Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Abstract

Staje się coraz bardziej jasne, że astrocyty modulują funkcje neuronów nie tylko na poziomie synaptycznym i pojedynczych komórek, ale także na poziomie sieci. Astrocyty są silnie połączone ze sobą za pomocą połączeń szczelinowych, a sprzężenie przez te połączenia jest dynamiczne i wysoce regulowane. Wyłaniającą się koncepcję jest to, że funkcje astrocytarne są wyspecjalizowane i przystosowane do funkcji obwodu neuronalnego, z którym są związane. W związku z tym potrzebne są metody pomiaru różnych parametrów sieci astrocytowych, aby lepiej opisać zasady rządzące ich komunikacją i sprzężeniem oraz lepiej zrozumieć ich funkcje.

Tutaj, korzystając z oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJFIJI), opisujemy metodę analizy obrazów konfokalnych sieci astrocytowych ujawnionych przez sprzężenie barwnikowe. Metody te pozwalają na: 1) zautomatyzowane i bezstronne wykrywanie znakowanych komórek, 2) obliczanie wielkości sieci, 3) obliczanie preferencyjnej orientacji rozprzestrzeniania się barwnika w sieci oraz 4) repozycjonowanie sieci w obszarze zainteresowania.

Ta analiza może być wykorzystana do scharakteryzowania sieci astrocytowych określonego obszaru, porównania sieci różnych obszarów związanych z różnymi funkcjami, lub porównania sieci uzyskanych w różnych warunkach, które mają różny wpływ na sprzężenie. Obserwacje te mogą prowadzić do ważnych rozważań funkcjonalnych. Na przykład, analizujemy sieci astrocytarne jądra trójdzielnego, gdzie wcześniej wykazaliśmy, że sprzężenie astrocytów jest niezbędne dla zdolności neuronów do przełączania swoich wzorców odpalania z tonicznego na rytmiczne bursting¹. Mierząc wielkość, ograniczenie i preferencyjną orientację sieci astrocytarnych w tym jądrze, możemy budować hipotezy na temat domen funkcjonalnych, które one opisują. Kilka badań sugeruje, że kilka innych obszarów mózgu, w tym kora beczkowata, boczna górna oliwka, kłębuszki węchowe i jądra czuciowe we wzgórzu i korze wzrokowej, by wymienić tylko kilka, może skorzystać z podobnej analizy.

Introduction

Wiele badań opisało, jak dialog neuron-astrocyt na poziomie subkomórkowym lub synaptycznym może mieć wpływ na funkcje neuronalne i transmisję synaptyczną. Powszechnie wiadomo, że astrocyty są wrażliwe na otaczającą aktywność neuronalną; w rzeczywistości mają receptory dla wielu neuroprzekaźników, w tym glutaminianu, GABA, acetylocholiny i ATP (zobacz wcześniej opublikowane recenzje^2,3,4). W zamian procesy astrocytowe obejmują elementy synaptyczne i wpływają na aktywność neuronów zarówno tam, jak i w miejscach pozasynaptycznych, regulując zewnątrzkomórkową homeostazę jonową i uwalniając kilka czynników lub przekaźników, takich jak glutaminian, D-seryna i ATP^5,6,7.

Pojawił się pomysł, że astrocyty mogą również modulować funkcje neuronów na poziomie sieci, z dowodami, że sprzężenie astrocytów jest regulowane przestrzennie i odpowiada segmentacji neuronów w obszarach charakteryzujących się wyraźnym anatomicznym podziałem (jak obszary z reprezentacjami sensorycznymi), co wskazuje, że astrocyty będą łączyć się z innymi astrocytami pełniącymi tę samą funkcję, a nie tylko z tymi, które są blisko. Na przykład w bocznej górnej oliwce większość sieci astrocytowych jest zorientowana prostopadle do osi tonotopowej⁸, podczas gdy w korze beczkowatej lub kłębuszkach olfactoty komunikacja między astrocytami jest znacznie silniejsza w beczkach lub kłębuszkach nerkowych i słabsza między sąsiednimi^9,10. W obu przypadkach sieci astrocytarne są zorientowane w kierunku środka glomerrule lub barrel^9,10.

Niedawno wykazaliśmy, że aktywność astrocytów moduluje odpalanie neuronów poprzez zmniejszenie stężenia zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ ([Ca²⁺]_e), przypuszczalnie poprzez uwalnianie S100β, białka wiążącego Ca²⁺¹¹. Efekt ten, który wykazano w populacji neuronów rytmicznych trójdzielnych w grzbietowej części głównego jądra czuciowego nerwu trójdzielnego (NVsnpr, uważanego za odgrywający ważną rolę w generowaniu ruchów żucia), wynika z faktu, że rytmiczne odpalanie w tych neuronach zależy od stałego prądu Na⁺, który jest promowany przez spadki [Ca²⁺]_e^{11, 12}. Rytmiczne odpalanie w tych neuronach może być wywołane "fizjologicznie" przez stymulację ich danych wejściowych lub sztuczne zmniejszenie [Ca²⁺]_e. Wykazaliśmy ponadto, że sprzężenie astrocytarne jest wymagane do rytmicznego odpalania neuronów¹. To podniosło możliwość, że sieci astrocytarne mogą tworzyć ograniczone domeny funkcjonalne, w których aktywność neuronalna może być zsynchronizowana i skoordynowana. Aby ocenić tę hipotezę, musieliśmy najpierw opracować metodę rygorystycznego dokumentowania organizacji tych sieci w ramach NVsnpr.

Poprzednie badania nad sieciami astrocytarnymi opisywały głównie zakres sprzężenia pod względem liczby komórek oraz gęstości i obszaru, który obejmował. Próby oceny kształtu sieci astrocytarnych i kierunku sprzężenia barwników przeprowadzono głównie poprzez porównanie wielkości sieci wzdłuż dwóch osi (x i y) w korze beczkowatej ⁹, hippocampus^13,14,15, barykowate pola wzgórza¹⁶, lateral superior olive⁸, glomeruli¹⁰, oraz cortex¹⁴. Opisane tutaj metody umożliwiają bezstronne zliczanie oznakowanych komórek w sieci i oszacowanie obszaru, który obejmują. Opracowaliśmy również narzędzia do definiowania preferowanej orientacji sprzężenia w sieci oraz do oceny, czy preferowana orientacja jest skierowana do środka jądra, czy w innym kierunku. W porównaniu z poprzednio stosowanymi metodami, protokół ten zapewnia środki do opisania organizacji i orientacji sieci astrocytarnych w strukturach takich jak grzbietowe trójdzielne główne jądro czuciowe, które nie mają znanego wyraźnego anatomicznego podziału na przedziały. W powyższych badaniach orientacja sieci jest opisana jako związek z kształtem samej struktury, który jest już udokumentowany (np. beczkowata we wzgórzu, beczki w korze, warstwy w hipokampie i korze, kłębuszki w opuszce węchowej itp.). Ponadto analiza wektorowa pozwala na porównanie orientacji sprzężeń ujawnionych w różnych warunkach. Aby przeanalizować, czy parametry te zmieniają się w zależności od położenia sieci w jądrze, opracowaliśmy również metodę wymiany każdej sieci w odniesieniu do granic jądra. Narzędzia te można łatwo zaadaptować do innych obszarów badania sieci sprzężonych komórek.

Protocol

Wszystkie procedury są zgodne z zasadami Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Montrealu.

1. Przygotowanie plastrów mózgu szczura

1. Przygotować 1 l roztworu na bazie sacharozy (Tabela 1) i 1 l standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (Tabela 2).
2. Roztwór na bazie sacharozy z mieszaniną 95%_O2 i 5% CO₂ (karbogenu) należy rozpylać przez 30 minut, a następnie umieścić w temperaturze -80 °C na około 30 minut, aż roztwór będzie zimny, ale nie całkowicie zamrożony. Użyj tej lodowatej sacharozy jako bufora tnącego do krojenia mózgu. Trzymaj go na lodzie po wyjęciu z zamrażarki.
3. Bąbelkować aCSF z karbogenem przez cały eksperyment. Użyj tego roztworu do przechowywania plastrów i jako buforu perfuzyjnego, w którym będzie wykonywane zaciskanie plastrów i wypełnianie biocytyną astrocytów. Przygotuj komorę do odzyskiwania plastrów, aby zdeponować plastry mózgu zaraz po ich pokrojeniu.
   Uwaga: Komora do odzysku plastrów może być wykonana na zamówienie i składa się zasadniczo z jednej małej studzienki z siatką na dole zawieszonej w większej studni wypełnionej CSF, do której wkładana jest rurka w celu doprowadzenia karbogenu z dna.
4. Używaj 15- do 21-dniowych szczurów Sprague-Dawley bez żadnych uprzedzeń związanych z płcią lub szczepem. Znieczulić zwierzę izofluranem (1 ml izofluranu w komorze indukcyjnej znieczulenia). Sprawdź głębokość znieczulenia, delikatnie szczypiąc tylną łapę lub ogon zwierzęcia.
5. Odetnij głowę szczura za pomocą gilotyny, przetnij mu czaszkę nożyczkami i szybko usuń mózg z czaszki płaską szpatułką.
6. Zanurz mózg w lodowatym roztworze na bazie sacharozy na około 30 s i przenieś go (wraz z roztworem) na szalkę Petriego. Za pomocą żyletki usuń części, które znajdują się z przodu i z tyłu obszaru, który ma być cięty, jeśli kroi się plastry w płaszczyźnie poprzecznej.
7. Przyklej pozostały blok tkanki mózgowej po jego stronie rostralnej i przystąp do krojenia plasterków mózgu (o grubości 350 μm) w podłożu na bazie sacharozy za pomocą wibratomu. Następnie przenieś zebrane plastry do komory odzysku wypełnionej karbogenicznym aCSF w temperaturze pokojowej (RT), aż będą gotowe do użycia (odczekaj co najmniej 1 godzinę na regenerację).
   Uwaga: Najnowsze osiągnięcia w tej dziedzinie pozwalają na przedłużoną inkubację do 24 godzin wycinków mózgu w warunkach in vitro ¹⁷.

2. Znakowanie astrocytów sulforodaminą 101 (SR-101)

1. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 34 °C i umieść w niej dwie komory inkubacyjne z plastrami. Wypełnić jedną z komór inkubacji plastrów roztworem aCSF zawierającym 1 μM SR-101, a drugą napełnić tylko roztworem CSF.
2. Inkubować plastry w komorze inkubacyjnej zawierającej 1 μM SR-101 przez 20 minut, a następnie przenieść je do drugiej komory inkubacyjnej w celu wypłukania nadmiaru SR-101 z tkanki. Pozostawić do inkubacji przez 20 minut lub dłużej w temperaturze 34 °C, a następnie utrzymać komorę inkubacyjną zawierającą plastry w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będą potrzebne¹⁸ %.

3. Łatanie astrocytów i wypełnianie biocytyną

1. Wybierz plasterek i umieść go w komorze rejestracyjnej mikroskopu. Do łatania astrocytów należy użyć elektrod o rezystancji 4-6MΩ po napełnieniu roztworem na bazie glukonianu potasu (patrz tabela 3).
2. Pod nadzorem wizualnym i za pomocą mikromanipulatora skieruj elektrodę rejestrującą w stronę astrocytu znakowanego SR-101, jak pokazano na Rysunek 1. Unikaj komórek znajdujących się na powierzchni plasterka, ponieważ jest bardziej prawdopodobne, że zostaną uszkodzone lub straciły połączenia z sąsiednimi komórkami.
3. Aby zapobiec wyciekowi biocytyny w tkance, należy zminimalizować nadciśnienie dodawane do pipety z plastrem i nakładać ją tylko wtedy, gdy znajduje się ona blisko astrocytu, który zostanie załatany (0,1-0,4 ml w strzykawce o pojemności 1 ml).
4. Przed przystąpieniem do stosowania poprawek należy wyregulować przesunięcie pipety i jej pojemność. Popraw potencjały złączy cieczy, ponieważ dokładne i precyzyjne polecenia napięcia mają kluczowe znaczenie dla eksperymentów¹⁹.
5. Przysuń pipetę na tyle blisko astrocytu, aby zaobserwować depresję spowodowaną dodatnim ciśnieniem. Następnie usuń nadciśnienie i powoli zastosuj podciśnienie. Zacisnąć astrocyt na -70 mV, gdy uszczelka osiągnie 100 MΩ. Poczekaj, aż uszczelka osiągnie 1-3 GΩ. Kontynuuj stosowanie podciśnienia, aż włamie się do komórki. Zachowaj ostrożność podczas stosowania podciśnienia, ponieważ astrocyty są bardzo delikatne.
6. Oceń właściwości elektrofizjologiczne załatanej komórki. W trybie cęgów napięciowych wykonaj protokół prądowo-napięciowy całego ogniwa z poleceniem narastania napięcia o czasie trwania 600 ms w zakresie od -120 do +110 mV. W trybie cęgów prądowych należy wykonać protokół kroku IV, w którym wstrzyknięcie 1000 ms kroków prądowych 100 pA od -1 do 1 nA, częstotliwość próbkowania nagrań całej komórki wynosi 10 kHz.
   Uwaga: Astrocyty wykazują liniowy profil prądowo-napięciowy bez żadnej rektyfikacji (jak pokazano na Rysunek 1B) i brak potencjału czynnościowego uruchamiającego się podczas depolaryzacji błony (Rysunek 1C). Spoczynkowy potencjał błonowy (RMP) powinien być stabilny i nie dodatni do -60mV. W niektórych obszarach mózgu RMP astrocytów jest bardziej hiperspolaryzowany niż w NVsnpr.
7. Pozwól biocytynie dyfundować w astrocycie przez 30 minut, wykonując protokół etapu IV co 5 minut.
8. Ostrożnie wycofaj i odłącz pipetę z plastrem, nie uszkadzając załatanego astrocytu i natychmiast zwróć uwagę na przesunięcie pipety przed wyjęciem jej z komory rejestrującej. Odejmij tę wartość od zapisów potencjału błonowego.
9. Pozostawić wycinek mózgu w komorze rejestracyjnej na co najmniej 15 minut (oprócz 30 minut na wstrzyknięcie), aby umożliwić rozprzestrzenienie się znacznika z łatanego astrocytu na całą sieć sprzężonych komórek.
   Uwaga: Aby ujawnić sieć sprzężonych komórek, tylko jedna komórka powinna być załatana w jądrze będącym przedmiotem zainteresowania. Jeśli do uzyskania udanego łatu wymagane jest wiele prób, odrzuć obudowę i spróbuj załatać po stronie przeciwnej lub w innym wycinku mózgu.
10. Wykonaj znak lub nacięcie w tkance, aby określić, która strona plasterka jest skierowana do góry, i przenieś plasterek najpierw na szalkę Petriego zawierającą normalny aCSF, a następnie do roztworu 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować plaster w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: PFA jest niezwykle szkodliwy. Używaj sprzętu ochronnego w wentylowanym kapturze. Upewnij się, że wszystkie materiały (szczotki, rurki itp.), które miały kontakt z PFA, nie stykają się z komorą rekonwalescencji, komorą inkubacyjną lub innymi materiałami używanymi do rejestrowania świeżej tkanki.

4. Objawienie biocytyny

1. Rewelacja z fluorescencyjną streptawidyną
   1. Umyj plastry mózgu 2 x 10 minut w 0,1 M buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze pokojowej. Następnie ujawnij biocytynę, inkubując wycinki mózgu ze streptawidyną sprzężoną z fluoroforem w rozcieńczeniu 1/200 w PBS z 4% niejonowym detergentem przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
   2. Umyj plastry mózgu 3 x 10 minut w 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej i zamontuj sekcje na szkiełkach za pomocą wodnego podłoża montażowego. Ułóż boki, które zostały wstrzyknięte do góry, nakryj szkiełka i uszczelnij je lakierem do paznokci.
2. Rewelacja z DAB
   Uwaga: Objawienie DAB (3,3-diaminozydyny) może być stosowane, gdy nie można użyć fluorescencji. W tym przypadku do dokonywania porównań powinna być stosowana tylko jedna metoda objawienia.
   1. Umyć plastry mózgu 3 x 10 min w PBS w temperaturze pokojowej stężenia. Inkubować plastry w PBS + H₂O₂ 0,5% przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Opłucz plastry 3 x 10 min w PBS w temperaturze RT. Następnie inkubować plastry w roztworze barwiącym z kompleksem awidyny-biotyny składającym się z PBS i 0,1% niejonowego detergentu + standardowych odczynników do barwienia peroksydazy kompleksu awidyny-biotyny w stosunku 1/100 przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
   3. Opłucz plastry 3 x 10 min w PBS w temperaturze pokojowej, inkubuj je w roztworze PBS + DAB 0,05% przez 20 min w stężonej temperaturze i przenieś do roztworu PBS + DAB 0,05% + H₂O₂ 0,5%.
      UWAGA: DAB jest niezwykle szkodliwy. Używaj sprzętu ochronnego w wentylowanym kapturze. Reakcja barwna zostaje zatrzymana, gdy plastry są przenoszone do PBS.
   4. Opłucz plastry 5 x 10 min w PBS w temperaturze pokojowej w temperaturze pokojowej, umieść sekcje na szkiełkach podstawowych (stronami, które zostały wstrzyknięte do góry) i pozostaw do wyschnięcia na stole do suszenia szkiełek przez noc w temperaturze 34 °C.
   5. Zanurz szkiełka szklane na 1 minutę w kilku kąpielach alkoholowych o stężeniu 70%, 95% i 100%, a zakończ kąpielą ksylenu przez 1 minutę.
   6. Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego z żywicy syntetycznej na bazie toluenu. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i uszczelnij je lakierem do paznokci.

5. Obrazowanie sieci

1. Wizualizuj sieci astrocytarne za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy 20X i 4X (lub odpowiedni obiektyw do wizualizacji całego jądra, w którym znajduje się sieć) oraz lasera do wykrywania fluoroforu (w tym przypadku używana jest Alexa-594).
2. Użyj 20-krotnego powiększenia, aby utworzyć stos z sieci oznaczonych komórek. Użyj rozdzielczości 800 x 800 pikseli i prędkości skanowania 12,5 μs/piksel.
   Uwaga: Aby zobrazować całą sieć, zwykle wymaganych jest wiele stosów, a liczba stosów musi być dostosowana do każdej sieci. Rozdzielczość i szybkość skanowania można zmienić, ale upewnij się, że używasz tych samych ustawień do obrazowania wszystkich danych.
3. Użyj 4-krotnego powiększenia, aby zrobić zdjęcia sieci i obszaru zainteresowania.
   Uwaga: Obrazowanie 4X służy do określenia pozycji sieci w jądrze będącym przedmiotem zainteresowania. Zawsze obrazuj to samo pole w świetle przechodzącym. Obraz ten będzie przydatny, jeśli nie można określić granicy jądra na konfokalnym obrazie fluorescencyjnym.

6. Analiza obrazu

1. Przygotowanie danych
   1. Użyj oprogramowania ImageJFIJI (pobierz je pod adresem https://fiji.sc/). Otwórz plik i kliknij OK w oknie "Opcje importu formatów biologicznych".
   2. Aby przedefiniować stos z, który będzie zawierał tylko warstwy optyczne potrzebne do końcowego stosu z (Rysunek 2A), kliknij na pokrętło "Stos" na pasku narzędzi (aby znaleźć, najpierw wybierz stk | Z Project). Wybierz "Max Intensity" w ustawieniu typu projekcji (Rysunek 2A). Zapisz plik i nazwij go "plik stosu".
   3. Jeśli plik obrazowania zawiera kilka kanałów, należy go podzielić, aby zachować tylko kanał z obrazowaniem sieci astrocytarnej (punkt menu Obraz | Kolor | Podział kanałów).
   4. Sprawdź ustawienia pikseli obrazu [Obraz | Właściwości | Piksel (z "1" dla wymiaru w pikselach)].
   5. Użyj narzędzia do odejmowania tła (punkt menu Proces | Odejmij tło), aby usunąć tło znakowania biocytyny. Użyj funkcji podglądu, aby ustawić promień toczącej się kuli, który zwykle wynosi 50 pikseli ( Rysunek 2B).
   6. Korzystanie z narzędzia do usuwania wartości odstających (punkt menu Process | Hałas | Usuń wartości odstające), jeśli jest to wymagane po wykonaniu kroku odejmowania tła. Wybierz "Jasny" w ustawieniu "Które wartości odstające" (Rysunek 2C). Użyj funkcji podglądu, aby ustawić promień i próg. Bądź ostrożny z tym narzędziem, ponieważ może ono zamazać dane, jak pokazano w Rysunek 2D.
      Uwaga: To narzędzie usuwa małe plamki spowodowane niespecyficznymi złogami streptawidyny (jak pokazano białymi strzałkami w Rysunek 2B i 2C odpowiednio przed i po leczeniu).
   7. Dostosuj próg (punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg). Wybierz tryb "Domyślny" i "Czarno-biały" ( Rysunek 2E). Kliknij "Zastosuj".
      Uwaga: Można użyć automatycznej regulacji, ale preferowana jest ręczna regulacja za pomocą dwóch suwaków. Celem tego kroku jest zredukowanie szumów do maksimum bez utraty jakichkolwiek oznakowanych komórek.
   8. Przekonwertuj obraz na obraz binarny za pomocą narzędzia procesu binarnego (punkt menu Proces | Binarny | Utwórz plik binarny), jak pokazano w Rysunek 2F. Zapisz plik jako plik TIFF i nadaj mu nazwę "plik binarny".
2. Zliczanie komórek
   1. Sprawdź ustawienie funkcji miary (punkt menu Analiza | Ustaw pomiar). Wybierz opcję "Centroid".
   2. Użyj narzędzia "Analizuj cząstki" na "pliku binarnym" (Rysunek 3A) utworzonego w poprzednim kroku (Analizuj | Analizuj cząstkę) (Rysunek 3C po lewej). Wybierz "Kontury" w ustawieniu "Pokaż" (Rysunek 3C). Spowoduje to wygenerowanie nowego pliku, który pokazuje wynik wykrywania (Rysunek 3B).
   3. Pobaw się parametrami: rozmiar (aby wykryć tylko komórki, użyj wartości od 30 do 6000) i okrągłość (aby określić przedział od 0 do 1, w którym "1" definiuje idealne koło, a "0" losowy kształt), aby uściślić wykrywanie (Rysunek 3C, lewa część). Uruchom wykrywanie, klikając "OK".
      Uwaga: Po wykryciu pojawią się dwie tabele: 1) tabela zatytułowana "Podsumowanie", która zawiera liczbę wykrytych komórek, oraz 2) tabela zatytułowana "Wyniki" (Rysunek 3C, prawa część), która zawiera współrzędne x i y każdej komórki.
   4. Skopiuj wartości i wklej je do aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Zapisz tę tabelę pod nazwą "tabela wykrywania". Pojawi się również plik z wykresem wykrytych komórek (Rysunek 3B). Zapisz ten plik jako plik TIFF pod nazwą "plik wykrywania".
   5. Jeśli grupa 2 lub więcej oznaczonych komórek w sieci zostanie wykryta jako pojedyncza komórka za pomocą narzędzia do analizy cząstek, ponieważ znajdują się one zbyt blisko siebie, użyj narzędzia zlewni (punkt menu Process | Binarny | Zlewnia) na obrazie binarnym przed zastosowaniem narzędzia do analizy cząstek i ponów kroki analizy cząstek.
      Uwaga: Narzędzie zlewnia tworzy rozgraniczenie o szerokości 1 piksela między bardzo bliskimi komórkami. Wtyczka licznika komórek może być używana, gdy etykietowanie jest jednoznaczne i może być przeprowadzone ręcznie.
3. Pomiar obszaru sieci astrocytarnej
   1. Aby zmierzyć powierzchnię sieci, użyj pliku wykrywania za pomocą obrazu J.
   2. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów (kliknij lewym przyciskiem myszy przycisk na pasku narzędzi, aby go zaznaczyć), aby prześledzić wielokąt, który łączy wszystkie komórki znajdujące się na zewnętrznych peryferiach sieci (Rysunek 4A). Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby rozpocząć śledzenie wielokąta, i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby go zamknąć.
      Uwaga: Ten wielokąt zostanie zdefiniowany jako obszar zainteresowania (ROI), a jego powierzchnia zostanie zmierzona w celu określenia obszaru sieci.
   3. Otwórz okno ustawionego pomiaru (punkt menu Analizuj | Ustaw pomiar) i wybierz opcję "Obszar". Otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji (punkt menu Analizuj | Narzędzia | Menedżer ROI) (Rysunek 4B). Następnie dodaj śledzony wielokąt w Menedżerze ROI, klikając "Dodaj" (Rysunek 4B) i uruchom pomiar, klikając "Zmierz"'' w Menedżerze ROI.
      Uwaga: Pomiar powierzchni pojawi się w tabeli i będzie wyrażony w pikselach. Nie zapomnij przeliczyć tej wartości na współczynnik konwersji dla mikroskopu użytego do uzyskania wartości w μm².
4. Wyznaczanie głównego wektora kierunkowego
   1. Oznaczanie załatanej komórki
      1. Otwórz plik stosu w ImageJFIJI i zidentyfikuj załataną komórkę w pliku stosu na podstawie jej silniejszej intensywności etykietowania (Rysunek 4C). Następnie otwórz plik o nazwie "tabela wykrywania" w aplikacji arkusza kalkulacyjnego i znajdź numer powiązany z załataną komórką i odpowiadające jej współrzędne.
      2. Jeśli nie możesz dokładnie określić załatanej komórki, otocz obszar, w którym złogi biocytyny są gęstsze w obrazowanej sieci sprzężonych komórek, używając narzędzia Wielokąt w ImageJFIJI, i odnieś się do tej pozycji jako do załatanej komórki (Rysunek 4D).
      3. Korzystanie z Menedżera zwrotu z inwestycji (Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji). Następnie narysuj ROI w miejscu załatanej komórki i dodaj go do Menedżera ROI (patrz Rysunek 4B).
      4. Ustawianie pomiaru (Analiza | Ustaw pomiar) i wybierz opcję "Środek ciężkości".
      5. W Menedżerze ROI kliknij "Zmierz", aby uzyskać współrzędne środka ciężkości śledzonego obszaru. Użyj tych współrzędnych jako punktu odniesienia dla tej konkretnej sieci.
   2. Tłumaczenie referencyjne
      1. Oblicz współrzędne każdej komórki w odniesieniu do astrocytu z łatą, używając następującego wzoru:
         
         Z: jako współrzędne danej komórki; jako współrzędne załatanej komórki (lub punktu odniesienia sieci); oraz jako współrzędne danej komórki w nowym referencji.
         Uwaga: Wyrażenie współrzędnych każdej komórki w odniesieniu do astrocytu z łatką jest ważnym krokiem w obliczaniu wektorów z astrocytu z łatką. Podczas korzystania z ImageJFIJI należy pamiętać, że odniesienie do dowolnego obrazu znajduje się w lewym górnym rogu obrazu.
   3. Określenie głównego wektora orientacji preferencyjnej
      1. Oblicz współrzędne głównego wektora orientacji preferencyjnej za pomocą następującego wzoru:
         
         Gdzie: () jako współrzędne głównego wektora orientacji preferencyjnej; oraz jako współrzędne każdej komórki sieci uzyskane za pomocą załatanej komórki jako referencyjne.
         Uwaga: Dla każdej komórki w sieci wektor jest określany względem współrzędnych astrocytu, który został załatany. Głównym wektorem preferencyjnej orientacji sieci jest suma wszystkich tych wektorów.
      2. Podziel długość głównego wektora (podaną przez współrzędne uzyskane przy użyciu powyższego wzoru) przez liczbę komórek w sieci pomniejszoną o jeden (ponieważ współrzędne załatanej komórki nie są uwzględnione), aby znormalizować wartości i umożliwić porównania między sieciami. Schematyczny widok tej analizy jest przedstawiony w Rysunek 5.
5. Rozmieszczenie analizowanych sieci w jądrze zainteresowania
   1. Wyrównanie obrazów 20X i 4X
      1. Aby określić położenie każdej sieci w jądrze zainteresowania (NVsnpr), użyj obrazu 4X. Otwórz obraz 4X za pomocą edytora obrazów wektorowych.
      2. Wybierz obraz 4X i zmodyfikuj jego rozmiar, mnożąc go przez 5. Okno wymiarowania znajduje się w prawej części górnego poziomego paska narzędzi. Na przykład, dla obrazu 4X, który został próbkowany w rozdzielczości 800 x 800 pikseli, zmień rozdzielczość próbkowania na 4000 x 4000 pikseli (aby ustawić jednostkę roboczą w pikselach, przejdź do "Ustawienia dokumentu" na karcie plik: Plik | Ustawienia dokumentu). Wyeksportuj plik w formacie TIFF i nazwij go "resized 4X".
      3. Wyrównaj lewy górny róg obrazu z lewym dolnym rogiem dokumentu programu Adobe Illustrator.
         Uwaga: Oprogramowanie udostępnia współrzędne z punktu odniesienia w lewym dolnym rogu.
      4. Otwórz 20-krotny obraz sieci. Użyj ''pliku binarnego'' lub ''pliku detekcji'', ponieważ są one łatwiejsze do wyrównania. Następnie pobaw się narzędziem do krycia w ''pliku binarnym'' obrazu 20X, aby wyrównać go z obrazem 4X o zmienionym rozmiarze.
         Uwaga: Narzędzie krycia znajduje się na górnym poziomym pasku narzędzi.
      5. Po zakończeniu wyrównywania wybierz i przytrzymaj narzędzie do pipetowania, aby pojawiło się narzędzie do mierzenia, a następnie wybierz je na lewym pasku narzędzi.
      6. Użyj narzędzia do mierzenia, aby kliknąć lewy górny róg obrazu 20X, aby uzyskać współrzędne punktu odniesienia 20X na obrazie 4X o zmienionym rozmiarze.
         Uwaga: Te współrzędne, które są określane jako odniesienie 20X (20XR w Rysunek 5), będą przydatne do wyrażenia pozycji każdej sieci na schematycznym rysunku jądra.
   2. Normalizacja jądra zainteresowania
      Uwaga: Aby podsumować dane, stosuje się normalizację jądra (NVsnpr) jako prostokąta. Kroki są opisane poniżej.
      1. Otwórz plik o zmienionym rozmiarze 4X w ImageJFIDIJI i użyj narzędzia wielokąta, aby otoczyć jądro (NVsnpr). Użyj obrazu ze światłem przechodzącym, jeśli granice jądra nie są widoczne; W takim przypadku pamiętaj, aby najpierw zmienić jego rozmiar.
      2. Otwórz Menedżera ROI i dodaj narysowany ROI. W "Ustaw miarę" wybierz opcję ''Prostokąt ograniczający''.
         Uwaga: Opcja "Prostokąt ograniczający" oblicza najmniejszy prostokąt wokół narysowanego jądra.
      3. Kliknij "Zmierz".
         Uwaga: Pojawi się tabela z BX i BY, współrzędnymi lewego górnego rogu prostokąta: ''Pozycja prostokąta'' oraz podają szerokość i wysokość. BX i BY to współrzędne prostokąta ograniczającego referencyjnego, które są określane jako i .
   3. Wyrażenie każdej pozycji sieci w znormalizowanym jądrze
      1. Wyraź współrzędne każdej komórki za pomocą referencji 4X (kwadrat w Rysunek 5) za pomocą następującego wzoru:
         
         gdzie: to współrzędne komórki z odniesieniem 4X; to współrzędne komórki z odniesieniem 20X (pomarańczowy kwadrat w Rysunek 5); oraz to współrzędne punktu odniesienia 20X na obrazie 4X (20XR).
      2. Wyraź współrzędne komórki w prostokącie ograniczającym referencyjnym (niebieski w Rysunek 5) za pomocą następującej formuły:
         
         gdzie: są współrzędnymi komórki w prostokącie ograniczającym odniesienie; to współrzędne komórki w referencji 4X; a są współrzędnymi prostokąta ograniczającego odniesienia na obrazie 4X.
      3. Przekształć współrzędne komórki w prostokącie ograniczającym odnoszące się do procentu szerokości i wysokości prostokąta ograniczającego, używając następującej formuły:
         
         gdzie: to współrzędne komórki wyrażone w procentach szerokości i wysokości prostokąta ograniczającego; to współrzędne komórki w prostokącie ograniczającym odniesienie; to szerokość prostokąta ograniczającego zmierzona powyżej w protokole; a to wysokość prostokąta ograniczającego zmierzona powyżej w protokole.
      4. Aby przedstawić wszystkie sieci na tym samym rysunku, weź pod uwagę orientację wycinka (lewa lub prawa strona). Aby ustandaryzować dane, odniesienie jest stosowane po lewej stronie wycinka. Przenieś współrzędne sieci z prawej strony na lewą, stosując następujący wzór tylko do współrzędnych x:
         
         gdzie: jest współrzędną x po prawej stronie wycinka; oraz to nowa współrzędna x wyrażona w referencji po lewej stronie wycinka.
         Uwaga: Alternatywnie można odbić obraz w ImageJFIJI przed analizą (punkt menu Obraz | Przekształcanie | Odwróć w poziomie).
      5. Aby wyrazić współrzędne głównego wektora orientacji preferencyjnej, wykonaj te same kroki ze współrzędnymi komórki (kroki od 6.5.3.1 do 6.5.3.4).
         Uwaga: Wyrażenie współrzędnych w procentach pozwala na zestawienie danych jako pojedynczego wykresu, w którym jądro (NVsnpr) jest zaprojektowane jako prostokąt.
6. Badanie różnicy kątowej głównego wektora kierunku preferencyjnego
   Uwaga: Różnica kątowa sieci astrocytowej jest używana do określenia, czy jej preferencyjna orientacja jest skierowana w stronę środka jądra będącego przedmiotem zainteresowania. Aby obliczyć różnicę kątową (α w Rysunek 5), która jest kątem między głównym wektorem preferencyjnego kierunku sieci (PD, czerwona linia w Rysunek 5) a linią łączącą P z C, zastosuj twierdzenie Al-Kashiego do trójkąta PDC (patrz wstawka Rysunek 5 i metody uzupełniające).
   1. Najpierw oblicz różne długości, stosując twierdzenie Pitagorasa do kartezjańskiego odniesienia za pomocą następującego równania:
      
      gdzie: współrzędne P i C to odpowiednio i w prostokącie ograniczającym (obliczonym powyżej).
   2. Wyznacz różnicę kątową w radianach za pomocą następującego wzoru:
      
   3. Przelicz różnicę kątów w stopniach (np. za pomocą funkcji STOPNIE w programie Excel).
   4. Skompiluj wszystkie różnice kątowe, wykreślając je na pionowych wykresach słupkowych (Rysunek 7C i 7D) i określ, czy istnieje preferencyjna orientacja sieci astrocytów.

Results

Sprzężenie między komórkami w mózgu nie jest statyczne, ale raczej dynamicznie regulowane przez wiele czynników. Opisane metody zostały opracowane w celu analizy sieci astrocytarnych ujawnionych w różnych warunkach i zrozumienia ich organizacji w NVsnpr. Te wyniki zostały już opublikowane¹. Przeprowadziliśmy wypełnianie biocytyną pojedynczych astrocytów w grzbietowej części NVsnpr w trzech różnych warunkach: w spoczynku (w warunkach kontrolnych przy braku jakiejkol...

Discussion

Istnieje wiele metod elektrofizjologicznych do oceny funkcjonalnego sprzężenia między astrocytami^23,24. Metody te nie dostarczają jednak informacji o anatomicznym układzie sieci astrocytowych. Szereg badań wykazało już, że "sprzężenie barwnikowe lub znacznikowe", jak to ma miejsce tutaj, występuje tylko we frakcji sprzężonych komórek, które są wykrywane metodami elektrofizjologicznymi 25,26,27, co sugeruje, że liczba komórek wykrytych tą metodą jest niedoszacowan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Chemicals	S671-3
KCl	Fisher Chemicals	P217-500
KH2PO4	Fisher Chemicals	P285-500
MgSO4	Fisher Chemicals	M65-500
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500
C6H12O6 Dekstroza bezwodna	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl2 dwuwodnisty	Sigma	C70-500
Sacharoza	Sigma	S9378
Sól potasowa kwasu D-glukonowego	Sigma	G45001
MgCl2 bezwodny	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATPTris Salt	Sigma	A9062
GTPTris Salt	Sigma	G9002
Biocytin	Sigma	B4261
Karbenosolon sól disodowa	Sigma	C4790
kompleks awidyny-biotyny: zestaw ABC	Laboratoria Vestor	PK-4000
Streptavidine-alexa 594	Sondy molekularne	S11227
Triton	Fisher Chemicals	BP151-500
Ksylen	Fisher Chemicals	X5-1
Wodne medium montażowe 1 : Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Medium montażowe z żywicy syntetycznej na bazie toluenu: Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Ławka do suszenia szkiełek	Fisherbrand	11-474-470
Vibratome	Leica	VT 1000S
Szkło osłonowe mikroskopu	Fisherbrand	12-544A Szkiełko
mikroskopowe ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Mikroskop konfokalny	Olympus
40X Soczewka zanurzeniowa	Olympus	LUMPLFLN40XW
20X Soczewka zanurzeniowa	Olympus	XLUMPLFL20XW
4X	Mikropipeta Olympus	XLFLUOR4X/340
ściągacz	Sutter Instrument	P97
Mikromanipulator	Sutter Instrument	MP 225
Kamera CCD	Sony	CX-ST50
Czarno-biały monitor	Sony	SSM-125
Digidata	Urządzenia molekularne	1322A Wzmacniacz zaciskowy
Axon	instrument	Mulitclamp 700A
Oprogramowanie do akwizycji elektrofizjologii	Urządzenia molekularne	pClamp 8
Oprogramowanie do analizy elektrofizjologicznej	Urządzenia molekularne	Clampfit 8
Oprogramowanie do analizy obrazowania	ImageJFIJI	Oprogramowanie open source. Wersja FIJI wraz z pakietem wtykowym.
Edytor obrazów wektorowych	Adobe	Illustrator CS4
Aplikacja arkusza kalkulacyjnego	Microsoft Office	Excel 2010