Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Solidna chemia tworząca wiązania peptydowe zaangażowana w syntezę peptydów w fazie stałej oraz możliwość kontrolowania długości i składu sekwencji sprawiają, że peptydy, które same łączą się w struktury supramolekularne, są intensywnie badaną dziedziną. Czynniki, które kontrolują i stabilizują samoorganizujące się struktury peptydowe, w tym oddziaływania steryczne i elektrostatyczne łańcucha bocznego, wiązania wodorowe i efekty hydrofobowe¹, służą jako zestaw reguł projektowania. Wraz z postępem badań nad tymi podstawowymi zasadami projektowania, logicznym kolejnym krokiem w samoorganizacji peptydów jest rozszerzenie różnorodności struktur i funkcji opartych na peptydach. Podczas gdy samoorganizujące się peptydy są wszechstronnym biomateriałem, który został wykorzystany do wielu zastosowań biomedycznych poprzez dostrojenie sekwencji peptydów lub warunków montażu^2,3,4, rozwój strategii modyfikacji nanowłókien peptydowych po montażu^5,6,7,8,9 pozostaje stosunkowo niezbadanym obszarem.

Dynamiczna wymiana dwusiarczków i chemia tiolu na powierzchni struktur supramolekularnych to jeden z obszarów, który ma potencjał do uzyskania nowych i funkcjonalnych biomateriałów. Włączenie ugrupowań 1,2-ditionanu (zwykle pochodnej kwasu liponowego (la) lub kwasu asparagusowego (aa)) zostało zgłoszone w systemach liposomowych^10,11, block copolymers^12,13, oraz jako organizowanie kotwic na powierzchniach^14,15. W niniejszym artykule przedstawiamy syntezę i charakterystykę samoorganizującego się peptydu pochodzącego z jądrującego rdzenia peptydu Aβ związanego z chorobą Alzheimera, który jest modyfikowany na N-końcu za pomocą grupy funkcyjnej 1,2-ditiolanowej^16,17. Powstałe w ten sposób włókna supramolekularne służą teraz jako platforma doświadczalna do badania wymiany dwusiarczkowej i reaktywności tiolowej na supramolekularnej powierzchni włókien amyloidowych¹⁸.

1. Synteza i oczyszczanie modyfikowanego peptydu 1,2-ditiolanu

1. Synteza prekursora ditiolanu, kwas 3-(acetylo)-2-(acetyliometylometylo)propanowy19.
   1. Dodać 1 g kwasu 3-bromo-2-(bromometylo)propionowego (1 ekwiwalent) rozpuszczonego w minimalnej ilości 1 M NaOH (około 4 ml) do kolby reakcyjnej okrągłodennej o pojemności 25 ml, mieszając w temperaturze 55 °C. Uszczelnić kolbę reakcyjną przegrodą i umieścić w atmosferze azotu.
   2. Przygotować roztwór zawierający 1,49 g tiooctanu potasu (odpowiednik 3,2) w 4 ml wody dejonizowanej i 3 ml 2 M kwasu siarkowego (_H2SO4) w celu wytworzeniakwasu tiooctowego in situ.
   3. Pobrać roztwór kwasu tiooctowego do plastikowej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml i umieścić igłę na strzykawce. Dodawać mieszaninę kroplami do kolby reakcyjnej, przekłuwając igłą przegrody. Kontynuować reakcję przez noc w temperaturze 55 °C.
   4. Monitorować reakcję metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach z żelem krzemionkowym 60 F₂₅₄ przy użyciu mieszaniny metanolu i dichlorometanu (1:9). Wizualizacja postępu reakcji za pomocą zielonego barwnika bromokrezolowego. Produkt ma R_f = 0,57.
   5. Po zakończeniu reakcji i schłodzeniu do temperatury pokojowej zakwasić mieszaninę do pH 1 za pomocą 2 M H₂SO₄. Żółty olej oddziela się od roztworu.
   6. Ekstrahować produkt zimnym chloroformem (40 ml x 3). Połącz warstwy organiczne i wysusz siarczan magnezu. Usunąć chloroform pod zmniejszonym ciśnieniem.
   7. Potwierdzić tożsamość wyizolowanego produktu, 1, za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), jak pokazano na rysunkach 1B i C. Spodziewaj się następujących wyników: ¹H NMR, CDCl₃, 300 MHz: d = 10,1 (b, 1 H), 3,2 (m, 4 H), 2,9 (m, 1 H), 2,4 (s, 6 H); ¹³C NMR, CDCl₃, 75 MHz: d = 195,1 (CH₃COS-), 177,6 (-COOH), 45,1 (-CH₂S-), 30,5 (CH), 29,2 (-SCOCH₃).
      Uwaga: Produkt jest żółtym olejem i ma ogólną wydajność 83%. Produkt należy stosować bez dalszego oczyszczania.
2. SPPS i sprzężenie na żywicy prekursora ditiolanu
   Uwaga: Opisana poniżej synteza peptydów w fazie stałej została przeprowadzona na automatycznym syntezatorze peptydów, zgodnie z zalecanymi protokołami producenta. Ustawienia i odczynniki mogą być dostosowane do innych instrumentów komercyjnych lub przy użyciu specjalistycznych aminokwasów.
   1. Odważyć 0,156 g żywicy amidowej 4-metylobenzhydryloaminy (MBHA) (0,1 mmol) i umieścić w naczyniu reakcyjnym. Spęczniać żywicę w dimetyloformamidzie (DMF) przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem syntezy.
   2. Odważyć 4 równoważniki każdego aminokwasu chronionego fluorenylometylokoksykarbonylem (Fmoc) (0,4 mmol) w sekwencji i 0,152 g N,N,N',N'--tetrametylo-O-(1H-benotriazol-1-ylo)uranu heksafluorofosforanu uranu (0,4 mmol, HBTU) dla każdego aminokwasu w sekwencji. Każdy wkład zawiera zarówno aminokwas chroniony przez Fmoc, jak i HBTU.
   3. Po przeprowadzeniu wszystkich kontroli syntezy wstępnej w syntezatorze (uzupełnienie odczynników, przepłukanie linii odczynników i zwiększenie ciśnienia we wszystkich butelkach z odczynnikami), umieść wkłady z aminokwasami w karuzeli w kierunku końca C' do N'. Umieść pusty wkład po końcowej pozycji aminokwasu dla ostatniego etapu deprotekcji Fmoc na N-końcu.
   4. Zsyntetyzuj peptyd przy użyciu standardowych zalecanych ustawień.
      1. Odchroń grupę Fmoc od żywicy za pomocą 5 ml 20% piperydyny w DMF (5 min x 2).
      2. Umyj żywicę DMF (6 x 5 ml) przed etapem łączenia.
      3. Do pojedynczego etapu sprzęgania dodaj 4 ml 0,4 M N-metylomorfoliny w DMF do aminokwasu chronionego Fmoc i HBTU. Aktywuj roztwór aminokwasowy chroniony przez Fmoc na 30 s przed przeniesieniem roztworu do naczynia reakcyjnego.
         Uwaga: Automatyczny syntezator peptydów miesza żywicę i roztwór poprzez bulgotanie gazu_N2 co 30 s przez 20 minut, podczas gdy zachodzi reakcja sprzęgania. W przypadku ręcznej syntezy peptydów należy umieścić naczynie reakcyjne na wytrząsarce orbitalnej z niską prędkością na czas trwania etapu sprzęgania.
      4. Odcedź roztwór i przemyj żywicę DMF (3 x 5 ml).
      5. Powtórz kroki od 1.2.4.1 do 1.2.4.4 dla każdego aminokwasu chronionego Fmoc w kierunku C' do N'-końca, aby zsyntetyzować peptyd będący przedmiotem zainteresowania.
   5. Po ostatnim N-końcowym etapie deprotekcji, przenieś żywicę do jednorazowej strzykawki ze strzykawką. Przemyć żywicę DMF (3 x 5 ml) i dichlorometanem (DCM, 3 x 5 ml).
      Uwaga: Żywica może być przechowywana po umyciu DCM w eksykatorze próżniowym. Jeśli żywica była przechowywana przed sprzężeniem, należy upewnić się, że żywica pęcznieje w DKZ przed reakcją sprzęgania.
   6. Sprzęgnąć prekursor ditiolanu (1) z N-końcem peptydu na żywicy, dodając 4 równoważniki 1,5 ml DMF, 4 równoważniki HBTU i 10 równoważników N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA). Wstępnie aktywuj mieszaninę sprzęgającą na 10 minut przed dodaniem do strzykawki zawierającej strzykawkę z żywicą.
   7. Potrząsać reakcją sprzęgania przez 2 godziny. Po 2 godzinach przemyć żywicę DMF (3 x 5 mL) i powtórzyć reakcję sprzęgania z wytrząsaniem przez noc.
   8. Po drugim sprzęgnięciu przemyć żywicę DMF (3 x 5 ml) i DCM (3 x 5 ml).
      Uwaga: Żywica może być przechowywana w tym momencie w próżni do momentu rozszczepienia.
3. Deprotekcja tiooctanu i rozszczepienie peptydów z żywicy
   1. Aby zdezprotect grupę tiooctanową przed prekursorem N-końcowego ditiolanu, przenieś wysuszoną żywicę do 10 ml mikrofalowej probówki reakcyjnej i dodaj 2 ml DMF. Pozwól żywicy pęcznieć, dodaj małe mieszadło magnetyczne do naczynia i ponownie zawiesić z małą prędkością mieszania magnetycznego na 15 minut.
   2. Dodać 2 ml stężonego wodorotlenku amonu, przykryć naczynie reakcyjne silikonową przegrodą i umieścić naczynie reakcyjne w reaktorze mikrofalowym, stosując ustawienia mikrofal 75 °C na 45 minut z mieszaniem.
   3. Po zakończeniu reakcji mikrofalowej przenieś żywicę do czystej, jednorazowej strzykawki do smażenia. Przemyć DMF (2 x 5 ml) i metanolem (MeOH, 2 x 5 mL).
   4. Dodać roztwór stężonego wodorotlenku amonu w metanolu (1:4) do całkowitej objętości 5 ml. Pozostaw na noc do wstrząśnięcia, aby zwiększyć wewnątrzcząsteczkowe utlenianie wiązania dwusiarczkowego w pierścieniu ditionowym.
   5. Umyj żywicę MeOH (2 x 5 ml) i DCM (3 x 5 ml).
      Uwaga: W tym momencie wysuszoną żywicę można przechowywać w eksykatorze próżniowym.
   6. Dodaj koktajl łupliwy do strzykawki zawierającej żywicę, delikatnie wstrząsając przez 1,5 godziny. Zastosowany koktajl łupliwy składa się z 95% kwasu trifluorooctowego (TFA), 2,5% triizopropylosilanu (TIPS) i 2,5% wody o całkowitej objętości 5 ml.
      UWAGA: Pracować wyłącznie pod wyciągiem chemicznym. TFA jest lotny i.
      Uwaga: W przypadku większości sekwencji peptydowych i grup chroniących łańcuch boczny aminokwasów powyższy roztwór koktajlu rozszczepienia jest wystarczający; jednak alternatywne koktajle rozszczepienia mogą być potrzebne dla niektórych grup chroniących łańcuch boczny aminokwasów (w szczególności peptydów zawierających Cys, Met, Trp i Arg) lub innych chemii żywic²⁰.
   7. Wytrącić surowy peptyd w 25 ml zimnego eteru dietylowego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez krople dodawane ze strzykawki do spiekawki. Peptyd wytrąca się w postaci białego ciała stałego. Osadzać peptyd przez odwirowanie przy 1300 x g przez 10 min. Ostrożnie zdekantować eter dietylowy do osobnego pojemnika w celu zbierania odpadów.
   8. Dodać kolejne 25 ml eteru dietylowego do stożkowej probówki i ponownie zawiesić osad przez wirowanie. Powtórzyć wirowanie przy 1300 x g przez 10 minut i ponownie zdekantować eter dietylowy. Wysuszyć granulat w próżni.
4. Oczyszczanie modyfikowanego peptydu 1,2-ditionanowego
   Uwaga: Oczyść surowy peptyd za pomocą HPLC z odwróconą fazą. Zbierz i połącz piki peptydów i potwierdź masę za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.
   1. Rozpuść surowy osad peptydowy w minimalnej ilości acetonitrylu z 0,1% TFA. Ze względu na hydrofobowość peptydu i skłonność do agregacji, delikatnie podgrzej próbkę w temperaturze 40 °C, aby poprawić rozpuszczalność.
      Uwaga: Unikaj wyższych temperatur i sonikacji peptydu, aby zapobiec potencjalnym reakcjom wymiany dwusiarczkowej^21,22,23.
   2. Aby przygotować 1 ml surowego peptydu do oczyszczania metodą HPLC, dodać 400 μl skoncentrowanego materiału peptydowego w acetonitrylu do 600 μl_H2Oz 0,1 % TFA i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 22 μm do fiolki HPLC. Można dodać dodatkowe 5% izopropanolu, aby zapobiec agregacji peptydów i wytrącaniu się.
   3. Oczyść peptyd za pomocą półpreparatywnej kolumny C-18 o natężeniu przepływu 3 ml/min po liniowym gradiencie 15-55% acetonitrylu w 20 minut. Ustaw detektory UV na 222 nm (szkielet amidowy) i 330 nm (wiązanie dwusiarczkowe). Zbierz i połącz interesujące nas piki (Rysunek 2A).
   4. Potwierdź masę produktu peptydowego za pomocą spektrometru masowego MALDI-TOF w trybie reflektronu ( Rysunek 2B). Do analizy zmieszać 0,5 μl zebranego piku na płytce MALDI z 0,5 μl matrycy kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) (10 mg/ml DHB w 50% acetonitrylu, 0,1% TFA).
      Uwaga: Typowe addukty w spektrometrii mas MALDI-TOF obejmują piki adduktu soli sodu i potasu ([M+Na]⁺ i [M+K]⁺). Odsalanie próbki przed analizą jest zalecane, jeśli piki adduktu soli tłumią sygnał głównego piku [M+H]⁺. Dodatkowo w peptydzie modyfikowanym 1,2-ditiolanem wykrywa się również utleniony pik [M+O]⁺. Raport na temat utleniania indukowanego laserem w wyniku jonizacji MALDI przy użyciu matrycy DHB sugeruje, że czynniki, takie jak stężenie próbki, rozpuszczalnik i intensywność lasera, mogą być modyfikowane w celu ograniczenia artefaktu utleniania indukowanego przez MALDI²⁴.
   5. Po potwierdzeniu przez MALDI-TOF prawidłowej masy, należy liofilizować peptyd po błyskawicznym zamrożeniu. Trzymaj liofilizowany proszek peptydowy w próżni do momentu montażu.

2. Charakterystyka supramolekularnych struktur samoorganizujących

1. Powstawanie włókien amyloidowych
   1. Aby przygotować roztwór do samodzielnego organizowania, odważyć 1 mg proszku peptydowego za pomocą wagi analitycznej. Rozpuścić w mieszaninie (pH 7,5) 20% acetonitrylu i 10 mM (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego kwasu (HEPES) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, do końcowego stężenia 1 mg/ml mieszaniny zespołu peptydów. Zmieszaj roztwór montażowy i pozostaw do złożenia w temperaturze pokojowej.
2. Charakterystyka spektroskopowa włókien amyloidowych
   1. Śledź proces składania peptydów za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) co kilka dni. Szeroki pik wyśrodkowany około 1670 ^cm-1 to sygnatura IR wynikająca z niepołączonych peptydów w sample¹⁷. Próbki składania peptydów zwykle potrzebują od jednego do dwóch tygodni, aby szeroki, niezłożony pik zniknął i osiągnął dojrzałość.
      1. Wysuszyć podwielokrotność 8-10 μl roztworu montażowego w postaci cienkiej warstwy na krysztale diamentu ATR. Monitoruj zanikanie dużego i szerokiego szczytu wody od 1640 do 1630 ^cm-1 w miarę tworzenia się suchego filmu.
      2. Pobieraj widma podczerwieni z zakresu 1500-1800 ^cm-1, wykonując średnio 50 skanów z rozdzielczością 2 ^cm-1. Pobieraj i odejmuj skany w tle przed każdym skanowaniem próbki. Sygnatura IR dla montażu β arkuszy to ostry szczyt między 1625 a 1635 ^cm-1 (Rysunek 3A)^25,26.
   2. Scharakteryzuj składanie peptydów w struktury supramolekularne bogate w β arkusze za pomocą dichroizmu kołowego (CD). Rejestrować widma za pomocą spektropolarymetru CD z systemem kontroli temperatury Peltiera.
      1. Odpipetować 30 μl roztworu montażowego w mikrokuwecie o długości ścieżki 0,1 mm.
         Uwaga: Uchwyt na kutę jest potrzebny do zaciśnięcia i umieszczenia ogniwa o krótkiej długości ścieżki w instrumencie.
      2. Dla każdego widma ustaw instrument CD na następujące parametry: długości fal skanowania od 300 nm do 180 nm, szybkość skanowania 100/min, szerokość pasma 1 nm, 25 °C, średnia z trzech skanów.
      3. Zebrać widmo buforu (20% acetonitrylu/10 mM HEPES, pH 7,5) i odjąć od każdej próbki jako kontrolę. Sygnatura CD dla β-arkuszy to minimum eliptyczności wyśrodkowane wokół 220 nm (Rysunek 3B)²⁷.
3. Mikroskopia włókien amyloidowych
   1. Odczekaj od dwóch do trzech tygodni, aż próbki peptydów dojrzeją do bogatych w β arkusze struktur supramolekularnych.
      Uwaga: Zespoły mogą być obrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) również na wcześniejszych etapach procesu montażu.
      1. Odmierzyć pipetą 10 μl roztworu zespołu peptydów na powierzchnię siatki węglowej TEM.
         Uwaga: Uważaj, aby nie dotknąć końcówki pipety do powierzchni siatki. Wysoce precyzyjna, samozamykająca się pęseta służy do przytrzymywania siatki TEM podczas przygotowania.
      2. Odczekaj 1-2 minuty, aby zespoły zaadsorbowały się na powierzchni siatki. Usunąć nadmiar próbki, dotykając bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki.
      3. Przygotuj 2% plamę z octanu uranylu, dodając 100 μl wody dejonizowanej do dostępnego w handlu 4% roztworu octanu uranylu. Odpipetować 10 μl 2% octanu uranylu na powierzchnię siatki i inkubować przez 2-3 minuty. Po inkubacji usuń nadmiar plamy, dotykając bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki.
      4. Umieść na noc kratki TEM w eksykatorze próżniowym. Przechowywać w próżni do czasu obrazowania.
      5. Zobrazuj przygotowane próbki za pomocą TEM ( Rysunek 3C). Typowe parametry dla mikroskopii są następujące: obrazy w powiększeniach od 9 300X do 23 000X, włókno wolframowe o napięciu przyspieszającym 120 kV.
         Uwaga: ImageJ może być używany do pomiaru średniej szerokości włókien w strukturach supramolekularnych uzyskanych obrazów TEM²⁸.
         UWAGA: Przed użyciem należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki (SDS). Kilka substancji chemicznych stosowanych w syntezie, oczyszczaniu i charakterystyce opisanych samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem jest lub toksycznych i powinno być stosowanych wyłącznie pod okapem oparów chemicznych. Podczas pracy w laboratorium należy zawsze używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (w tym okularów ochronnych, fartucha laboratoryjnego, długich spodni, butów z zakrytymi palcami).

Oprócz początkowej jednoetapowej syntezy cząsteczki prekursora ditiolanu, reszta syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditionanową zachodzi na stałym podłożu (Rysunek 1A). Konwersja kwasu 3-bromo-2-(bromometylo)propionowego do kwasu 3-(acetylo)-2-(acetylotiometylo)propanowego, prekursora ditiolanu, jest potwierdzana przez 1H i 13C NMR (Rysunek 1B i C) przed sprzężeniem z wolną aminą N-końcową peptydu nadal na żywicy. Deprotekcję tiooctanu do tioli wodorotlenkiem amonu przeprowadza się za pomocą reaktora mikrofalowego, a 1,2-ditionan utlenia się przez noc w metanolu, zanim peptyd zmodyfikowany 1,2-ditiolanem zostanie odłupany od żywicy. Surowy peptyd jest oczyszczany za pomocą HPLC z odwróconą fazą ( Rysunek 2A), a masa produktu jest potwierdzana za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF (Rysunek 2B).

Oczyszczony peptyd 1,2-ditiolane samoistnie składa się w dojrzałe włókna amyloidowe w ciągu 2-3 tygodni. FT-IR (Rysunek 3A) i spektroskopia CD (Rysunek 3B) są używane do śledzenia procesu montażu i scharakteryzowania rozszerzonej konformacji arkusza β. Włókna są obrazowane przez TEM (Rysunek 3C).

Rysunek 1. Schemat syntetyczny do charakterystyki cząsteczki prekursora 1,2-ditiolanu. (A) Schemat syntetyczny końcowego peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem, 1,2-ditiolan-KLVFFAQ-NH2. (B) 1H-NMR kwasu 3-(acetylo)-2-(acetylotiometylo)propanowego w CDCl3 przy 300 MHz. (C)13C-NMR kwasu 3-(acetylo)-2-(acetylotiometylo)propanowego w CDCl3 przy 75 MHz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Synteza peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem. (A) Chromatogram HPLC z oczyszczania 1,2-ditiolan-KLVFFAQ-NH2. (B) Widmo masowe MAVIDI-TOF głównego piku z oczyszczania HPLC (czas retencji ~17,5 min) w trybie reflektronowym przy użyciu matrycy DHB potwierdza obliczoną masę 1,2-ditiolan-KLVFFAQ-NH2. Identyfikowane są również wspólne przywodzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Supramolekularna charakterystyka peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem. (A) FT-IR z 1 mg/ml włókien 1,2-ditiolan-KLVFFAQ-NH2 połączonych w 10 mM HEPES, pH 7,5 w 20%CH3CN. Szczyt na wysokości 1627 cm-1 jest zgodny z peptydami złożonymi w konformację β-arkuszową. (B) CD z 1 mg / ml włókien 1,2-ditiolan-KLVFFAQ-NH2 złożonych w 10 mM HEPES, pH 7,5 w 20% CH3CN. Minimum eliptyczności przy 218 nm jest zgodne z peptydami złożonymi w konformację β-arkuszową. (C) Obraz włókna amyloidowego 1,2-ditiolan-KLVFFAQ-NH2 (ujemne zabarwienie 2% octanu uranylu) za pomocą TEM. Podziałka wynosi 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.