Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dla modelu raka płuc ex vivo, który naśladuje etapy progresji guza i pomaga wyizolować guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe i zmiany przerzutowe.

Streszczenie

Trudno jest wyizolować komórki nowotworowe w różnych punktach progresji nowotworu. Stworzyliśmy model płuc ex vivo, który może pokazać interakcję komórek nowotworowych z naturalną macierzą i ciągłym przepływem składników odżywczych, a także model, który pokazuje interakcję komórek nowotworowych z normalnymi składnikami komórkowymi i naturalną matrycą. Bezkomórkowy model płuc ex vivo jest tworzony przez wyizolowanie bloku płuco-serce szczura i usunięcie wszystkich komórek w procesie decelularyzacji. Prawe oskrzele główne jest wiązane, a komórki nowotworowe są umieszczane w tchawicy za pomocą strzykawki. Komórki poruszają się i zasiedlają lewe płuco. Płuco jest następnie umieszczane w bioreaktorze, w którym tętnica płucna otrzymuje ciągły przepływ mediów w obiegu zamkniętym. Guz wyrosły na lewym płucu jest guzem pierwotnym. Komórki nowotworowe, które są izolowane w krążących pożywkach, są krążącymi komórkami nowotworowymi, a komórki nowotworowe w prawym płucu są zmianami przerzutowymi. Komórkowy model płuc ex vivo jest tworzony przez pominięcie procesu decelularyzacji. Każdy model może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na różne pytania badawcze.

Wprowadzenie

Przerzuty raka są przyczyną większości zgonów związanych z rakiem i stanowią największe wyzwanie w walce z rakiem. Ogólnym celem tej metody jest zaprojektowanie protokołu dla czterowymiarowej (4-D) hodowli komórkowej, która oprócz trójwymiarowego (3D) wzrostu komórek ma wymiar przepływu. Reprezentuje trzy odrębne fazy procesu przerzutów [tj. guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe (CTC) i zmiany przerzutowe].

W ciągu ostatnich trzech dekad naukowcy na całym świecie dostarczyli niezrównanego bogactwa informacji, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw progresji przerzutów w różnych nowotworach, co zwiększyło perspektywę wyleczenia lub przeżycia wolnego od progresji. Leczenie kliniczne niektórych nowotworów, takich jak rak piersi, uległo znacznej poprawie¹; Jednak niektóre nowotwory, takie jak rak płuc, nadal mają niską przeżywalność². Modele zwierzęce in vitro i in vivo odegrały zasadniczą rolę w uzyskaniu nowych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw rozwoju choroby. W ciągu ostatnich kilku lat ksenoprzeszczepy pochodzące z linii komórkowych (CDX) i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) stały się bardziej interesujące, ponieważ zachowują wiele istotnych cech pierwotnego ludzkiego nowotworu³, takich jak kinetyka wzrostu, cechy histologiczne, cechy behawioralne i odpowiedź na terapię. Jednak każdy model ma swoje ograniczenia, aby zrozumieć mechanizm powstawania CTC i przerzutów do odległego narządu^4,5,6.

Niedawno opracowaliśmy model 4-D ex vivo raka płuc, wykorzystując koncepcję reinżynierii narządów i hodowli komórkowej opartej na perfuzji. Naśladuje wzrost ludzkiego raka płuc poprzez tworzenie perfuzyjnych guzków nowotworowych, które rosną z czasem przy podobnej produkcji białek wydzielanych przez ludzkiego raka⁷. Reprezentuje sygnaturę ekspresji genu, która przewiduje słabe przeżycie u pacjentów z rakiem, a także pokazuje odpowiedź terapeutyczną poprzez regresję guza po leczeniu cisplatyną8^,9. Model płuc został dodatkowo zmodyfikowany tak, aby mógł tworzyć zmiany przerzutowe. CTC rozwijają się z guza pierwotnego i są wewnątrznaczyniowe do układu krwionośnego, a następnie wynaczynione do płuca przeciwległego, tworząc zmiany przerzutowe¹⁰. Badania ekspresji genów sugerują odrębny profil ekspresji guza pierwotnego, CTC i zmian przerzutowych oraz regulację w górę podzbioru genów wymaganych dla fenotypu¹⁰. Ten proces przerzutowy zachodzi z powodu obecności warunków biologicznych obserwowanych u pacjentów z rakiem. Zaletą tego modelu jest obecność naturalnej matrycy i architektury oraz perfuzja składników odżywczych, która prowadzi do powstawania guzków nowotworowych. Ponadto daje również możliwość zbadania wpływu różnych składników mikrośrodowiska guza lub leków na progresję guza w czasie. Model ten może być wykorzystany do hodowli szeregu komórek nowotworowych (rak płuc, rak piersi, mięsak itp.) w warunkach laboratoryjnych.

Protokół

Protokoły eksperymentów na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Houston Methodist Research Institute i przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi przepisami, obowiązującymi prawami, wytycznymi i politykami.

1. Żniwa z płuc szczurów

1. Znieczulić 4- do 6-tygodniowego samca szczura Sprague-Dawley poprzez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) w bok. Zapewnij znieczulenie, sprawdzając, czy nie ma ruchu, gdy palec u nogi tylnej kończyny jest ściśnięty kleszczami.
2. Po 10 minutach ogolić klatkę piersiową i brzuch oraz przetrzeć skórę wacikiem z chlorheksydyną.
3. Usuń skórę, podnosząc ją kleszczami i nacinając jednorazowym skalpelem. Po otwarciu jamy klatki piersiowej poprzez nacięcie skalpelem należy wykonać torakotomię obustronną, przecinając nożyczkami przednią stronę klatki piersiowej po lewej i prawej stronie przepony.
   UWAGA: Jest to operacja niezapewniająca przeżycia.
4. Przytrzymaj klatkę piersiową i wstrzyknij 2 ml heparyny (1000 jednostek/ml) do prawej komory bijącego serca za pomocą igły 27 G.
   UWAGA: Zapobiegnie to tworzeniu się skrzepów krwi w płucach.
5. Całkowicie usuń klatkę piersiową nożyczkami i umieść igłę 18 G w lewej komorze jako odpowietrznik, aż wypłynie krew. Następnie wstrzyknąć 15 ml heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (12,5 jednostki/ml; heparynizowany PBS) do prawej komory za pomocą igły 25 G.
6. Przeciąć żyłę główną dolną i górną, dwie duże żyły po prawej stronie serca i przepłukać płuca dodatkowymi 10 ml heparynizowanego PBS w prawej komorze za pomocą igły 27 G.
   UWAGA: Żyła główna dolna jest wizualizowana pod dnem serca jako duże naczynie wypełnione czerwoną krwią. Podobnie, żyła główna górna jest wizualizowana w górnej części serca jako duże naczynie.
7. Przetnij tchawicę u podstawy tarczycy. Ostrożnie usuń aortę zstępującą na poziomie żyły hemiazygotycznej i gałęzie aorty na łuku.
8. Wyjmij blok płuco-serce z jamy klatki piersiowej i reszty ciała szczura.
9. Wykonaj ventriculotomię, przecinając połowę prawej i lewej komory i umieszczając specjalnie wykonaną, wstępnie napełnioną kaniulę igłową ze stali nierdzewnej 18 G przez prawą komorę do głównej tętnicy płucnej (PA).
10. Zabezpiecz kaniulę jedwabnym opaską 2-0 i ostrożnie odsłoń prawą komorę i przedsionek.
11. Umieść żeńską gródź Luer w lewej komorze i zabezpiecz ją jedwabnym krawatem 2-0.
12. Przepłukać blok płuco-serce 20 ml heparynizowanego PBS przez kaniulę PA i umieścić go w probówce o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę hodowlaną lub heparynizowany PBS.
    UWAGA: W przypadku modelu komórkowego przejdź do kroku 3.1, aby skonfigurować bioreaktor. W przypadku modelu bezkomórkowego przejdź do kroku 2.1 dotyczącego decelularyzacji.

2. Decelularyzacja płuc

1. Przygotowanie jednostki decelularyzacji
   1. Przygotuj każdą komorę/butelkę decelularyczną, przebijając dwa otwory w nakrętki butelki i wsuwając w nie żeński Luer (Rysunek 1A i 1B). Zabezpiecz go czarnym nylonowym pierścieniem po drugiej stronie. Podobnie, wywierć pojedynczy otwór w innej zakrętce butelki na nasadkę zestawu dożylnego (Rysunek 1C).
      UWAGA: Rysunek 1A i 1B przedstawiają te same nakrętki z dwóch różnych stron. Rysunek 1C przedstawia inną nasadkę z pojedynczym otworem, jak podano powyżej w kroku 2.1.1.
   2. Przymocuj 0,5-calową rurkę (na końcu tętnicy płucnej lub PA) i 6-calowe rurki (Rysunek 1J) do żeńskiej Luer od wewnątrz nakrętek butelek (Rysunek 1A i 1B) i przymocuj męską blokadę Luer na końcach. Ustaw zamek z butelką o pojemności 500 ml jako komorą/butelką do decelularyzacji.
   3. Podłącz jeden koniec dwóch rurek o długości 2 stóp (które są połączone męskim zamkiem Luer) do obu końców rurki pompy ( Rysunek 1H), która jest przymocowana do głowicy pompy ( Rysunek 1E i 1F) za pomocą wkładu ( Rysunek 1G) z żeńską blokadą Luer ( Rysunek 1I).
   4. Podłącz drugie końce rurek o długości 2 stóp (z kroku 2.1.3) do żeńskiej głowicy Luer lock na komorze decelularyzacyjnej/nakrętce butelki (Rysunek 1L).
   5. Ustaw butelkę PBS o pojemności 250 ml (z 200 ml PBS), zawieszając odwróconą butelkę na stojaku z bliższym końcem zestawu dożylnego (Rysunek 1D) włożoną do nakrętki butelki i dystalnym końcem zastępującym rurkę o długości 2 stóp podłączoną do komory/butelki decelularyzacyjnej na końcu PA (Rysunek 1B). Podłącz tę rurkę o długości 2 stóp do butelki jednorazowego użytku.
      UWAGA: Butelki są umieszczone w kartonie, jak pokazano na Rysunek 1K. Rurki dożylne wychodzą z wiszących butelek w celu dozowania odczynników w rusztowaniu płuc.
2. Proces decelularyzacji płuc
   1. Uruchom heparynizowany PBS przy fizjologicznym ciśnieniu perfuzji 30 mm Hg (Rysunek 1K), aż zacznie swobodnie przepływać w komorze / butelce decelularyzacyjnej, a następnie przymocuj blok płuco-serce do końca PA przez kaniulę PA.
   2. Kontynuuj ciągłą pracę pompy, aby nadmiar bufora/roztworu wewnątrz komory/butelki decelularyzacyjnej został wyrzucony.
   3. Przeprowadź heparynizowany PBS przez PA przez 15 minut przy ciśnieniu perfuzji 30 mm Hg dla początkowego płukania (Rysunek 1K).
   4. Zastąp heparynową butelkę PBS 0,1% dodecylosiarczanem sodu (SDS) w wodzie dejonizowanej i perfaktoruj płuca przez 2 godziny w celu decelularyzacji.
   5. Po decelularyzacji perfuzja dejonizowanej autoklawizowanej wody przez rusztowanie płuc przez 15 minut.
   6. Następnie perfaktor 1% detergentu niejonowego należy mieszać w wodzie dejonizowanej przez 10 min.
   7. Zastąp komorę/butelkę decelularyzacyjną 500 ml autoklawizowanego PBS uzupełnionego 1x antybiotykami (penicylina-streptomycyna, amfoterycyna), pozostawiając wiszące płuco w stanie nienaruszonym z nakrętką wewnątrz butelki.
   8. Wyrzuć zestaw dożylny, umieść rurkę o długości 2 stóp przymocowaną do pojemnika do wyrzucania z powrotem do końca tętnicy płucnej komory decelularyzacyjnej i uruchom pompę z prędkością 6 ml / min (Rysunek 1L).
   9. Perfuzja płuc przez 72 godziny i wymiana PBS z antybiotykami co 12 godzin < br /> UWAGA: Płuco bezkomórkowe jest gotowe do natychmiastowego użycia. Może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. Jeśli w płatach płuc można wyraźnie uwidocznić różowe plamy lub skrzepy krwi, wyrzuć płuco. Możliwe jest losowe badanie DNA lub histopatologii. Kompletne bezkomórkowe płuco nie będzie miało komórek, a 99,9% DNA zostanie zmyte.
      UWAGA: Podczas pracy z komórkowym modelem płuc pomiń decelularyzację. Pobrane płuco (krok 1) można umieścić bezpośrednio w bioreaktorze.

3. Konfiguracja bioreaktora

1. Przygotuj butelkę bioreaktora i elementy potrzebne do konfiguracji.
   1. Wywierć trzy otwory w jednej zakrętce butelki o pojemności 500 ml w równej odległości i zamocuj żeński Luer we wszystkich trzech otworach, używając czarnych nylonowych pierścieni (Rysunek 2A i 2B).
      UWAGA: W dwóch otworach końce zamka Luer są skierowane na zewnątrz, podczas gdy jeden koniec jest skierowany do wnętrza butelki.
   2. Wytnij rurkę pompy 6 cali, rurkę 2 cale, rurkę 6 cali, rurkę 1.5 stopy, rurkę 2 stopy i rurkę natleniacza 10 stóp na bioreaktor
   .
   3. Wytnij igłę ze stali nierdzewnej o wadze 18 G i ponownie połącz końce za pomocą biokompatybilnej rurki do kaniuli tchawiczej.
   4. Owiń rurkę natleniacza, ze złączami Luer lock na końcach, na siatce drucianej elektromagnesu za pomocą taśm autoklawu (Rysunek 2C).
   5. Wyżej wymienione przedmioty należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w świetle UV przez 10 minut.
2. Ustaw pompę wewnątrz zwykłego inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ) z zachowaniem odpowiednich odstępów między tacami, aby z łatwością zmieścić butelkę o pojemności 500 ml.
3. Rozpyl 70% etanolu na wkład pompy i połącz rurkę pompy z żeńskimi złączami Luer lock na obu końcach pompy.
4. Ustaw natleniacz owinięty wokół siatki drucianej elektromagnesu wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych, łącząc jeden koniec (odpływ) natleniacza z rurką pompy, a drugi koniec z rurką o długości 1,5 stopy w bioreaktorze.
5. Ustaw butelkę bioreaktora w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach aseptycznych.
   1. Podłącz 3-drogowy kran (żółty) do głowy jednej z samic Luer, aby kontrolować przepływ przez PA.
   2. Podłącz jednokierunkowy kran (niebieski) do innej żeńskiej grodzi Luer lock w celu wysiewu komórek przez tchawicę (Rysunek 2F).
   3. Podłącz 2 rurki wejściowe na zewnątrz (białe) i 6 przewodów po wewnętrznej stronie butelki, aby rozprowadzić media na zewnątrz. Zamontuj męski zamek Luer do rury o długości 2 stóp i przymocuj żeński trójnik w stylu Luer Lug, aby zapewnić dostęp do dodawania lub usuwania czegokolwiek.
   4. Przymocuj jednokierunkowy kran odcinający do jednego z otworów łącznika trójdrożnego (żeński trójnik z uchem Luer).
   5. Przymocuj męski zamek Luer i żeński zamek Luer do rur o długości 2 stóp.
   6. Dodać 200 ml RPMI1640 z 10% FBS i 1% antybiotykową pożywką do hodowli komórkowych (w zależności od zapotrzebowania na komórki) i przenieść bioreaktor do inkubatora. Podłącz rurkę natleniacza do dwóch otwartych końców (jednokierunkowy kran i złącze trójnikowe), aby uczynić z niej bioreaktor z zamkniętą pętlą.
6. Uruchom pompę z prędkością 6 ml/min wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych z pożywką do hodowli komórkowych, aby napełnić natleniacz i rurki, tak aby w rurkach nie było pęcherzyków powietrza.
7. Po napełnieniu probówek pożywką zamknij zawór odcinający i wyjmij butelkę bioreaktora z inkubatora, odłączając natleniacze z obu końców butelki bioreaktora.
8. Umieść butelkę bioreaktora w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przepuść pożywkę hodowlaną przez zawór odcinający i przymocuj kaniulę PA rusztowania płuc (bezkomórkowego lub komórkowego) do kranu przez męskie złącze Luer.
   UWAGA: W tym przypadku możliwe jest użycie modelu bezkomórkowego (po procesie decelularyzacji) lub świeżo pobranego bloku płuco-serce (tj. modelu komórkowego, ponieważ zachowuje on natywne komórki szczura).
9. Przepuścić pożywkę hodowlaną przez jednokierunkowy zawór odcinający, aby usunąć powietrze i przywiązać kaniulę tchawicy jedwabną nicią do tchawicy.
10. Upewnij się, że nie skręcasz PA i tchawicy. Zamknąć nakrętkę butelki bioreaktora z rusztowaniem płuc w środku i ponownie aseptycznie przenieść bioreaktor do inkubatora i uruchomić pompę z prędkością 6 ml/min.
11. Uruchom pożywkę hodowlaną przez 10 - 15 minut, aby upewnić się, że wszystkie płaty są napompowane, a płuca wyglądają na w dobrym stanie (Rysunek 2G).

4. Model przerzutów i wysiewanie komórek

UWAGA: Przejdź do wysiewu komórek za pomocą powyższego modelu płuc w celu przeprowadzenia badania wzrostu guza pierwotnego. Zmodyfikuj rusztowanie płuc (bezkomórkowe lub komórkowe) w następujący sposób dla modelu przerzutowego.

1. Wyjąć bioreaktor z rusztowaniem płuc z inkubatora i umieścić go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Użyj strzykawki typu Luer lock, aby przepuścić 5 ml pożywki hodowlanej przez tchawicę i otwórz pokrywę bioreaktora z wiszącym rusztowaniem płuc (Rysunek 2F).
3. Na tym etapie potrzebna jest jeszcze jedna osoba, która pomoże w modyfikacji płuca do modelu przerzutowego.
4. Przygotuj jedwab 2-0 i użyj kleszczy kątowych, aby przejść przez tchawicę w punkcie rozwidlenia.
5. Przywiąż tchawicę biegnącą do prawego płuca w punkcie rozwidlenia i sprawdź swobodny przepływ pożywki przez tchawicę do lewego płuca, przepuszczając pożywkę hodowlaną.
   UWAGA: Gdy tchawica zostanie związana w punkcie rozwidlenia, komórki wysiane przez tchawicę zostaną automatycznie skierowane do zasiewu do lewych płatów. Można go przetestować przed wysiewem komórek, przepychając pożywkę hodowlaną przez tchawicę. W modelu przerzutowym podłoże przesunie się tylko do lewego płata, który zostanie napompowany, a nie do prawego płat10.
6. Umieść strzykawkę Luer lock o pojemności 20 ml na kaniuli tchawicy i dodaj komórki raka płuc ATCC (A549, H1299) w 50 ml RPMI1640 kompletnej pożywki hodowlanej (Rysunek 2F).
7. Wykonaj wysiew komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 15 ml komórek do strzykawki i pozwolić jej przejść grawitacyjnie przez płaty płuc. Dodaj resztę komórek, zanim przejdą przez nie pęcherzyki powietrza.
8. W przypadku bezkomórkowego wysiewu płuc zbierz perfundowane podłoże spływające do butelki bioreaktora i pozwól mu ponownie przejść przez tchawicę 3x.
   UWAGA: Perfuzja pożywki czasami ma wysiane komórki rakowe. Dlatego, aby zapewnić efektywny wysiew, należy ponownie umieścić pożywkę w tchawicy przez strzykawkę.
9. Po wysianiu wyjmij strzykawkę, odczekaj 15 minut, dodaj świeżą pożywkę i włóż bioreaktor z powrotem do inkubatora. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z rurki.
10. Uruchom pompę, aby perfuzjować pożywkę z prędkością 6 ml/min.

Wyniki

Płuco pobrane od szczura zachowuje nienaruszone naczynia krwionośne i pęcherzyki płucne¹¹ (Rysunek 3A i 3B). Po decelularyzacji składniki macierzy zewnątrzkomórkowej bezkomórkowego płuca, takie jak kolagen, fibronektyna i elastyna, są zachowane¹¹ (Rysunek 3C, 3D, 3E i 3F). Decelularyzacja prowadzi do całkowitego usunięcia nat...

Dyskusja

Płuco 4-D ex vivo daje możliwość badania wzrostu guza i przerzutów w warunkach laboratoryjnych. Natywna macierz płucna to złożony system, który zapewnia wsparcie dla normalnej tkanki i utrzymuje interakcje komórka-komórka, interakcje komórka-macierz, różnicowanie komórkowe i organizację tkanek. Daje to możliwość dodania dowolnych składników mikrośrodowiska guza w celu zbadania ich wpływu na wzrost guza i interakcję z innymi komórkami.

Pobranie płuc jest kluczowym etapem dla 4-wymiaro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprague Dowley rat	Harlan	206M	męski
wacik z chlorheksydyną	Prevantics, Nowy Jork, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
igła o rozmiarze 18 McMaster	Carr, USA	75165A249
2-0 jedwabny krawat	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Pompa Masterflex L/S	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Głowica pompy Masterflex L/S	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Wkład pompy Masterflex L/S	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Rurka	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Stany Zjednoczone	14171211
Rurka pompy MasterFlex	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Stany Zjednoczone	06598-16
Złącza żeńskie luer lock	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Męskie złącza luer lock	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
nylonowy pierścień	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Zestaw dożylny	CareFusion	41134E
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antybiotyki	Gibco	15240-062
Dotleniacz silikonowy	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-Siatka
druciana	1164610105	Lowes	Nowy Jork Drut
żeński luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Męski zintegrowany pierścień blokujący luer do 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Łącznik żeński z gwintem luer	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Złącze Clave	ICU Medical	11956
Hi-Flo & handel; 4-drogowy kran z obrotowym męskim ślusarzem luer	MX9341L		medycznym
MasterFlex Rurka pompy	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	do kaniuli