Artykuł metodologiczny

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/58130

⸱

25 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Allen Institute for Cell Science

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), które wyrażają endogenne białka połączone z N- lub C-końcowymi znacznikami fluorescencyjnymi w ramce. Prokariotyczny system CRISPR/Cas9 (zgrupowany regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne/CRISPR-associated 9) może być używany do wprowadzania dużych sekwencji egzogennych do loci genomu poprzez naprawę ukierunkowaną homologią (HDR). Aby osiągnąć pożądany efekt domina, protokół ten wykorzystuje podejście oparte na rybonukleoproteinach (RNP), w którym białko Cas9 Streptococcus pyogenes typu dzikiego, syntetyczny 2-częściowy przewodnik RNA (gRNA) i plazmid matrycy dawcy są dostarczane do komórek za pomocą elektroporacji. Przypuszczalnie edytowane komórki wyrażające fluorescencyjnie znakowane białka są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Następnie generowane są linie klonalne, które można analizować w celu uzyskania precyzyjnych wyników edycji. Wprowadzając znacznik fluorescencyjny w genomowym locus genu będącego przedmiotem zainteresowania, wynikająca z tego subkomórkowa lokalizacja i dynamika białka fuzyjnego mogą być badane pod endogenną kontrolą regulacyjną, co stanowi kluczową poprawę w porównaniu z konwencjonalnymi systemami nadekspresji. Wykorzystanie hiPSC jako modelowego systemu znakowania genów daje możliwość badania znakowanych białek w diploidalnych, nietransformowanych komórkach. Ponieważ hiPSC mogą być różnicowane w wiele typów komórek, takie podejście daje możliwość tworzenia i badania znakowanych białek w różnych izogenicznych kontekstach komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie strategii edycji genomu, zwłaszcza CRISPR/Cas9, do badania procesów komórkowych staje się coraz bardziej dostępne i wartościowe1,2,3,4,5,6,7. Jednym z wielu zastosowań CRISPR/Cas9 jest wprowadzanie (poprzez naprawę kierowaną homologią (HDR)) dużych sekwencji egzogennych, takich jak GFP, do określonych loci genomowych, które następnie służą jako reportery dla aktywności genu lub produktu białkowego8. Technika ta może być wykorzystana do połączenia fluorescencyjnej sekwencji białka z endogenną otwartą ramką odczytu, w której powstałe endogennie regulowane białko fuzyjne może być wykorzystane do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji i dynamiki białka będącego przedmiotem zainteresowania5,6,9,10,11. Podczas gdy endogennie znakowane białka oferują wiele korzyści w porównaniu z systemami nadekspresji, wprowadzanie dużych sekwencji do ludzkiego genomu jest nieefektywnym procesem, zwykle wymagającym strategii selekcji lub wzbogacania w celu uzyskania populacji komórek, które można łatwo zbadać5,12.

Ten protokół opisuje insercję sekwencji DNA kodującej białko fluorescencyjne (FP) do pożądanego locus genomu. Protokół obejmuje zaprojektowanie i dostarczenie plazmidu matrycy dawcy oraz kompleksu rybonukleoproteiny (RNP) (białko Cas9 typu dzikiego S. pyogenes w połączeniu z syntetycznym CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującym crRNA (tracrRNA)). Opisano również wzbogacanie przypuszczalnie edytowanych komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i proces generowania klonalnej linii komórkowej. Do tej pory metoda ta była stosowana do generowania linii hiPSC z monoallelicznymi lub (rzadko) dwuallelicznymi znacznikami białka zielonej fluorescencji (GFP) znakującymi dwadzieścia pięć białek reprezentujących główne struktury komórkowe. Potwierdzono, że uzyskane w wyniku tych wysiłków edytowane komórki mają oczekiwaną insercję genetyczną, wyrażają prawidłowo lokalizujące białko fuzyjne i utrzymują pluripotencję oraz stabilny kariotyp12 (i dane niepublikowane). Metoda ta została również wykorzystana do wygenerowania wielu innych pojedynczych i podwójnych (dwa różne białka oznaczone w tej samej komórce) edytowanych populacji hiPSC (dane niepublikowane).

Ludzkie iPSC pochodzące od zdrowego dawcy zostały wybrane do edycji genomu, ponieważ, w przeciwieństwie do wielu konwencjonalnych linii komórkowych, są one diploidalne, kariotypowo stabilne, nieprzekształcone i proliferacyjne. Właściwości te stanowią atrakcyjny model do badania podstawowej biologii komórki i modelowania chorób. Co więcej, potencjał różnicowania hiPSC daje możliwość równoległego badania wielu etapów rozwojowych w różnych liniach i typach komórek przy użyciu komórek izogenicznych, w tym organoidów, tkanek i modeli "choroby w naczyniu"13,14,15. Chociaż protokół ten został opracowany dla hiPSC (linia WTC), może być przydatny do opracowania protokołów wykorzystujących inne linie komórkowe ssaków.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt in Silico plazmidu crRNA i matrycy dawcy do wbijania FP

  1. Uzyskaj sekwencję referencyjną z adnotacjami z NCBI16 lub UCSC Genome Browser17 (np. format GenBank) interesującego Cię genu i zaimportuj go do wybranego oprogramowania bioinformatycznego. Jeśli wiadomo, że sekwencja genomu gospodarza zawiera warianty względem odniesienia, uwzględnij je teraz, dostosowując sekwencję referencyjną w oprogramowaniu bioinformatycznym (patrz Dyskusja).
  2. Zlokalizuj żądane miejsce wstawienia FP. W przypadku znaczników C-końcowych sekwencja dla znacznika FP zostanie wprowadzona między ostatnią zasadą ostatniego kodonu a pierwszą zasadą kodonu stop. W przypadku znakowania N-końcowego sekwencja znacznika FP będzie zwykle wprowadzana między ostatnią zasadą kodonu start a pierwszą zasadą następnego kodonu. W niektórych przypadkach, na przykład gdy kodon start jest pojedynczym eksonem kodonu lub gdy sekwencja sygnałowa znajduje się w pobliżu końca białka, pożądane miejsce insercji FP może znajdować się w pozycji bardziej 3ʹ, o ile nadal znajduje się w ramce.
  3. Użyj 50 pz z każdej strony żądanego miejsca insercji jako sekwencji wejściowej dla dowolnego publicznie dostępnego narzędzia do projektowania crRNA. Po zidentyfikowaniu 2-4 celów crRNA w pobliżu miejsca insercji, należy opisać miejsca wiązania crRNA i sekwencje motywu przylegającego do protospacera (PAM) (NGG) w oprogramowaniu bioinformatycznym. Te crRNA zostaną wykorzystane do wywołania dwuniciowych pęknięć (zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej wskazówek na temat projektowania crRNA).
    UWAGA: Niestandardowe sekwencje crRNA mogą być przesyłane do syntezy u komercyjnego dostawcy (zalecane) lub sekwencja może być wykorzystana jako punkt wyjścia do zaprojektowania strategii klonowania lub syntezy in vitro, co wykracza poza zakres tego protokołu (patrz Dyskusja).
  4. Aby zainicjować plazmid matrycy dawcy, użyj 1 kb sekwencji przed pożądanym miejscem insercji jako ramienia homologii 5ʹ (powinno to obejmować kodon start dla insercji N-końcowych) i użyj 1 kb sekwencji za pożądanym miejscem insercji jako ramienia homologii 3 (powinno to obejmować kodon stop dla insercji C-końcowych). Zasady między dwoma ramionami homologii zazwyczaj nie są pomijane. Włączenie wariantów specyficznych dla linii komórkowej do ramion homologii pozwoli zachować te warianty genetyczne w powstałych edytowanych komórkach.
  5. Pomiędzy dwoma ramionami homologii wstaw sekwencję dla FP (lub innej sekwencji knock-in) i sekwencję łącznika (zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej wskazówek dotyczących łączników). W przypadku znaczników N-końcowych sekwencja konsolidatora powinna znajdować się bezpośrednio 3ʹ od FP; w przypadku znaczników C-terminal sekwencja konsolidatora powinna znajdować się bezpośrednio 5ʹ od FP.
  6. Zakłócić miejsca wiązania crRNA w plazmidzie matrycy dawcy, aby zapobiec przecięciu Cas9 sekwencji dawcy (patrz Dyskusja, aby zapoznać się z rozważaniami dotyczącymi zmiany miejsc wiązania crRNA). Jeśli to możliwe, preferowane jest zakłócenie PAM do sekwencji innej niż NGG lub NAG. Alternatywnie, przewiduje się, że wprowadzenie mutacji punktowych do trzech zasad w regionie nasiennym crRNA (10 zasad proksymalnie PAM) wystarczająco zakłóci wiązanie crRNA. Niektóre miejsca wiązania crRNA są zakłócone przez wprowadzenie sekwencji FP do plazmidu matrycy dawcy; upewnij się, że w takich przypadkach nadal nie istnieje PAM lub nienaruszony region wiązania.
    UWAGA: Plazmid matrycy dawcy in silico może zostać przesłany do syntezy genów przez komercyjnego dostawcę lub może być wykorzystany jako punkt wyjścia do zaprojektowania strategii klonowania, co wykracza poza zakres tego protokołu. Wystarczy prosta sieć szkieletowa, taka jak pUC19 lub pUC57.

2. Transfekcja rybonukleoprotein (RNP) dla CRISPR/Cas9 Mediated Knock-in w hiPSC

UWAGA: W tym protokole termin 'gRNA' opisuje syntetyczne crRNA i tracrRNA prawidłowo zawieszone, oznaczone ilościowo i wstępnie skompleksowane zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów). Uzupełnij wszystkie pożywki 1% penicyliną Streptomycyną. Ogólne wytyczne dotyczące hodowli linii hiPSC WTC są opisane bardziej szczegółowo na stronie Allen Cell Explorer18,19. W tym protokole stosuje się hiPSC WTC, ale przy odpowiedniej optymalizacji transfekcji, elektroporacja RNP i plazmidu matrycowego dawcy może być z powodzeniem dostosowana do innych typów komórek.

  1. Przygotuj 10 μM zapasów roboczych gRNA i dzikiego typu S. pyogenes Cas9 białko2,20; trzymaj na lodzie. Przygotować 1 μg/μl zapasu roboczego plazmidu matrycowego dawcy; przechowywać w temperaturze pokojowej (RT). Do wszystkich rozcieńczeń należy stosować bufor o pH 8,0 TE.
  2. Przygotować pokrytą matrycą 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z 5 ml świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK (Ri) na dołek. Przechowywać płytkę z pożywką w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu, gdy będzie gotowa do płytki komórek po procedurze transfekcji (maksymalnie 2 godziny).
    UWAGA: Wszystkie płytki pokryte matrycą używane w tym protokole są wytwarzane przez dodanie objętości lodowatego Matrigelu rozcieńczonego w stosunku 1:30 w zimnym pożywce DMEM/F12 zgodnie z protokołem Allen Institute for Cell Science dotyczącym hodowli linii hiPSC WTC19.
  3. Używając delikatnego odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, zgodnie z zaleceniami w Tabeli materiałów, przeprowadź hiPSC do zawiesiny pojedynczej komórki i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
    UWAGA: Szczegółowy protokół dla używanej tutaj linii hiPSC WTC można znaleźć na stronie Allen Cell Explorer19. Krótko mówiąc, umyj komórki raz za pomocą RT DPBS i potraktuj odczynnikiem dysocjacyjnym przez 3-5 minut. Następnie rozdrobnić komórki do zawiesiny jednokomórkowej przez delikatne pipetowanie i granulki przez odwirowanie. Zawiesić osad żywych komórek w pożywce wzrostowej uzupełnionej 10 μM Ri.
    1. Przygotować podwielokrotność 1,84 x 106 komórek dla każdego warunku doświadczalnego, która ma być transfekowana w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Wszystkie objętości są obliczane dla 4,5 μl całkowitej objętości reakcji w 100 μl objętości elektroporacji, razy 2,3 reakcji. Odpowiada to za zduplikowaną transfekcję i nadmiar błędu pipetowania.
  4. Przygotuj probówki z kompleksem rybonukleoproteinowym (RNP) dla każdego warunku doświadczalnego, dodając 2,88 μl 10 μM gRNA i 2,88 μl 10 μM Cas9 do probówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować w temperaturze pokojowej przez minimum 10 minut (maksymalnie 1 godzinę).
  5. Osad jednokomórkowy (przygotowany w kroku 2.3.1) w temperaturze 211 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 220 μl buforu elektroporacyjnego producenta.
  6. Dodać 220 μl zawieszonych komórek z kroku 2.5 do 1,5 ml probówki złożonej RNP przygotowanej w kroku 2.4.
  7. Dodać 4,60 μl plazmidu matrycy dawcy 1 μg/μl do probówki o pojemności 1,5 ml przygotowanej w kroku 2.4.
  8. Za pomocą końcówki do nukleofekcji i pipety wymieszać zawartość probówki 2-3 razy, a następnie przenieść 100 μl zawiesiny do przygotowanego urządzenia do elektroporacji. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do końcówki. Zastosuj 1300 V dla 1 impulsu 30 ms.
  9. Delikatnie przenieść zawiesinę do przygotowanej płytki 6-dołkowej z kroku 2.2 ruchem wirowym. Rozprowadź komórki, delikatnie przesuwając płytkę z boku na bok i z przodu do tyłu.
  10. Używając nowej końcówki do nukleofekcji, powtórzyć kroki 2,8-2,9 z pozostałymi 100 μl zawiesiny i przenieść do drugiego dołka przygotowanej płytki 6-dołkowej.
    1. Powtórz kroki od 2.4 do 2.10 dla każdej kombinacji gRNA i plazmidu matrycy dawcy, w tym niedocelowego gRNA, tylko plazmidu matrycy dawcy i kontroli tylko buforowej. Należy pamiętać o wymianie końcówek pipet i nukleofekcji, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
  11. Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 24 godzinach należy zmienić pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową (bez Ri) i kontynuować podawanie hiPSC co 24 godziny przez 72-96 godzin, monitorując zbieg. Gdy hiPSC osiągną 60-80% konfluencji, przejdź do kroku 3.
    UWAGA: Śmierć komórek ciężkich (>70%, szacunkowo) jest normalna 24-48 godzin po transfekcji.

3. FACS-Wzbogacenie przypuszczalnie edytowanych hiPSC

Uwaga: Podczas sortowania komórek macierzystych, dostosuj ustawienia instrumentu, aby promować przeżywalność komórek, jak sugerowano w Dyskusji. Krótko mówiąc, należy użyć największej możliwej dyszy (130 μm), niskiego natężenia przepływu (≤ 24 μl/min), płynu osłonowego bez konserwantów (takiego jak sól fizjologiczna, patrz tabela materiałów) i niskiego ciśnienia próbki (10 psi).

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu FACS należy zmienić pożywkę na pożywkę wzrostową uzupełnioną 10 μM Ri i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-4 godziny, aby zwiększyć przeżycie po FACS.
  2. Używając delikatnego odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, zgodnie z zaleceniami w Tabeli materiałów, przeprowadź hiPSC do zawiesiny pojedynczej komórki w pożywce wzrostowej uzupełnionej 10 μM Ri19.
  3. Filtruj zawiesinę hiPSC przez filtr siatkowy 35 μm do polistyrenowych rurek okrągłodennych.
  4. Sortuj komórki przy użyciu rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego (w tym wysokości i szerokości), aby wykluczyć zanieczyszczenia i dublety. Użyj aktywnych komórek kontrolnych tylko z buforem, aby ustawić bramkę FP-dodatnią, tak aby <0,1% komórek tylko buforowych znajdowało się w bramce.
  5. Sortuj całą populację komórek FP-dodatnich do probówki polipropylenowej o pojemności 1,5-15 ml zawierającej 0,5-2 ml pożywki wzrostowej RT uzupełnionej 10 μM Ri.
    UWAGA: Polipropylen zmniejsza możliwość przylegania komórek do tworzywa sztucznego.
  6. Odwirować zebrane komórki przy 211 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 μM Ri. Przenieś do 3 000 posortowanych komórek do jednego dołka świeżej, pokrytej matrycą 96-dołkowej płytki19.
    UWAGA: Przy odpowiedniej konfiguracji urządzenia, komórki można również sortować (luzem) bezpośrednio do pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej pokrytej matrycą, zawierającej 200 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 μM Ri o zalecanej gęstości 1,000-3,000 komórek na studzienkę dla hiPSC.
  8. Inkubować posortowane komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmienić pożywkę na pożywkę wzrostową uzupełnioną 5 μM Ri po 24 godzinach. Po 48 godzinach rozpocznij karmienie komórek regularnymi pożywkami wzrostowymi (bez Ri) co 24 godziny przez 72-96 godzin, monitorując zbieganie. Szacuje się, że przeżycie po FACS jest większe niż 50%, jeśli co najmniej 500 komórek zostanie wysianych w jednym dołku na 96-dołkowej płytce.
    1. Gdy hiPSC osiągną 60-80% konfluencji i wykażą dojrzałą morfologię (gładkie, dobrze upakowane centra kolonii), przejdź do płytki o większym formacie, takiej jak płytka 24-dołkowa, a następnie z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej.
    2. Gdy hiPSC w płytce 6-dołkowej osiągną 60-80% konfluencji i wykażą dojrzałą morfologię, rozpręż się do płytki 100 mm, ponownie płytkuj do obrazowania, kriorezerwy lub zasiewu przy gęstości zbioru klonów (krok 4)19.

4. Generowanie przypuszczalnie edytowanych linii klonalnych hiPSC

  1. Używając delikatnego odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, zgodnie z zaleceniami w Tabeli Materiałów, przeprowadź hiPSC do zawiesiny jednokomórkowej i określ liczbę komórek na ml19.
  2. Zasiaj 10 000 komórek edytowanej populacji hiPSC na świeżej, pokrytej matrycą 100-milimetrowej szalce do hodowli tkankowej przy użyciu pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 μM Ri19. Zmień pożywkę na pożywkę wzrostową bez Ri 24 godziny po wysiewie i podawaj hiPSC świeżą pożywką wzrostową co 24 godziny przez 5-7 dni.
  3. Gdy hiPSC utworzą kolonie, które są widoczne makroskopowo (około 500 μm), są wystarczająco duże, aby można je było wyizolować. Przygotować pokrytą matrycą 96-dołkową płytkę, odsysając nadmiar matrycy i dodając 100 μL pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 μM Ri na dołek19.
  4. W mikroskopie preparacyjnym użyj pipety P-200 lub podobnej, aby delikatnie zeskrobać i zassać poszczególne kolonie z powierzchni płytki. Przenieś objętość (~20-100 μl) zawierającą kolonię do pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki przygotowanej w kroku 4.3.
    1. Po przeniesieniu wszystkich kolonii należy inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C i 5%CO2. Zmień pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową (bez Ri) po 24 godzinach i kontynuuj karmienie komórek co 24 godziny przez 72-96 godzin, aż kolonie osiągną około trzykrotny rozmiar (około 1500 μm).
      UWAGA: Zaleca się pobranie 24-96 kolonii na crRNA użyte w transfekcji. Przeżywalność izolowanych klonów jest zwykle większa niż 95%.
  5. Używając delikatnego odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, zgodnie z zaleceniami w Tabeli Materiałów, klony hiPSC przechodzą do nowej, pokrytej matrycą 96-dołkowej płytki w następujący sposób19.
    1. Za pomocą 8-kanałowego aspiratora wyjmij i wyrzuć pożywkę z pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej.
    2. Za pomocą pipety wielokanałowej P-200 dodaj ~200 μl DPBS do pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej, aby przepłukać komórki. Za pomocą 8-kanałowego aspiratora usuń i wyrzuć płyn do płukania DPBS z pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej P-200 dodaj 40 μl odczynnika dysocjacyjnego do pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej.
    4. Powtórz kroki 4.5.1-4.5.3 dla łącznie do sześciu kolumn płytki 96-dołkowej, zmieniając końcówki, aby upewnić się, że studzienki nie zostaną zanieczyszczone krzyżowo. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3-5 minut od momentu dodania odczynnika dysocjacyjnego do pierwszej kolumny (etap 4.5.3).
      UWAGA: Zaleca się przejście maksymalnie przez sześć kolumn (48 studzienek) na raz ze względu na czas potrzebny na wykonanie tych kroków. Wykonując ten protokół po raz pierwszy, zacznij od przejścia tylko jednej lub dwóch kolumn na raz. Ograniczenie liczby kolumn przechodzących jednocześnie zapewnia, że komórki nie pozostają zbyt długo w odczynniku dysocjacyjnym, co mogłoby być szkodliwe dla hiPSC.
    5. Gdy komórki w pierwszej kolumnie płytki zaczną odrywać się od dna płytki, użyj pipety wielokanałowej P-200, aby dodać 160 μl DPBS do pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej i delikatnie rozcierać komórki w pozycjach "12:00", "3:00", "6:00" i "9:00" każdej studzienki. Przenieść całą objętość zawiesiny komórek (200 μl) na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V.
    6. Powtórzyć krok 4.5.5 dla pozostałych kolumn komórek, w których znajduje się odczynnik dysocjacyjny; zmienić końcówki, aby nie zanieczyszczać krzyżowo studzienek.
    7. Obracać dolną płytkę w kształcie litery V w wirówce o masie 385 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    8. Za pomocą pipety wielokanałowej P-200 delikatnie usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 200 μl świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 μM Ri na studzienkę. Powtórz dla wszystkich studzienek, zmieniając końcówki, aby nie zanieczyszczać krzyżowo.
    9. Przenieść całą zawiesinę komórek na świeżą, pokrytą matrycą płytkę 96-dołkową19. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmień pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową (bez Ri) po 24 godzinach i kontynuuj karmienie komórek co 24 godziny przez 72-96 godzin, aż większość klonów osiągnie 60-80% konfluencji.
      UWAGA: To przejście pomaga rozprowadzić komórki i pozwala na większy wzrost na całej powierzchni płytki 96-dołkowej.
  6. Obserwuj klony i określ odpowiedni stosunek podziału dla każdego pojedynczego klonu w 96-dołkowej płytce (np. 1:10 lub 1:8). Używając delikatnego odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, zgodnie z sugestią zawartą w Tabeli materiałów, należy przemieścić klony hiPSC do nowej, pokrytej matrycą 96-dołkowej płytki (kroki 4.5.1-4.5.8), przenosząc stosunek zawiesiny komórek odpowiedni dla każdego klonu. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C i 5% CO2 . Zmień pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową (bez Ri) po 24 godzinach i kontynuuj karmienie komórek co 24 godziny przez 72-96 godzin, aż większość klonów osiągnie 60-80% konfluencji i wykaże dojrzałą morfologię.
    UWAGA: Każdy klon może mieć inny współczynnik podziału ze względu na nieco inne tempo wzrostu lub przeżycie w porównaniu z poprzednim pasażem, więc ten fragment pomaga znormalizować liczbę komórek na studzienkę każdego klonu dla następnego etapu zamrażania. Ze względu na różne wskaźniki przeżycia i wzrostu, niektóre klony mogą przerosnąć lub nie urosnąć podczas tych etapów przejścia.
    1. Zachowaj pozostałą część zawiesiny komórkowej i osadu do izolacji gDNA poprzez odwirowanie komórek na 96-dołkowej płytce z dnem V o sile 385 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant i przystąp do izolacji gDNA za pomocą zestawu 96-dołkowego lub przechowuj płytkę z granulowanymi komórkami w temperaturze -20°C przez okres do trzech tygodni.

5. Kriokonserwacja klonalnych linii komórkowych w formacie 96-dołkowej płytki

  1. Używając odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, klony hiPSC pasażują zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 4.5.1-4.5.7). Odessać supernatant za pomocą pipety wielokanałowej P-200 i ponownie zawiesić w 60 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 μM Ri. Powtórz dla wszystkich dołków; Zmień wskazówki, aby nie zanieczyszczać krzyżowo.
  2. Przenieść 30 μl zawiesiny komórkowej na 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej bez pokrycia matrycą. Następnie szybko dodaj 170 μl buforu zamrażającego (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki, bez mieszania. Czynność powtórzyć, przenosząc pozostałe 30 μl zawiesiny do płytki siostrzanej i dodając 170 μl buforu zamrażającego.
    UWAGA: Proces ten odbywa się na zduplikowanych płytkach siostrzanych, tak aby po rozmrożeniu jednej z pojedynczych płytek istniała zapasowa populacja komórek. Umieszczenie komórek kriokonserwowanych tylko w co drugiej kolumnie 96-dołkowej płytki pozwala na szybsze rozmrażanie (krok 5.6).
  3. Owiń talerz parafilmem i umieść w pudełku RT Styrofoam z pokrywką. Umieść całe pudełko w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  4. Po 24 godzinach płyty można wyjąć z pudełka styropianowego i przechowywać w temperaturze -80°C do czterech tygodni.
    UWAGA: Podczas gdy komórki są tymczasowo przechowywane w temperaturze -80 °C, genetyczne testy kontroli jakości mogą być przeprowadzane z gDNA pobranym z komórek uzyskanych w kroku 4.6.1 w celu identyfikacji klonów do dalszego rozmrażania i rozmnażania, jak omówiono w wcześniej opublikowanej pracy12. Krótko mówiąc, cyfrowy test PCR z liczbą kopii może być użyty do identyfikacji klonów, które zawierają jedną lub dwie kopie GFP i nie mają integracji szkieletu plazmidu z matrycą dawcy. Połączenie testów PCR w punkcie końcowym i sekwencjonowania Sangera może następnie zidentyfikować klony, które zawierają precyzyjną wstawkę.
  5. Aby rozmrozić, doprowadzić całą płytkę do temperatury 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych, uważnie obserwując, czy granulki lodu się topią. Zagłębienia na krawędzi talerza mają tendencję do rozmrażania się jako pierwsze.
    1. Gdy osad lodu z pożądanego klonu topi się, delikatnie przenieś całe 200 μl do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml pożywki wzrostowej RT uzupełnionej 10 μM Ri i odwiruj przy 211 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 1 ml pożywki wzrostowej RT uzupełnionej 10 μM Ri. Przenieść na świeżą, pokrytą matrycą płytkę 24-dołkową i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmień pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową (bez Ri) po 24 godzinach i kontynuuj karmienie komórek co 24 godziny przez 72-96 godzin, aż klon osiągnie 60-80% konfluencji i osiągnie dojrzałą morfologię19.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego eksperymentu było połączenie mEGFP (monomeric enhanced GFP) z białkiem laminy jądrowej B1 poprzez wprowadzenie sekwencji mEGFP do końca 5ʹ genu LMNB1 (N-koniec białka). Łącznik (sekwencja aminokwasowa SGLRSRAQAS) został wybrany na podstawie poprzednich konstruktów cDNA z Michael Davidson Fluorescent Protein Collection21. Ponieważ region wiążący crRNA w plazmidzie matrycy dawcy dla każdego kandydującego crRNA został zakłócony po insercji in silico mEGFP i sekwencji łącznikowej, nie trzeba było dokonywać mutacji punktowych, aby zakłócić potencjalne rozpoznawanie i szczepienie crRNA przez Cas9 sekwencji dawcy (Figura 1). Sekwencja dawcy zawierała ramiona homologii 1 kb flankujące oba końce sekwencji mEGFP-linker. Uzyskane w ten sposób 2734 pz DNA sklonowano do szkieletu pUC57, zweryfikowano sekwencję, a powstały plazmid matrycy dawcy oczyszczono przy użyciu maxi prepu wolnego od endotoksyn. Plazmid matrycy dawcy i kompleks RNP transfekowano, przypuszczalnie edytowane komórki zostały wzbogacone, a lokalizacja białka fuzyjnego mEGFP-jądrowej laminy B1 została potwierdzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Ryc. 2). Opisano tutaj tylko wyniki transfekcji crRNA1, chociaż obie sekwencje crRNA dały przypuszczalnie edytowane populacje12.

W porównaniu z kontrolą negatywną, która nie zawierała gRNA, białka Cas9 ani plazmidu matrycy dawcy w reakcji elektroporacji (tylko bufor), transfekowane komórki crRNA1 LMNB1 zawierały 0,95% komórek mEGFP-dodatnich reprezentujących przypuszczalnie edytowaną populację mEGFP-jądrowej laminy B1 (Rysunek 3a). Wynik ten mieścił się w zakresie efektywności knock-in obserwowanej w wielu loci genomowych przy użyciu tej metody, jak wcześniej informowano12.

Komórki mEGFP-dodatnie zostały wyizolowane przez FACS i zobrazowane za pomocą mikroskopii na żywo, aby potwierdzić oczekiwaną lokalizację białka fuzyjnego mEGFP-jądrowej laminy B1 do otoczki jądrowej. Po wzbogaceniu FACS około 90% posortowanych komórek z populacji crRNA1 LMNB1 było mEGFP-dodatnich (jak określono za pomocą mikroskopii), co sugeruje, że niektóre komórki mEGFP-ujemne współoczyszczały się z komórkami GFP-dodatnimi podczas procedury sortowania. Był to akceptowalny poziom wzbogacenia, który pozwolił na wybranie 96 klonów, które następnie mogły zostać poddane badaniom genetycznym w celu udanej edycji. Ogólnie rzecz biorąc, wartość graniczna dla udanego wzbogacenia wynosi 50% dodatnia wartość GFP.

Większość posortowanej populacji komórek wykazywała fluorescencję na otoczce jądrowej (peryferii jądrowej) w komórkach niedzielących się oraz na rozszerzonej blaszce jądrowej w cytoplazmie podczas mitozy, co dawało pewność co do poprawnej edycji genomu w locus LMNB1. Wzbogacona populacja zawierała komórki o jasnym lub słabym sygnale. Ta różnica w intensywności sygnału może odzwierciedlać kombinację prawidłowych i nieprawidłowych wyników edycji i podkreśla użyteczność generowania genetycznie potwierdzonej linii klonalnej do dalszych badań (patrz Dyskusja) (Rysunek 3b)12. Po wygenerowaniu linii klonalnej, genetycznie zwalidowane komórki wykazały jednolitą intensywność GFP w eksperymentach mikroskopowych (Rysunek 3c).

figure-results-1
Rysunek 1. Strategia projektowania znakowania genu LMNB1 metodą N-końcowego GFP. Znacznik GFP został zaprojektowany do insercji N-końcowej 5ʹ pierwszego eksonu LMNB1 znajdującego się na chromosomie 5. Ramiona homologii 5ʹ i 3ʹ mają rozmiar 1 kb każde i spotykają się między kodonem start (ATG) a drugim kodonem (ramiona homologiczne są tylko częściowo przedstawione na rysunku). Dwa kandydujące crRNA zostały zaprojektowane tak, aby poprowadzić Cas9 do rozszczepienia jak najbliżej zamierzonego miejsca insercji, zachowując jednocześnie unikalny charakter w genomie. Sekwencja dla mEGFP i łącznika aminokwasów została wstawiona tylko 3ʹ kodonu start (sekwencja mEGFP i łącznika nie jest skalowana). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Przepływ pracy do produkcji endogennie znakowanych linii klonalnych hiPSC. Składniki transfekcji, w tym kompleks RNP Cas9 / crRNA / tracrRNA (pokazany jako czerwone białko Cas9 ze złotym crRNA i fioletowym tracrRNA), plazmid matrycy dawcy zawierający ramiona homologii (HA, pokazane na złoto) i sekwencja FP + linker (pokazana na zielono), zostały poddane elektroporacji. Po 4 dniach, przypuszczalnie edytowane komórki FP-dodatnie zostały wzbogacone przez FACS i rozszerzone jako populacja poprzez wysiew wszystkich posortowanych komórek do pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki (~ 1000 komórek), a następnie namnażone w hodowli, aż robocza populacja kilku milionów komórek może zostać oznaczona jako "wzbogacona populacja" (patrz krok protokołu 3.8). Wydajność komórek FP-dodatnich różni się w zależności od eksperymentu ze względu na zmienne dawki HDR12; udane wzbogacenie może zwykle obejmować ~ 300-5,000 komórek po transfekcji około 1,6 x 106 komórek hiPS. Wstępne badania obrazowe potwierdziły sygnał i lokalizację białka fuzyjnego w wzbogaconej populacji. Kolonie zostały ręcznie pobrane na 96-dołkową płytkę w celu ekspansji i kriokonserwacji. Dalsze badania przesiewowe kontroli jakości genomu przy użyciu kropelkowego cyfrowego PCR (ddPCR) i innych testów opartych na PCR zostały następnie wykorzystane do identyfikacji prawidłowo edytowanych klonów, jak opisano wcześniej12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Wzbogacanie przypuszczalnie edytowanych populacji komórek. (A) Wykresy cytometrii przepływowej komórek edytowanych przez LMNB1 cztery dni po transfekcji. Oś y wyświetla intensywność GFP, a oś x wyświetla rozproszenie do przodu. Bramki sortowania zostały ustawione w oparciu o kontrolkę tylko buforową. Ponieważ hiPSC są wrażliwe na zakłócenia, pominięto żywą/martwą plamę, a zamiast niej zastosowano bardzo konserwatywną bramkę FSC/SSC. (B) Po wzbogaceniu populacja komórek edytowanych przez LMNB1 Cr1 wykazała ~ 90% komórek z GFP zlokalizowanych w otoczce jądrowej (oczekiwana lokalizacja LMNB1). Populacja zawierała komórki o różnym nasileniu GFP, a także niektóre komórki GFP-ujemne. Paski skali mają 10 mikronów. (C) Po wygenerowaniu linii klonalnej komórki wykazywały jednolitą intensywność GFP, z pewnymi różnicami zależnymi od cyklu komórkowego. Skala wynosi 20 mikronów.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda generowania endogennie regulowanych fuzji białek fluorescencyjnych w hiPSC jest wszechstronnym i potężnym podejściem do generowania linii komórkowych z edytowanymi genami o zastosowaniach od obrazowania żywych komórek po różne badania funkcjonalne i modele "choroby w naczyniu" przy użyciu linii hiPSC pochodzących od pacjenta 13,14,15. Chociaż metoda ta została wykorzystana do wprowadzenia dużych znaczników FP do N- lub C-końca endogennych białek, może być potencjalnie wykorzystana do wprowadzenia innych znaczników lub małych zmian genetycznych w celu modelowania lub korygowania mutacji powodujących chorobę22,23. W przypadku mniejszych insertów rozmiar ramienia homologii może być zmniejszony, ale ogólne podejście do edycji przedstawione w tej metodzie może nadal mieć zastosowanie24,25. Chociaż zdecydowanie zaleca się stosowanie hiPSC ze względu na ich ogromną użyteczność, przy starannej optymalizacji, protokół ten może zostać dostosowany do edycji genomów innych linii komórkowych ssaków.

Podczas identyfikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania do znakowania FP, oszacowania obfitości transkryptów (na podstawie danych z mikromacierzy lub RNA-Seq) są dobrym punktem wyjścia do oceny, czy gen lub izoforma będąca przedmiotem zainteresowania jest wyrażana, chociaż poziomy transkryptów nie zawsze korelują z poziomami białka. Opisana tutaj strategia wzbogacania FACS będzie działać najlepiej w przypadku genów, które są co najmniej umiarkowanie dobrze wyrażone w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Strategia ta okazała się również skuteczna w selekcji fuzji, które wykazują punktowe i/lub dyskretne wzorce lokalizacji, takie jak centryna, desmoplakina i paxillina, gdzie stosunek sygnału do tła jest bardzo niski12,19. Geny, które nie są wysoce eksprymowane lub ulegają ekspresji tylko w pochodnych typach komórek, mogą wymagać dodatkowych strategii selekcji.

Punktem wyjścia dla projektów plazmidów crRNA i matryc dawcy stosowanych w ludzkich liniach komórkowych powinien być ludzki genom referencyjny (GRCh38). Ponieważ genomy różnych linii komórkowych mogą różnić się w obrębie tego samego gatunku, a CRISPR/Cas9 jest specyficzny dla sekwencji, niezwykle pomocne jest zidentyfikowanie wariantów specyficznych dla linii komórkowej (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu lub insercje/delecje (indele), które różnią się od genomu referencyjnego i włączenie ich do projektu. Gwarantuje to, że crRNA będą kompatybilne z genomem gospodarza i że ramiona homologii plazmidu matrycy dawcy zachowają wszelkie warianty specyficzne dla linii komórkowej. Sugerowaną strategią jest włączenie wariantów homozygotycznych do crRNA i ramion homologii plazmidu matrycy dawcy podczas procesu projektowania. Włączenie wariantów heterozygotycznych jest opcjonalne. Konkretne odczynniki używane w dużych eksperymentach knock-in i inne kluczowe kwestie dotyczące tego protokołu omówiono poniżej.

Białko Cas9

Główną korzyścią ze stosowania białka Cas9 jest to, że wykazano, że wprowadzenie Cas9 i gRNA jako kompleksu RNP powoduje ograniczony czas trwania aktywności nukleazy w porównaniu z podejściami opartymi na plazmidach, w których ekspresja Cas9 i gRNA może trwać przez kilka dni i prowadzić do większej aktywności na miejscu i poza celem26,27. Dodatkową korzyścią płynącą ze stosowania białka Cas9 jest to, że jest ono łatwo dostępne do rozszczepienia po wejściu do komórek. Kontrastuje to z bardziej konwencjonalnymi metodami wykorzystania mRNA Cas9 lub plazmidu Cas9 / gRNA, które wymagają transkrypcji, translacji i przetwarzania białek26,28. Białko Cas9 S. pyogenes typu dzikiego jest obecnie dostępne z wielu źródeł komercyjnych.

Przewodnik RNA

Istnieje wiele publicznie dostępnych narzędzi do znajdowania celów crRNA w pobliżu pożądanego miejsca insercji FP, które mają zero lub niewiele przewidywanych celów poza celami w genomie gospodarza 29,30,31,32. Wydajność HDR i precyzja wyniku HDR różnią się znacznie między celami crRNA stosowanymi w danym locus12. Z tego powodu zaleca się testowanie kilku crRNA (2-4 i najlepiej w odległości 50 pz od pożądanego miejsca insercji) na locus, ponieważ może to zwiększyć prawdopodobieństwo udanego eksperymentu edycyjnego. Obecne możliwości dostarczania gRNA obejmują syntetyczne 2-częściowe crRNA i tracrRNA, syntetyczne pojedyncze gRNA (sgRNA), transkrybowane in vitro sgRNA lub dostarczanie plazmidu do komórek wyrażających sgRNA z promotora U6. Protokół ten nie został zoptymalizowany pod kątem wysokiej aktywności rozszczepienia. Niezmodyfikowane 2-częściowe crRNA i tracrRNA (patrz tabela materiałów) zostały użyte w celu wygenerowania monoallelicznych linii komórkowych znakowanych FP przy jednoczesnym powodowaniu najmniejszych potencjalnych zakłóceń w komórkach.

Plazmid szablonu dawcy

Ponieważ część sekwencji ramienia homologicznego dostarczonej w plazmidzie matrycy dawcy zostanie włączona do genomu gospodarza podczas zdarzenia HDR, należy wprowadzić mutacje punktowe w miejscach rozpoznawania crRNA, aby zapobiec dalszemu rozszczepianiu przez Cas9 po HDR. Często najprostszą destrukcyjną zmianą jest mutacja sekwencji PAM. Ponieważ niektóre niekanoniczne sekwencje PAM mogą być nadal rozpoznawane przez dziki typ S. pyogenes Cas9, najlepiej jest unikać używania NGG, NAG lub NGA33. Podczas mutacji ramienia homologicznego należy unikać mutacji niesynonimicznych i wprowadzania rzadkich kodonów. Jeśli synonimiczna zmiana sekwencji PAM nie jest możliwa, rozważ wykonanie trzech synonimicznych mutacji punktowych w regionie nasiennym (10 pz proksymalnie do PAM) miejsca wiązania crRNA. Należy zachować szczególną ostrożność przy wprowadzaniu tych zmian w regionie nieulegającym translacji 5ʹ (UTR), ponieważ regiony te mogą zawierać ważne sekwencje regulatorowe. Zapoznanie się z bazą danych o ochronie genetycznej, taką jak ścieżki genomiki porównawczej UCSC Genome Browser, może dostarczyć wskazówek w takich przypadkach, ponieważ zmiany w niekonserwatywnych zasadach mogą być lepiej tolerowane niż zmiany w wysoce konserwatywnych zasadach17. Czasami samo wprowadzenie sekwencji FP wystarczy, aby zakłócić miejsce wiązania crRNA (jak na rysunku 1); jednak nowo dołączoną sekwencję należy sprawdzić pod kątem trwałości wiązania crRNA i sekwencji PAM.

Łączniki aminokwasowe między FP a białkiem natywnym są zalecane w celu zachowania funkcji białka fuzyjnego34. Często łącznik aminokwasów może być wybrany ze względu na jego konkretny ładunek lub rozmiar. Jeśli fuzja cDNA o konstrukcji podobnej do docelowego endogennego białka fuzyjnego została dobrze zbadana, ta sama sekwencja łącznikowa może być wykorzystana w eksperymencie knock-in CRISPR/Cas9 12,19. Jeśli takie informacje nie są dostępne, z powodzeniem zastosowano również krótki linker, taki jak GTSGGS12. Inne badania wykazały sukces z generyczną małą sekwencją łącznika 3-aminokwasowego dla różnych celów35.

Transfekcja i wzbogacanie FACS

Wiele dostępnych na rynku odczynników do transfekcji jest opracowanych do dostarczania określonych typów cząsteczek do komórek, podczas gdy system elektroporacji może być używany do dostarczania odczynników o szerokim zakresie rozmiarów, ładunków i składu. Oprócz tego, że jest powszechną metodą transfekcji dla komórek trudnych do transfekcji, takich jak hiPSC, elektroporacja niesie ze sobą również korzyść w postaci dostarczania wszystkich trzech składników do knock-inu FP za pośrednictwem CRISPR/Cas9, jak opisano w tej metodzie. Stwierdzono, że elektroporacja daje najlepsze wyniki w porównaniu z innymi dostępnymi na rynku odczynnikami podczas opracowywania tej metody (dane nie pokazane), a także była stosowana przez innych do dostarczania RNP 26,28,36.

Podczas korzystania z tego protokołu do edycji hiPSC należy zwrócić szczególną uwagę na zapewnienie delikatnego obchodzenia się z komórkami przed i po procesie edycji genów w celu optymalnego przeżycia komórek i zminimalizowania spontanicznego różnicowania. W szczególności metody wzbogacania FACS powinny być dostosowane do sortowania komórek macierzystych przy użyciu możliwie największej dyszy (130 μm), niskiego natężenia przepływu (≤24 μl/min), płynu osłonkowego bez konserwantów (takiego jak sól fizjologiczna, patrz tabela materiałów) i niskiego ciśnienia próbki (10 psi). Zamiast sortowania pojedynczych komórek, które skutkuje nieoptymalną żywotnością komórek macierzystych, hiPSC wzbogacone w FACS są sortowane luzem i namnażane jako populacja w celu optymalizacji żywotności komórek i integralności komórek macierzystych. Jednak sortowanie pojedynczych komórek może być odpowiednie dla mniej wrażliwych typów komórek. Aby zapewnić przetrwanie komórek, komórki są zwracane do hodowli nie później niż godzinę po pobraniu w celu wzbogacenia FACS i utrzymywane w temperaturze pokojowej przez cały proces sortowania. W przypadku niektórych typów komórek przeżywalność komórek może być również zwiększona przez inkubację komórek w lodzie (4°C) przez cały proces sortowania.

Masowa ekspansja komórek FP-dodatnich daje możliwość oceny populacji poprzez analizę obrazową lokalizacji białka fuzyjnego przed wygenerowaniem linii klonalnych. Chociaż uzyskana w ten sposób wzbogacona populacja komórek może być wystarczająca dla niektórych badań, populacje te często wykazują sygnał FP o różnej intensywności. Izolowane linie klonalne mają jednolity sygnał (ryc. 3), co czyni je bardziej odpowiednimi do eksperymentów funkcjonalnych12.

Generowanie klonalnej linii komórkowej

W całym procesie edycji i generowania linii klonalnych ważne jest monitorowanie morfologii komórki. Rodziny hiPSC hodowane w warunkach bezkarmowych powinny charakteryzować się gładkimi krawędziami i równym, dobrze upakowanym środkiem 12,18,19. Zróżnicowane komórki należy obserwować w mniej niż 5% hodowli. Wybierając poszczególne kolonie, wybieraj te, które wykazują dobrą morfologię. Podczas pasażowania płytki 96-dołkowej należy sprawdzić klony pod kątem morfologii i przerwać te, które przerosły, ponieważ może to prowadzić do różnicowania lub wskazywać na niestabilność genetyczną.

Generowanie klonalnych linii komórkowych pozwala na genetyczne potwierdzenie precyzyjnej edycji, co jest ważne, ponieważ wywołane przez Cas9 podwójne pęknięcia nici w genomie są często naprawiane nieprecyzyjnie, pomimo włączenia znacznika do pożądanego locus. Wcześniej opisane testy oparte na PCR wykazały, że łącznie w dziesięciu unikalnych loci genomowych wiele (45%) klonów wykazujących ekspresję FP cierpiało na integrację szkieletu plazmidu dawcy w docelowym locus lub (rzadko) losowo w genomie12. Ponadto stwierdzono, że 23% klonów GFP-dodatnich (n = 177) w dziesięciu unikalnych loci zawiera mutacje w przewidywanym miejscu cięcia crRNA w nieoznakowanym allelu lub w jego pobliżu, najprawdopodobniej z powodu NHEJ12. Ta analiza genetyczna wielu linii klonalnych (~100 klonów / edycję) podkreśliła znaczenie walidacji genetycznej, która nie jest możliwa w populacji komórek, ponieważ sama ekspresja FP i oczekiwana lokalizacja białka fuzyjnego nie gwarantują precyzyjnej edycji12. Ponadto te testy oparte na PCR nie mogą być przeprowadzone na wzbogaconej populacji komórek z całą pewnością, co uzasadnia potrzebę generowania linii klonalnej przed zakończeniem miarodajnej analizy. Genetyczne potwierdzenie wstawionego znacznika FP i weryfikacja integralności genetycznej nieedytowanego allelu (w monoallelicznym edytowanym klonie) są niezbędne, aby zapewnić precyzyjną edycję w docelowym locus poza ekspresją znacznika.

Do tej pory przy użyciu tej metody zaobserwowano niski wskaźnik edycji biallelicznej i brak mutacji poza celem (zgodnie z testem Sangera i sekwencjonowaniem egzomu) (dane niepublikowane)12. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami opisującymi zastosowanie krótkotrwałego RNP w eksperymentach CRISPR/Cas926,27. Brak klonalnych linii komórkowych z edycjami bi-allelicznymi może być również specyficzny dla locus lub wynikać z niezdolności komórki do tolerowania dwóch oznakowanych kopii niezbędnego białka, jak sugerowano z wcześniej opublikowanych eksperymentów, w których zaobserwowano przypuszczalne komórki edytowane bi-allelic dla jednego locus (LMNB1), ale nie dla innego (TUBA1B)12. Bi-alleliczne, w pełni zwalidowane klonalne linie komórkowe zostały wygenerowane przy użyciu tej metody w celu znakowania ST6 beta-galaktozydu alfa-2, 6-sjalilotransferazy 1 (ST6GAL1) i rodziny onkogenów RAB5A RAS (RAB5A) za pomocą mEGFP19.

Oprócz potwierdzenia precyzji edycji genomu, istnieje wiele testów kontroli jakości, które można wykorzystać do dalszego scharakteryzowania linii klonalnej i identyfikacji klonów, które spełniają wszystkie kryteria komórek macierzystych, genomu i biologii komórki do wykorzystania w przyszłych badaniach. Testy biologiczne i funkcjonalne komórek można wykorzystać do potwierdzenia odpowiedniej ekspresji, lokalizacji i funkcji białka fuzyjnego12. Porównanie z nieedytowaną kontrolą rodzicielską pomoże ocenić wpływ procesu edycji na lokalizację, dynamikę i funkcję. Inne testy, takie jak analiza wzrostu i testy stabilności genomu, mogą również pomóc w ustaleniu, czy oznakowane białko zakłóca działanie komórki. W przypadku stosowania hiPSC w tym protokole ocena markerów pluripotencji i potencjału różnicowania może mieć kluczowe znaczenie w określeniu klonu, który jest cenny dla dalszych badań12. Ponieważ wykazano, że rozszerzona hodowla hiPSC prowadzi do niestabilności genetycznej, ważne jest również monitorowanie tempa wzrostu i kariotypu linii komórek klonalnych 12,37. Jednak ostateczne przeznaczenie edytowanych komórek ostatecznie określi poziom i zakres analizy kontroli jakości i będzie się różnić w zależności od zastosowania.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Daphne Dambournet za wiele wnikliwych dyskusji i porad dotyczących edycji genów, Thao Do za ilustrację, Angelique Nelson za krytyczną lekturę manuskryptu i Andrew Tuckerowi za wygenerowanie linii komórkowej Laminy B1 oznaczonej mEGFP. Pragniemy podziękować zespołom ds. komórek macierzystych oraz edycji genów i rozwoju testów w Allen Institute for Cell Science za ich wkład w proces edycji genów i kontroli jakości. Linia WTC, której użyliśmy do stworzenia naszej linii komórkowej z edytowanymi genami, została dostarczona przez Laboratorium Bruce'a R. Conklina w Gladstone Institutes i UCSF. Dziękujemy założycielowi Allen Institute for Cell Science, Paulowi G. Allenowi, za jego wizję, zachętę i wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Geneious R9Biomatters lub podobneoprogramowanie bioinformatyczne do in silico projekt plazmidu dawcy
TE Buffer pH 8.0IDT lub podobny11-01-02-05
Inkubator CO2 lub podobnyThermoFisher Scientific lub podobny51030408
Pipety (1000 &mikro; L, 200 i mikro; L, 20 i mikro; L, 10 i mikro; L, 2 i mikro; L)Rainin lub podobne
końcówki do pipet (1000 µ L, 200 i mikro; L, 20 i mikro; L)Pipeta wielokanałowa Rainin lub podobna
(200 µ L)Rainin lub podobne
pipety serologiczne (25 ml, 10 ml, 5 ml)Costar lub podobne
8-kanałowe rozdzielacze BRAND do Quiksip, autoklawowalneMillipore Sigma lub podobneBR704526-1EAdo użytku z niefiltrowanymi końcówkami do pipet, takie jak końcówki do pipet o niskiej retencji Molecular Bioproducts, Pure 10, poniżej
końcówek do pipet o niskiej retencji Molecular Bioproducts, Pure 10Thermo Fisher, lub podobny3501-05
XP2 Kontroler pipetDrummond lub podobny4-000-501
Jednorazowe pipety PasteuraVWR lub podobny53300-567
klasa II, szafa bezpieczeństwa biologicznego typu A2CELLGARD lub podobnyNU-481
Matrigel Matrix, obniżony współczynnik wzrostuCorning354230lot testowany przed użyciem z hiPSC
DMEM/F12 (czerwień fenolowa)Gibco11039-021na zimno, do rozcieńczania Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media ZalecaneStemCell Technologies85850dla linii WTC hiPSC
Penicylina-streptomycynaGibco15070-063
Linia hiPSC WTCCoriellGM25256linia hiPSC stosowana w tym protokole jest dostępna za pośrednictwem Coriell
Naczynie do hodowli tkankowych 100 mmFalcon353003
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCELLSTAR657160
StemPro AccutaseGibcoA11105-01
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) bez wapnia, bez magnezuGibco14190144
15 ml polistyrenu stożkowySarstedt62.554.100
Y-27632 ( Inhibitor ROCK)StemCell Technologies72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Syntetyczny crRNA, niezmodyfikowany (sekwencja niestandardowa)DharmaconCustom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Syntetyczny tracrRNADharmaconU-002005-05
Rekombinowany typ dziki Streptococcus pyogenes Białko oczyszczone Cas9-NLS, 40 i mikro; MUniwersytet Kalifornijski-Berkeley QB3 Macrolab
Niestandardowy plazmid dawcy (PriorityGENE)Projekt wkładki dawcy Genewiz został zsyntetyzowany i sklonowany do szkieletu pUC57 za pomocą probówki Genewiz
Naukowy
, 100 i mikro; Zestaw LThermoFisher ScientificMPK10096
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitka do komórekFalcon352235
15 ml stożkowa rurka polipropylenowa o wysokiej czystościFalcon352196
FACSAriaIII FusionBD Biosciences656700
Oprogramowanie FACSDivaWersja BD Biosciences
FlowJo 10.2Bank krwi TreeStar
NERL Sól fizjologicznaThermoFisher Scientific8504używany jako bezkonserwantowy bufor FACS
Mikroskop stereoskopowy Olympus SZX7 lub podobnyOlympus lub podobny
Płytka do hodowli tkankowych, 96-dołkowapłytka do353072
96 dołków, V-BottomCELLSTAR351180
CryoStor CS10SigmaC2874-100MLstosowany jako bufor do kriokonserwacji komórek w formacie płytki 96-dołkowej
ParafilmBemisPM-996
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejCELLSTAR662160
podłoża wzrostowe DNA LoBind 1,5 ml Eppendorf 22431021 NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50 System transfekcji neonowej ThermoFisher system transfekcji neonowej MPK5000 hodowli komórkowych Falcon

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307(2011).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  5. Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9. Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).
  6. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Sci Rep. 5, 9592(2015).
  7. Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).
  8. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  9. Doyon, J. B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  10. Cho, W. K., et al. Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci Rep. 6, 35949(2016).
  11. White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time. Sci Rep. 7 (1), 3187(2017).
  12. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  13. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
  14. Young, J. E., Goldstein, L. S. Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models. Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).
  15. Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).
  16. Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , U.S. National Library of Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene (2017).
  17. Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , UCSC Genome Browser. https://genome.ucsc.edu/ (2017).
  18. Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc (2018).
  19. Allen Cell Explorer. , http://www.allencell.org/ (2017).
  20. Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing. Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).
  21. Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/ (2017).
  22. Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  23. Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. Therapeutic genome editing with engineered nucleases. Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).
  24. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).
  25. Orlando, S. J., et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Research. 38 (15), e152(2010).
  26. DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 121-122, 9-15 (2017).
  27. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  28. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766(2014).
  29. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  30. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  31. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  32. CRISPOR V4.3. , http://crispor.tefor.net/ (2017).
  33. Zhang, Y., et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci Rep. 4, 5405(2014).
  34. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  35. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
  36. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  37. Baker, D., et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ludzkie iPSCznakowanie fluorescencyjnemetoda rybonukleoproteinowadostarczanie poprzez elektroporacjwzbogacanie metod FACSgenerowanie linii klonalnychnaprawa kierowana homologigenomiczny knock in

Powiązane artykuły