Artykuł metodologiczny

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

DOI:

10.3791/58135

⸱

20 sierpnia 2018

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport skupia się na syntezie N-końcowego, zmodyfikowanego 1,2-ditiolanem, samoorganizującego się peptydu i charakterystyce powstałych w ten sposób samoorganizujących się struktur supramolekularnych. Droga syntezy wykorzystuje syntezę peptydów w fazie stałej z sprzężeniem cząsteczki prekursora ditiolanu na żywicy, kwasu 3-(acetylotio)-2-(acetylometylo)propanowego, oraz wspomaganą mikrofalami deprotekcją tiooctanu N-końca peptydu przed ostatecznym rozszczepieniem od żywicy w celu uzyskania peptydu zmodyfikowanego 1,2-ditiolanem. Po oczyszczeniu peptydu 1,2-ditionanowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) pochodzącego z jądrowego rdzenia peptydu Aβ związanego z chorobą Alzheimera, wykazano, że peptyd samoorganizuje się w krzyżowe włókna amyloidowe β. Przedstawiono protokoły charakterystyki włókien amyloidowych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR), spektroskopii dichroizmu kołowego (CD) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Metody modyfikacji N-końcówek z ugrupowaniem 1,2-ditiolanowym do dobrze scharakteryzowanych peptydów samoorganizujących się mogą być teraz badane jako systemy modelowe w celu opracowania strategii modyfikacji po montażu i zbadania dynamicznej chemii kowalencyjnej na powierzchniach nanowwłókien peptydowych supramolekularnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solidna chemia tworząca wiązania peptydowe zaangażowana w syntezę peptydów w fazie stałej oraz możliwość kontrolowania długości i składu sekwencji sprawiają, że peptydy, które same łączą się w struktury supramolekularne, są intensywnie badaną dziedziną. Czynniki, które kontrolują i stabilizują samoorganizujące się struktury peptydowe, w tym oddziaływania steryczne i elektrostatyczne łańcucha bocznego, wiązania wodorowe i efekty hydrofobowe1, służą jako zestaw reguł projektowania. Wraz z postępem badań nad tymi podstawowymi zasadami projektowania, logicznym kolejnym krokiem w samoorganizacji peptydów jest rozszerzenie różnorodności struktur i funkcji opartych na peptydach. Podczas gdy samoorganizujące się peptydy są wszechstronnym biomateriałem, który został wykorzystany do wielu zastosowań biomedycznych poprzez dostrojenie sekwencji peptydów lub warunków montażu2,3,4, rozwój strategii modyfikacji nanowłókien peptydowych po montażu5,6,7,8,9 pozostaje stosunkowo niezbadanym obszarem.

Dynamiczna wymiana dwusiarczków i chemia tiolu na powierzchni struktur supramolekularnych to jeden z obszarów, który ma potencjał do uzyskania nowych i funkcjonalnych biomateriałów. Włączenie ugrupowań 1,2-ditionanu (zwykle pochodnej kwasu liponowego (la) lub kwasu asparagusowego (aa)) zostało zgłoszone w systemach liposomowych10,11, block copolymers12,13, oraz jako organizowanie kotwic na powierzchniach14,15. W niniejszym artykule przedstawiamy syntezę i charakterystykę samoorganizującego się peptydu pochodzącego z jądrującego rdzenia peptydu Aβ związanego z chorobą Alzheimera, który jest modyfikowany na N-końcu za pomocą grupy funkcyjnej 1,2-ditiolanowej16,17. Powstałe w ten sposób włókna supramolekularne służą teraz jako platforma doświadczalna do badania wymiany dwusiarczkowej i reaktywności tiolowej na supramolekularnej powierzchni włókien amyloidowych18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza i oczyszczanie modyfikowanego peptydu 1,2-ditiolanu

  1. Synteza prekursora ditiolanu, kwas 3-(acetylo)-2-(acetyliometylometylo)propanowy19.
    1. Dodać 1 g kwasu 3-bromo-2-(bromometylo)propionowego (1 ekwiwalent) rozpuszczonego w minimalnej ilości 1 M NaOH (około 4 ml) do kolby reakcyjnej okrągłodennej o pojemności 25 ml, mieszając w temperaturze 55 °C. Uszczelnić kolbę reakcyjną przegrodą i umieścić w atmosferze azotu.
    2. Przygotować roztwór zawierający 1,49 g tiooctanu potasu (odpowiednik 3,2) w 4 ml wody dejonizowanej i 3 ml 2 M kwasu siarkowego (H2SO4) w celu wytworzeniakwasu tiooctowego in situ.
    3. Pobrać roztwór kwasu tiooctowego do plastikowej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml i umieścić igłę na strzykawce. Dodawać mieszaninę kroplami do kolby reakcyjnej, przekłuwając igłą przegrody. Kontynuować reakcję przez noc w temperaturze 55 °C.
    4. Monitorować reakcję metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach z żelem krzemionkowym 60 F254 przy użyciu mieszaniny metanolu i dichlorometanu (1:9). Wizualizacja postępu reakcji za pomocą zielonego barwnika bromokrezolowego. Produkt ma Rf = 0,57.
    5. Po zakończeniu reakcji i schłodzeniu do temperatury pokojowej zakwasić mieszaninę do pH 1 za pomocą 2 M H2SO4. Żółty olej oddziela się od roztworu.
    6. Ekstrahować produkt zimnym chloroformem (40 ml x 3). Połącz warstwy organiczne i wysusz siarczan magnezu. Usunąć chloroform pod zmniejszonym ciśnieniem.
    7. Potwierdzić tożsamość wyizolowanego produktu, 1, za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), jak pokazano na rysunkach 1B i C. Spodziewaj się następujących wyników: 1H NMR, CDCl3, 300 MHz: d = 10,1 (b, 1 H), 3,2 (m, 4 H), 2,9 (m, 1 H), 2,4 (s, 6 H); 13C NMR, CDCl3, 75 MHz: d = 195,1 (CH3COS-), 177,6 (-COOH), 45,1 (-CH2S-), 30,5 (CH), 29,2 (-SCOCH3).
      Uwaga: Produkt jest żółtym olejem i ma ogólną wydajność 83%. Produkt należy stosować bez dalszego oczyszczania.
  2. SPPS i sprzężenie na żywicy prekursora ditiolanu
    Uwaga: Opisana poniżej synteza peptydów w fazie stałej została przeprowadzona na automatycznym syntezatorze peptydów, zgodnie z zalecanymi protokołami producenta. Ustawienia i odczynniki mogą być dostosowane do innych instrumentów komercyjnych lub przy użyciu specjalistycznych aminokwasów.
    1. Odważyć 0,156 g żywicy amidowej 4-metylobenzhydryloaminy (MBHA) (0,1 mmol) i umieścić w naczyniu reakcyjnym. Spęczniać żywicę w dimetyloformamidzie (DMF) przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem syntezy.
    2. Odważyć 4 równoważniki każdego aminokwasu chronionego fluorenylometylokoksykarbonylem (Fmoc) (0,4 mmol) w sekwencji i 0,152 g N,N,N',N'--tetrametylo-O-(1H-benotriazol-1-ylo)uranu heksafluorofosforanu uranu (0,4 mmol, HBTU) dla każdego aminokwasu w sekwencji. Każdy wkład zawiera zarówno aminokwas chroniony przez Fmoc, jak i HBTU.
    3. Po przeprowadzeniu wszystkich kontroli syntezy wstępnej w syntezatorze (uzupełnienie odczynników, przepłukanie linii odczynników i zwiększenie ciśnienia we wszystkich butelkach z odczynnikami), umieść wkłady z aminokwasami w karuzeli w kierunku końca C' do N'. Umieść pusty wkład po końcowej pozycji aminokwasu dla ostatniego etapu deprotekcji Fmoc na N-końcu.
    4. Zsyntetyzuj peptyd przy użyciu standardowych zalecanych ustawień.
      1. Odchroń grupę Fmoc od żywicy za pomocą 5 ml 20% piperydyny w DMF (5 min x 2).
      2. Umyj żywicę DMF (6 x 5 ml) przed etapem łączenia.
      3. Do pojedynczego etapu sprzęgania dodaj 4 ml 0,4 M N-metylomorfoliny w DMF do aminokwasu chronionego Fmoc i HBTU. Aktywuj roztwór aminokwasowy chroniony przez Fmoc na 30 s przed przeniesieniem roztworu do naczynia reakcyjnego.
        Uwaga: Automatyczny syntezator peptydów miesza żywicę i roztwór poprzez bulgotanie gazuN2 co 30 s przez 20 minut, podczas gdy zachodzi reakcja sprzęgania. W przypadku ręcznej syntezy peptydów należy umieścić naczynie reakcyjne na wytrząsarce orbitalnej z niską prędkością na czas trwania etapu sprzęgania.
      4. Odcedź roztwór i przemyj żywicę DMF (3 x 5 ml).
      5. Powtórz kroki od 1.2.4.1 do 1.2.4.4 dla każdego aminokwasu chronionego Fmoc w kierunku C' do N'-końca, aby zsyntetyzować peptyd będący przedmiotem zainteresowania.
    5. Po ostatnim N-końcowym etapie deprotekcji, przenieś żywicę do jednorazowej strzykawki ze strzykawką. Przemyć żywicę DMF (3 x 5 ml) i dichlorometanem (DCM, 3 x 5 ml).
      Uwaga: Żywica może być przechowywana po umyciu DCM w eksykatorze próżniowym. Jeśli żywica była przechowywana przed sprzężeniem, należy upewnić się, że żywica pęcznieje w DKZ przed reakcją sprzęgania.
    6. Sprzęgnąć prekursor ditiolanu (1) z N-końcem peptydu na żywicy, dodając 4 równoważniki 1,5 ml DMF, 4 równoważniki HBTU i 10 równoważników N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA). Wstępnie aktywuj mieszaninę sprzęgającą na 10 minut przed dodaniem do strzykawki zawierającej strzykawkę z żywicą.
    7. Potrząsać reakcją sprzęgania przez 2 godziny. Po 2 godzinach przemyć żywicę DMF (3 x 5 mL) i powtórzyć reakcję sprzęgania z wytrząsaniem przez noc.
    8. Po drugim sprzęgnięciu przemyć żywicę DMF (3 x 5 ml) i DCM (3 x 5 ml).
      Uwaga: Żywica może być przechowywana w tym momencie w próżni do momentu rozszczepienia.
  3. Deprotekcja tiooctanu i rozszczepienie peptydów z żywicy
    1. Aby zdezprotect grupę tiooctanową przed prekursorem N-końcowego ditiolanu, przenieś wysuszoną żywicę do 10 ml mikrofalowej probówki reakcyjnej i dodaj 2 ml DMF. Pozwól żywicy pęcznieć, dodaj małe mieszadło magnetyczne do naczynia i ponownie zawiesić z małą prędkością mieszania magnetycznego na 15 minut.
    2. Dodać 2 ml stężonego wodorotlenku amonu, przykryć naczynie reakcyjne silikonową przegrodą i umieścić naczynie reakcyjne w reaktorze mikrofalowym, stosując ustawienia mikrofal 75 °C na 45 minut z mieszaniem.
    3. Po zakończeniu reakcji mikrofalowej przenieś żywicę do czystej, jednorazowej strzykawki do smażenia. Przemyć DMF (2 x 5 ml) i metanolem (MeOH, 2 x 5 mL).
    4. Dodać roztwór stężonego wodorotlenku amonu w metanolu (1:4) do całkowitej objętości 5 ml. Pozostaw na noc do wstrząśnięcia, aby zwiększyć wewnątrzcząsteczkowe utlenianie wiązania dwusiarczkowego w pierścieniu ditionowym.
    5. Umyj żywicę MeOH (2 x 5 ml) i DCM (3 x 5 ml).
      Uwaga: W tym momencie wysuszoną żywicę można przechowywać w eksykatorze próżniowym.
    6. Dodaj koktajl łupliwy do strzykawki zawierającej żywicę, delikatnie wstrząsając przez 1,5 godziny. Zastosowany koktajl łupliwy składa się z 95% kwasu trifluorooctowego (TFA), 2,5% triizopropylosilanu (TIPS) i 2,5% wody o całkowitej objętości 5 ml.
      UWAGA: Pracować wyłącznie pod wyciągiem chemicznym. TFA jest lotny i.
      Uwaga: W przypadku większości sekwencji peptydowych i grup chroniących łańcuch boczny aminokwasów powyższy roztwór koktajlu rozszczepienia jest wystarczający; jednak alternatywne koktajle rozszczepienia mogą być potrzebne dla niektórych grup chroniących łańcuch boczny aminokwasów (w szczególności peptydów zawierających Cys, Met, Trp i Arg) lub innych chemii żywic20.
    7. Wytrącić surowy peptyd w 25 ml zimnego eteru dietylowego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez krople dodawane ze strzykawki do spiekawki. Peptyd wytrąca się w postaci białego ciała stałego. Osadzać peptyd przez odwirowanie przy 1300 x g przez 10 min. Ostrożnie zdekantować eter dietylowy do osobnego pojemnika w celu zbierania odpadów.
    8. Dodać kolejne 25 ml eteru dietylowego do stożkowej probówki i ponownie zawiesić osad przez wirowanie. Powtórzyć wirowanie przy 1300 x g przez 10 minut i ponownie zdekantować eter dietylowy. Wysuszyć granulat w próżni.
  4. Oczyszczanie modyfikowanego peptydu 1,2-ditionanowego
    Uwaga: Oczyść surowy peptyd za pomocą HPLC z odwróconą fazą. Zbierz i połącz piki peptydów i potwierdź masę za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.
    1. Rozpuść surowy osad peptydowy w minimalnej ilości acetonitrylu z 0,1% TFA. Ze względu na hydrofobowość peptydu i skłonność do agregacji, delikatnie podgrzej próbkę w temperaturze 40 °C, aby poprawić rozpuszczalność.
      Uwaga: Unikaj wyższych temperatur i sonikacji peptydu, aby zapobiec potencjalnym reakcjom wymiany dwusiarczkowej21,22,23.
    2. Aby przygotować 1 ml surowego peptydu do oczyszczania metodą HPLC, dodać 400 μl skoncentrowanego materiału peptydowego w acetonitrylu do 600 μlH2Oz 0,1 % TFA i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 22 μm do fiolki HPLC. Można dodać dodatkowe 5% izopropanolu, aby zapobiec agregacji peptydów i wytrącaniu się.
    3. Oczyść peptyd za pomocą półpreparatywnej kolumny C-18 o natężeniu przepływu 3 ml/min po liniowym gradiencie 15-55% acetonitrylu w 20 minut. Ustaw detektory UV na 222 nm (szkielet amidowy) i 330 nm (wiązanie dwusiarczkowe). Zbierz i połącz interesujące nas piki (Rysunek 2A).
    4. Potwierdź masę produktu peptydowego za pomocą spektrometru masowego MALDI-TOF w trybie reflektronu ( Rysunek 2B). Do analizy zmieszać 0,5 μl zebranego piku na płytce MALDI z 0,5 μl matrycy kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) (10 mg/ml DHB w 50% acetonitrylu, 0,1% TFA).
      Uwaga: Typowe addukty w spektrometrii mas MALDI-TOF obejmują piki adduktu soli sodu i potasu ([M+Na]+ i [M+K]+). Odsalanie próbki przed analizą jest zalecane, jeśli piki adduktu soli tłumią sygnał głównego piku [M+H]+. Dodatkowo w peptydzie modyfikowanym 1,2-ditiolanem wykrywa się również utleniony pik [M+O]+. Raport na temat utleniania indukowanego laserem w wyniku jonizacji MALDI przy użyciu matrycy DHB sugeruje, że czynniki, takie jak stężenie próbki, rozpuszczalnik i intensywność lasera, mogą być modyfikowane w celu ograniczenia artefaktu utleniania indukowanego przez MALDI24.
    5. Po potwierdzeniu przez MALDI-TOF prawidłowej masy, należy liofilizować peptyd po błyskawicznym zamrożeniu. Trzymaj liofilizowany proszek peptydowy w próżni do momentu montażu.

2. Charakterystyka supramolekularnych struktur samoorganizujących

się
  1. Powstawanie włókien amyloidowych
    1. Aby przygotować roztwór do samodzielnego organizowania, odważyć 1 mg proszku peptydowego za pomocą wagi analitycznej. Rozpuścić w mieszaninie (pH 7,5) 20% acetonitrylu i 10 mM (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego kwasu (HEPES) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, do końcowego stężenia 1 mg/ml mieszaniny zespołu peptydów. Zmieszaj roztwór montażowy i pozostaw do złożenia w temperaturze pokojowej.
  2. Charakterystyka spektroskopowa włókien amyloidowych
    1. Śledź proces składania peptydów za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) co kilka dni. Szeroki pik wyśrodkowany około 1670 cm-1 to sygnatura IR wynikająca z niepołączonych peptydów w sample17. Próbki składania peptydów zwykle potrzebują od jednego do dwóch tygodni, aby szeroki, niezłożony pik zniknął i osiągnął dojrzałość.
      1. Wysuszyć podwielokrotność 8-10 μl roztworu montażowego w postaci cienkiej warstwy na krysztale diamentu ATR. Monitoruj zanikanie dużego i szerokiego szczytu wody od 1640 do 1630 cm-1 w miarę tworzenia się suchego filmu.
      2. Pobieraj widma podczerwieni z zakresu 1500-1800 cm-1, wykonując średnio 50 skanów z rozdzielczością 2 cm-1. Pobieraj i odejmuj skany w tle przed każdym skanowaniem próbki. Sygnatura IR dla montażu β arkuszy to ostry szczyt między 1625 a 1635 cm-1 (Rysunek 3A)25,26.
    2. Scharakteryzuj składanie peptydów w struktury supramolekularne bogate w β arkusze za pomocą dichroizmu kołowego (CD). Rejestrować widma za pomocą spektropolarymetru CD z systemem kontroli temperatury Peltiera.
      1. Odpipetować 30 μl roztworu montażowego w mikrokuwecie o długości ścieżki 0,1 mm.
        Uwaga: Uchwyt na kutę jest potrzebny do zaciśnięcia i umieszczenia ogniwa o krótkiej długości ścieżki w instrumencie.
      2. Dla każdego widma ustaw instrument CD na następujące parametry: długości fal skanowania od 300 nm do 180 nm, szybkość skanowania 100/min, szerokość pasma 1 nm, 25 °C, średnia z trzech skanów.
      3. Zebrać widmo buforu (20% acetonitrylu/10 mM HEPES, pH 7,5) i odjąć od każdej próbki jako kontrolę. Sygnatura CD dla β-arkuszy to minimum eliptyczności wyśrodkowane wokół 220 nm (Rysunek 3B)27.
  3. Mikroskopia włókien amyloidowych
    1. Odczekaj od dwóch do trzech tygodni, aż próbki peptydów dojrzeją do bogatych w β arkusze struktur supramolekularnych.
      Uwaga: Zespoły mogą być obrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) również na wcześniejszych etapach procesu montażu.
      1. Odmierzyć pipetą 10 μl roztworu zespołu peptydów na powierzchnię siatki węglowej TEM.
        Uwaga: Uważaj, aby nie dotknąć końcówki pipety do powierzchni siatki. Wysoce precyzyjna, samozamykająca się pęseta służy do przytrzymywania siatki TEM podczas przygotowania.
      2. Odczekaj 1-2 minuty, aby zespoły zaadsorbowały się na powierzchni siatki. Usunąć nadmiar próbki, dotykając bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki.
      3. Przygotuj 2% plamę z octanu uranylu, dodając 100 μl wody dejonizowanej do dostępnego w handlu 4% roztworu octanu uranylu. Odpipetować 10 μl 2% octanu uranylu na powierzchnię siatki i inkubować przez 2-3 minuty. Po inkubacji usuń nadmiar plamy, dotykając bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki.
      4. Umieść na noc kratki TEM w eksykatorze próżniowym. Przechowywać w próżni do czasu obrazowania.
      5. Zobrazuj przygotowane próbki za pomocą TEM ( Rysunek 3C). Typowe parametry dla mikroskopii są następujące: obrazy w powiększeniach od 9 300X do 23 000X, włókno wolframowe o napięciu przyspieszającym 120 kV.
        Uwaga: ImageJ może być używany do pomiaru średniej szerokości włókien w strukturach supramolekularnych uzyskanych obrazów TEM28.
        UWAGA: Przed użyciem należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki (SDS). Kilka substancji chemicznych stosowanych w syntezie, oczyszczaniu i charakterystyce opisanych samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem jest lub toksycznych i powinno być stosowanych wyłącznie pod okapem oparów chemicznych. Podczas pracy w laboratorium należy zawsze używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (w tym okularów ochronnych, fartucha laboratoryjnego, długich spodni, butów z zakrytymi palcami).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprócz początkowej jednoetapowej syntezy cząsteczki prekursora ditiolanu, reszta syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditionanową zachodzi na stałym podłożu (Rysunek 1A). Konwersja kwasu 3-bromo-2-(bromometylo)propionowego do kwasu 3-(acetylo)-2-(acetylotiometylo)propanowego, prekursora ditiolanu, jest potwierdzana przez 1H i 13C NMR (Rysunek 1B i C) przed sprzężeniem z wolną aminą N-końcową peptydu nadal na żywi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule omówiono szczegóły zarówno syntezy, jak i oczyszczania N-końcowego samoorganizującego się peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem oraz charakterystykę powstałych struktur supramolekularnych. Opisana tutaj synteza peptydu 1,2-ditiolanu ma zalety, w tym jednoetapową syntezę w celu wytworzenia prekursora ditiolanu, kwasu 3-(acetylotio)-2-(acetylotiometylo)propanowego, oraz reakcję deprotekcji mikrofalowej na żywicy grupy ochronnej prekursora tiooctanu w celu uzyskania utlenionej cząstki 1,2-ditiolanu wykorzystujące...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr B. Ellen Scanley za jej techniczne szkolenie i pomoc przy użyciu TEM w Connecticut State Colleges and University (CSCU) Center for Nanotechnology oraz dr Ishita Mukerji z Wesleyan University za dostęp do jej spektrofotometru CD. Przedstawione prace były częściowo wspierane przez Instytut Naukowy na Uniwersytecie Fairfield, NASA Connecticut Space Grant Consortium oraz przez National Science Foundation w ramach grantu o numerze CHE-1624774.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lodowisko amidowe, żywica MBHA, o dużym obciążeniuGyros Protein TechnologiesRAM-5-HLUnikać kontaktu ze skórą i oczami; nie wdychać
N,N-dimetyloformamiduFisher ScientificD119-4Łatwopalna ciecz i pary; działa drażniąco na oczy i skórę; Stosować środki ochrony osobistej; Przechowywać z dala od otwartego ognia
Fmoc-L-Val-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-VStosować środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Leu-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-LStosować środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Lys(Boc)-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-KBCNosić środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Phe-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-FNosić środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Ala-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-AStosować środki ochrony osobistej; nie wdychać
Fmoc-L-Gln(Trt)-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-QTStosować środki ochrony osobistej; nie wdychać
N,N,N′,N′-tetrametylo-O-(1H-benzotriazol-1-ylo)heksafluorofosforan uranuGyros Protein Technologies26432Działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe; nie wdychać; stosować pod maską lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu
0,4 M N-metylomorfolina w DMFGyros Protein TechnologiesPS3-MM-Lwysoce łatwopalny; nosić środki ochrony osobistej; Przechowywać z dala od źródeł ciepła i przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty; Nie wdychać ani nie połykać; dokładnie umyć skórę po kontakcie z
20% piperydyną w DMFGyros Protein TechnologiesPS3-PPR-LPowoduje poważne oparzenia oczu i skóry; Łatwopalna ciecz i para; Nie wdychać
dichlorometanuFisher ScientificD37-4Może powodować raka; Nie wdychać; Nosić środki ochrony osobistej; używać tylko pod maską; w przypadku kontaktu zalać wodą przez co najmniej 15 minut i zasięgnąć porady lekarza
acetonitrylFisher ScientificA998-4Łatwopalny; działa drażniąco na oczy; Stosować środki ochrony osobistej; Używać tylko pod wyciągiem; Przechowywać z dala od otwartego ognia lub gorących powierzchni; W przypadku kontaktu płukać wodą przez co najmniej 15 minut i uzyskać pomoc lekarską
Kwas trifluorooctowyFisher ScientificA116-50Powoduje poważne oparzenia; nie wdychać; działa szkodliwie na organizmy wodne; stosować środki ochrony osobistej; stosować tylko pod wyciągiem; w przypadku kontaktu płukać wodą przez co najmniej 15 minut i natychmiast wezwać
octanu uranylu 4% octan uranyluMikroskopia elektronowa Nauki22400-4Nie wdychać; Działa szkodliwie na organizmy wodne
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowyAcros OrganicsAC172571000Nie wdychać; używać na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu
azot GazTechAirZawartość pod ciśnieniem, może eksplodować po podgrzaniu
Kwas 3-bromo-2-(bromometylo)propionowyAlfa AesarAAA1963014Nie wdychać; działa drażniąco na skórę i oczy;
wodorotlenek soduFisher ScientificS318-100Stosować środki ochrony osobistej; stosować tylko pod wyciągiem; w przypadku kontaktu spłukać obszar przez co najmniej 15 minut i zasięgnąć porady lekarza
Tiooctan potasuAcros OrganicsAC221300250Działa drażniąco na skórę i oczy; nie wdychać; stosować środki ochrony osobistej
kwas siarkowyFisher ScientificSA213Powoduje oparzenia; trzymać z dala od wody; trzymać z dala od materiałów palnych; nie wdychać; stosować środki ochrony osobistej; w przypadku kontaktu spłucz obszar przez co najmniej 15 minut i zasięgnij porady lekarza
chloroform-dAcros OrganicsAC320690075Możliwe zagrożenie rakiem; działa drażniąco na skórę i oczy; nie wdychać; Stosować środki ochrony osobistej; Używać tylko pod wyciągiem; W przypadku kontaktu spłucz obszar przez co najmniej 15 minut i zasięgnij porady lekarza
chloroformFisher ScientificC298-4Możliwe zagrożenie rakiem; działa drażniąco na skórę i oczy; nie wdychać; Stosować środki ochrony osobistej; Używać tylko pod wyciągiem; W przypadku kontaktu płukać obszar przez co najmniej 15 minut i uzyskać pomoc lekarską
N,N-diizopropyloetyloaminaAcros OrganicsAC367841000Wysoce łatwopalny; szkodliwy dla organizmów wodnych; nosić środki ochrony osobistej; nie połykać
wodorotlenku amonuFisher ScientificA669S-500; nie wdychać
metanoluFisher ScientificA452-4Łatwopalna ciecz i para; stosować środki ochrony osobistej; nie wdychać; W przypadku kontaktu spłucz obszar przez co najmniej 15 minut i zasięgnij porady lekarza
triizopropylosilanSigma Aldrich233781łatwopalny; używać osobistego sprzętu ochronnego; przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty
eter dietylowyFisher ScientificE138-1Skrajnie łatwopalny; Działa drażniąco na skórę i oczy; Stosować środki ochrony osobistej
Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowySigma Aldrich39319-10x10MG-Fnie wdychać; działa drażniąco na skórę i oczy
Kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowyAlfa AesarAAJ67635EXK
c18 końcówka zamka błyskawicznegoMilliporeZTC18S096
chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosforynowyThermo ScientificPI20490
żel krzemionkowy 60 F254 powlekane aluminiowe arkusze TLCEMD Millipore1.05549.0001
Cienkościenne precyzyjne rurki NMRBel-Art6630005855mm OD
całkowicie plastikowe strzykawki Norm-JectAir TiteAL10
BD PrecisionGlideBD 305185zużyte igły są wyrzucane do pojemnika na ostre odpady
jednorazowa strzykawka spiekanaW raporcie użyto strzykawek spiekanych Torviq SF1000LL 10 ml, ale w razie potrzeby dostępne są większe strzykawki do syntezy na większą skalę.
siatkawęglowa Ted Pella, Inc.CF200-CUUpewnij się, że przygotowujesz próbki i barwienie po stronie siatki węglowej, a nie po błyszczącej miedzianej stronie siatki
pęseta samozamykającasię Mikroskopia elektronowaSciences 78318-3Xbardzo ostre końcówki, długość: 120 mm
0,1 mm krótka długość ścieżki komórkaStarna Cells, Inc.20 / C-Q-0.1Delikatne
nasadki naczyń 10 mlCEM909210
Zbiorniki ciśnieniowe 10 ml CEM908035
Aeris Semi-Prep Kolumna HPLCPhenomenex00F-4632-N0150 x 10 mm
Starna Cells, Inc.CH-2049Potrzebny przy użyciu komórek o krótkiej długości ścieżki
Syntezator peptydowy PS3Gyros Protein Technologies
DiscoverSP Reaktor mikrofalowyWirówka CEM
HERMLEZ 206 Aużywała stałego wirnika 6x50 mL
HPLCShimadzuUV Detector
spektrometr magnetycznego rezonansu jądrowegoAvance, Bruker
Spektrometr masowy 300 MHz MALDI-TOFAxima Confidence, liofilizator Shimadzu
Millrock TechnologyBT85A
Alpha Tensor,
Tecnai Spirit, FEIUżywany z światłowodową kamerą cyfrową CCD Gatan, Orius. Dostęp do CSCU Center for Nanotechnology
Circular Dichroism SpectropolarimeterJ-810, JASCOUżywany z sześcioogniwowym regulatorem temperatury Peltiera. Dostęp na Uniwersytecie Wesleyan.
: lekarza do : W raporcie zastosowano Jednorazowa igła Uchwyt na kuwetę Spektrometr podczerwieni z transformacją Fouriera transmisyjny mikroskop elektronowy Bruker

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, J., Liu, K., Xing, R., Yan, X. Peptide self-assembly: Thermodynamics and kinetics. Chemical Society Reviews. 45, 5589-5604 (2016).
  2. Dong, R., et al. Functional supramolecular polymers for biomedical applications. Advanced Materials. 27, 498-526 (2015).
  3. Edwards-Gayle, C. J. C., Hamley, I. W. Self-assembly of bioactive peptides, peptide conjugates, and peptide mimetic materials. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5867-5876 (2017).
  4. Goor, O. J. G. M., Hendrikse, S. I. S., Dankers, P. Y. W., Meijer, E. W. From supramolecular polymers to multi-component biomaterials. Chemical Society Reviews. 46, 6621-6637 (2017).
  5. DiMaio, J. T. M., Doran, T. M., Ryan, D. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Modulating supramolecular peptide hydrogel viscoelasticity using biomolecular recognition. Biomacromolecules. 18, 3591-3599 (2017).
  6. DiMaio, J. T. M., Raymond, D. M., Nilsson, B. L. Display of functional proteins on supramolecular peptide nanofibrils using a split-protein strategy. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 5279-5283 (2017).
  7. Mahmoud, Z. N., Gunnoo, S. B., Thomson, A. R., Fletcher, J. M., Woolfson, D. N. Bioorthogonal dual functionalization of self-assembling peptide fibers. Biomaterials. 32, 3712-3720 (2011).
  8. Petkau-Milroy, K., Uhlenheuer, D. A., Spiering, A. J. H., Vekemans, J. A. J. M., Brunsveld, L. Dynamic and bio-orthogonal protein assembly along a supramolecular polymer. Chemical Science. 4, 2886-2891 (2013).
  9. Li, A., et al. Neurofibrillar tangle surrogates: Histone H1 binding to patterned phosphotyrosine peptide nanotubes. Biochemistry. 53, 4225-4227 (2014).
  10. Sadownik, A., Stefely, J., Regen, S. L. Polymerized liposomes formed under extremely mild conditions. Journal of the American Chemical Society. 108, 7789-7791 (1986).
  11. Zhang, N., et al. ATN-161 Peptide functionalized reversibly cross-linked polymersomes mediate targeted doxorubicin delivery into melanoma-bearing C57BL/6 mice. Molecular Pharmaceutics. 14, 2538-2547 (2017).
  12. Margulis, K., et al. Formation of polymeric nanocubes by self-assembly and crystallization of dithiolane-containing triblock copolymers. Angewandte Chemie International Edition. 56, 16357-16362 (2017).
  13. Zhang, X., Waymouth, R. 1,2-Dithiolane-Derived Dynamic, Covalent Materials: Cooperative Self-Assembly and Reversible Cross-Linking. Journal of the American Chemical Society. 139, 3822-3833 (2017).
  14. Sakia, N., Matile, S. Stack exchange strategies for the synthesis of covalent double-channel photosystems by self-organizing surface-initiated polymerization. Journal of the American Chemical Society. 133, 18542-18545 (2011).
  15. Uji, H., Morita, T., Kimura, S. Molecular direction dependence of single-molecule conductance of a helical peptide in molecular junction. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, 757-760 (2013).
  16. Liang, C., Ni, R., Smith, J. E., Childers, W. S., Mehta, A. K., Lynn, D. G. Kinetic intermediates in amyloid assembly. Journal of the American Chemical Society. 136, 15116-15149 (2014).
  17. Smith, J. E., et al. Defining the dynamic conformational network of cross-β peptide assembly. Israel Journal of Chemistry. 55, 763-769 (2015).
  18. Black, S. P., Sanders, J. K. M., Stefankiewicz, A. R. Disulfide exchange: Exposing supramolecular reactivity through dynamic covalent chemistry. Chemical Society Reviews. 43, 1861-1872 (2014).
  19. Vendetti, A., et al. Dihydroasparagusic acid: Antioxidant and tyrosinase inhibitory activities and improved synthesis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 6848-6855 (2013).
  20. Stawikowski, M., Fields, G. B. Introduction to peptide synthesis. Current Protocols in Protein Science. 26, (2002).
  21. Canadell, J., Goossens, H., Klumperman, B. Self-healing materials based on disulfide links. Macromolecules. 44, 2536-2541 (2011).
  22. Lafont, U., van Zeijl, H., van der Zwaag, S. Influence of cross-linkers on the cohesive and adhesive self-healing ability of polydisulfide-based thermosets. ACS Applied Materials and Interfaces. 4, 6280-6288 (2012).
  23. Komaromy, D., Stuart, M. C. A., Santiago, G. M., Tezcan, M., Krasnikov, V. V., Otto, S. Self-assembly can direct dynamic covalent bond formation toward diversity or specificity. Journal of the American Chemical Society. 139, 6234-6241 (2017).
  24. McAvery, K. M., Guan, B., Fortier, C. A., Tarr, M. A., Cole, R. B. Laser-induced oxidation of cholesterol observed during MALDI-TOF mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 659-669 (2011).
  25. Krimm, S., Bandekar, J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins. Advances in Protein Chemistry. 38, 181-364 (1986).
  26. Halverson, K. J., Sucholeiki, I., Ashburn, T. T., Lansbury, P. T. Location of β-sheet-forming sequences in amyloid proteins by FTIR. Journal of the American Chemical Society. 113, 6701-6703 (1991).
  27. Greenfield, N., Fasman, G. D. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein confirmation. Biochemistry. 8, 4108-4116 (1969).
  28. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2016).
  29. Roy, S., Shinde, S., Hamilton, G. A., Hartnett, H. E., Jones, A. K. Artificial [FeFe]-hydrogenase: On resin modification of an amino acid to anchor a hexacarbonyldiiron cluster in a peptide framework. European Journal of Inorganic Chemistry. 2011, 1050-1055 (2011).
  30. Van Duinen, S. G., Castano, E. M., Prelli, F., Bots, G. T. A. B., Luyendijk, W., Frangione, B. Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis in patients of Dutch origin is related to Alzheimer disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 5991-5994 (1987).
  31. Barth, A. The infrared absorption of amino acid sidechains. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 74, 141-173 (2000).
  32. Jayaraman, M., et al. Slow amyloid nucleation via α-helix-rich oligomeric intermediates in short polyglutamine-containing Huntingtin fragments. Journal of Molecular Biology. 415, 881-899 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Peptyd 12 ditiolanowysynteza na fazie sta ejdeprotekcja mikrofalowaoczyszczanie metod HPLCanaliza MALDI TOFspektroskopia FT IRdichroizm ko owytransmisyjna mikroskopia elektronowaw kna amyloidowe

Powiązane artykuły