Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

18.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58118

⸱

22 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1LamImSys Lab, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 2LamImSys Lab, Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), 3CIBER de Enfermedades Cardiovasculares

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Streszczenie

Kwantyfikacja aktywacji, proliferacji i różnicowania naiwnych limfocytów T CD4 do komórek T pomocniczych 1 (Th1) jest użytecznym sposobem oceny roli, jaką odgrywają limfocyty T w odpowiedzi immunologicznej. Protokół ten opisuje różnicowanie in vitro komórek progenitorowych szpiku kostnego (BM) w celu uzyskania komórek dendrytycznych (DC) pochodzących z czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF). Protokół opisuje również adoptywny transfer peptydu albuminy jaja kurzego (OVAp) DC pochodzących z GM-CSF i naiwnych limfocytów T CD4 od transgenicznych myszy OTII w celu analizy aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 in vivo przenoszonych limfocytów T CD4. Protokół ten omija ograniczenia metod czysto in vivo, wynikające z braku możliwości specyficznego manipulowania lub selekcji badanej populacji komórek. Co więcej, protokół ten umożliwia badania w środowisku in vivo, unikając w ten sposób zmian w czynnikach funkcjonalnych, które mogą wystąpić in vitro, oraz uwzględniając wpływ typów komórek i innych czynników występujących tylko w nienaruszonych narządach. Protokół jest użytecznym narzędziem do generowania zmian w limfocytach DC i T, które modyfikują adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne, potencjalnie dostarczając ważnych wyników pozwalających zrozumieć pochodzenie lub rozwój wielu chorób związanych z układem odpornościowym.

Wprowadzenie

Limfocyty T CD4 i komórki prezentujące antygen (APC), takie jak DC, są wymaganymi mediatorami odporności na patogeny mikrobiologiczne1,2. W obwodowych narządach limfatycznych limfocyty T CD4 są aktywowane po rozpoznaniu specyficznych antygenów prezentowanych przez APCs3,4,5. Aktywowane limfocyty T CD4 namnażają się i różnicują w odrębne specyficzne komórki efektorowe Th, które są niezbędne do rozwoju prawidłowej adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej6,7. Kontrola tych procesów ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia odpowiedniej obrony adaptacyjnej, która zabija patogen bez powodowania szkodliwych uszkodzeń tkanek8. Komórki Th są definiowane zgodnie z ekspresją lub produkcją cząsteczek powierzchniowych, czynników transkrypcyjnych i cytokin efektorowych i pełnią podstawowe i precyzyjne funkcje w odpowiedzi na patogeny1. Komórki podzbioru komórek Th1 wyrażają czynnik transkrypcyjny T-bet i interferon cytokinowy γ (IFNγ) i uczestniczą w obronie gospodarza przed patogenami wewnątrzkomórkowymi1. Kwantyfikacja naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania limfocytów T CD4 jest użytecznym sposobem oceny roli, jaką limfocyty T odgrywają w odpowiedzi immunologicznej.

Ten protokół umożliwia analizę in vivo zdolności generowanych in vitro DC pochodzących z BM do modulowania aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych limfocytów T CD4. Protokół służy również do oceny zdolności naiwnych limfocytów T CD4 do aktywacji, indukowania do proliferacji i różnicowania Th1 (Figura 1). Ten wszechstronny protokół pozwala obejść brak możliwości specyficznego manipulowania lub selekcji badanej populacji komórek w protokołach czysto in vivo. Wpływ różnych cząsteczek i terapii na DC można badać za pomocą BM od genetycznie zmodyfikowanych myszy5 lub poprzez leczenie lub genetyczne manipulowanie izolowanymi komórkami BM9. Podobnie, odpowiedzi limfocytów T można zbadać, uzyskując limfocyty T do transferu adoptywnego z różnych źródeł lub po kilku manipulacjach3,8,10.

Główne zalety tego protokołu są dwojakie. Aktywacja, proliferacja i różnicowanie limfocytów T są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej; Jest to połączone z badaniami in vivo, zapobiegając w ten sposób zmianom, które mogą wystąpić in vitro, a także uwzględniając typy komórek i inne czynniki występujące tylko w nienaruszonych narządach11.

Użycie barwników witalnych jest powszechnie stosowaną techniką do śledzenia proliferacji komórek przy jednoczesnym unikaniu użycia radioaktywności. Pomiar proliferacji za pomocą tych odczynników opiera się na rozcieńczeniu barwnika po podziale komórek. Co więcej, barwniki te mogą być wykrywane na wielu długościach fal i są łatwo analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w połączeniu z wieloma przeciwciałami lub markerami fluorescencyjnymi. Podkreślamy użyteczność tego protokołu, pokazując, w jaki sposób aktywacja, proliferacja i różnicowanie limfocytów Th1 mogą być analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) i Comunidad Autónoma de Madrid zgodnie z hiszpańskimi i europejskimi wytycznymi. Myszy były hodowane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów (SPF) i zostały uśpione przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2).

1. Izolacja komórek szpiku kostnego myszy od kości piszczelowych i udowych

UWAGA: Kongeniczny szczep myszy C57BL/6 zawiera różnicowy marker leukocytów Ptprca, ogólnie rozpoznawany jako CD45.1 lub Ly5.1, podczas gdy szczepy C57BL typu dzikiego zawierają allel Ptprcb, znany jako CD45.2 lub Ly5.2. Warianty CD45.1 i CD45.2 można odróżnić za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciał. Myszy CD45.1, CD45.2 i CD45.1/CD45.2 mogą być używane jako źródła komórek lub jako biorcy do transferu adoptywnego, co pozwala na śledzenie odrębnych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Preferencyjnie należy używać samców lub samic myszy w wieku poniżej 12 tygodni dopasowanych pod względem wieku i płci.

  1. Przygotowanie kości udowych i piszczelowych
    1. Eutanazja myszy przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami.
    2. Zdezynfekuj kończyny tylne, spryskując powierzchnię zwierzęcia 70% etanolem.
    3. Używaj sterylnych nożyczek, kleszczy i skalpeli. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w skórze i usuń skórę z dystalnej części myszy, w tym skórę pokrywającą tylne kończyny. Obierz skórę wokół dolnej części mięśnia łydki i całkowicie usuń skórę z nóg (Rysunek 2A, 2B).
    4. Oddziel mięsień czworogłowy uda od kości udowej za pomocą skalpela. Zdemaskuj staw biodrowy bez złamania głowy kości udowej. Usuń mięśnie z kości piszczelowej za pomocą skalpela (Rysunek 2C, 2D). Oddziel kość udową od kości piszczelowej bez łamania końców kości.
    5. Trzymaj kości na szalce Petriego zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w lodowatym podłożu 1x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
  2. Izolacja komórek
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać pod kapturem hodowlanym i przy użyciu sterylnego materiału, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    1. Na sterylnej szalce Petriego ostrożnie odetnij skalpelem bliższe i dalsze końce każdej kości.
    2. Kilkakrotnie przepłukać kości całkowitą objętością 10 ml ciepłej, kompletnej pożywki RPMI (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny, 20 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 1 mM pirogronianu sodu i 2 mM L-glutaminy). Przepłukać kości z obu końców za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
    3. Przenieść ścieki do stożkowej rurki o pojemności 50 ml wyposażonej w nylonowy filtr sieciowy o średnicy 70 μm. Ostrożnie usunąć zanieczyszczenia i konglomeraty komórkowe, delikatnie mieszając i pipetując.
    4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego buforu do lizy krwinek czerwonych (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, dostosować pH do 7,2 za pomocą 1 N HCl, 0,4 μm sterylnie przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C). Trzymaj na lodzie przez 5 minut z ręcznym potrząsaniem.
    6. Dodać 10 ml zimnego buforu (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 2 mM EDTA + 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) w celu inaktywacji i wypłukania buforu do lizy czerwonych krwinek.
    7. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Umyć komórki 25 ml pełnej pożywki RPMI i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki RPMI. Zmieszać 50 μl zawiesiny komórek w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym. Określ liczbę komórek w komorze liczącej pod mikroskopem. Oblicz liczbę komórek za pomocą wzoru: Komórki/ml = [(liczba komórek niebarwionych/4) x 2 x 10 000]12.
      UWAGA: Ta metoda daje 40 x 106 do 60 x 106 komórek szpiku kostnego na niezakażoną 8 do 12 tygodniową mysz C57BL/6.
    10. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

2. Różnicowanie, dojrzewanie i ładowanie antygenów DC

  1. Zbieranie komórek BM
    1. Wysiewaj kompletną kulturę na 6-dołkowych płytkach powierzchniowych o bardzo niskim przyleganiu w10-6 komórkach na ml pożywki, zwykle w 5 ml na studzienkę. Zróżnicowane makrofagi przyczepiają się do płytek hodowlanych. Po 12 godzinach przenieś supernatant, który zawiera głównie monocyty, do czystych płytek 6-dołkowych, odrzucając stare płytki 6-dołkowe z przylegającymi makrofagami.
    2. Aby promować różnicowanie komórek, hodować nieprzylegające komórki w 5 x 105 komórek na ml w typie 5 ml na studzienkę kompletnej pożywki RPMI zawierającej 20 ng / ml komercyjnie otrzymanej rekombinowanej mysiej GM-CSF w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2) i obserwować codziennie.
    3. Co 3 dni odwiruj zawieszone komórki i zbierz przylegające komórki z 5 mM EDTA w PBS i odwiruj. Połączyć i ponownie zawiesić w stężeniach 5 x 105 komórek/ml w świeżej pożywce zawierającej 20 ng/ml rm-GM-CSF.
    4. W dniu 8 zebrać przylegające i oderwane komórki, jak powyżej, i ponownie zawiesić w 5 x 105 komórek/ml w pożywce zawierającej 20 ng/mL GM-CSF i 20 ng/ml lipopolisacharydu (LPS) przez 24 godziny na sterylnej szalce Petriego bez hodowli tkankowej, w celu wywołania wysokiej ekspresji MHC-II, CD80 i CD86.
    5. Sprawdź różnicowanie DC za pomocą cytometrii przepływowej, jak wskazano w kroku 2.2.
  2. Analiza różnicowania i dojrzewania cytometrii przepływowej.
    1. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten czyn dwukrotnie.
    2. Blokować receptory Fc poprzez inkubację zawieszonego osadu komórkowego w blokerze mysiego receptora Fc (oczyszczone przeciwciało anty mysie CD16/CD32 IgG2b) przez 15 minut w temperaturze 4 °C zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Dla każdej sondy należy ponownie zawiesić 250 000 komórek w 300 μl buforu cytometrii przepływowej (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieść 30 μl roztworu komórkowego na studzienkę do płytki 96-dołkowej.
    6. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Odrzucić supernatant i dodać 30 μl buforu zawierającego przeciwciała do każdej studzienki zgodnie ze wskazaniami producenta. Inkubować komórki z przeciwciałami przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Zwykle stosowanymi markerami dla DC, monocytów i makrofagów są CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 i CD86 (Figura 3).
    8. Odwirować próbki przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 200 μl na studzienkę buforu do cytometrii przepływowej na zimno zawierającego marker wykluczający martwe komórki (np. jodek propidyny, 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub barwnik reagujący aminami) w zalecanym przez producenta stężeniu13.
    9. Monitoruj różnicowanie komórek, przenosząc próbki do probówek do cytometrii przepływowej i wykonując analizę cytometrii przepływowej z wyłączeniem martwych komórek w dniach 0, 3, 6 i 9.
  3. Ładowanie antygenu DC.
    1. W dniu 8 odwirować próbki o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić granulki w pożywce o pojemności 200 μl (RPMI + 10% FBS bez antybiotyków). Powtórz ten krok dwukrotnie.
    2. Inkubować DC z 10 μg/ml OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) na 1 x 107 DC w 1 ml pożywki (RMPI + 1% FBS) w plastikowej probówce przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C. Jako warunek kontroli ujemnej należy stosować DC nieobciążone OVAp.
    3. Odwirować próbki o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić granulki w 200 μl pełnej pożywki RPMI. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    4. Odwirować próbki przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić granulki w podłożu o pojemności 200 μl (RPMI + 10% FBS) przy 2 x 106 komórek/ml.

3. Izolacja naiwnych limfocytów T CD4 od myszy OTII

UWAGA: Ta metoda daje około 100 x 106 spleenocytów na niezainfekowaną 8 do 12 tygodniową mysz C57BL/6. Można stosować zarówno mężczyzn, jak i kobiety. Limfocyty T CD4 można wyizolować ze śledziony lub węzłów chłonnych; Limfocyty T CD4 stanowią odpowiednio około 25% i 50% komórek w tych narządach. Wykonaj następujące czynności w sterylnych warunkach.

  1. Wyizoluj pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i krezkowe węzły chłonne oraz śledzionę od transgenicznych myszy OTII (ryc. 4) i przenieś je na plastikową szalkę Petriego zawierającą 10 ml kompletnej pożywki RPMI.
  2. Przepłucz sitko komórkowe 2 ml kompletnej pożywki RPMI i wyjmij je z probówki o pojemności 50 ml. Przenieś węzły chłonne i śledzionę do sitka komórkowego o wielkości 70 μm umieszczonego w probówce o pojemności 50 ml. Homogenizować za pomocą tłoka strzykawki (Rysunek 5) i dodać pożywkę do 15 ml.
  3. Odwirować próbki o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 15 ml pełnej pożywki RPMI. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  4. W przypadku zawiesiny komórek śledziony należy ponownie zawiesić osad komórkowy i poddać lizie krwinki czerwone, jak wskazano w kroku 1.2.5.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Umyć komórki 25 ml kompletnej pożywki RPMI i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki. Zmieszać 50 μl zawiesiny komórek w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym. Określ liczbę komórek za pomocą komory liczącej pod mikroskopem. Oblicz liczbę komórek za pomocą wzoru: komórki/ml = [(liczba komórek niebarwionych/4) x 2 x 10 000]12.
  8. Powtórz krok 2.2.2.
  9. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować komórki z rozcieńczeniami biotynylowanych przeciwciał przeciwko CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 i DX5 przez 30 minut na lodzie w celu późniejszej negatywnej selekcji limfocytów T CD4.
  10. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta oraz na podstawie liczby komórek i pojemności kulek, należy obliczyć wymaganą ilość mikrokulek magnetycznych pokrytych streptawidyną i wyizolować limfocyty T CD4 za pomocą magnetycznego separatora komórek i odpowiednich kolumn separacyjnych.
  11. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki RPMI i trzymać je na lodzie podczas liczenia żywych komórek zgodnie z opisem w kroku 3.7.
  12. Ekstrahować 2 x 105 komórek i sprawdzić czystość pobranych komórek za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych anty CD4, CD3, B220 i CD8 w cytometrze przepływowym przy użyciu zalecanych przez producenta rozcieńczeń przeciwciał.
  13. Aby wybarwić izolowane naiwne limfocyty T CD4 / OTII, ponownie zawieś 106 komórek w buforze 500 μl (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA). Przygotuj 500 μl buforu (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) zawierającego dwukrotnie wyższe niż zalecane przez producenta końcowe stężenie barwnika znacznikowego dla komórek. Wymieszaj oba roztwory, powoli dodając roztwór znacznika komórek do zawiesiny komórek. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  14. Umyć komórki 5 ml pełnej pożywki RPMI i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki RPMI przy 1 x 107komórek/ml.

4. Test aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 in vivo

UWAGA: Vital cell tracer dye karboksyfluoresceiny dioctan sukcynimidylu ester (CFSE) i inne barwniki na bazie estrów sukcynimidylowych, które są wzbudzone i emitują fluorescencję na różnych długościach fal, są szeroko stosowane do oceny proliferacji limfocytów za pomocą cytometrii przepływowej ze względu na ich wysoką intensywność fluorescencji, długą żywotność, niską zmienność i niską toksyczność14.

  1. Adoptywnie przenieś (dożylnie) 1 x 106 żywych, ważnych komórek znacznikowych, barwionych barwnikiem, naiwnych limfocytów T CD4 / OTII w 100 μl PBS na mysz. Oznaczone limfocyty T mogą być adoptywnie przenoszone przez żyłę ogonową lub wstrzyknięcie zaoczodołowe15; w obu przypadkach komórki będą domem dla narządów limfatycznych (Ryc. 6A).
  2. Rzuć wyzwanie myszom biorcom dzień później, adoptywnie przenosząc 100 000 dojrzałych w LPS DC załadowanych OVAp przez wstrzyknięcie podskórne (si) w opuszki stóp (Figura 6B).
  3. Pobrać węzły chłonne podkolanowe od myszy biorców i przetwarzać je aż do uzyskania zawiesin jednokomórkowych, wykonując te same czynności, jak opisano poprzednio w ppkt 3.1 i 3.2. Zrób to w 2 dniu po szczepieniu, aby zmierzyć aktywację limfocytów T CD4 / OTII oraz w 5 dniu, aby zmierzyć proliferację i różnicowanie Th1.
  4. Aby przeanalizować aktywację limfocytów T w dniu 2, wybarwić komórki przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko CD4, CD69 i CD25 (opcjonalnie CD45.1 i CD45.2) i określić procent limfocytów T C69 + CD25 + w populacji CD4. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 7).
  5. Aby sprawdzić proliferację limfocytów T w 5 dniu, wybarwij komórki za pomocą odpowiednich przeciwciał fluorescencyjnych przeciwko CD4 i opcjonalnie CD45.1 i CD45.2. Przeanalizuj rozpad sygnału barwnika znacznikowego ważnych komórek w populacji CD4 za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 8). W badaniach tych można określić kilka parametrów, takich jak liczba podziałów komórkowych przechodzących przez komórki znakowane niezbędnym barwnikiem znacznikowym komórek, procent dzielących się komórek w każdym piku fluorescencji oraz procent dzielących się komórek w całej populacji komórek.
  6. Aby określić różnicowanie Th1 w 5 dniu, należy umieścić 400 000 komórek na basenie 96-dołkowej płytki w 200 μl kompletnej pożywki RPMI zawierającej 1 μM jonomycynę i 10 ng/ml octanu mirystynianu 13 forbolu 12 (PMA) przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Przez ostatnie 4 godziny dodawać 3–10 μg/ml brefeldyny A, aby zablokować wydzielanie cytokin do pożywki.
  7. Odwirować płytki przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez szybkie odwrócenie płytki 96-dołkowej.
  8. Powtórz krok 2.2.2.
  9. Wybarwić błony komórkowe przez inkubację przez 15 minut w temperaturze 4 °C w 30 μl buforu (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) zawierającego przeciwciała przeciwko CD4 i opcjonalnie przeciwko CD45.1 i CD45.2 w rozcieńczeniach zalecanych przez producenta. Przepłukać komórki, dodając 150 μl buforu (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) i odwirować płytki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  10. Utrwalić komórki, dodając 100 μl 2% paraformaldehydu/1% sacharozy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować płytki przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  11. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 50 μl wewnątrzkomórkowego buforu permeabilizacji (1x PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponiny) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Dodać 150 μl PBS i wirować przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej stężenia. Odrzucić supernatant.
  13. Wybarwić cytokiny wewnątrzkomórkowe, dodając 30 μl przeciwciała anty IFNγ sprzężonego z fluoroforem w buforze (PBS + 0,1% saponiny) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  14. Przemyj komórki, dodając 150 μl buforu (PBS + 0,1% saponiny). Odwirować płytki przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  15. Analizuj populacje komórek za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 8).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia kroki opisane w niniejszym protokole. Rysunek 2 ilustruje izolację i hodowlę komórek szpiku kostnego (BM) myszy. Dodanie GM-CSF i LPS do tych hodowli umożliwia generowanie i dojrzewanie komórek dendrytycznych (DCs) in vitro. Rysunek 3 przedstawia analizę cytometrii przepływowej różnicowania i dojrzewania uzyskanych DCs. Obciążone OVAp DCs pochodzące z BM hodowane z GM-C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie zdolności DC pochodzących z BM do modulowania aktywacji, proliferacji i różnicowania naiwnych limfocytów T CD4. Co więcej, może być również stosowany do oceny podatności limfocytów T CD4 na modulację przez prądy stałe pochodzące z BM. Dzięki temu protokołowi zmiany w tych zdarzeniach mogą być mierzone in vivo.

W zależności od badanej hipotezy można zastosować kilka kombinacji limfocytów T i DC. Na przykład, można przeanalizować konsekwencje w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Simonowi Bartlettowi za edycję w języku angielskim. Badanie to było wspierane przez granty z Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; Numer identyfikacyjny PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), program Miguel Servet i Fundación Ramón Areces; przy współfinansowaniu ze środków Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). CNIC jest wspierany przez Ministerstwo Gospodarki, Przemysłu i Konkurencyjności (MEIC) oraz Fundację Pro CNIC i jest Centrum Doskonałości Severo Ochoa (SEV-2015-0505). RTF jest założony przez Fundación Ramón Areces i CNIC, VZG przez ISCIII, BHF przez Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), a JMG-G przez ISCIII Miguel Servet Program i imas12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EtanolVWR Chemicals20,824,365L
NożyczkiNarzędzia do nauki (FST)14001-12
KleszczeNarzędzia do nauki precyzyjnej (F.S.T.)11000-13
KleszczeNarzędzia do nauki (FST)11253-20
Skalpeldo narzędzi naukowych (FST)10020-00Pudełko ze 100 ostrzami
Płodowa surowica bydlęcaSIGMAF7524
Penicylina/streptomycynaLONZADE17-602E
Pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI)GIBCO21875-034
Sterylne szalki PetriegoFalcon353003
Igła o rozmiarze 25BD Microlance 3300600
Strzykawka 1 mlNovicoN15663
Probówki stożkowe 15 mlFalcon352096
Probówki stożkowe 50 mlFalcon352098
70 μ m nylonowy filtr wstęgowyBD Falcon352350
Bufor do czerwonej krwiSIGMAR7757100 Ml
EDTASIGMAED2SS-250
Albumina surowicy bydlęcejSIGMAA7906100 g
Błękit trypanowySIGMA302643-25G
Płytki hodowlaneFalcon353003
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)CambrexBE17-737E
Beta-merkaptoetanolMerck8-05740-0250
Pirogronian soduLONZABE13-115E
L-glutaminaLONZABE17-605E
Rekombinowany mysi czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)Prepotech315-03
lipopolisacharyd (LPS)SIGMA-ALDRICHL2018
96-dołkowa płytkaCostar3799
v450 anty-mysie przeciwciało CD11bBD Biosciences560455
PE anty-mysie przeciwciało CD64BioLegend139303
anty-mysie CD115BioLegend135505
FITC anty-myszy Przeciwciało CD11cBioLegend117305
FITC przeciw mysim przeciwciałom MHCIIBioLegend125507
APC przeciwciało przeciw mysim CD86BioLegend105011
APC przeciwciało przeciw mysim CD80Probówki do
Zelian300800-1PS 12X75 5mL
OTII PeptydowoalbuminowyInvivoGen323-339
anty-mysie biotynylowane przeciwciało CD8&alfa;Tonbo Biosciences30-0081-U500
anty-mysie biotynylowane przeciwciało IgMBioLegend406503
anty-mysie biotynylowane B220Tonbo Biosciences30-0452-U500
anty-mysie biotynylowane przeciwciało CD19Tonbo Biosciences30-0193-U500
biotynylowane przeciwciało przeciw myszom MHCII (I-Ab)BioLegend115302
antymysie biotynylowane przeciwciało CD11bTonbo Biosciences30-0112-U500
antymysie biotynylowane przeciwciało CD11cBioLegend117303
biotynylowane przeciwciało anty-mysie CD44BioLegend103003
anty-mysie biotynylowane Przeciwciało CD25Tonbo Biosciences30-0251-U100
antymysie biotynylowane przeciwciało DX5BioLegend108903
mikrokulki magnetyczne pokryte streptawidynąMACS Miltenyi Biotec130-048-101
Magnetyczny separator komórekMACS Miltenyi Biotec130-090-976QuadroMACS Separator
Kolumny separacyjneMACS Miltenyi Biotec130-042-401
PE przeciwciało anty-mysie CD4BioLegend100408
Przeciwciało przeciw myszom CD3BioLegend100235
FITC przeciwciało przeciw myszom CD8Tonbo Biosciences35-0081-U025
Cell Violet TracerThermofisherC34557
Przeciwciało przeciw myszom CD25 APCTonbo Biosciences20-0251-U100
Alexa647 przeciwciało anty-mysie CD69BioLegend104518
Przeciwciało anty-mysie CD45.1 PerCPCY5.5Tonbo Biosciences65-0453
APC przeciwciało anty-mysie CD45.1Tonbo Biosciences20-0453
PECY7 przeciwciało anty-mysie CD45.1Tonbo Biosciences60-0453
FITC anty-myszy CD45.2 przeciwciałoTonbo Biosciences35-0454
JonomycynaSIGMA-ALDRICHI0634
Octan mirystynianu 13 Phorbol 12 (PMA)SIGMAP8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug)BD555029
ParaformaldehydMillipore8-18715-02100
Wewnątrzkomórkowy bufor permeabilizacyjnyeBioscience00-8333
Przeciwciało przeciw myszom IFNg APCTonbo Biosciences20-7311-U100
Blok Fc (anty-mysie CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161-U100
B6. Myszy SJL CD45.1Laboratorium Jacksona002014
BD LSRFortessa™ Analizator komórekBD Biosciences649225
Rozwiązanie DAPIThermofisher62248
5 precyzyjne PE przeciwciało cytometrii przepływowej BioLegend 104713

Bibliografia

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37(2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9(2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591(2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627(2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976(2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja naiwnych limfocytów T CD4adoptywny transfer komórekanaliza cytometrycznaizolacja szpiku kostnegopobieranie węzłów chłonnychproliferacja limfocytów Twewnątrzkomórkowe barwienie cytokinmyszy transgeniczne OTII
Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.