Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie regulacji efferocytozy wymaga metod, które są w stanie dokładnie określić ilościowo pobór komórek apoptotycznych oraz zbadać procesy sygnalizacyjne i komórkowe, które kontrolują efferocytozę. Ta kwantyfikacja może być trudna do przeprowadzenia, ponieważ komórki apoptotyczne są często eferocytozowane fragmentarycznie, co wymaga metod, które mogą dokładnie odróżnić zefferocytozowaną część celu apoptotycznego od pozostałych, niepochłoniętych fragmentów komórkowych. Przedstawione w niniejszym dokumencie podejście wykorzystuje podejścia podwójnego znakowania w celu dokładnego ilościowego określenia dynamiki efferocytozy i zdolności efferocytarnej efferocytów, takich jak makrofagi. Cytozol komórki apoptotycznej jest znakowany barwnikiem śledzącym komórkę, aby umożliwić monitorowanie wszystkich materiałów pochodzących z komórek apoptotycznych, podczas gdy biotynylacja powierzchniowa komórki apoptotycznej pozwala na różnicowanie między zinternalizowanymi i niezinternalizowanymi frakcjami komórek apoptotycznych. Zdolność efferocytarną efferocytów określa się poprzez wykonywanie obrazów fluorescencyjnych żywych lub utrwalonych komórek i ilościowe określanie ilości związanych i zinternalizowanych celów, zróżnicowanych przez barwienie streptawidyną. Podejście to ma kilka zalet w porównaniu z metodami takimi jak cytometria przepływowa, a mianowicie dokładne rozgraniczenie nieefferocytozowanych i eferocytozowanych frakcji komórek apoptotycznych, możliwość pomiaru dynamiki efferocytarnej za pomocą mikroskopii żywych komórek oraz zdolność do wykonywania badań sygnalizacji komórkowej w komórkach eksprymujących transgeny znakowane fluorescencyjnie. W połączeniu metody przedstawione w niniejszym protokole służą jako podstawa elastycznego podejścia eksperymentalnego, które można wykorzystać do dokładnego ilościowego określenia aktywności efferocytarnej i zbadania komórkowych szlaków sygnałowych aktywnych podczas efferocytozy.
Wprowadzenie
Apoptoza, czyli zaprogramowana śmierć komórki, jest wysoce regulowanym procesem fizjologicznym, który występuje w większości organizmów wielokomórkowych i jest kluczowy dla ich rozwoju i homeostazy1. Oprócz udziału w prawidłowym obrocie komórkowym i rozwoju embrionalnym, apoptoza umożliwia eliminację zainfekowanych lub uszkodzonych komórek z tkanek i może być wywołana w odpowiedzi na infekcję, stan zapalny, raka, a także przez interwencje medyczne, takie jak radioterapia lub sterydy1. Komórki apoptotyczne eksponują sygnały "zjedz mnie" na powierzchni komórki, które są rozpoznawane przez receptory na szeregu profesjonalny....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pobranie krwi od zdrowych ochotników zostało zatwierdzone przez Radę Etyki Badań Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Western Ontario. Wenipunkturę wykonano zgodnie z wytycznymi Tri-Council Policy Statement dotyczącymi badań nad ludźmi.
1. Hodowla i przygotowanie linii komórkowej monocytów THP-1
- Hoduj monocyty THP-1 w zawiesinie w kolbach T25 w temperaturze 37 °C + 5% CO2. Komórki należy hodować w 5 mL pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
- Codziennie równomiernie zawieszaj komórki w pożywce wzrostowej, delikatnie potrząsając kolbą, a następnie niezwło....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nocna hodowla komórek Jurkat z dodatkiem 1 µM staurosporyny prowadzi do apoptozy >95% komórek, co można potwierdzić barwieniem Annexin V (Rysunek 1). Do tych eksperymentów można wykorzystać inne typy komórek, choć stężenie staurosporyny oraz czas trwania inkubacji będą wymagały optymalizacji dla każdej linii komórkowej. W celu wiarygodnej detekcji i kwantyfikacji eferocytozy, >80% komórek powinno znajdować się w stanie apoptozy przed dodaniem ich do efe.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metody przedstawione w tym protokole umożliwiają obrazowanie i kwantyfikację dynamicznego procesu efferocytarnego, przy użyciu zarówno metod z komórkami stałymi, jak i żywymi. Podejścia te mają kilka zalet w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami opartymi na cytometrii przepływowej23,24. Zastosowanie barwienia na lewą stronę z ustalonymi próbkami zapewnia bardziej solidną i dokładną ocenę ilościową szybkości i zakresu efferocytozy - w rzeczywistości wiele .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Operating Grant MOP-123419, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant 418194, oraz Ontario Ministry of Research and Innovation Early Research Award dla BH. DGW przyczyniło się do optymalizacji niektórych z prezentowanych obrazów, do optymalizacji protokołów i napisania rękopisu; Był finansowany z grantu na zalewanie pomp z Uniwersytetu w Liverpoolu. CY jest finansowany przez stypendium Vanier Graduate Scholarship i stypendium CIHR MD / PhD. Agencje finansujące nie odgrywały żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Media | Żubr | 3500-000-EL | |
| DMEM Media | Żubr | 319-005-CL | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Żubr | 080-150 | |
| PBS | Żubr | 311-010-CL | |
| Szkiełka nakrywkowe okrągłe 18 mm #1,5 grubości | Mikroskopia elektronowa Nauki | 72290-08 | Rozmiar i kształt szkiełka nakrywkowego nie jest krytyczny, ale 18 mm pasuje do studzienek standardowej 12-dołkowej płytki, co upraszcza hodowlę komórkową |
| Staurosporine | Cayman Chemical | 81590 | Rozpuścić w DMSO przy 1 mM (1,000x roztwór podstawowy) |
| Annexin V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | Przechowywać w eksykatorze. Nie należy przygotowywać roztworu podstawowego. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
| CellTrace Orange | ThermoFisher | C34851 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
| Pożywka do separacji limfolitowo-polikomórkowej | Cedarlane Labs | CL5071 | |
| Rekombinowany ludzki M-CSF | Peprotech | 200-04 | |
| Rekombinowany ludzki IL-4 | Peprotech | 300-25 | |
| J774.2 Linia komórkowa makrofagów | Sigma-Aldrich | 85011428-1VL | |
| THP-1 Ludzka linia komórkowa monocytów | ATCC | TIB-202 | |
| Linia komórkowa T Jurkat | ATCC | TIB-152 |
Bibliografia
- Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
- Ravichandran, K. S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
