Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

DOI:

10.3791/58162

⸱

1 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Division of Renal-Electrolyte, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowanie struktury i funkcji kłębuszków nerkowych jest kluczowe w zapobieganiu kłębuszkowemu zapaleniu nerek, kategorii choroby nerek charakteryzującej się białkomoczem, który może ostatecznie prowadzić do przewlekłej i schyłkowej choroby nerek. Kłębuszek nerkowy to złożony aparat odpowiedzialny za filtrację osocza z organizmu. W chorobie dochodzi do utraty integralności strukturalnej, co pozwala na nieprawidłowy wyciek treści osocza do moczu. Metoda izolowania i badania kłębuszków nerkowych w kulturze ma kluczowe znaczenie dla badania tych chorób. W niniejszym protokole opisano skuteczną metodę odzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerek dorosłych szczurów przy jednoczesnym zachowaniu cech strukturalnych i morfologicznych. Proces ten jest w stanie wygenerować wysokie plony kłębuszków nerkowych na nerkę przy minimalnym zanieczyszczeniu innymi segmentami nefronu. W przypadku tych kłębuszków nerkowych stany urazu można naśladować, inkubując je z różnymi toksynami chemicznymi, w tym siarczanem protaminy, który powoduje zacieranie wyrostka stopy i białkomocz w modelach zwierzęcych. Stopień uszkodzenia można ocenić za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, barwienia immunofluorescencyjnego i western blotting. Poziomy nefryny i guza Wilmsa 1 (WT1) można również ocenić na podstawie tych kultur. Ze względu na łatwość i elastyczność tego protokołu, izolowane kłębuszki nerkowe mogą być wykorzystywane zgodnie z opisem lub w sposób, który najlepiej odpowiada potrzebom badacza, aby pomóc lepiej badać zdrowie i strukturę kłębuszków nerkowych w stanach chorych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kłębuszek nerkowy to wysoce wyspecjalizowana kępka naczyń włosowatych odpowiedzialnych za filtrację krążącego osocza. Stanowi początek nefronu, który jest podstawową jednostką funkcjonalną nerki. Funkcja kłębuszków nerkowych jest definiowana przez wyjątkowo fenestrowany śródbłonek naczyń włosowatych, szczelinową membranę podocytów i pośrednią błonę podstawną. Warstwy te tworzą półprzepuszczalną barierę, która umożliwia selektywne wydalanie substancji do filtratu. Woda, jony i inne małe cząsteczki na ogół przechodzą, podczas gdy większe cząsteczki są zatrzymywane w plazmie. Podocyty to wyspecjalizowane komórki nabłonkowe, które rozprzestrzeniają się po błonie podstawnej, otaczając naczynia włosowate wypustkami cytoplazmatycznymi znanymi jako wyrostki stopy. Wyrostki stopy sąsiednich podocytów krzyżują się ze sobą i są przecinane przez membrany szczelinowe składające się z białek takich jak nefryna, podocyna, P-kadheryna i ZO-11. W przekroju poprzecznym te wyrostki stopy są równomiernie ułożone na membranie podstawnej. W chorych kłębuszkach nerkowych wyrostki stopy stają się rażąco nieprawidłowe lub "zatarte", co prowadzi do nieprawidłowego wycieku treści osocza do filtratu. W związku z tym uszkodzenie kłębuszków nerkowych charakteryzuje się na ogół obecnością nienormalnie dużych ilości białka (np. białkomoczu) i/lub czerwonych krwinek (np. krwiomoczu) w moczu. Ponadto uszkodzone podocyty tracą ekspresję nefryny, a także jej regulatora Wilms Tumor 1 (WT1), kluczowego białka odpowiedzialnego za utrzymanie różnicowania2,3. Kłębuszki nerkowe są głównym celem uszkodzeń w nefropatii cukrzycowej i innych kłębuszkowych nerkowcach, takich jak choroba minimalnych zmian, nefropatia błoniasta i ogniskowe segmentowe stwardnienie kłębuszków nerkowych. Choroby te są głównymi przyczynami postępującej niewydolności nerek i rozwoju schyłkowej niewydolności nerek, stanu, w którym przeżycie zależy od dializ lub przeszczepu nerki. Dlatego ważne jest, aby badać kłębuszki nerkowe, aby lepiej zrozumieć patologię przewlekłej choroby nerek (PChN).

System hodowli komórkowych jest kluczowy dla badania biologii kłębuszków nerkowych. Ze względu na jego centralną rolę w generowaniu membrany szczelinowej, a także istnienie specyficznych chorób białkomoczowych spowodowanych mutacjami białka przepony szczelinowej, wiele badań, co zrozumiałe, wykorzystywało podocyty w izolacji. Doprowadziło to do wytworzenia pierwotnych linii komórkowych podocytów do wykorzystania in vitro. Komórki te mogą być hodowane w różnych warunkach, a nawet mogą być hodowane na przepuszczalnych podporach w celu oceny przepuszczalności4. Jednak izolacja proliferujących komórek często wybiera odróżnicowane komórki, które utraciły część markerów podocytów. Doprowadziło to do wygenerowania warunkowo unieśmiertelnionych podocytów pochodzących z transgenicznego szczepu myszy przenoszącego wrażliwego na temperaturę mutanta dużego genu T SV40 (np. immortomouse), który może być hodowany w kulturze, ale także różnicowany w celu ekspresji pełnego zestawu markerów podocytów5. Te metody hodowli pierwotnej odegrały kluczową rolę w zrozumieniu biologii podocytów4,6,7.

Niemniej jednak, kultury zawierające pojedyncze typy komórek nie mają relacji międzykomórkowych, które występują in vivo, jak również struktury podporowej i matryc, a monowarstwy tych komórek niekoniecznie odzwierciedlają trójwymiarową architekturę kłębuszków nerkowych. Unieśmiertelnione podocyty mogą być również kłopotliwe i trudne do wyhodowania8 i wymagają posiadania albo immortomy, albo początkowej porcji komórek od uznanych badaczy, aby rozpocząć. Ponadto kłębuszek nerkowy składa się nie tylko z podocytów, ale także z komórek śródbłonka naczyń włosowatych i błony podstawnej, a także komórek mezangialnych, które zapewniają podparcie dla struktury. Dlatego przydatne jest opracowanie podejścia ex vivo dostępnego dla wszystkich badaczy do badania nienaruszonych kłębuszków nerkowych, które zachowują swoją natywną architekturę, jak również wszystkie komórki tworzące normalne kłębuszki nerkowe.

W 1958 roku Cook i Pickering opisali pierwszą izolację kłębuszków nerkowych z nerki królika. Po obserwacjach, że zatory tłuszczowe zagnieżdżają się w kłębuszkach nerkowych, postulowali, że cząstki tej samej wielkości mogą być użyte do specyficznej izolacji tych struktur. Rzeczywiście, wlew cząstek tlenku żelaza do nerki doprowadził do uwięzienia tych cząstek w kłębuszkach nerkowych. Po mechanicznej dysocjacji i przesianiu nerki, kłębuszki nerkowe mogą zostać wyizolowane w stanie nienaruszonym i czystym dzięki zastosowaniu separacji magnetycznej9. W 1971 roku Misra wykazał, że napary z tlenku żelaza można pominąć, a izolację kłębuszków nerkowych osiągnąć poprzez przesiewanie zmielonej tkanki nerkowej człowieka, psa, królika lub szczura10. Od tego czasu technika ta była modyfikowana w zależności od celu badaczy, ale zasadniczo zaowocowała oczyszczonymi preparatami, które można było dalej badać lub na podstawie których można było ustalić pierwotne hodowle komórek11,12,13,14,15,16,17.

Tutaj opisujemy protokół izolacji nienaruszonych żywotnych kłębuszków nerkowych z nerki szczura. Cały protokół trwa zaledwie kilka godzin. Chociaż nie rozmnażają się, plany eksperymentalne dowolnej wielkości mogą być wspierane po prostu przez zwiększenie liczby nerek jako materiału wyjściowego. Chociaż istnieją opublikowane protokoły separacji kulek magnetycznych kłębuszków nerkowych, wymagają one dożylnego wstrzyknięcia kulek, są droższe i mogą zmienić biologię, ponieważ kulki są albo zatrzymywane przez kłębuszki nerkowe w hodowli, albo wymagają "lizy" kłębuszków nerkowych i usuwania przez wirowanie19. W porównaniu z kłębuszkami myszymi, większy rozmiar kłębuszków nerkowych szczurów (prawie 100 μm u dwumiesięcznych szczurów18) znacznie ułatwia oddzielenie ich od innych struktur nerkowych za pomocą prostej techniki przesiewania.

Jako dowód ich użyteczności, scharakteryzowaliśmy kłębuszki nerkowe, aby zademonstrować różne typy komórek. Mogą być również narażone na działanie czynników, o których wiadomo, że uszkadzają kłębuszki nerkowe in vivo, a my wykazujemy niekorzystny wpływ siarczanu protaminy (PS) na te kultury. PS to polikacja, która neutralizuje miejsca anionowe wzdłuż ściany naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych20. Ta neutralizacja ma dramatyczny wpływ na barierę filtracyjną kłębuszków nerkowych, a tym samym zwiększa białkomocz i zanikanie procesu stopy. Kłębuszki te można ocenić za pomocą immunoblotów dla kluczowych białek, takich jak nefryna i WT1, w celu oceny ogólnego stanu zdrowia. Ponadto ich strukturę można ocenić za pomocą mikroskopii świetlnej, immunofluorescencyjnej i elektronowej.

Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół jest dostępny dla większości badaczy (wystarczy dostęp do zwierząt i prostego sprzętu). Z nieuszkodzonymi cechami morfologicznymi badacz jest w stanie przeanalizować kłębuszki nerkowe i zobaczyć, jak inne ważne typy komórek i zachowanie macierzy w kłębuszkach nerkowych wpływają na funkcję i postęp choroby, co jest wadą kultur podocytów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Izolacja kłębuszków szczurzych

  1. Aby przygotować sterylny 1% bufor izolacyjny, dodaj 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do zlewki o pojemności 600 ml.
    1. Dodać 500 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do zlewki i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego, aż cała BSA się rozpuści.
    2. Sterylny filtr 1% buforu BSA/PBS w kapturze do hodowli komórkowych.
      UWAGA: Sterylny 1% bufor BSA/PBS można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.
  2. Zdobądź od 2 do 4 szczurów Sprague-Dawley o wadze od 150 do 200 g każdy.
    1. Eutanazja szczurów poprzez wdychanie dwutlenku węgla przy użyciu komory, do której wprowadza się 100% dwutlenku węgla w tempie 10-30% objętości komory na minutę. Obserwuj zwierzęta pod kątem ustania oddychania i wyblakłego koloru oczu przed usunięciem z dwutlenku węgla.
    2. Przygotuj skórę nad przednią częścią brzucha za pomocą 70% etanolu i w razie potrzeby użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć włosy. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry za pomocą nożyczek chirurgicznych lub skalpela. Wykonaj kolejne nacięcie w linii środkowej przez warstwę mięśni, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Przedłuż nacięcie górnie przez przeponę i mostek lub klatkę piersiową jako drugorzędną metodę eutanazji.
    3. Wyizoluj i usuń obie nerki i umieść w sterylnej plastikowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 30 ml buforowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) na lodzie.
      UWAGA: Kilka szczurów może zostać poddanych eutanazji w tej samej komorze, a wszystkie nerki mogą zostać umieszczone w tej samej stożkowej rurce.
  3. Trzymaj nerki na lodzie i transportuj do sterylnego kaptura do hodowli komórkowych. Przenieść nerki na sterylną szalkę Petriego zawierającą 5 ml HBSS, również z lodem, a następnie usunąć i wyrzucić tłuszcz okołonerkowy za pomocą nożyczek i ostrych kleszczy. Jeśli nadal jest obecna, wyjmij i wyrzuć kapsułkę otaczającą nerkę, wykonując małe powierzchowne nacięcie, a następnie użyj ostrych kleszczy, aby delikatnie odciągnąć ją od narządu.
    UWAGA: Zawsze trzymaj izolaty nerek na lodzie i ćwicz sterylną technikę przez cały czas. Kawałek sterylnej gazy można umieścić na szalce Petriego jako teksturowaną powierzchnię, aby utrzymać nerkę na miejscu podczas manipulacji.
    1. Przeciąć nerki wzdłuż na pół (odcinek strzałkowy), a następnie usunąć i wyrzucić rdzeń (który ma ciemniejszy kolor) za pomocą skalpela na drugiej szalce Petriego z 5 ml HBSS.
    2. Pozostałe kawałki, które są głównie korą nerkową, przenieść na trzecią szalkę Petriego z 5 ml HBSS i zmielić sterylną żyletką, aż kawałki będą miały mniej niż 1 mm wielkości lub aż powstanie pasta.
  4. Zwilżyć górną i dolną część sita o wielkości 180 μm 1% BSA/PBS w zlewce o pojemności 500 ml. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ powleka sito białkiem i zmniejsza przyleganie kłębuszków nerkowych, co poprawi wydajność.
  5. Umieść rozdrobnioną korę na małej krawędzi sita i użyj teksturowanego kołnierza tłoka (strona przeciwna do gumowej uszczelki) strzykawki o pojemności 10 ml, aby rozdrobnić tkankę przez sito do dolnej patelni siedzącej na lodzie. Okresowo płukać HBSS, ale używać jak najmniej, aby uniknąć rozcieńczenia próbki.
    UWAGA: Nie przekraczaj 30 ml całkowitego buforu, więc można tutaj użyć tylko 25 ml więcej. Powodem umieszczania tkanki mielonej tylko na jednej krawędzi sita jest zmniejszenie przylegania kłębuszków nerkowych poprzez ograniczenie ekspozycji na część sita, a nie na całą powierzchnię sita.
    1. Aby to ułatwić, ponownie wykorzystaj płyn zbierający się w dolnej misce do wypłukania sitka. Po zakończeniu przesiewania ostrożnie umyj dno sita ponownie 1% buforem BSA/PBS z dna naczynia, aby wychwycić wszelkie kłębuszki, które mogą być luźno przylegające.
    2. Zebrać cały płyn z dolnej miski do kilku strzykawek o pojemności 10 ml wyposażonych w igły 20 G i przepuścić go przez igłę co najmniej 2 dodatkowe razy. Podczas ostatniego zbierania należy przechowywać płyn zawierający kłębuszki nerkowe w strzykawce do momentu, gdy będzie on gotowy do przepuszczenia go przez sito o średnicy 90 μm.
  6. Podczas przechowywania płynu w strzykawkach umyć dolną miskę, przepłukując ją 1% BSA/PBS do zlewki na odpady, a następnie zwilżyć górną i dolną część sita 90 μm 1% BSA/PBS. Umieść sitko na dolnej patelni na lodzie.
    1. Nałożyć próbkę w strzykawkach na jedną krawędź sita i przetrzeć przez sito za pomocą innego kołnierza strzykawki, jak opisano powyżej. Umyj roztworem z dolnej miski, aby zebrać wszystko na jednej krawędzi sita.
    2. Po zakończeniu przesiewania ostrożnie umyj spód sita, jak w kroku 1.5.1. Zbierz cały płyn z dolnej miski do plastikowej stożkowej rurki o pojemności 50 ml.
  7. Umyć dolną miskę z 1% BSA/PBS do zlewki na odpady, a następnie zwilżyć górną i dolną część sita 75 μm 1% BSA/PBS. Umieść sitko na dolnej patelni na lodzie.
    1. Nałożyć próbkę na jedną krawędź sita. Ciecz powinna łatwo przepływać. Przepłukać przez wierzch co najmniej 20 ml 1% BSA/PBS do zlewki na odpady. Ostrożnie umyj również spód sitka. Kłębuszki nerkowe pozostaną na wierzchu tego sita o wielkości 75 μm.
    2. Użyj HBSS, aby zebrać kłębuszki nerkowe na szalce Petriego, spłukując je przez sito do góry nogami. Użyj tutaj tyle HBSS, ile potrzeba. Zebrać do jednej lub więcej plastikowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml na lodzie.
  8. Wirować przy 1800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 10 ml zimnego HBSS. Połączyć próbki, jeżeli pobrano wiele stożkowych probówek w ppkt 1.7.2. Powtórz etap wirowania.
  9. Ponownie zawiesić kłębuszki nerkowe w 5 ml HBSS, aż będą gotowe do przejścia do następnego kroku.
  10. W razie potrzeby policz całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych. W tym celu należy pobrać pipetą próbkę o objętości 10 μl i umieścić kroplę na szkiełku podstawowym. Obejrzyj pod mikroskopem, policz kłębuszki nerkowe na polu i pomnóż przez 500, aby uzyskać całkowity plon.
    UWAGA: Czystość można oznaczyć, licząc liczbę kanalików widocznych w terenie i dzieląc przez całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych i struktur kanalików. W polu widzenia powinno znajdować się > 95% kłębuszków nerkowych.
    1. W przypadku znacznego zanieczyszczenia przewodów należy powtórzyć kroki od 1.6.1 i należy upewnić się, że zostały dokładnie umyte po wykonaniu kroku 1.7.1. Jest to krok, w którym najbardziej prawdopodobne jest wystąpienie zanieczyszczenia przewodów rurowych.

2. Uszkodzenie kłębuszków nerkowych

  1. Zebrać kłębuszki nerkowe do plastikowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować w tempie 200 x g. Ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości HBSS w oparciu o całkowitą wydajność, tak aby na studzienkę przypadało około 9 000 kłębuszków nerkowych. Pobrać pipetę 450 μl próbki do każdego dołka na płytce 24-dołkowej lub w dowolnym formacie płytki, który pasuje do wymaganych dalszych testów.
    UWAGA: Pipetowanie w górę i w dół w celu wymieszania kłębuszków w buforze zapewnia jednorodny roztwór. Kłębuszki nerkowe są bardzo lepkie i ciężkie i sklejają się ze sobą, a także szybko osadzają się na dnie roztworu i po bokach probówki.
  2. Aby przygotować roztwór siarczanu protaminy (PS) o stężeniu 6 mg/ml, należy najpierw rozpuścić 1 g PS w 10 ml dH2O podgrzanego do 40 °C w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dokładnie przemieszać. Pobrać 30 μl roztworu i dodać do 470 μl dH2O.
    UWAGA: W ten sposób otrzyma się roztwór o stężeniu 6 mg/ml, a po dodaniu 50 μl do studzienki, jak opisano poniżej, końcowe stężenie wynosi 0,6 mg/ml.
    1. Po kolei dodać 50 μl siarczanu protaminy (jest to rozcieńczenie 1:10) do każdej studzienki jednej grupy, jednocześnie dostarczając innej grupie 50 μl HBSS (kontrola ujemna).
  3. Inkubować płytkę przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Odwirować zawartość każdej studzienki w probówce do mikrowirówki (4000 x g, 4 °C, 10 - 15 s) i przemyć dwukrotnie po 1 ml PBS każdy.
  5. Odessać końcowe płukanie i ponownie zawiesić w 300 μl PBS. Podziel na trzy podwielokrotności, które należy przygotować do izolacji białka, wizualizacji transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) i barwienia immunofluorescencyjnego (IF).

3. Przygotowanie kłębuszków nerkowych do analizy

  1. Odwirować zawartość trzech podwielokrotności (4000 x g, 4 °C, 10-15 s) i odessać pozostały bufor i przystąpić do analizy próbki przez TEM, If lub izolację białka.
  2. Przetwarzanie dla TEM
    1. Utrwalić granulki kłębuszkowe w 150 μl zimnego 2,5% aldehydu glutarowego w 0,01 M PBS. Ostrożnie usunąć utrwalacz z osadu za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć osadu, a następnie przepłukać go PBS i następnie utrwalić w 1% tetratlenku osmu z 1% żelazocyjankiem potasu.
    2. Odwodnić próbkę za pomocą stopniowanej serii etanolu (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) i tlenku propylenu, a następnie zatopić w materiale do zatapiania epoksydu.
    3. Wytnij półcienkie (300 nm) odcinki na ultramikrotomie. Zabarwić 0,5% błękitem toluidynowym w 1% boranie sodu i zbadać je pod mikroskopem świetlnym.
    4. Wyciąć ultracienkie skrawki (65 nm), wybarwić je octanem uranylu i cytrynianem ołowiu Reynoldsa i zbadać pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.
  3. Przetwarzanie dla IF
    1. Dodać 150 μl 12% żelatyny w roztworze PBS i natychmiast umieścić na suchym lodzie, aby uformować granulkę. Namoczyć granulat w 500 μl 2% paraformaldehydu/1x PBS w probówce mikrowirówkowej przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Umieść granulat w formie bazowej i osadź go, dodając pożywkę o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na suchym lodzie. Wyciąć skrawki 5-10 μm na kriotomii i przystąpić do immunofluorescencji/immunohistochemii lub standardowych barwień histologicznych.
  4. Do izolacji białek
    1. Dodać 150 μl buforu RIPA do odwirowanego osadu kłębuszkowego z 1,5 μl inhibitora proteazy i przemieszać z homogenizatorami tkankowymi.
    2. Przejdź do kwantyfikacji białek i immunoblottingu lub innej analizy białek.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół od momentu eutanazji do izolacji kłębuszków nerkowych może być ukończony w ciągu zaledwie 2 godzin i charakteryzuje się wysoką przepustowością i wydajnością. Przy odpowiednim wykorzystaniu tej techniki wydajność kłębuszków nerkowych na nerkę szczura waha się od 6 000 do 10 000 kłębuszków nerkowych, gdy zaczyna się od 8 nerek. Końcowa zawiesina jest gęsto wypełniona kłębuszkami nerkowymi i ma ogólną czystość > 95%, wykazując minimalne zanieczyszczenie segmentami rurkowymi lub innymi typami komórek (Rysunek 1A, B). Ponadto, kłębuszki nerkowe osadzone w OCT mogą być barwione barwnikami Hematoxylin i Eozyny (H i E), aby zobaczyć morfologię (Rysunek 1C). Kłębuszki te zachowują swoją strukturę przez cały protokół, nawet po przetworzeniu. Pokazujemy, że izolowane kłębuszki nerkowe posiadają nienaruszone i żywotne podocyty ( Rycina 2A), komórki mezangialne ( Figura 2B) i komórki śródbłonka ( Rycina 2C).

Po odizolowaniu, kłębuszki nerkowe mogą być narażone na dobrze znane urazy chemiczne symulujące patologię in vivo. W tym przypadku wybrano siarczan protaminy (PS) ze względu na jego zdolność do zakłócania ładunku bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych, co ostatecznie prowadzi do zaniku procesu stopy. Kłębuszki nerkowe traktowane PS mają uderzającą redukcję nefryny (czerwony) i liczbę jąder dodatnich dla WT1 (zielony) poprzez immunofluorescencję (Rysunek 3A, B). Kłębuszki nerkowe mogą być również przygotowane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Rysunek 3C). Próbki kontrolne mają normalną morfologię podocytów i wyrostki stopy, podczas gdy kłębuszki nerkowe traktowane PS mają zatarcie wyrostka stopy (Rysunek 3D), co jest oznaką dysfunkcji podocytów i jest widoczne w modelach in vivo przy użyciu PS21. Odpowiadało to również spadkowi nefryny wykrywanemu przez immunoblotting (Ryc. 3E, F).

Aby określić żywotność, rozszczepiona kaspaza-3 została oceniona jako marker apoptozy. Stosując immunofluorescencję, rozszczepiona kaspaza-3 pojawia się po raz pierwszy w kilku komórkach począwszy od 2 godzin po izolacji (Ryc. 4). Liczba komórek wyrażających tę proteazę stawała się z czasem coraz większa, a najwyższe poziomy obserwowano po 24 i 48 godzinach. Sugeruje to, że apoptoza zachodzi stosunkowo wcześnie w hodowli i że dalsze aplikacje powinny być wykonywane wkrótce po izolacji, aby uzyskać najlepsze wyniki.

figure-results-1
Rysunek 1. Typowy wygląd kultur kłębuszków nerkowych szczurów po izolacji. (A) Obraz w jasnym polu hodowli kłębuszków nerkowych. Chociaż wybraliśmy pole, w którym na tym mikrozdjęciu znajduje się pojedynczy kanalik nerkowy (grot strzały), uzyskane kultury są na ogół > czystości 95%. Podziałka skali wynosi 100 μm. (B) Powiększony obraz pojedynczego kłębuszka nerkowego. (C) Barwienie hematoksyliną i eozyną pojedynczego kłębuszka nerkowego. Podziałka w B i C wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Typy komórek składowych są zatrzymywane w izolowanych kłębuszkach nerkowych. Przeprowadzono konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną dla nefryny (czerwień, podocyty) i markerów specyficznych dla komórek w celu identyfikacji podocytów, komórek mezangialnych i śródbłonka. (A) Barwnik dla nefryny i WT1 (zielony, podocyty). (B) Barwnik dla nefryny i PDGFR-β (zielony, komórki mezangialne, strzałka). (C) Barwnik dla nefryny i CD31 (kolor zielony, komórki śródbłonka, naczynia w przekroju zaznaczone grotami strzałek). Podziałka = 25 μm na wszystkich panelach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Uszkodzenie podocytów można wywołać in vitro przy użyciu izolowanych kłębuszków nerkowych szczurów. (A) Konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna dla nefryny i WT1 w nieleczonej hodowli kłębuszków nerkowych. Zwróć uwagę na liniowe barwienie nefryną (czerwone) i obecność jąder WT1-dodatnich (zielonych), które są zwykle obserwowane, gdy istnieją zdrowe podocyty. (B) Po leczeniu siarczanem protaminy ekspresja nefryny jest zmniejszona i nieliniowa, a WT1 jest nieobecny, co wskazuje na uszkodzenie podocytów. (C) Obraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) przedstawiający wyrostki stóp, błonę podstawną i śródbłonek z fenestracją typową dla normalnej struktury kłębuszków nerkowych. Bar wynosi 500 nm. (D) Po siarczanie protaminy wyrostki stopy są wydłużone lub zatarte (groty strzałek), co wskazuje na uszkodzenie podocytów. (E) Western blot dla nefryny wykazujący obniżoną zawartość nefryny po leczeniu siarczanem protaminy. (F) Pokazano kontrolę ładowania aktyny dla western blot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Ocena żywotności komórek w izolowanych kłębuszkach nerkowych. Wykonano konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną dla rozszczepionej kaspazy-3 (zielona). Wykonano barwienie nefryną, aby łatwo zlokalizować kłębuszki nerkowe. Podczas gdy nie stwierdzono dodatniego wyniku rozszczepionej kaspazy-3 po 0 i 1 godzinie od wyizolowania kłębuszków nerkowych, sygnał fluorescencyjny w kilku komórkach odnotowano po 2 godzinach. Stopniowo więcej komórek stawało się dodatnich, im dłużej po izolacji, im bardziej były badane. Największą liczbę komórek dodatnich kaspazy-3 odnotowano po 24 i 48 godzinach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jest to skuteczna metoda odzyskiwania kłębuszków nerkowych z nerki szczura przy użyciu niedrogiego sprzętu wielokrotnego użytku z prostym protokołem. Podobnie jak w przypadku wszystkich procedur, istnieją ograniczenia co do ich użyteczności. Po pierwsze, chociaż uzyskujemy czystość > 95%, ze względu na przesiewający charakter protokołu i materiału wyjściowego nie można wykluczyć wszystkich zanieczyszczeń, a w kulturze będzie obecnych kilka czerwonych krwinek i sporadycznie segment rurkowy. Nie przewidujemy, aby te małe zanieczyszczenia stanowiły problem w zdecydowanej większości zastosowań. Po drugie, protokół przesiewania opiera się na wykorzystaniu nerek szczurów, w których kłębuszki nerkowe są znacznie większe niż u myszy. Jeśli potrzebne są kłębuszki mysie, opublikowano technikę wykorzystującą komercyjne kulki magnetyczne (np. Dynabeads)22 . Po trzecie, wykazano, że specyficzne mRNA (inhibitor aktywatora plazminogenu-1 i kolagen I) w izolowanych kłębuszkach nerkowych pochodzą prawie całkowicie z torebki Bowmana, a nie z komórek wewnątrzkłębuszkowych23. Może to prowadzić do niewłaściwych wniosków, jeśli zostanie podjęta próba izolacji mRNA z tych kłębuszków nerkowych. Należy zauważyć, że w naszych rękach większość kłębuszków nerkowych jest zdekapsulowana i dlatego nie powinno mieć znaczącego wkładu kapsułek Bowmana. Po czwarte, śmierć komórki zaczyna zachodzić stosunkowo szybko w warunkach hodowli.

Stwierdziliśmy, że program apoptozy, o czym świadczy pojawienie się rozszczepionej kaspazy-3, był aktywowany począwszy od 2 godzin hodowli. Jest to ogólnie zgodne z wcześniejszymi doniesieniami pokazującymi, że apoptoza, oceniana za pomocą fragmentacji DNA, TUNEL i analizy histologicznej, zaczyna wystąpić w ciągu 1-2 godzin po izolacji24. Należy jednak również zauważyć, że wczesne obserwacje wykazały, że aktywność metaboliczną można wykryć na podstawie izolowanych przesianych kłębuszków nerkowych, gdy są hodowane przez co najmniej 3 godziny, co sugeruje znaczną żywotność komórkową w tym punkcie czasowym16. Niemniej jednak, w oparciu o wyniki, uważamy, że rozsądne byłoby natychmiastowe wykorzystanie izolowanych kłębuszków nerkowych w zamierzonych eksperymentach w celu uzyskania najlepszych wyników. Zalecamy, aby wszystkie eksperymenty były wykonywane przed upływem 72 godzin, ponieważ zaobserwowaliśmy, że cała struktura kłębuszków nerkowych zaczyna się pogarszać po upływie tego czasu.

O wiele łatwiej jest uzyskać wyższe plony, gdy zaczynasz od 4-8 nerek, a nie tylko 2, ponieważ pewna liczba kłębuszków nerkowych jest tracona z powodu przylegania do różnych sit, ale gdy sita są maksymalnie pokryte, nie ma dodatkowych strat. Z tego samego powodu ważne jest, aby przed użyciem namoczyć sita w buforze BSA/PBS, ponieważ kłębuszki nerkowe z większym prawdopodobieństwem przylegają do suchego sita i ograniczyć narażenie tkanek na jedną krawędź sita. Sugerujemy zacząć od nie mniej niż 6 nerek (3 szczury), aby uzyskać rozsądną wydajność.

Niektórzy badacze wyizolowali pierwotne kultury podocytów z izolowanych kłębuszków nerkowych, które mają tendencję do wyrastania z kłębuszków nerkowych podczas hodowli17. Zauważyliśmy, że niektóre izolowane kłębuszki nerkowe będą przylegać do plastiku naczynia hodowlanego, a komórki zaczną migrować ze struktury kłębuszkowej w późnych punktach czasowych (72 godziny po izolacji). Badanie tych komórek wykracza poza zakres tego protokołu izolacji i istnieją pewne kontrowersje co do tego, czy komórki te są podocytami, komórkami nabłonka ciemieniowego, czy też obiema tymi komórkami. Warto zauważyć, że Mundel i in. stwierdzili, że komórki brukowe zebrane z przesianych kłębuszków nerkowych mogą być indukowane do różnicowania się w dojrzałe podocyty w określonych warunkach hodowli26. Niektóre niejasności dotyczące tożsamości komórek mogą zależeć od tego, czy izolowane kłębuszki nerkowe są zamknięte w kapsułkach (w tym torebka Bowmana, która jest wypełniona komórkami nabłonka ciemieniowego), czy też zdekapsulowane w procedurze przesiewania. W naszych rękach zastosowanie sit o rozmiarach sekwencyjnych 180, 90 i 75 μm doprowadziło do dekapsulacji większości kłębuszków nerkowych.

Większość postaci białkomoczowej przewlekłej choroby nerek jest spowodowana wzrostem przepuszczalności kłębuszków nerkowych. Kilku autorów wykorzystało izolowane kłębuszki nerkowe w eksperymentach przepuszczalności ex vivo . W jednej z metod do oszacowania przepuszczalności wykorzystano zmianę objętości kłębuszków nerkowych po zmianie zawartości osmotycznej otaczających ośrodków27. Niedawno ustalono, że wyciek sondy fluorescencyjnej z izolowanych kłębuszków nerkowych może być określony ilościowo w celu pomiaru przepuszczalności i może być przeprowadzony u gryzoni narażonych na chorobę kłębuszków nerkowych w modelach eksperymentalnych28.

Zauważyliśmy, że w procesie przygotowania TEM czasami widzimy, jak procesy stopy podocytów odrywają się od błony podstawnej. Nie uważamy, że dzieje się to w kulturze i jest bardziej prawdopodobne, że jest to artefakt podczas przygotowywania próbki TEM. Warto zauważyć, że nawet gdy tak się dzieje, jasne jest, czy procesy stopy wyglądają "normalnie", czy są zatarte.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia metodę, za pomocą której można ocenić zmiany morfologiczne i komórkowe w odpowiedzi na uraz. Przewidujemy, że może być stosowany jako technika towarzysząca izolowanym kulturom podocytów, zwłaszcza gdy rozważane są interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową lub innymi natywnymi typami komórek. Jest to nadzieja na pogłębienie wiedzy na temat białkomoczowej PChN, co poprawi zdolność do opracowywania przyszłych metod leczenia tej wyniszczającej choroby.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant FTF 16990086 American Heart Association, NIH P30 DK079307, American Society of Nephrology Gottschalk Award, University of Pittsburgh Medical Center Competitive Medical Research Fund Award oraz University of Pittsburgh Physicians Academic Foundation Award. Dziękujemy Gerardowi Apodaca za jego sugestie techniczne dotyczące konserwacji kłębuszków nerkowych do analizy histologicznej, Marze Sullivan i Ming Sunowi za pomoc w mikroskopii elektronowej oraz Yingjian Li i Youhua Liu za ich wkład techniczny w ten protokół. Dziękujemy również Cynthii St. Hilaire za przeciwciało CD31.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwory, chemikalia i zwierzęta
Szczury Sprague-DawleyEnvigo207M
Albumina surowicy bydlęcejFisherBP1605100
Zbilansowany roztwór soli Hanka z Ca2+ i Mg2+Thermo14025092
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanamiVWR97063-660
Protamina siarczanMP BioICN15197105
Utrwalacz Karnovsky'ego Żelatyna
ParaformaldehydEMDEM-PX0055-3
OCTScigen23730571
RIPA Buffer
Halt Inhibitory proteazyThermoPI78442
Przeciwciało nefrynyFitzgerald2OR-NP002
WT-1 PrzeciwciałoAbcamab89901-10ul
PDGFR-β Sygnalizacja komórkowa#3169S
Przeciwciało CD31LSBioLS-C348736
Rozszczepione przeciwciało kaspazy-3Sygnalizacja komórkowa9661S
Poly/Bed 812 (Luft) epoksydowaPolysciences08792-1
Sprzęt
Komora
Rurki stożkowe, 15 ml
Probówki stożkowe, 50 ml
Nożyczki
Kleszcze
Sterylna gaza szalki
Petriego, 100 mm
Skalpele
Żyletki
Sterylny aparat
Sito PanAlfa AesarAA39999ON
180um SitoAlfa AesarAA39996ON
90um SitoAlfa AesarAA39990ON
75um SitoAlfa AesarAA39991ON
Strzykawki
mL Zlewki600 ml
Inkubator
Picofuge
Vortex
Homogenizatory tkankoweFisher Scientific50550226
Igły
Leica Reichart Ultracut
przeciwciaładwutlenku węglachirurgicznechirurgicznefiltracyjny10do hodowli komórkowych20 G

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
  2. Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963(2013).
  3. Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
  4. Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
  5. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  6. Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
  7. Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77(2010).
  8. Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
  9. Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
  10. Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
  11. Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
  12. Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
  13. Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
  14. Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
  15. Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
  16. Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
  17. Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
  18. Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
  21. Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
  22. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  23. Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
  24. Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
  25. Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
  26. Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
  27. McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
  28. Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja k bk w nerkowychkora nerektransmisyjna mikroskopia elektronowabarwienie immunofluorescencyjneWestern blottingocena nefrynypoziomy WT1siarczan protaminybarwienie hematoksylin i eozyn

Powiązane artykuły