Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Summary

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Abstract

Ten raport skupia się na syntezie N-końcowego, zmodyfikowanego 1,2-ditiolanem, samoorganizującego się peptydu i charakterystyce powstałych w ten sposób samoorganizujących się struktur supramolekularnych. Droga syntezy wykorzystuje syntezę peptydów w fazie stałej z sprzężeniem cząsteczki prekursora ditiolanu na żywicy, kwasu 3-(acetylotio)-2-(acetylometylo)propanowego, oraz wspomaganą mikrofalami deprotekcją tiooctanu N-końca peptydu przed ostatecznym rozszczepieniem od żywicy w celu uzyskania peptydu zmodyfikowanego 1,2-ditiolanem. Po oczyszczeniu peptydu 1,2-ditionanowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) pochodzącego z jądrowego rdzenia peptydu Aβ związanego z chorobą Alzheimera, wykazano, że peptyd samoorganizuje się w krzyżowe włókna amyloidowe β. Przedstawiono protokoły charakterystyki włókien amyloidowych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR), spektroskopii dichroizmu kołowego (CD) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Metody modyfikacji N-końcówek z ugrupowaniem 1,2-ditiolanowym do dobrze scharakteryzowanych peptydów samoorganizujących się mogą być teraz badane jako systemy modelowe w celu opracowania strategii modyfikacji po montażu i zbadania dynamicznej chemii kowalencyjnej na powierzchniach nanowwłókien peptydowych supramolekularnych.

Introduction

Solidna chemia tworząca wiązania peptydowe zaangażowana w syntezę peptydów w fazie stałej oraz możliwość kontrolowania długości i składu sekwencji sprawiają, że peptydy, które same łączą się w struktury supramolekularne, są intensywnie badaną dziedziną. Czynniki, które kontrolują i stabilizują samoorganizujące się struktury peptydowe, w tym oddziaływania steryczne i elektrostatyczne łańcucha bocznego, wiązania wodorowe i efekty hydrofobowe¹, służą jako zestaw reguł projektowania. Wraz z postępem badań nad tymi podstawowymi zasadami projektowania, logicznym kolejnym krokiem w samoorganizacji peptydów jest rozszerzenie różnorodności struktur i fu....

Protocol

1. Synteza i oczyszczanie modyfikowanego peptydu 1,2-ditiolanu

1. Synteza prekursora ditiolanu, kwas 3-(acetylo)-2-(acetyliometylometylo)propanowy19.
   1. Dodać 1 g kwasu 3-bromo-2-(bromometylo)propionowego (1 ekwiwalent) rozpuszczonego w minimalnej ilości 1 M NaOH (około 4 ml) do kolby reakcyjnej okrągłodennej o pojemności 25 ml, mieszając w temperaturze 55 °C. Uszczelnić kolbę reakcyjną przegrodą i umieścić w atmosferze azotu.
   2. Przygotować roztwór zawierający 1,49 g tiooctanu potasu (odpowiednik 3,2) w 4 ml wody dejonizowanej i 3 ml 2 M kwasu siarkowego (_H2SO4) w celu wytworzenia

Results

Oprócz początkowej jednoetapowej syntezy cząsteczki prekursora ditiolanu, reszta syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditionanową zachodzi na stałym podłożu (Rysunek 1A). Konwersja kwasu 3-bromo-2-(bromometylo)propionowego do kwasu 3-(acetylo)-2-(acetylotiometylo)propanowego, prekursora ditiolanu, jest potwierdzana przez ¹H i ¹³C NMR (Rysunek 1B i C) przed sprzężeniem z wolną aminą N-końcową peptydu nadal na żywi.......

Discussion

W artykule omówiono szczegóły zarówno syntezy, jak i oczyszczania N-końcowego samoorganizującego się peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem oraz charakterystykę powstałych struktur supramolekularnych. Opisana tutaj synteza peptydu 1,2-ditiolanu ma zalety, w tym jednoetapową syntezę w celu wytworzenia prekursora ditiolanu, kwasu 3-(acetylotio)-2-(acetylotiometylo)propanowego, oraz reakcję deprotekcji mikrofalowej na żywicy grupy ochronnej prekursora tiooctanu w celu uzyskania utlenionej cząstki 1,2-ditiolanu wykorzystujące.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lodowisko amidowe, żywica MBHA, o dużym obciążeniu	Gyros Protein Technologies	RAM-5-HL	Unikać kontaktu ze skórą i oczami; nie wdychać
N,N-dimetyloformamidu	Fisher Scientific	D119-4	Łatwopalna ciecz i pary; działa drażniąco na oczy i skórę; Stosować środki ochrony osobistej; Przechowywać z dala od otwartego ognia
Fmoc-L-Val-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-V	Stosować środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Leu-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-L	Stosować środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-KBC	Nosić środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Phe-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-F	Nosić środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Ala-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-A	Stosować środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-QT	Stosować środki ochrony osobistej; nie wdychać
N,N,N′,N′-tetrametylo-O-(1H-benzotriazol-1-ylo)heksafluorofosforan uranu	Gyros Protein Technologies	26432	Działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe; nie wdychać; stosować pod maską lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu
0,4 M N-metylomorfolina w DMF	Gyros Protein Technologies	PS3-MM-L	wysoce łatwopalny; nosić środki ochrony osobistej; Przechowywać z dala od źródeł ciepła i przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty; Nie wdychać ani nie połykać; dokładnie umyć skórę po kontakcie z
20% piperydyną w DMF	Gyros Protein Technologies	PS3-PPR-L	Powoduje poważne oparzenia oczu i skóry; Łatwopalna ciecz i para; Nie wdychać
dichlorometanu	Fisher Scientific	D37-4	Może powodować raka; Nie wdychać; Nosić środki ochrony osobistej; używać tylko pod maską; w przypadku kontaktu zalać wodą przez co najmniej 15 minut i zasięgnąć porady lekarza
acetonitryl	Fisher Scientific	A998-4	Łatwopalny; działa drażniąco na oczy; Stosować środki ochrony osobistej; Używać tylko pod wyciągiem; Przechowywać z dala od otwartego ognia lub gorących powierzchni; W przypadku kontaktu płukać wodą przez co najmniej 15 minut i uzyskać pomoc lekarską
Kwas trifluorooctowy	Fisher Scientific	A116-50	Powoduje poważne oparzenia; nie wdychać; działa szkodliwie na organizmy wodne; stosować środki ochrony osobistej; stosować tylko pod wyciągiem; w przypadku kontaktu płukać wodą przez co najmniej 15 minut i natychmiast wezwać
octanu uranylu 4% octan uranylu	Mikroskopia elektronowa Nauki	22400-4	Nie wdychać; Działa szkodliwie na organizmy wodne
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy	Acros Organics	AC172571000	Nie wdychać; używać na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu
azot Gaz	TechAir		Zawartość pod ciśnieniem, może eksplodować po podgrzaniu
Kwas 3-bromo-2-(bromometylo)propionowy	Alfa Aesar	AAA1963014	Nie wdychać; działa drażniąco na skórę i oczy;
wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	S318-100	Stosować środki ochrony osobistej; stosować tylko pod wyciągiem; w przypadku kontaktu spłukać obszar przez co najmniej 15 minut i zasięgnąć porady lekarza
Tiooctan potasu	Acros Organics	AC221300250	Działa drażniąco na skórę i oczy; nie wdychać; stosować środki ochrony osobistej
kwas siarkowy	Fisher Scientific	SA213	Powoduje oparzenia; trzymać z dala od wody; trzymać z dala od materiałów palnych; nie wdychać; stosować środki ochrony osobistej; w przypadku kontaktu spłucz obszar przez co najmniej 15 minut i zasięgnij porady lekarza
chloroform-d	Acros Organics	AC320690075	Możliwe zagrożenie rakiem; działa drażniąco na skórę i oczy; nie wdychać; Stosować środki ochrony osobistej; Używać tylko pod wyciągiem; W przypadku kontaktu spłucz obszar przez co najmniej 15 minut i zasięgnij porady lekarza
chloroform	Fisher Scientific	C298-4	Możliwe zagrożenie rakiem; działa drażniąco na skórę i oczy; nie wdychać; Stosować środki ochrony osobistej; Używać tylko pod wyciągiem; W przypadku kontaktu płukać obszar przez co najmniej 15 minut i uzyskać pomoc lekarską
N,N-diizopropyloetyloamina	Acros Organics	AC367841000	Wysoce łatwopalny; szkodliwy dla organizmów wodnych; nosić środki ochrony osobistej; nie połykać
wodorotlenku amonu	Fisher Scientific	A669S-500	; nie wdychać
metanolu	Fisher Scientific	A452-4	Łatwopalna ciecz i para; stosować środki ochrony osobistej; nie wdychać; W przypadku kontaktu spłucz obszar przez co najmniej 15 minut i zasięgnij porady lekarza
triizopropylosilan	Sigma Aldrich	233781	łatwopalny; używać osobistego sprzętu ochronnego; przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty
eter dietylowy	Fisher Scientific	E138-1	Skrajnie łatwopalny; Działa drażniąco na skórę i oczy; Stosować środki ochrony osobistej
Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy	Sigma Aldrich	39319-10x10MG-F	nie wdychać; działa drażniąco na skórę i oczy
Kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy	Alfa Aesar	AAJ67635EXK
c18 końcówka zamka błyskawicznego	Millipore	ZTC18S096
chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosforynowy	Thermo Scientific	PI20490
żel krzemionkowy 60 F254 powlekane aluminiowe arkusze TLC	EMD Millipore	1.05549.0001
Cienkościenne precyzyjne rurki NMR	Bel-Art	663000585	5mm OD
całkowicie plastikowe strzykawki Norm-Ject	Air Tite	AL10
	BD PrecisionGlide	BD 305185	zużyte igły są wyrzucane do pojemnika na ostre odpady
jednorazowa strzykawka spiekana		W raporcie użyto strzykawek spiekanych Torviq SF1000LL 10 ml, ale w razie potrzeby dostępne są większe strzykawki do syntezy na większą skalę.
siatka	węglowa Ted Pella, Inc.	CF200-CU	Upewnij się, że przygotowujesz próbki i barwienie po stronie siatki węglowej, a nie po błyszczącej miedzianej stronie siatki
pęseta samozamykająca	się Mikroskopia elektronowa	Sciences 78318-3X	bardzo ostre końcówki, długość: 120 mm
0,1 mm krótka długość ścieżki komórka	Starna Cells, Inc.	20 / C-Q-0.1	Delikatne
nasadki naczyń 10 ml	CEM	909210
Zbiorniki ciśnieniowe 10 ml CEM		908035
Aeris Semi-Prep Kolumna HPLC	Phenomenex	00F-4632-N0	150 x 10 mm
	Starna Cells, Inc.	CH-2049	Potrzebny przy użyciu komórek o krótkiej długości ścieżki
Syntezator peptydowy PS3	Gyros Protein Technologies
DiscoverSP Reaktor mikrofalowy	Wirówka CEM
	HERMLE	Z 206 A	używała stałego wirnika 6x50 mL
HPLC	Shimadzu		UV Detector
spektrometr magnetycznego rezonansu jądrowego	Avance, Bruker
Spektrometr masowy 300 MHz MALDI-TOF	Axima Confidence, liofilizator Shimadzu
	Millrock Technology	BT85A
	Alpha Tensor,
	Tecnai Spirit, FEI		Używany z światłowodową kamerą cyfrową CCD Gatan, Orius. Dostęp do CSCU Center for Nanotechnology
Circular Dichroism Spectropolarimeter	J-810, JASCO		Używany z sześcioogniwowym regulatorem temperatury Peltiera. Dostęp na Uniwersytecie Wesleyan.