektor względem współrzędnych astrocytu patchowanego. Główny wektor preferencyjnej orientacji sieci jest sumą wszystkich tych wektorów.
      2. Podziel długość głównego wektora (wyznaczoną z współrzędnych uzyskanych za pomocą powyższego wzoru) przez liczbę komórek w sieci minus jeden (ponieważ współrzędne komórki patchowanej nie są wliczane), aby znormalizować wartości i umożliwić porównania między sieciami. Schematyczna wizualizacja tej analizy przedstawiona jest na Rycini 5.
  5. Umieszczenie analizowanych sieci w jądrze zainteresowania
    1. Dopasowanie obrazów 20X i 4X
      1. Aby określić pozycję każdej sieci w jądrze zainteresowania (NVsnpr), użyj obrazu 4X. Otwórz obraz 4X w edytorze grafiki wektorowej.
      2. Zaznacz obraz 4X i zmień jego rozmiar, mnożąc go przez 5. Okno wymiarów znajduje się w prawej części górnego poziomego paska narzędzi. Na przykład dla obrazu 4X, który został próbkowany w rozdzielczości 800 x 800 pikseli, zmień rozdzielczość próbkowania na 4000 x 4000 pikseli (aby ustawić jednostkę roboczą w pikselach, przejdź do „Document Setup” w zakładce plik: File | Document Setup). Eksportuj plik w formacie TIFF i nazwij go „resized 4X”.
      3. Dopasuj lewy górny róg obrazu do lewego dolnego rogu dokumentu Adobe Illustrator.
        Uwaga: Oprogramowanie podaje współrzędne z punktu odniesienia w lewym dolnym rogu.
      4. Otwórz obraz sieci 20X. Użyj „binary file” lub „detection file”, ponieważ łatwiej je dopasować. Następnie użyj narzędzia przezroczystości (opacity) na „binary file” obrazu 20X, aby dopasować go do przeskalowanego obrazu 4X.
        Uwaga: Narzędzie przezroczystości znajduje się na górnym poziomym pasku narzędzi.
      5. Po dokonaniu dopasowania przytrzymaj narzędzie pipety, aż pojawi się narzędzie pomiarowe, i wybierz je z lewego paska narzędzi.
      6. Użyj narzędzia pomiarowego, aby kliknąć w lewy górny róg obrazu 20X i uzyskać współrzędne punktu odniesienia 20X na przeskalowanym obrazie 4X.
        Uwaga: Współrzędne te, określane jako referencja 20X (20XR na Rycini 5), będą przydatne do określenia pozycji każdej sieci na schematycznym rysunku jądra.
    2. Normalizacja jądra zainteresowania
      Uwaga: Aby podsumować dane, stosuje się normalizację jądra (NVsnpr) jako prostokąta. Kroki opisano poniżej.
      1. Otwórz przeskalowany plik 4X w ImageJFIJI i użyj narzędzia wielokąta, aby otoczyć jądro (NVsnpr). Użyj obrazu w świetle przechodzącym, jeśli granice jądra nie są widoczne; w takim przypadku pamiętaj o wcześniejszym przeskalowaniu obrazu.
      2. Otwórz ROI Manager i dodaj narysowany ROI. W „Set Measurement” wybierz opcję „Bounding Rectangle”.
        Uwaga: Opcja „Bounding Rectangle” oblicza najmniejszy prostokąt otaczający narysowane jądro.
      3. Kliknij „Measure”.
        Uwaga: Pojawi się tabela z BX i BY, współrzędnymi lewego górnego rogu prostokąta: „Rectangle Position”, oraz szerokością i wysokością. BX i BY to współrzędne punktu odniesienia prostokąta ograniczającego, określane jako Równowaga statyczna, diagram ΣFx=0, prezentujący równowagę sił dla celów edukacji z fizyki; słowa kluczowe: wektory, siły. i Równowaga statyczna, ΣFx=0, diagram sił w układzie mechanicznym, ilustrujący koncepcję równowagi..
    3. Wyrażenie pozycji każdej sieci w znormalizowanym jądrze
      1. Wyraź współrzędne każdej komórki względem referencji 4X (czarny kwadrat na Rycini 5) korzystając z następującego wzoru:
        Równanie równowagi statycznej; ΣFx=0; wzór matematyczny; ilustracja edukacyjna.
        Gdzie: Równanie równowagi statycznej ΣFx=0, ΣFy=0; diagram wektorów sił i wynikowe obliczenia. to współrzędne komórki względem referencji 4X; Diagram równania równowagi statycznej ΣFx=0; analiza wektorów i sił dla badań edukacyjnych. to współrzędne komórki względem referencji 20X (pomarańczowy kwadrat na Rycini 5); a Diagram współrzędnych matematycznych (x<sub>20XR</sub>, y<sub>20XR</sub>) ilustrujący punkty danych. to współrzędne punktu odniesienia 20X na obrazie 4X (20XR).
      2. Wyraź współrzędne komórek w układzie odniesienia prostokąta ograniczającego (niebieski na Rycini 5) korzystając z następującego wzoru:
        Równanie równowagi statycznej; ΣFx=0; przedstawia równowagę sił; przedstawiono składowe wektora.
        Gdzie: Diagram równowagi statycznej; równania ΣFx=0, ΣFy=0, moment MA=0; analiza mechaniczna. to współrzędne komórki w układzie odniesienia prostokąta ograniczającego; Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, reprezentacja matematyczna, analiza równowagi sił. to współrzędne komórki w referencji 4X; a Równowaga statyczna, ΣF=0, ΣM=0, diagram równania; rozkład wektorów w analizie mechaniki. to współrzędne punktu odniesienia prostokąta ograniczającego na obrazie 4X.
      3. Przekształć współrzędne komórek w układzie prostokąta ograniczającego na procenty szerokości i wysokości prostokąta ograniczającego, korzystając z następującego wzoru:
        Wzór na obliczanie współrzędnych w formie procentowej, z użyciem zmiennych \(x_R\), \(y_R\), \(w\), \(h\).
        Gdzie: Notacja matematyczna, współrzędne (x₀, y₀), używane w wykresach i wyrażeniach algebraicznych. to współrzędne komórki jako procent szerokości i wysokości prostokąta ograniczającego; Równania równowagi statycznej ΣFx=0, ΣFy=0, Στ=0 diagram, ilustrujący koncepcje równowagi sił. to współrzędne komórki w układzie odniesienia prostokąta ograniczającego; Diagram dyfrakcji rentgenowskiej, analiza struktury kryształu białka, ustawienie spektroskopowe, wyniki krystalograficzne. to szerokość prostokąta ograniczającego zmierzona wcześniej w protokole; a Równowaga statyczna; wzór ΣFx=0; diagram; równoważenie sił; edukacyjna koncepcja fizyczna. to wysokość prostokąta ograniczającego zmierzona wcześniej w protokole.
      4. Aby przedstawić wszystkie sieci na tej samej rycini, należy wziąć pod uwagę orientację przekroju (strona lewa lub prawa). W celu standaryzacji danych, układ odniesienia stosuje się do lewej strony przekroju. Przenieś współrzędne sieci z prawej strony na lewą, stosując następujący wzór tylko do współrzędnych x:
        Wzór na równowagę x; równowaga statyczna; równanie; istotne dla obliczeń fizycznych.
        Gdzie: Równanie równowagi statycznej ΣFx=0 diagram do analizy sił i równowagi w badaniach fizycznych. to współrzędna x po prawej stronie przekroju; a Indukcja elektromagnetyczna; XL = ωL−1; schemat obwodu; badanie reaktancji indukcyjnej; analiza prądu przemiennego to nowa współrzędna x wyrażona w układzie odniesienia po lewej stronie przekroju.
        Uwaga: Alternatywnie można odzwierciedlić obraz w ImageJFIJI przed analizą (Image | Transform | Flip Horizontally).
      5. Aby wyrazić współrzędne głównego wektora preferencyjnej orientacji, wykonaj te same kroki co dla współrzędnych komórek (kroki 6.5.3.1 do 6.5.3.4).
        Uwaga: Wyrażenie współrzędnych w procentach umożliwia zestawienie danych w formie jednego wykresu, w którym jądro (NVsnpr) jest przedstawione jako prostokąt.
  6. Badanie różnicy kątowej głównego wektora preferencyjnego kierunku
    Uwaga: Różnica kątowa sieci astrocytarnej służy do określenia, czy jej preferencyjna orientacja jest skierowana w stronę centrum jądra zainteresowania. Aby obliczyć różnicę kątową (α na Rycini 5), która jest kątem między głównym wektorem preferencyjnego kierunku sieci (PD, czerwona linia na Rycini 5) a linią łączącą P z C, zastosuj twierdzenie Al-Kashiego w trójkącie PDC (patrz wstawka na Rycini 5 oraz Metody Uzupełniające).
    1. Najpierw oblicz poszczególne długości, stosując twierdzenie Pitagorasa w układzie Kartezjańskim za pomocą następującego równania:
      Wzór na odległość euklidesową, równanie do obliczania odległości między dwoma punktami, koncepcja edukacyjna.
      Gdzie: współrzędne P i C to odpowiednio Równania równowagi statycznej ΣFx=0 diagram; pokazuje siły w analizie układu mechanicznego. i Równowaga statyczna; ΣFx=0, ΣFy=0; diagram wektorowy do analizy sił i oceny równowagi układu. w układzie odniesienia prostokąta ograniczającego (obliczone wcześniej).
    2. Wyznacz różnicę kątową w radianach za pomocą następującego wzoru:
      Równanie tożsamości trygonometrycznej, wzór na obliczanie kąta w diagramie matematycznym.
    3. Przelicz różnicę kątową na stopnie (np. za pomocą funkcji STOPNIE w oprogramowaniu Excel).
    4. Zestaw wszystkie różnice kątowe, przedstawiając je na wykresach słupkowych (Rycina 7C i 7D), i określ, czy istnieje preferencyjna orientacja sieci astrocytarnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Połączenia między komórkami w mózgu nie są statyczne, lecz są dynamicznie regulowane przez wiele czynników. Opisane metody opracowano w celu analizy sieci astrocytarnych ujawnianych w różnych warunkach oraz zrozumienia ich organizacji w NVsnpr. Wyniki te zostały już opublikowane1. Wykonano wypełnianie biocytyną pojedynczych astrocytów w części grzbietowej NVsnpr w trzech różnych warunkach: w spoczynku (w warunkach kontrolnych, w przypadku braku jakiejkolwiek stymul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje wiele metod elektrofizjologicznych do oceny funkcjonalnego sprzężenia między astrocytami23,24. Metody te nie dostarczają jednak informacji o anatomicznym układzie sieci astrocytowych. Szereg badań wykazało już, że "sprzężenie barwnikowe lub znacznikowe", jak to ma miejsce tutaj, występuje tylko we frakcji sprzężonych komórek, które są wykrywane metodami elektrofizjologicznymi 25,26,27, co sugeruje, że liczba komórek wykrytych tą metodą jest niedoszacowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest finansowana przez Canadian Institutes of Health Research, numer grantu/nagrody: 14392.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClFisher ChemicalsS671-3
KClFisher ChemicalsP217-500
KH2PO4Fisher ChemicalsP285-500
MgSO4Fisher ChemicalsM65-500
NaHCO3Fisher ChemicalsS233-500
C6H12O6 Dekstroza bezwodnaFisher ChemicalsD16-500
CaCl2 dwuwodnistySigmaC70-500
SacharozaSigmaS9378
Sól potasowa kwasu D-glukonowegoSigmaG45001
MgCl2 bezwodnySigmaM8266
HEPESSigmaH3375
EGTASigmaE4378
ATPTris SaltSigmaA9062
GTPTris SaltSigmaG9002
BiocytinSigmaB4261
Karbenosolon sól disodowaSigmaC4790
kompleks awidyny-biotyny: zestaw ABCLaboratoria VestorPK-4000
Streptavidine-alexa 594Sondy molekularneS11227
TritonFisher ChemicalsBP151-500
KsylenFisher ChemicalsX5-1
Wodne medium montażowe 1 : Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
Medium montażowe z żywicy syntetycznej na bazie toluenu: PermountFisher ChemicalsSP15-100
Ławka do suszenia szkiełekFisherbrand11-474-470
VibratomeLeicaVT 1000S
Szkło osłonowe mikroskopuFisherbrand12-544A Szkiełko
mikroskopowe ColorFrostFisherbrand12-550-413
PFAFisherchemicals04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Mikroskop konfokalnyOlympus
40X Soczewka zanurzeniowaOlympusLUMPLFLN40XW
20X Soczewka zanurzeniowaOlympusXLUMPLFL20XW
4XMikropipeta OlympusXLFLUOR4X/340
ściągaczSutter InstrumentP97
MikromanipulatorSutter InstrumentMP 225
Kamera CCDSonyCX-ST50
Czarno-biały monitorSonySSM-125
DigidataUrządzenia molekularne1322A Wzmacniacz zaciskowy
AxoninstrumentMulitclamp 700A
Oprogramowanie do akwizycji elektrofizjologiiUrządzenia molekularnepClamp 8
Oprogramowanie do analizy elektrofizjologicznejUrządzenia molekularneClampfit 8
Oprogramowanie do analizy obrazowaniaImageJFIJIOprogramowanie open source. Wersja FIJI wraz z pakietem wtykowym.
Edytor obrazów wektorowychAdobeIllustrator CS4
Aplikacja arkusza kalkulacyjnegoMicrosoft OfficeExcel 2010

Bibliografia

  1. Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
  2. Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).
  3. Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. How do glial cells contribute to motor control? Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).
  4. Verkhratsky, A., Steinhauser, C. Ion channels in glial cells. Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).
  5. Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers Neuroscience. 9, 499(2015).
  6. Montero, T. D., Orellana, J. A. Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release. Neuroscience. 286, 45-59 (2015).
  7. Araque, A., et al. Gliotransmitters travel in time and space. Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).
  8. Augustin, V., et al. Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive. Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).
  9. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  10. Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).
  11. Morquette, P., et al. An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis. Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).
  12. Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).
  13. Anders, S., et al. Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).
  14. Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
  15. Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).
  16. Claus, L., et al. Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus. Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).
  17. Cameron, M. A., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
  18. Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).
  19. Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).
  20. Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles. Frontiers in Pharmacology. 4, 88(2013).
  21. Torres, A., et al. Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia. Science Signaling. 5 (208), ra8(2012).
  22. Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).
  23. Ma, B., et al. Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium. Glia. 64 (2), 214-226 (2016).
  24. Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices. Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).
  25. Ransom, B. R., Kettenmann, H. Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture. Glia. 3 (4), 258-266 (1990).
  26. Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis. Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).
  27. Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis. Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).
  28. Griemsmann, S., et al. Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells. Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).
  29. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  30. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329 (5991), 571-575 (2010).
  31. Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity. eLife. 6, (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza sieci astrocyt wImageJ FIJIanaliza obrazowania konfokalnegodetekcja sprz gania barwnikaobliczanie wielko ci siecipomiar orientacji preferencyjnejautomatyzacja detekcji kom rekmetoda wyznaczania ROItechnika normalizacji wektor wbadanie j dra tr jdzielnego
Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.