Tutaj prezentujemy protokół opisujący technikę pozaustrojowego natleniania błony żylno-żylnej (ECMO) u niezaintubowanej, spontanicznie oddychającej myszy. Ten mysi model ECMO może być skutecznie zaimplementowany w badaniach eksperymentalnych nad ostrymi i końcowymi chorobami płuc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Żylno-żylne pozaustrojowe utlenowanie błony u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Użycie pozaustrojowego natleniania membranowego (ECMO) znacznie wzrosło w ostatnich latach. ECMO stało się niezawodną i skuteczną terapią zarówno ostrych, jak i końcowych chorób płuc. Wraz ze wzrostem zapotrzebowania klinicznego i długotrwałym stosowaniem ECMO, optymalizacja procedur i zapobieganie uszkodzeniom wielonarządowym mają kluczowe znaczenie. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie szczegółowej techniki wykonywania żylno-żylnego ECMO u niezaintubowanej, spontanicznie oddychającej myszy. Protokół ten przedstawia projekt techniczny ECMO i kroków chirurgicznych. Ten mysi model ECMO ułatwi badanie patofizjologii związanej z ECMO (np. zapalenie, krwawienie i zdarzenia zakrzepowo-zatorowe). Ze względu na obfitość genetycznie modyfikowanych myszy, można również przeanalizować mechanizmy molekularne związane z powikłaniami związanymi z ECMO.
Wprowadzenie
Pozaustrojowe natlenienie membranowe (ECMO) to tymczasowy system podtrzymywania życia, który przejmuje funkcje płuc i serca, aby umożliwić odpowiednią wymianę gazową i perfuzję. Hill et al1 opisali pierwsze zastosowanie ECMO u pacjentów w 1972 roku; jednak stał się szeroko stosowany dopiero po jego udanym zastosowaniu podczas pandemii grypy H1N1 w 2009 roku2. Obecnie ECMO jest rutynowo stosowane jako procedura ratująca życie w końcowych stadiach chorób serca i płuc3. ECMO żylno-żylne jest coraz częściej stosowane jako alternatywa dla inwazyjnej wentylacji mechanicznej u obudzonych, niezaintubowanych, spontanicznie oddychających pacjentów z oporną na leczenie niewydolnością oddechową4.
Pomimo jego powszechnego przyjęcia, zgłoszono różne komplikacje dla ECMO5,6,7. Powikłania, które mogą wystąpić u pacjentów poddawanych ECMO, obejmują krwawienie, zakrzepicę, posocznicę, małopłytkowość, awarie związane z urządzeniem i zatorowość powietrzną. Co więcej, zespół ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej (SIRS) prowadzący do uszkodzenia wielonarządowego jest dobrze opisany zarówno klinicznie, jak i w badaniach eksperymentalnych8,9. Powikłania neurologiczne, takie jak zawał mózgu, są również często zgłaszane u pacjentów poddawanych długotrwałej terapii ECMO. Aby zagmatwać sprawę, często trudno jest odróżnić, czy powikłania są spowodowane przez samą ECMO, czy też wynikają z zaburzeń towarzyszących chorobom ostrym i końcowym.
Aby dokładnie zbadać wpływ ECMO na zdrowy organizm, musi zostać stworzony wiarygodny eksperymentalny model zwierzęcy. Istnieje bardzo niewiele doniesień na temat skuteczności ECMO u małych zwierząt i wszystkie ograniczają się do szczurów. Do tej pory w literaturze nie opisano mysiego modelu ECMO. Ze względu na dostępność dużej liczby genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy, stworzenie mysiego modelu ECMO pozwoliłoby na dalsze badania mechanizmów molekularnych związanych z powikłaniami związanymi z ECMO10,11.
Na podstawie naszego wcześniej opisanego mysiego modelu krążenia pozaustrojowego (CPB)12, opracowaliśmy stabilną metodę żylno-żylnego ECMO u niezaintubowanych, spontanicznie oddychających myszy. Obwód ECMO (Rysunek 1), zawierający kaniule odpływowe i napływowe, pompę perystaltyczną, natleniacz i zbiornik zatrzymujący powietrze, jest podobny do naszego wcześniej opisanego modelu mysiego CPB12, z wyjątkiem mniejszej objętości zalewania (0,5 ml). Protokół ten demonstruje szczegółowe techniki, monitorowanie fizjologiczne i analizę gazometrii krwi zaangażowane w udaną procedurę ECMO.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty przeprowadzono na samcach myszy C57BL/6 w wieku 12 tygodni. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi niemieckiego prawa o zwierzętach na mocy protokołu TSA 16/2250.
1. Przygotowanie materiałów
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w czystych, niesterylnych warunkach. Sterylne warunki byłyby wymagane, jeśli zwierzę ma przeżyć po operacji.
- Wprowadź 3 okienka do rurki poliuretanowej 2-Fr za pomocą ostrza chirurgicznego pod mikroskopem z 16-krotnym powiększeniem.
UWAGA: Wszystkie otwory muszą znajdować się w dystalnej jednej trzeciej kaniuli, aby zapewnić optymalny drenaż krwi. - Przygotować roztwór gruntujący (tabela materiałów). Dodać 30 j.m./ml heparyny i 2,5% v/v 8,4% roztworu NaHCO3. Przechowywać ten roztwór w lodówce w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do użycia. Zalać obwód 500 μl roztworu gruntującego.
- Umieścić kaniulę odpływową w roztworze zalewowym i napełnić maszynę ECMO, włączając pompę perystaltyczną. Kontynuuj cyrkulację roztworu zalewającego w maszynie przez następne 30 minut przy natężeniu przepływu 1 ml/min.
- Podaj 0,5 l/min 100% tlenu do oksygenatora.
2. Znieczulenie
- Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej wypełnionej mieszaniną izofluranu i tlenu o stężeniu 2,5% v/v. Dostarczyć 0,5 l/min 100% tlenu do parownika. Przed zabiegiem sprawdź, czy uzyskano pełne znieczulenie, testując wycofanie pedału i odruchy bólowe. Nałóż żel pod oczy, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym wysuszeniem.
- Użyj podkładki rozgrzewającej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
- Wykonać znieczulenie maską wziewną za pomocą parownika izofluranu i wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karprofenu.
- Regularnie obserwuj spontaniczny oddech i dostosuj stężenie izofluranu tak, aby mieściło się w przedziale od 1,3 do 2,5%.
3. Chirurgia
- Odsłoń lewą żyłę szyjną za pomocą bocznego nacięcia skóry o średnicy 4 mm za pomocą cienkich nożyczek po lewej stronie szyi. Wraz z ostrym i preparatem za pomocą mikrokleszczyków i wacików bawełnianych należy zastosować bipolarną koagulację małych naczyń.
- Po odsłonięciu lewej żyły szyjnej podwiąż dystalną część za pomocą 8-0 szew jedwabny za pomocą mikrokleszczyków.
- Umieść węzeł poślizgowy na bliższym końcu żyły. Naciąć przednią ścianę żyły za pomocą mikronożyczek.
- Aby osiągnąć pełną heparynizację, należy wstrzyknąć 2,5 j.m./g heparyny do żyły szyjnej za pomocą 26 G braunuli.
- Podnieś głowę podkładki dla zwierząt o 30°, aby uniknąć nadmiernej utraty krwi z żyły podczas wprowadzania kaniuli.
- Wprowadzić kaniulę poliuretanową (PU) 2-Fr do bliższej części żyły szyjnej, obracając ją nieznacznie, jednocześnie wciskając na głębokość 4 cm; w tym czasie zostanie osiągnięte rozwidlenie biodrowe żyły głównej dolnej (IVC).
- Zabezpiecz kaniulę za pomocą 8-0 jedwabne węzły za pomocą mikrokleszczyków.
- Odsłoń prawą żyłę szyjną, wykonując czynności opisane w 3.1, 3.2 i 3.3.
- Kanulować prawą żyłę szyjną za pomocą kaniuli 1-Fr PU i delikatnie przesunąć ją o 5 mm w kierunku prawego przedsionka.
- Powtórz krok 3.7.
- Cewnikować lewą tętnicę udową za pomocą kolejnej kaniuli 1-Fr PU i używać jej do inwazyjnego monitorowania ciśnienia, a także pobierania próbek krwi do gazometrii (BGA).
- Igły do elektrokardiogramu (EKG) podłączone do urządzenia do zbierania danych należy wprowadzić podskórnie do obu kończyn przednich i do lewej ściany klatki piersiowej.
- Włóż termometr doodbytniczy podłączony do urządzenia do akwizycji danych.
4. Natlenienie błony żylno-żylnej i gazometria
UWAGA: Aby zobaczyć schemat kompletnego obwodu ECMO, zobacz Rysunek 1.
- Zainicjuj ECMO u zwierzęcia, włączając pompę o początkowym natężeniu przepływu 0,1 ml/min. Dostosuj natężenie przepływu pompy w ciągu najbliższych 2 minut do 3-5 ml/min.
- W przypadku zasysania powietrza w kaniuli odpływowej przez miejsce kaniulacji, należy zmniejszyć przepływ i dodać 0,1 ml roztworu zalewającego do obwodu przez zbiornik zatrzymujący powietrze.
- Przy stabilnym przepływie kontynuuj monitorowanie w czasie rzeczywistym wszystkich istotnych parametrów za pomocą urządzenia do akwizycji danych.
- Stale obserwuj przepływ wsteczny z drenażu żylnego i monitoruj poziom krwi w zbiorniku powietrznym.
- Zebrać krew wyciekającą z ran do strzykawki o pojemności 1 cm3 za pomocą końcówki branuli 24 G i zwrócić ją do obwodu ECMO przez zbiornik zatrzymujący powietrze.
- W przypadku BGA użyj wkładu do pobierania próbek krwi, aby zebrać około 75 μl krwi tętniczej w następujących punktach czasowych i z następujących lokalizacji:
- 10 minut po rozpoczęciu ECMO należy pobrać krew z IVC przez dodatkową rurkę wbudowaną przed oksygenatorem, przez podobną dodatkową rurkę za oksygenatorem (kontrola) i bezpośrednio z tętnicy udowej.
- 30 minut po rozpoczęciu ECMO należy pobrać krew z tętnicy udowej.
- Podawaj dodatkowe 0,1 ml roztworu gruntującego, aby skompensować wewnątrznaczyniową utratę płynów co 45 minut za pomocą pułapki powietrznej lub cewnika do tętnicy udowej lub poprzez zasysanie pęcherzyków powietrza przez kaniulę drenującą krew.
- W przypadku BGA użyj wkładu do pobierania próbek krwi, aby zebrać około 75 μl krwi tętniczej:
- 1 h po rozpoczęciu ECMO z tętnicy udowej.
- Po 2 godzinach od uruchomienia ECMO należy pobrać krew z IVC przez dodatkową rurkę wbudowaną przed oksygenatorem, przez podobną dodatkową rurkę za oksygenatorem (kontrolą) oraz bezpośrednio z tętnicy udowej.
- Po 2 godzinach należy stopniowo zmniejszać natężenie przepływu na pompie (w ciągu 5 minut), zatrzymując w ten sposób ECMO.
- Kontynuuj rejestrowanie parametrów życiowych przez kolejne 10 minut.
- Zakończ eksperyment, wykrwawiając zwierzę i pobierając krew oraz narządy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół opisuje metodę ECMO żylno-żylnego u myszy. Model ten jest wiarygodny i powtarzalny, a w porównaniu z naszym wcześniej opisanym modelem CPB z zatrzymaniem oddechu i krążenia12,13, jest mniej wymagający technicznie w przygotowaniu.
Przepływ ECMO w układzie żylnym utrzymywano w przedziale od 1,5 do 5 mL/min. Średnie ciśnienie tętnicze utrzymywano na pozio...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wcześniej opisaliśmy udany model CPB u myszy12,13. Aby wdrożyć taki model w przypadku ostrych lub schyłkowych zaburzeń płuc, opracowaliśmy łatwy w użyciu żylno-żylny obwód ECMO dla myszy. W przeciwieństwie do modelu CPB, ECMO żylno-żylne nie wymaga skomplikowanych zabiegów chirurgicznych, takich jak sternotomia i zaciśnięcie aorty, co zmniejsza ryzyko krwawienia z rany u zwierzęcia w pełni zheparynowanego. Aby uniknąć embolizacji oksygenatora z zakrzepami krwi, k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt był wspierany przez KFO 311 Grant od Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN: 8609189 | w 1:1 z Tetraspan |
| Tetraspan 6% roztwór | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | w 1:1 ze Sterofundin |
| Heparyna Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 j.m./ml roztworu gruntującego |
| NaHCO3 8,4% roztwór | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% w roztworze gruntującym |
| Carprofen | Zoetis Inc., Stany Zjednoczone | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Cewnik | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | tętnica szyjna |
| 2 Fr PU Cewnik | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | żyła szyjna |
| 8-0 Jedwabny szew pleciony | Ashaway Line & Twine Co., Stany Zjednoczone | 75290 | ligatura |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Nożyczki sprężynowe - ostrza 6 mm | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instrumenty |
| Nożyczki sprężynowe - ostrza 2 mm | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instrumenty |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | Instrumentów |
| Dumont #55 Kleszcze | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instrumenty |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instrumenty |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instrumenty |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instrumenty |
| Isoflurane Vaporizer Dräger 19.1 | Drä gerwerk AG & Co. KGaA | znieczulenie 1,3 -2,5% | |
| Wielokanałowe urządzenie do pozyskiwania danych z oprogramowaniem ISOHEART | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Niemcy | ciśnienie inwazyjne, EKG, t i deg; Przenośne | |
| urządzenie C i-STAT | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | Gazometria | |
| Wkłady i-STAT CG4+ i CG8+ Abbott | Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | Gazometria | |
| Myszy C57Bl/6, samiec, 30 g, 14 tygodni | Charles River Laboratories | mieścił się 1 tydzień wcześniej |
Bibliografia
- Hill, J. D., et al. Prolonged Extracorporeal Oxygenation for Acute Post-Traumatic Respiratory Failure (Shock-Lung Syndrome). New England Journal of Medicine. 286 (12), 629-634 (1972).
- Noah, M. A., et al. Referral to an Extracorporeal Membrane Oxygenation Center and Mortality Among Patients With Severe 2009 Influenza A(H1N1). Journal of the American Medical Association. 306 (15), 1659(2011).
- Maslach-Hubbard, A., Bratton, S. L. Extracorporeal membrane oxygenation for pediatric respiratory failure: History, development and current status. World Journal of Critical. Care Medicine. 2 (4), 29-39 (2013).
- Langer, T., et al. "Awake" extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): pathophysiology, technical considerations, and clinical pioneering. Critical Care. 20 (1), 150(2016).
- Esper, S. A. Extracorporeal Membrane Oxygenation. Advances in Anesthesia. 35 (1), 119-143 (2017).
- Millar, J. E., Fanning, J. P., McDonald, C. I., McAuley, D. F., Fraser, J. F. The inflammatory response to extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a review of the pathophysiology. Critical Care. 20 (1), 387(2016).
- Lubnow, M., et al. Technical complications during veno-venous extracorporeal membrane oxygenation and their relevance predicting a system-exchange--retrospective analysis of 265 cases. Public Library of Science One. 9 (12), e112316(2014).
- Passmore, M. R., et al. Inflammation and lung injury in an ovine model of extracorporeal membrane oxygenation support. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), L1202-L1212 (2016).
- Vaquer, S., de Haro, C., Peruga, P., Oliva, J. C., Artigas, A. Systematic review and meta-analysis of complications and mortality of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation for refractory acute respiratory distress syndrome. Annals of Intensive Care. 7 (1), 51(2017).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovascular Pathology. 15 (6), 318-330 (2006).
- Madrahimov, N., et al. Novel mouse model of cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 53 (1), 186-193 (2017).
- Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
