Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tworzenie luminoforów w różnych konformacjach albuminy surowicy bydlęcej przez wiązanie złota(III)

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58141

⸱

31 sierpnia 2018

 , 
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokoły do badania wiązania kationów złota (Au(III)) z różnymi konformacjami albuminy surowicy bydlęcej (BSA), jak również do charakteryzowania zależnej od konformacji unikalnej fluorescencji BSA-Au.

Streszczenie

Celem prezentowanych protokołów jest badanie procesu wiązania Au(III) z BSA, co daje wywołaną zmianą konformacji czerwoną fluorescencję (λem = 640 nm) kompleksów BSA-Au(III). Metoda dostosowuje pH, aby pokazać, że pojawienie się czerwonej fluorescencji jest skorelowane z indukowanymi przez pH przemianami równowagi konformacji BSA. Kompleksy BSA-Au(III) z czerwoną fluorescencją mogą być tworzone tylko przy dostosowaniu pH do 9,7 lub wyższego, co odpowiada konformacji BSA w formie "A". Opisano protokół regulacji stosunku molowego BSA do Au oraz monitorowania przebiegu w czasie procesu wiązania Au(III). Minimalna liczba Au(III) na powierzchnię powierzchniową potrzebna do wytworzenia czerwonej fluorescencji jest mniejsza niż siedem. Opisujemy protokół w krokach, aby zilustrować obecność wielu miejsc wiązania Au(III) w BSA. Po pierwsze, dodając kationy miedzi (Cu(II)) lub niklu (Ni(II)), a następnie Au(III), metoda ta ujawnia miejsce wiązania Au(III), które nie jest czerwonym fluoroforem. Po drugie, poprzez modyfikację BSA za pomocą tiolowych środków zamykających, ujawnia się inne nietworzące fluoroforu miejsce wiązania Au(III). Po trzecie, zmieniając konformację BSA poprzez rozszczepianie i zamykanie wiązań dwusiarczkowych, zilustrowano możliwe miejsca wiązania Au(III). Opisany protokół, służący do kontroli konformacji BSA i wiązania Au(III), może być ogólnie stosowany do badania interakcji innych białek i kationów metali.

Wprowadzenie

Związek BSA-Au wykazujący pobudliwą czerwoną fluorescencję w ultrafiolecie (UV), z niezwykłym przesunięciem w kierunku Stokesa, został pierwotnie zsyntetyzowany przez Xie et al. 1. Unikalna i stabilna czerwona fluorescencja może znaleźć różne zastosowania w takich dziedzinach jak sensing2,3,4, imaging5,6,7, lub nanomedicine8,9,10,11,12,13. Związek ten był w ostatnich latach intensywnie badany przez wielu badaczy w dziedzinie nanonauki14,15,16. Związek BSA-Au został zinterpretowany jako nanoklastry Au25. Celem przedstawionej metody jest szczegółowe zbadanie tego związku oraz zrozumienie pochodzenia czerwonej fluorescencji. Postępując zgodnie z przedstawionym podejściem, można zilustrować obecność wielu miejsc wiązania Au oraz pochodzenie fluorescencji, alternatywnej dla zarodkowania w jednym miejscu nanoklastrów Au25. To samo podejście można zastosować do zbadania, w jaki sposób inne białka17,18,19 skompleksowane z Au(III) mogą zmieniać swoje wewnętrzne właściwości fluorescencyjne.

Synteza czerwono-fluorescencyjnego związku BSA-Au wymaga ścisłej kontroli stosunków molowych BSA do Au (BSA:Au), aby zmaksymalizować intensywność fluorescencji i lokalizację pików na mapie wzbudzenia-emisji (EEM)20. Można wykazać, że istnieje wiele miejsc wiązania, w których Au(III) może się związać, w tym fragment asparaginy (lub fragment Asp, pierwsze cztery reszty aminokwasowe na N-końcu BSA)21,22. Wykazano również, że 34. aminokwas BSA (Cys-34) koordynuje Au(III) i bierze udział w mechanizmie czerwonej fluorescencji ([Cys34-capped-BSA]-Au(III)))20. Po rozszczepieniu wszystkich wiązań dwusiarczkowych Cys-Cys i zamknięciu wszystkich tioli nie powstaje czerwona fluorescencja ([BSA-all-tiol-capped-BSA]-Au(III)). Wskazuje to na konieczność wiązań dwusiarczkowych Cys-Cys jako miejsca wiązania Au(III) do wytworzenia czerwonej fluorescencji.

Techniki chemii białek nie były powszechnie stosowane do badania kompleksów BSA-Au(III) w społeczności nanonaukowej. Jednak cenne byłoby zastosowanie tych technik w celu zrozumienia niektórych aspektów tych kompleksów, a także uzyskania szczegółowej wiedzy na temat miejsc wiązania Au(III) w BSA. Ten artykuł ma na celu pokazanie niektórych z tych technik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza kompleksu BSA-Au(III)

  1. Rozpuścić 25 mg BSA w 1 ml wody klasy HPLC o wysokiej sprawności (HPLC) w fiolce reakcyjnej o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Roztwór powinien wydawać się przezroczysty.
  2. Rozpuścić trójwodny chlorek złota (III) (kwas chloroaurowy) do stężenia 5 mM w wodzie o czystości HPLC.
    UWAGA: Roztwór powinien być żółty. Roztwór kwasu chloroaurowego przygotowany w tym stężeniu spowoduje, że stosunek BSA do Au wyniesie 1:13.
    1. Alternatywnie, należy przygotować roztwór kwasu chloroaurowego o stężeniu od 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) do 20 mM (BSA:Au = 1: 50) w wodzie klasy HPLC.
      UWAGA: Różne proporcje BSA do złota spowodują drastycznie różne wzorce czerwonej fluorescencji na mapie wzbudzenia-emisji.
  3. Umieścić fiolkę reakcyjną BSA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i energicznie mieszać z prędkością 750 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego.
  4. Natychmiast po rozpoczęciu mieszania dodać 1 ml kwasu chloroaurowego do roztworu. Kolor roztworu powinien zmienić się z przezroczystego na żółty.
  5. Mieszać mieszaninę przez 2 minuty w temperaturze 37 °C i przy 750 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego.
  6. Do fiolki reakcyjnej dodać 100 μl 1 M NaOH do roztworu, aby doprowadzić pH do 12,
    UWAGA: Natychmiast po dodaniu NaOH roztwór powinien lekko ciemniejeć do żółto-brązowego, a następnie ponownie zmienić kolor na żółty.
  7. Mieszać dalej przy 750 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Roztwór powinien powoli zmieniać kolor z żółtego na ciemnożółty/brązowy. Ta zmiana koloru wskazuje na tworzenie się czerwonego fluorescencyjnego kompleksu BSA-Au(III).
  8. Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na 2 dni, a roztwór będzie nadal ciemnieć do bursztynowobrązowego koloru, a intensywność fluorescencji wzrośnie.
    1. Alternatywnie, pozostawić próbkę nadal mieszać w temperaturze 37 °C przez kolejne 12 godzin, gdy kolor roztworu zmieni się na bursztynowo-brązowy.

2. Synteza BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. Rozpuścić 25 mg BSA w 1 ml wody klasy HPLC. Rozwiązanie powinno wydawać się jasne.
  2. Rozpuścić dwuwodny chlorek miedzi (II) w wodzie o czystości HPLC do stężenia 5 mM. Roztwór powinien wydawać się jasnoniebieski.
  3. Dodać 1 ml wodnego roztworu BSA do fiolki reakcyjnej o pojemności 5 ml i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Wymieszać mieszaninę przy prędkości 750 obr./min.
  4. Natychmiast dodać 0,5 ml roztworu dwuwodnego chlorku miedzi (II) do fiolki reakcyjnej i mieszać przez 2 minuty. Roztwór pozostanie jasnoniebieski.
  5. Dodać 75 μl 1 M NaOH, aby doprowadzić pH do 12 i pozostawić do wymieszania na 2 godziny. Roztwór stanie się fioletowy.
  6. Rozpuścić kwas chloroaurowy w wodzie o czystości HPLC do stężenia 5 mM.
  7. Dodać 0,5 ml wodnego roztworu kwasu chloroaurowego do fiolki reakcyjnej i doprowadzić pH z powrotem do 12 za pomocą 1 M NaOH.
  8. Mieszaninę reakcyjną mieszać przez 2 h.
    UWAGA: Roztwór powinien ewoluować do brązowego koloru.

3. Synteza BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. Rozpuścić 25 mg BSA w 1 ml wody klasy HPLC. Rozwiązanie powinno wydawać się jasne.
  2. Rozpuścić sześciowodny chlorek niklu (II) w wodzie klasy HPLC do stężenia 5 mM. Roztwór powinien być jasnozielony.
  3. Dodać 1 ml wodnego roztworu BSA do fiolki reakcyjnej o pojemności 5 ml i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC. Wymieszać mieszaninę przy prędkości 750 obr./min.
  4. Natychmiast dodać 0,5 ml sześciowodnego roztworu chlorku niklu (II) do fiolki reakcyjnej i mieszać przez 2 min.
    UWAGA: Roztwór pozostanie jasnozielony.
  5. Dodać 75 μl 1 M NaOH, aby doprowadzić pH do 12 i pozostawić do wymieszania przez 2 godziny
    UWAGA: Roztwór stanie się ciemnożółty.
  6. Rozpuścić kwas chloroaurowy w wodzie o czystości HPLC do stężenia 5 mM.
  7. Dodać 0,5 ml wodnego roztworu kwasu chloroaurowego do fiolki reakcyjnej i ustawić pH z powrotem na 12.
  8. Mieszaninę reakcyjną mieszać przez 2 h.
    UWAGA: Roztwór powinien ewoluować do brązowego koloru.

4. Synteza [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. Rozpuścić 2 mg N-etylomaleimidu (NEM) w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4).
  2. Rozpuścić 2 mg BSA w 1 ml roztworu PBS-NEM.
  3. Przenieść roztwór do fiolki reakcyjnej o pojemności 5 ml i mieszać w temperaturze 20 °C przy 500 obr./min przez 1 godzinę.
  4. Roztwór należy dializować za pomocą rurki dializacyjnej o natężeniu 12 kDa w 500 ml PBS, mieszając z prędkością 50 obr./min z mieszadłem magnetycznym przez noc w celu usunięcia nieprzereagowanego NEM.
  5. Rozpuścić kwas chloroaurowy w PBS do stężenia 0,4 mM.
    UWAGA: Roztwór będzie miał bladożółty kolor.
  6. Przenieść fiolkę reakcyjną do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszać przy prędkości 750 obr./min.
  7. Natychmiast dodać 1 ml roztworu kwasu chloroaurowego do fiolki reakcyjnej i pozostawić do wymieszania na 2 minuty.
  8. Dodać 75 μl 1 M NaOH do fiolki reakcyjnej, aby doprowadzić pH do 12 i pozostawić do wymieszania na 2 godziny.

5. Synteza [BSA]-Au(III)

  1. Przygotować roztwór 2 M mocznika i 50 mM wodorowęglanu amonu (NH4HCO3, pH 8,0) w wodzie o czystości HPLC.
  2. Rozpuścić 3,3 mg BSA w 1 ml powyższego roztworu i przenieść do fiolki reakcyjnej o pojemności 5 ml.
  3. Przygotować roztwór podstawowy 0,25 M tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP), rozpuszczając 62,5 mg TCEP w 1 ml wody HPLC.
  4. Dodać roztwór podstawowy TCEP do fiolki reakcyjnej, aż końcowe stężenie TCEP wyniesie 8 mM.
  5. Inkubować roztwór w łaźni wodnej przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C. Mieszać przy 500 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego.
  6. Poczekaj, aż roztwór całkowicie ostygnie do temperatury pokojowej.
  7. Przygotować roztwór podstawowy 100 mM NEM, rozpuszczając 12,5 mg NEM w 1 ml wody klasy HPLC.
  8. Dodać roztwór podstawowy NEM do fiolki reakcyjnej, aż końcowe stężenie NEM wyniesie 16 mM.
  9. Pozostawić roztwór do połączenia przez 2 godziny w temperaturze 20 °C. Mieszać przy 500 obr./min.
  10. Dializować roztwór za pomocą rurki dializacyjnej o sile 12 kDa, mieszając roztwór z prędkością 50 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego przez noc w 500 ml 50 mM NH4HCO3 w celu usunięcia nadmiaru TCEP, NEM i mocznika.
  11. Przenieść fiolkę reakcyjną do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i mieszać z prędkością 750 obr./min.
  12. Rozpuścić kwas chloroaurowy w wodzie klasy HPLC do stężenia 0,66 mM.
  13. Natychmiast dodać 1 ml roztworu kwasu chloroaurowego do fiolki reakcyjnej i pozostawić do wymieszania na 2 minuty.
  14. Dodać 1 M NaOH do momentu, gdy pH roztworu osiągnie 12 i pozostawić roztwór do dalszego mieszania przez 2 godziny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na podstawie fluorescencji kompleksu BSA-Au(III) zaobserwowano, że konwersja wewnętrznej niebieskiej fluorescencji BSA (λem = 400 nm) na fluorescencję czerwoną (λem = 640 nm) zachodzi przy pH około 9,7 poprzez przejście równowagowe (Rycina 1). EEM BSA-Au(III) przy różnych stosunkach molowych BSA do Au przedstawiono na Rycini 2; dane te pokazują, że zmiana stosunków molowych prowadzi do uzys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Związki BSA-Au(III) przygotowane przy pH 12 wykazują czerwoną fluorescencję przy długości fali emisji λem= 640 nm po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (UV) λex = 365 nm (rysunek 1A). Pojawienie się czerwonej fluorescencji jest procesem powolnym i zajmie kilka dni w temperaturze pokojowej, aby osiągnąć maksymalną intensywność. Przeprowadzenie reakcji w temperaturze 37 °C przyniesie optymalne wyniki, chociaż wyższa temperatura może być użyta do szybszego wytwor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

S.E. dziękuje za wsparcie ze strony Duke Endowment Special Initiative Fund, Wells Fargo Fund, PhRMA Foundation, a także Startup Funds z University of North Carolina, Charlotte.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), 96%Sigma-AldrichA5611
trójwodny chlorek złota (III), 99.9%Sigma-Aldrich520918
dwuwodny chlorek miedzi (II), 99.999%Sigma-Aldrich459097
sześciowodny chlorek niklu (II), 99.9%Sigma-Aldrich654507
N-etylomaleimid (NEM), >99.0%Sigma-Aldrich4259
Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), >98,0%Sigma-AldrichC4706
Wodorotlenek sodu, >98,0%Sigma-AldrichS8045
Mocznik, 99,5%Chem-Implex Int'l30142
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)CorningMT21040CV
Wodorowęglan amonu, 99.5%Sigma-Aldrich9830

Bibliografia

  1. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
  2. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
  3. Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
  4. Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  5. Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
  6. Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
  7. Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
  8. Daniel, M. -C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
  9. Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
  10. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681(2007).
  11. Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
  12. Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885(2012).
  13. Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853(2014).
  14. Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
  15. Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
  16. Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  17. Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
  18. Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591(2011).
  19. Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
  20. Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
  21. Peters, T. Jr All About Albumin. , (1996).
  22. Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
  23. Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
  24. Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
  25. Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
  26. Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
  27. Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
  28. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  29. Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wiązanie złota(III)tworzenie fluorescencjiregulacja pHzmiana konformacyjnamiejsca wiązania metalicapping tiolowyrozrywanie wiązań disiarczkowychtraktowanie mocznikiemredukcja TCEP
Tworzenie luminoforów w różnych konformacjach albuminy surowicy bydlęcej przez wiązanie złota(III)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.