Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58149

⸱

18 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

W tym artykule

Podsumowanie

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Streszczenie

Badanie regulacji efferocytozy wymaga metod, które są w stanie dokładnie określić ilościowo pobór komórek apoptotycznych oraz zbadać procesy sygnalizacyjne i komórkowe, które kontrolują efferocytozę. Ta kwantyfikacja może być trudna do przeprowadzenia, ponieważ komórki apoptotyczne są często eferocytozowane fragmentarycznie, co wymaga metod, które mogą dokładnie odróżnić zefferocytozowaną część celu apoptotycznego od pozostałych, niepochłoniętych fragmentów komórkowych. Przedstawione w niniejszym dokumencie podejście wykorzystuje podejścia podwójnego znakowania w celu dokładnego ilościowego określenia dynamiki efferocytozy i zdolności efferocytarnej efferocytów, takich jak makrofagi. Cytozol komórki apoptotycznej jest znakowany barwnikiem śledzącym komórkę, aby umożliwić monitorowanie wszystkich materiałów pochodzących z komórek apoptotycznych, podczas gdy biotynylacja powierzchniowa komórki apoptotycznej pozwala na różnicowanie między zinternalizowanymi i niezinternalizowanymi frakcjami komórek apoptotycznych. Zdolność efferocytarną efferocytów określa się poprzez wykonywanie obrazów fluorescencyjnych żywych lub utrwalonych komórek i ilościowe określanie ilości związanych i zinternalizowanych celów, zróżnicowanych przez barwienie streptawidyną. Podejście to ma kilka zalet w porównaniu z metodami takimi jak cytometria przepływowa, a mianowicie dokładne rozgraniczenie nieefferocytozowanych i eferocytozowanych frakcji komórek apoptotycznych, możliwość pomiaru dynamiki efferocytarnej za pomocą mikroskopii żywych komórek oraz zdolność do wykonywania badań sygnalizacji komórkowej w komórkach eksprymujących transgeny znakowane fluorescencyjnie. W połączeniu metody przedstawione w niniejszym protokole służą jako podstawa elastycznego podejścia eksperymentalnego, które można wykorzystać do dokładnego ilościowego określenia aktywności efferocytarnej i zbadania komórkowych szlaków sygnałowych aktywnych podczas efferocytozy.

Wprowadzenie

Apoptoza, czyli zaprogramowana śmierć komórki, jest wysoce regulowanym procesem fizjologicznym, który występuje w większości organizmów wielokomórkowych i jest kluczowy dla ich rozwoju i homeostazy1. Oprócz udziału w prawidłowym obrocie komórkowym i rozwoju embrionalnym, apoptoza umożliwia eliminację zainfekowanych lub uszkodzonych komórek z tkanek i może być wywołana w odpowiedzi na infekcję, stan zapalny, raka, a także przez interwencje medyczne, takie jak radioterapia lub sterydy1. Komórki apoptotyczne eksponują sygnały "zjedz mnie" na powierzchni komórki, które są rozpoznawane przez receptory na szeregu profesjonalnych i nieprofesjonalnych fagocytów, zwanych zbiorczo "efferocytami". Zaangażowanie tych receptorów indukuje wychwyt i degradację komórki apoptotycznej przez efferocyt w procesie znanym jako efferocytoza2,3. Fosfatydyloseryna jest najlepiej scharakteryzowanym sygnałem eat-me napędzającym efferocytozę. Zwykle jest ograniczony do wewnętrznej ulotki błony komórkowej, a apoptoza aktywuje mieszankę lipidową, która zaburza tę asymetrię błony, odsłaniając w ten sposób fosfatydyloserynę na powierzchni komórki4. Fosfatydyloseryna znajduje się na zewnątrzkomórkowej powierzchni niektórych komórek nieapoptotycznych, takich jak dojrzałe makrofagi i aktywowane płytki krwi. Jednak komórki te nie są efferocytozowane ze względu na obecność sygnałów "nie jedz mnie", takich jak CD47, na powierzchni komórki5,6,7. Eksponowana fosfatydyloseryna jest rozpoznawana przez szereg receptorów efferocytarnych wyrażanych przez efferocyty. Wiązanie tych receptorów z fosfatydyloseryną, bezpośrednio lub za pomocą opsonin, aktywuje szlaki sygnałowe, które promują wchłonięcie komórki apoptotycznej do wakuoli związanej z błoną, zwanej efferosomem8,9,10,11,12. Effersom łączy się sekwencyjnie z endosomami i lizosomami, które dostarczają molekularną maszynerię niezbędną do zakwaszenia efferosomu i degradacji komórki apoptotycznej cargo13,14. Po degradacji materiały pochodzące z komórek apoptotycznych są transportowane do endosomu recyklingu — proces, który ogranicza odpowiedzi immunologiczne na antygeny pochodzące z komórek apoptotycznych i który może pozwolić na odzyskanie składników odżywczych z komórki apoptotycznej 13,15. Niepowodzenie w eferocytozie powoduje upośledzenie klirensu komórek apoptotycznych; Te nieoczyszczone komórki w końcu ulegają wtórnej martwicy. Komórki martwicze uwalniają prozapalną zawartość cytozolową, patogeny i autoantygeny do środowiska zewnątrzkomórkowego, napędzając w ten sposób szereg chorób zakaźnych, zapalnych i autoimmunologicznych16,17. Apoptoza i efferocytoza razem ułatwiają usuwanie obumierających i martwych komórek oraz pozwalają na utrzymanie homeostazy tkanek.

Badanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw efferocytozy wymaga metod, które zapewniają jasną kwantyfikację absorpcji komórek apoptotycznych. Tę kwantyfikację komplikuje fakt, że w przeciwieństwie do innych mechanizmów wychwytu, takich jak endocytoza i fagocytoza18,19, efferocytoza może nie prowadzić do pochłonięcia nienaruszonej komórki docelowej, co skutkuje fragmentarycznym wychwytem komórki apoptotycznej przez efferocyty20. Opisany tutaj protokół opisuje test eferocytozy in vitro, który zapewnia dokładne określenie zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych i może być łączony z różnymi podejściami do mikroskopii komórek stałych i żywych. Tradycyjne testy fagocytozy dodają przeciwciała specyficzne dla celu fagocytarnego na końcu eksperymentu w celu oznaczenia niezinternalizowanych celów, gdzie nasza metoda różni się znakowaniem celu apoptotycznego kowalencyjnie połączoną biotyną21,22. Podczas gdy w tym teście można zastosować przeciwciała specyficzne dla komórek apoptotycznych, podejście biotynylacji pozwala na znakowanie dowolnego celu zawierającego białko i pozwala uniknąć potencjalnych problemów z wtórną reaktywnością krzyżową przeciwciał, jeśli przeprowadza się barwienie immunologiczne. W szczególności przedstawiamy przygotowanie apoptotycznych komórek Jurkat, które zostały podwójnie wybarwione zarówno barwnikiem śledzącym komórki, jak i biotyną. Barwnik śledzący komórki pozwala na śledzenie apoptotycznych materiałów pochodzących z komórek podczas efferocytozy, podczas gdy biotynylacja powierzchniowa pozwala na rozróżnienie zinternalizowanych i niezinternalizowanych części efferocytozowanych komórek apoptotycznych. Opisujemy również hodowlę i przygotowanie linii komórkowych J774.2 i THP-1 do stosowania jako mysie i ludzkie efferocyty, makrofagi M2 pochodzące z monocytów jako przykład pierwotnej efferocytozy komórkowej oraz komórki Jurkat do stosowania jako cele efferocytarne. Metody te można łatwo zastosować do innych linii komórkowych lub komórek pierwotnych, do komórek docelowych przechodzących jakąkolwiek formę śmierci komórkowej (np. apoptozy, nekrozy i nekroptozy) oraz do mimików o rozmiarach mikronów, które symulują apoptozę komórek przez powłoki lipidowe lub powłoki z ligandami specyficznymi dla receptora efferocytarnego będącego przedmiotem zainteresowania.

Metoda opisana w tym protokole ma kilka zalet w porównaniu z metodami opartymi na cytometrii przepływowej powszechnie stosowanymi w polu23,24. Poprzez bezpośrednie obrazowanie interakcji fagocytów-komórek apoptotycznych, w połączeniu z wyraźnym znakowaniem zarówno całkowitego, jak i niezinternalizowanego materiału komórek apoptotycznych, można dokonać ilościowych pomiarów efferocytozy. Co więcej, stosowanie fluoroforów niewrażliwych na pH ogranicza czynniki zakłócające, takie jak tłumienie fluorescencji FITC i GFP przy pH lizosomalnym, co zakłóca niektóre alternatywne metody25. Wreszcie, chociaż nie opisano ich szczegółowo, metody te można zastosować przy użyciu efferocytów eksprymujących transgeny znakowane fluorescencyjnie lub przy barwieniu immunologicznym po utrwaleniu, aby umożliwić ilościowe określenie aktywności cząsteczki sygnałowej i monitorowanie procesów komórkowych podczas efferocytozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pobieranie krwi od zdrowych ochotników zostało zatwierdzone przez Radę Etyki Badań Nauk Medycznych (Health Science Research Ethics Board) Uniwersytetu Western Ontario. Venipunkcję przeprowadzono zgodnie z wytycznymi zawartymi w Oświadczeniu Polityki Tri-Council dotyczącym badań nad ludźmi.

1. Hodowla i przygotowanie linii komórkowej monocytów THP-1

  1. Hodować monocyty THP-1 w formie zawiesiny w kolbach T25 w temperaturze 37 °C + 5% CO2. Komórki należy hodować w 5 mL pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% płatkowej surowicy bydlęcej (FBS).
  2. Codziennie równomiernie zawieszać komórki w pożywce wzrostowej poprzez delikatne potrząsanie kolbą, a następnie niezwłocznie zliczać komórki za pomocą hemocytometru. Przesiew komórek należy przeprowadzić, gdy gęstość komórek osiągnie 1 x 106 cells/mL:
    1. Podgrzać pożywkę RPMI 1640 + 10% FBS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Przenieść 2 x 105 komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL lub stożkowej probówki 15 mL, a następnie odwirować komórki przy 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    3. Usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego, i resuspendować osad w 1 mL (probówka 1,5 mL) lub 5 mL (probówka 15 mL) soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
    4. Odwirować probówkę przy 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Usunąć PBS, nie naruszając osadu komórkowego.
    5. Resuspendować osad w 1 mL świeżej pożywki RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. Do nowej kolby T25 wlać 4 mL podgrzanej pożywki, a następnie dodać resuspendowane komórki z punktu 1.2.5. Hodować w inkubatorze w 37 °C + 5% CO2 do momentu konieczności ponownego przesiewu (zazwyczaj 3 dni) lub do czasu wykorzystania komórek w eksperymencie.
  3. W przypadku eksperymentu z makrofagami pochodzącymi z linii THP-1, przed przesiewem pobrać z kolby wymaganą liczbę komórek i wysiać je:
    1. Umieścić wymaganą liczbę okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm (grubość #1,5) w dołkach płytki 12-dołkowej — zazwyczaj 1 szkiełko na warunek i/lub punkt czasowy. Do każdego dołka nanieść 5 x 104 monocytów THP-1. Liczbę komórek dodawanych do każdego dołka można zmienić w razie potrzeby.
    2. Uzupełnić objętość w każdym dołku z komórkami do 1 mL, używając pożywki RPMI + 10% FBS podgrzanej do 37 °C.
    3. Do każdego dołka dodać 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) i hodować przez 3 dni, aby zindukować różnicowanie monocytów THP-1 w komórki podobne do makrofagów.

2. Hodowla i przygotowanie linii komórkowej makrofagów J774.2

  1. Hodować komórki J774.2 w kolbach T25 w temperaturze 37 °C + 5% CO2. Komórki należy hodować w 5 mL pożywki DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) + 10% FBS i pasażować po osiągnięciu przez kulturę 80-90% konfluencji. Aby przeprowadzić pasaż komórek:
    1. Usunąć całą pożywkę z kolby i wypłukać ją raz 5 mL PBS.
    2. Usunąć PBS z kolby i zastąpić go 5 mL świeżej pożywki DMEM + 10% FBS.
    3. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać dno kolby, aby zawiesić komórki w pożywce. Kilkukrotnie energicznie pipetować komórki, aby rozbić wszelkie agregaty komórkowe.
    4. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:5, usuwając 4 mL zawiesiny komórkowej z kolby i zastępując ją 4 mL świeżej pożywki. Pozostałą zawiesinę komórkową można zutylizować, wykorzystać do rozpoczęcia nowej kultury komórkowej w nowej kolbie T25 lub wykorzystać do eksperymentu.
  2. Przygotowanie do testu eferocytozy z użyciem komórek J774.2:
    1. Na jeden dzień przed rozpoczęciem eksperymentu zawiesić komórki J774.2 w 5 mL świeżej pożywki, zgodnie z krokami 2.1.1–2.1.3. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przygotować niezbędną objętość komórek o stężeniu 5 x 104 komórek/mL.
    2. Umieścić odpowiednią liczbę okrągłych szklanych zakrywek o średnicy 18 mm (grubość #1.5) w studzienkach płytki 12-dołkowej. Do każdej studzienki nanieść 1 mL zawiesiny komórkowej o stężeniu 5 x 104 komórek/mL.
    3. Inkubować przez noc, aby umożliwić komórkom przywarcia do zakrywki i regenerację po pasażowaniu.

3. Hodowla pierwotnych ludzkich makrofagów M2

  1. Pobrać 10 ml heparynowanej krwi ludzkiej na każdą płytkę 12-dołkową z makrofagami M2, której będziemy potrzebować.
  2. W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml nanieś 5 ml krwi ludzkiej na warstwę 5 ml uprzednio ogrzanego medium do separacji komórkowej Lympholyte-poly. Przygotuj kilka probówek, jeżeli przetwarzanych jest >5 ml krwi zamiast używania probówek o większej objętości.
  3. Wiruj przy 300 x g przez 35 min, stosując średnie przyspieszenie i bez hamowania.
  4. Ostrożnie usuń górny pas bogaty w komórki mononuklearne za pomocą plastikowego pipetora i przenieś go do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli w kroku 3.2 przygotowano kilka probówek, pasy można połączyć w jednej probówce 50 ml. Uzupełnij objętość w probówce do 50 ml za pomocą PBS.
  5. Wirować z przyspieszeniem 300 x g przez 8 min, a następnie usunąć nadfiltr. W tym czasie do każdego dołka płytki 12-dołkowej umieścić autoklawowane okrągłe szkiełka nakrywki o średnicy 18 mm (grubość #1,5).
  6. Resuspendować osad komórkowy w 300 µL pożywki RPMI 1640 bez surowicy, odpowiadającej pożądanej liczbie dołków; np. Jeśli do przygotowania pełnej płytki 12-dołkowej przetworzono 10 ml krwi, należy zawiesić pellet komórkowy w 3,6 ml medium.
  7. Dodać 300 µL zawiesiny komórkowej do każdej studni płytki 12-dołkowej zawierającej szkiełko podstawowe. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C + 5% CO22.
  8. Delikatnie przemyj szkiełko coverglass 3 razy przy użyciu 1 ml podgrzanego PBS, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki.
  9. Dodać 1 ml pożywki RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego M-CSF + antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy do hodowli komórkowych. Inkubować w 37 °C + 5% CO22 przez 5 dni.
  10. Wymień pożywkę na RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL rekombinowanego ludzkiego M-CSF + 10 ng/mL rekombinowanej ludzkiej IL-4 + antybiotyk/antymykotyk do hodowli komórkowych. Inkubuj w 37 °C + 5% CO₂2 przez 2 dni w celu zakończenia polaryzacji M2.
  11. Spolaryzowane makrofagi należy wykorzystać w ciągu następnych 3 dni.

4. Przygotowanie apoptotycznych komórek Jurkat

  1. Hodować komórki Jurkat w 5 ml pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS w temperaturze 37 °C + 5% CO22Komórki Jurkat są linią komórkową w zawiesinie i mogą być hodowane poprzez pasażowanie w stosunku 1:5 do świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki co 3–5 dni.
  2. Aby przygotować komórki apoptotyczne, należy doprowadzić kulturę komórek Jurkat do wysokiej gęstości (4–5 dni po pasażowaniu). Odpiąć 1,5 ml zawiesiny do probówki do mikrocentryfużki o pojemności 1,5 ml i odwirować komórki przy 500 x g przez 5 min.
  3. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 1 ml bezserowego pożywki RPMI 1640 zawierającej 1 µM staurosporyna
  4. Inkubować przez 16 h w temperaturze 37 °C + 5% CO22 w celu wywołania apoptozy komórek.
  5. W razie potrzeby można potwierdzić indukcję apoptozy, wykonując barwienie aneksyną V:
    1. Aliquotowanie 100 µL hodowli komórek Jurkat traktowanych staurosporyną do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Odwiruj komórki przez 5 min przy 500 x g, odlej nadsącz i ponownie zawiesił osad komórkowy w 100 µL pożywki RPMI 1640 bez surowicy.
    2. Dodać 1 µL dodaj Aneksynę V znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Dodaj 900 µL z PBS i przenieś całą objętość do pojedynczej studzienki płytki 12-dołkowej zawierającej kolisty szkiełka nakrywkę o średnicy 18 mm (grubość #1,5). Wirować w wirówce wyposażonej w adapter do płytek przy 200 x g przez 1 min, aby wymusić adhezję komórek do szkiełka nakrywki. Alternatywnie komórki można umieścić w szkiełku z komorą do obrazowania.
    4. Obrazowanie przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

5. Ilościowe określanie pochłaniania i dynamiki eferycytozy z wykorzystaniem testu eferycytozy na utrwalonych komórkach oraz barwienia „inside-out”

  1. Przygotować ludzkie makrofagi THP-1, J774.2 lub M2 zgodnie z opisem w Sekcje 1-3odpowiednio.
  2. Wieczorem przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować apoptotyczne komórki Jurkat zgodnie z opisem w Sekcja 4.
  3. Bezpośrednio przed eksperymentem należy policzyć komórki apoptotyczne przy użyciu hemocytometru. Przenieś odpowiednią liczbę komórek apoptotycznych do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml – zazwyczaj dodajemy 5 x 105 komórek/dołek, zapewniając stosunek komórek docelowych do eferocytów wynoszący 10:1.
  4. Odwiruj komórki Jurkat w wirowróczce przy 500 x g przez 5 min, a następnie resuspenderuj w 500 μL buforu PBS.
  5. Podczas wirowania, podziel próbkę na alikwoty 10 µL DMSO do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. W DMSO rozpuścić minimalną ilość N-hydroksysukcynimidobiotyny (NHS-biotyny). Wystarczy 5–10 kryształków (~0,005 mg).
  6. Przenieś 500 μL zawiesinę komórek apoptotycznych w PBS do probówki zawierającej DMSO/NHS-biotynę. Następnie rozcieńczyć barwnik do śledzenia komórek do stężenia zalecanego przez producenta w zawiesinie komórek apoptotycznych. Należy upewnić się, że wybrany barwnik do śledzenia komórek nie wykazuje nakładania się widm z FITC-Streptawidyną (np. czerwony lub dalekoczerwony barwnik do śledzenia komórek).
  7. Inkubować zawiesinę przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodać taką samą objętość medium RPMI 1640 + 10% FBS i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej w ciemności, aby zatrzymać reakcję nieprzereagowanego barwnika.
  8. Odwiruj komórki przy 500 x g przez 5 min, odlej nadsącz i ponownie zawieś zabarwione komórki apoptotyczne w 100 µL podłoża RPMI 1640 + 10% FBS na studzienkę z makrofagami.
  9. Dodaj 100 µL kroplami zawiesinę barwionych komórek apoptotycznych do każdej studni z makrofagami. Wirować z prędkością 200 x g przez 1 min w wirówce wyposażonej w adapter do płytek, aby wymusić kontakt między makrofagami a komórkami apoptotycznymi.
  10. Inkubować płytkę przez pożądany czas w temperaturze 37 °C + 5% CO22 w inkubatorze do hodowli tkanek. W przypadku makrofagów materiał poddany eferocytozie jest zazwyczaj pierwszy wykrywalny po 20–30 min, a proces ten kończy się po 120–180 min.
  11. W wybranych punktach czasowych należy wyjąć komórki z inkubatora. Komórki należy przemyć dwukrotnie 1 ml PBS o temperaturze pokojowej, aby przerwać proces eferozy i usunąć apoptotyczne komórki, które nie zostały poddane eferozie.
  12. Do każdej studzienki dodać streptawidynę znakowaną FITC w rozcieńczeniu 1:1000 i inkubować przez 20 min w ciemności. Pozwoli to na znakowanie odsłoniętej biotyny w materiale z komórek apoptotycznych, które nie zostały poddane efferozy.
    UWAGA: Jeśli jest to pożądane, jądra komórkowe można zabarwić na tym etapie, dodając rozcieńczenie 1:20 000 Hoechst 33342 lub 4',6-diamidino-2-fenyloindolu, dichlorowodorku (DAPI).
  13. Przemyć komórki 3 razy 1 ml PBS, delikatnie wstrząsając lub kołysząc próbkami przez 5 min podczas każdego płukania. Utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS przez 20 min w temperaturze pokojowej. Przepłukać komórki raz PBS, aby usunąć nadmiar PFA.
  14. Przymocuj szkiełka nakrywki do preparatu w celu wykonania obrazowania i przeniesienia go do mikroskopu fluorescencyjnego. Wykonaj serie obrazów (z-stacki) dla odpowiedniej liczby komórek pozwalającej na dokładną kwantyfikację — zazwyczaj od 10 do 30 komórek na warunek. Materiał apoptyczny, który nie został zinternalizowany, będzie widoczny na otrzymanym obrazie jako materiał znakowany barwnikiem do śledzenia komórek, otoczony barwieniem FITC-streptawidyną, podczas gdy materiał poddany eferocytozie będzie tworzył dyskretne punkty (puncta) barwnika do śledzenia komórek pozbawione barwienia streptawidyną.
  15. Ilościowo określ eferecytozę na uzyskanych obrazach, stosując szereg różnych miar:
    1. Oblicz indeks eferozy przez wyznaczenie średniej liczby poszczególnych eferosomów (barwnik do śledzenia komórek+/streptawidyna- punktów) na makrofag. Należy policzyć wyłącznie makrofagi związane z komórką apoptotyczną lub zawierające ≥1 widoczne eferosomy. Makrofagi związane z komórką apoptotyczną, ale nieposiadające wyraźnych eferosomów, należy zarejestrować jako mające wskaźnik eferocytozy równy 0.
    2. Oblicz wydajność eferocytozy, mierząc frakcję makrofagów zawierających ≥1 eferosom.
    3. Oblicz szybkość eferozy poprzez obrazowanie komórek utrwalonych i barwionych w wielu punktach czasowych. Obrazuj wyłącznie makrofagi związane z komórkami apoptotycznymi lub zawierające widoczne eferosomy, wykonując stosy obrazów (z-stacks) dla każdej komórki. Po zakończeniu obrazowania wyznacz szybkość eferozy:
      1. Wykorzystując barwienie streptawidyną jako wzorzec oraz narzędzie zaznaczania swobodnego lub wielokątnego w programie FIJI/ImageJ26 (lub inny pakiet oprogramowania do analizy obrazu), obrysuj wszystkie barwniki do śledzenia komórek+/streptawidyna- (np. zinternalizowany) materiał w jednej płaszczyźnie stosu z (z-stack). Zmierzyć zintegrowaną intensywność barwnika do śledzenia komórek w tym obszarze. Pojedyncze pomiary dla każdego eferosomu (np. średnica, położenie względem brzegu komórki lub jądra, itp.)15,27 można je łatwo pozyskać równocześnie z tymi pomiarami, co znacząco zwiększa ilość danych gromadzonych podczas analizy.
      2. Na tym samym przekroju z, kierując się barwieniem streptawidyną i korzystając z narzędzia zaznaczania ręcznego lub wielokąta, obwedź cały barwnik do śledzenia komórek+/streptawidyna+ (np. materiał (niezinternalizowany) w jednej płaszczyźnie stosu z. Uwzględnić jedynie barwienie komórek apoptotycznych w kontakcie z fagocytem. Zmierzyć całkowitą intensywność (integrated intensity) tego obszaru.
      3. Powtórz kroki 4.2.3.1 do 4.2.3.2 dla pozostałych przekrojów z obrazu. Zsumuj całkowitą intensywność sygnału z efierocytowanychΣeff) oraz niepodlegających eferocytozie (ΣProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.) materiały. Udział komórki apoptotycznej, która została poddana eferozy, można obliczyć dla danej komórki jako:
        figure-protocol-1
      4. Ilościowo określ frakcję poddaną eferocytozie dla wszystkich komórek we wszystkich punktach czasowych. Należy pamiętać, że intensywność fluorescencji komórek apoptotycznych/eferozomów może różnić się pomiędzy obrazami ze względu na zmienne pochłanianie barwników do śledzenia komórek przez poszczególne komórki apoptotyczne oraz zmiany w parametrach akwizycji obrazu, takich jak czas ekspozycji. W związku z tym, pomiędzy obrazami, warunkami eksperymentalnymi oraz powtórzeniami doświadczeń, należy porównywać wyłącznie wartości znormalizowane, takie jak frakcja poddana eferocytozie, lub wartości niezależne od intensywności, takie jak indeks eferocytozy i wydajność eferocytozy.
    4. Aby zapewnić, że uzyskany zbiór danych dokładnie odzwierciedla zmienność efersocytozy między komórkami, analizy te należy przeprowadzić na maksymalnej możliwej liczbie komórek w każdym eksperymencie.
      UWAGA: Efektywność eferocytozy oraz indeks eferocytozy można obliczyć szybko (kilka sekund/komórkę); zazwyczaj dążymy do przeanalizowania co najmniej 100 komórek na eksperyment, powtarzając każdy eksperyment minimum 3 razy. Obliczanie frakcji materiału poddanego eferocytozie oraz pomiary specyficzne dla eferosomów są bardziej pracochłonne i zazwyczaj zajmują od 2 do 3 minut na komórkę w przypadku doświadczonego analityka. W tych obliczeniach kwantyfikujemy minimum 15 komórek dla każdego stanu w każdym eksperymencie.
    5. Zarejestruj wskaźnik eférocytozy, frakcję poddaną eférocytozie oraz indywidualne dane dotyczące eférozomów w przeliczeniu na jedną komórkę.
      UWAGA: Umożliwia to analizę danych z wykorzystaniem podejść jednokomórkowych, co pozwala na ilościowe określenie zmienności międzykomórkowej. Analizy na poziomie populacyjnym mogą być nadal przeprowadzane na tych zbiorach danych poprzez uśrednianie danych jednokomórkowych uzyskanych w poszczególnych eksperymentach. Pomiary specyficzne dla eferosomów można analizować na poziomie populacyjnym, na poziomie pojedynczej komórki oraz jako zespoły (np. jako populacje efferozomów niezależne od zawierających je komórek)15.

6. Analiza eferocytozy żywych komórek z wykorzystaniem komórek apoptotycznych

  1. Przygotować makrofagi THP-1, J774.2 lub M2 zgodnie z opisem w krokach 1-3 odpowiednio. Jeśli jest to wymagane, komórki należy przetransfekować transgenami lub innymi konstrukcjami genetycznymi co najmniej 18 h przed rozpoczęciem eksperymentów.
  2. Wieczorem przed rozpoczęciem eksperymentu przygotować apoptotyczne komórki Jurkat zgodnie z opisem w sekcjach 4 i 5, wprowadzając następujące modyfikacje:
    1. Rozcieńczyć komórki i indukować apoptozę zgodnie z punktami 4.1–4.3, a następnie zebrać wymaganą liczbę apoptotycznych komórek zgodnie z punktami 5.3–5.4.
    2. Do zawiesiny apoptotycznych komórek dodać barwnik do śledzenia komórek w stężeniu zalecanym przez producenta. Inkubować zawiesinę przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodać taką samą objętość RPMI 1640 + 10% FBS i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej w ciemności, aby zneutralizować nieprzereagowany barwnik. W tych eksperymentach nie dodawać NHS-biotyny.
    3. Osadzić komórki poprzez wirowanie przy 500 x g przez 5 min, odlać supernatant i ponownie zawiesić zbarwione apoptotyczne komórki w 100 µL RPMI 1640 + 10% FBS na każdą studnię z makrofagami.
  3. Jeśli jest to wymagane, oznakować makrofagi poprzez usunięcie pożywki hodowlanej z każdej studni i dodanie 500 µL PBS zawierającego zalecane przez producenta rozcieńczenie barwnika do śledzenia komórek, który nie nakłada się spektralnie na barwnik dodany do apoptotycznych komórek ani na żadne fluorescencyjne transgeny ekspresowane przez makrofagi. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie dodać taką samą objętość DMEM + 10% FBS i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej w ciemności, aby zneutralizować nieprzereagowany barwnik.
  4. Przenieść szkiełko nakrywkowe z makrofagami do komory Leidena. Dodać 400 µL DMEM + 10% FBS, a następnie 100 µL oznakowanej zawiesiny apoptotycznych komórek. Wymieszać, delikatnie pipetując pożywkę 2–3 razy.
  5. Przenieść komorę Leidena do podgrzewanej i przepływanej CO2 komory fluorescencyjnego mikroskopu do żywych komórek.
    UWAGA: W przypadku zestawów mikroskopowych bez możliwości perfuzji CO2, należy użyć pożywki do hodowli tkankowych buforowanej 1 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) zamiast wodorowęglanu sodu, aby utrzymać fizjologiczne pH podczas ekspozycji hodowli na powietrze.
  6. Nagrać serię time-lapse zawierającą obraz w białym świetle (kontrast fazowy lub DIC) oraz obrazy wszystkich znaczników fluorescencyjnych:
    1. Użyć obiektywu 100X w eksperymentach, w których wymagane jest rozdzielenie drobnych szczegółów (np. dynamika błon w interakcjach fagocytów z komórkami apoptotycznymi). Natomiast pomiary bardziej ogólne (tempo pobierania komórek apoptotycznych, czas interakcji między makrofagami a komórkami apoptotycznymi, itp.) najlepiej obrazować za pomocą obiektywu 60X lub 63X.
    2. Jeśli jest dostępna, użyć funkcji point-visiting do obrazowania wielu pól widzenia podczas jednej akwizycji, zwiększając tym samym liczbę zarejestrowanych zdarzeń eferocytozy w jednym eksperymencie.
    3. Ponieważ eferocyty często pochłaniają małe fragmenty komórek apoptotycznych, a nie całe komórki, najlepiej jest rejestrować stosy z (z-stacks). Aby zminimalizować fototoksyczność, należy rejestrować sekcje z oddzielone głębokością ostrości obiektywu mikroskopu (zazwyczaj 0,5–1,0 µm) przez grubość komórki (zazwyczaj 8-10 µm dla makrofagów, np. 8–20 warstw/komórka). Zapewnia to, że wszystkie zdarzenia pochłaniania i transportu będą widoczne w co najmniej jednej płaszczyźnie z. Alternatywnie można użyć dużych (średnica 1–5 µm) mimetyków komórek apoptotycznych lub komórek apoptotycznych, które ulegają minimalnej fragmentacji podczas eferocytozy (np. neutrofile poddane szokowi termicznemu) bez stosowania z-stackingu. Opisaliśmy wcześniej przygotowanie zarówno mimetyków, jak i apoptotycznych neutrofili28.
    4. Aby zminimalizować fotobleaching, należy używać jasnych fluoroforów i rejestrować obrazy przy ustawieniach akwizycji minimalizujących fotobleaching — np. niskie natężenie wzbudzenia w połączeniu z wysokim wzmocnieniem kamery i krótkimi czasami ekspozycji29. Do tego rodzaju obrazowania stanowczo zalecamy użycie mikroskopu wyposażonego w wysokoczułą kamerę z urządzeniem ładunkowym sprzężonym elektromagnetycznie (EM-CCD) lub konfokalny z wirującym dyskiem oraz szybki piezoelektryczny stolik mechaniczny.
  7. Liczba możliwych metod analizy, które można zastosować do tych filmów time-lapse, jest ogromna i wykracza poza możliwości omówienia w tym miejscu. Jako przykłady można podać: użycie ręcznego lub zautomatyzowanego oprogramowania do śledzenia fuzji, podziału i ruchu eferosomów wewnątrz komórek15, kwantyfikację dynamiki fuzji eferosomów z endolizosomami poprzez analizę kolokalizacji w makrofagach ekspresujących specyficzne dla przedziałów fluorescencyjne transgeny13, monitorowanie procesów pobierania, takich jak sondowanie i tworzenie pucharów (cup formation)30, określanie dynamiki rekrutacji białek sygnałowych i transportowych do eferosomu13 oraz/lub kwantyfikację aktywności degradacyjnej eferosomów przy użyciu komórek apoptotycznych znakowanych fluoroforami wrażliwymi na pH, utleniacze lub aktywowanymi przez proteazy31.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nocna hodowla komórek Jurkat z dodatkiem 1 µM staurosporyny prowadzi do apoptozy >95% komórek, co można potwierdzić poprzez barwienie anneksyną V (Rysunek 1). W eksperymentach można wykorzystać inne typy komórek, choć stężenie staurosporyny oraz czas trwania inkubacji będą wymagały optymalizacji dla każdej linii komórkowej. Aby zapewnić wiarygodną detekcję i kwantyfikację efocytozy, >80% komórek powinno znajdować się w stanie apoptozy przed dodaniem i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metody przedstawione w tym protokole umożliwiają obrazowanie i kwantyfikację dynamicznego procesu efferocytarnego, przy użyciu zarówno metod z komórkami stałymi, jak i żywymi. Podejścia te mają kilka zalet w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami opartymi na cytometrii przepływowej23,24. Zastosowanie barwienia na lewą stronę z ustalonymi próbkami zapewnia bardziej solidną i dokładną ocenę ilościową szybkości i zakresu efferocytozy - w rzeczywistości wiele ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Operating Grant MOP-123419, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant 418194, oraz Ontario Ministry of Research and Innovation Early Research Award dla BH. DGW przyczyniło się do optymalizacji niektórych z prezentowanych obrazów, do optymalizacji protokołów i napisania rękopisu; Był finansowany z grantu na zalewanie pomp z Uniwersytetu w Liverpoolu. CY jest finansowany przez stypendium Vanier Graduate Scholarship i stypendium CIHR MD / PhD. Agencje finansujące nie odgrywały żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640 MediaŻubr3500-000-EL
DMEM MediaŻubr319-005-CL
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Żubr080-150
PBSŻubr311-010-CL
Szkiełka nakrywkowe okrągłe 18 mm #1,5 grubościMikroskopia elektronowa Nauki72290-08Rozmiar i kształt szkiełka nakrywkowego nie jest krytyczny, ale 18 mm pasuje do studzienek standardowej 12-dołkowej płytki, co upraszcza hodowlę komórkową
StaurosporineCayman Chemical81590Rozpuścić w DMSO przy 1 mM (1,000x roztwór podstawowy)
Annexin V-Alexa 488ThermoFisherR37174
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217Przechowywać w eksykatorze. Nie należy przygotowywać roztworu podstawowego.
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace OrangeThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Pożywka do separacji limfolitowo-polikomórkowejCedarlane LabsCL5071
Rekombinowany ludzki M-CSFPeprotech200-04
Rekombinowany ludzki IL-4Peprotech300-25
J774.2 Linia komórkowa makrofagówSigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 Ludzka linia komórkowa monocytówATCCTIB-202
Linia komórkowa T JurkatATCCTIB-152

Bibliografia

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529(2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863(1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884(2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004(2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964(2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie eferocytozypoch anianie kom rek apoptycznychpodej cie z podw jnym znakowaniembarwnik do ledzenia kom rekbiotinylacja powierzchniowabarwienie streptawidynmikroskopia ywych kom rekfluorescencyjne geny reporteroweanaliza stosu Z Z stack

Powiązane artykuły