Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja zawartości białka rozpuszczalnego w roślinach i strawnych węglowodanów na przykładzie kukurydzy (Zea mays)

DOI:

10.3791/58164

⸱

6 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj protokoły zapewniają jasną i przystępną metodologię pomiaru zawartości rozpuszczalnych białek i strawnych (niestrukturalnych) węglowodanów w tkankach roślinnych. Możliwość ilościowego określenia tych dwóch makroskładników odżywczych roślin ma znaczące implikacje dla postępu w dziedzinie fizjologii roślin, ekologii żywieniowej, interakcji roślinożerców i ekologii sieci pokarmowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane elementarne są powszechnie używane do wnioskowania o jakości roślin jako zasobu dla roślinożerców. Jednak wszechobecność węgla w biomolekułach, obecność roślinnych związków obronnych zawierających azot oraz zmienność specyficznych dla gatunku korelacji między zawartością azotu a zawartością białka roślinnego ograniczają dokładność tych wniosków. Ponadto badania skoncentrowane na fizjologii roślin i/lub roślinożerców wymagają poziomu dokładności, którego nie osiąga się przy użyciu uogólnionych korelacji. Przedstawione tu metody oferują naukowcom przejrzysty i szybki protokół bezpośredniego pomiaru rozpuszczalnych w roślinach białek i strawnych węglowodanów, dwóch roślinnych makroskładników odżywczych najściślej związanych z wydajnością fizjologiczną zwierząt. Protokoły łączą dobrze scharakteryzowane testy kolorymetryczne ze zoptymalizowanymi etapami trawienia specyficznymi dla roślin, aby zapewnić precyzyjne i powtarzalne wyniki. Nasze analizy różnych tkanek kukurydzy cukrowej pokazują, że testy te mają czułość pozwalającą na wykrywanie zmian w zawartości rozpuszczalnych w białkach roślinnych i strawnych węglowodanów w wielu skalach przestrzennych. Należą do nich różnice między roślinami w różnych regionach uprawy i gatunkach lub odmianach roślin, a także różnice w typie tkanki wewnątrz rośliny, a nawet różnice w położeniu w tej samej tkance. Połączenie zawartości rozpuszczalnego białka i strawnych węglowodanów z danymi pierwiastkowymi może również zapewnić nowe możliwości w biologii roślin w zakresie łączenia odżywiania mineralnego roślin z procesami fizjologicznymi roślin. Analizy te pomagają również w generowaniu danych dotyczących rozpuszczalnych białek i strawnych węglowodanów potrzebnych do badania ekologii żywieniowej, interakcji między roślinami a roślinożercami oraz dynamiki sieci pokarmowej, co z kolei poprawi fizjologię i badania ekologiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomasa roślinna stanowi podstawę praktycznie wszystkich lądowych sieci pokarmowych. Rośliny pozyskują składniki odżywcze z gleby przez systemy korzeniowe i wykorzystują światło słoneczne w tkankach liści do syntezy biomolekuł. W szczególności węgiel i azot są wykorzystywane do tworzenia węglowodanów, białek (składających się z aminokwasów) i lipidów, które są potrzebne do budowy biomasy roślinnej (należy zauważyć, że w fizjologii roślin termin "makroskładnik" często odnosi się do elementów gleby, takich jak N, P, K i S, jednak w całym artykule termin ten będzie odnosił się do biomolekuł, takie jak białka, węglowodany i lipidy). Kiedy roślinożercy spożywają materiał roślinny, makroelementy zawarte w tkankach roślinnych są rozkładane na części składowe, a następnie wykorzystywane do napędzania procesów fizjologicznych konsumenta. W ten sposób makroskładniki odżywcze roślin mają silny wpływ na fizjologię konsumenta, a także mają ważne implikacje dla interakcji ekologicznych wyższego rzędu i dynamiki sieci pokarmowej.

W całym królestwie zwierząt, rozpuszczalne białko i strawne węglowodany są makroskładnikami najściślej związanymi z przetrwaniem, reprodukcją i wydajnością1. Co więcej, większość zwierząt aktywnie reguluje spożycie tych dwóch makroskładników, aby zaspokoić swoje potrzeby fizjologiczne1,2. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku owadów roślinożernych, które wykrywają stężenia cukrów i aminokwasów w tkankach roślinnych, co z kolei kieruje zachowaniami żywieniowymi. W rezultacie, rozpuszczalne w roślinach białko i strawne węglowodany odegrały istotną rolę w ewolucji interakcji między roślinami a owadami.

Chociaż dane o zawartości rozpuszczalnych w roślinach białek i węglowodanów strawnych są stosunkowo rzadkie (ale zobacz6,7,8,9,10,11), istnieje przewaga dostępnych danych na temat zawartości pierwiastków w roślinach (węgiel, azot i fosfor). W dużej mierze dzieje się tak dlatego, że pierwiastki odgrywają główną rolę w odżywianiu mineralnym roślin3,4,5. Tam, gdzie mierzone są pierwiastki, stosuje się korelacje do ekstrapolacji ilości rozpuszczalnego białka i strawnych węglowodanów, ale dokładne obliczenia są często trudne do uzyskania. Na przykład niemożliwe jest użycie węgla jako wskaźnika zawartości węglowodanów trawionych przez rośliny, ponieważ węgiel jest wszechobecny we wszystkich związkach organicznych. Istnieje silniejszy związek między azotem elementarnym a zawartością rozpuszczalnych w roślinach białek i często stosuje się uogólnione współczynniki konwersji azotu na białko. Istnieją jednak mocne dowody na to, że konwersje azotu na białko są wysoce specyficzne dla gatunku12,13,14,15, co sprawia, że użycie uogólnionej konwersji jest prawdopodobnie niedokładne. Z tego powodu współczynniki konwersji azotu na białko często nie są precyzyjne, szczególnie w zakresie, który jest wymagany do badań żywieniowych na roślinożercach. Również obecność allelochemikaliów roślinnych zawierających N, takich jak alkaloidy i glukozynolany, które często są toksyczne dla roślinożerców, może zakłócić te konwersje.

Tutaj oferujemy dwa testy chemiczne do pomiaru stężenia rozpuszczalnych białek i strawnych węglowodanów w tkankach roślinnych. Testy te są prezentowane oddzielnie, ale sugeruje się, aby były one stosowane jednocześnie do analizy tych samych próbek roślin w celu uzyskania bardziej kompleksowej analizy makroskładników odżywczych roślin. W obu przypadkach stosuje się podobne metodologie, składające się z etapu ekstrakcji, po którym następuje kwantyfikacja za pomocą absorbancji. Przygotowanie próbek roślin jest również identyczne dla obu protokołów, co ułatwia przeprowadzanie obu analiz jednocześnie. Użyteczność tych testów nie wynika z ich nowości, ponieważ opierają się one na starszych, (Bradford, Jones, Dubois) dobrze ugruntowanych testach kolorymetrycznych16,17,18, ale tutaj zorganizowaliśmy przejrzysty i łatwy do naśladowania protokół, który łączy te metody z bardziej niejasnymi technikami ekstrakcji specyficznymi dla roślin17,19 w celu ułatwienia stosowania tych testów osobom pracującym w dziedzinach związanych z roślinami.

Dla obu testów, makroskładniki roślinne są najpierw ekstrahowane fizycznie poprzez zamrażanie, liofilizację i mielenie materiału roślinnego. W przypadku testu białka rozpuszczalnego przeprowadza się dalszą ekstrakcję chemiczną17,19 przez kilka rund wirowania i podgrzewania próbek w roztworze NaOH. Dobrze znany test Bradforda, wykorzystujący błękit brylantowy Coomassie G-250, jest następnie używany do ilościowego oznaczania rozpuszczalnych białek i polipeptydów między 3,000-5,000 daltonów16,17. Ten test ma zakres wykrywania od 1 do 20 μg całkowitych białek na mikropłytkę lub <25 μg/ml, ale nie mierzy wolnych aminokwasów. Etap ekstrakcji testu węglowodanów strawnych opiera się na metodzie rozcieńczonych kwasów Smitha i wsp.20 i pozwala na izolację rozpuszczalnych cukrów, skrobi i fruktozanu - ale nie węglowodanów strukturalnych. Metodę oznaczania ilościowego kwasu fenolowo-siarkowego zaczerpnięto z Dubois i wsp.18 i mierzy wszystkie mono-, oligo- i polisacharydy (a także pochodne metylu). Ten test jest w stanie określić ilościowo określone cukry, ale tutaj używamy go jako wskaźnika całkowitej zawartości strawnych węglowodanów (patrz Smith i wsp.20 dla bardziej szczegółowej analizy). Łącznie testy te mierzą dwa makroskładniki odżywcze, które są silnie powiązane z ekofizjologią roślin i wydajnością roślinożerców, dostarczając ważnych danych na temat jakości zasobów u podstawy lądowych sieci pokarmowych. Przedstawienie tych protokołów sprzyja generowaniu zestawów danych makroskładników odżywczych roślin w celu uzyskania dokładniejszego zrozumienia fizjologii roślin, ekologii żywieniowej roślinożerców i interakcji między roślinami a roślinożercami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie i przetwarzanie roślin

  1. Pobieranie i przetwarzanie próbek z roślin
    1. Po pobraniu próbek roślinnych należy je błyskawicznie zamrozić, zanurzając materiał roślinny w ciekłym azocie za pomocą kleszczy i przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeżeli pobrane próbki roślin są zbyt duże, aby można je było błyskawicznie zamrozić, należy je szybko schłodzić suchym lodem i jak najszybciej przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Zawartość makroskładników odżywczych w materiale roślinnym może ulec zmianie po oddzieleniu tkanek od rośliny, dlatego ważne jest, aby zamrozić próbki roślinne tak szybko, jak to możliwe po pobraniu.
      ostrożność: Ciekły azot może powodować silne odmrożenia w kontakcie ze skórą. Upewnij się, że przewozisz ciekły azot w zatwierdzonych pojemnikach i noś odpowiednie środki ochrony osobistej podczas jego obsługi, w tym rękawice kriogeniczne, gogle na oczy, osłonę twarzy, fartuch i fartuch laboratoryjny.
    2. Liofilizuj materiał roślinny za pomocą liofilizatora, aby upewnić się, że tkanki są metabolicznie nieaktywne podczas usuwania wody. Suszyć, aż masa próbki ustabilizuje się, aby upewnić się, że cała woda została usunięta.
    3. Po wyschnięciu próbek zmielić na drobny proszek za pomocą młynka lub młynka. Próbki należy przechowywać w komorze osuszającej do czasu analizy.

2. Test białka rozpuszczalnego

  1. Przygotowanie próbki
    1. Odważyć powtórzone próbki każdej tkanki, około 20 mg każda, do probówek do mikrowirówek z polistyrenu o pojemności 1,5 ml i probówek do etykietowania. Próbki te będą następnie określane jako próbki nieznane. Należy zanotować dokładną masę każdej próbki, ponieważ informacje te będą niezbędne do obliczenia % rozpuszczalnego białka w każdej nieznanej próbce. Używaj probówek do mikrowirówek z zamykanymi pokrywkami, ponieważ nieblokujące się pokrywki mogą się otworzyć podczas kolejnego etapu ogrzewania, powodując utratę roztworu próbki.
  2. Rozpuszczanie i izolowanie nieznanych próbek białek
    1. Za pomocą mikropipetora dodać 500 μl 0,1 M NaOH do każdej probówki. Zamknij szczelnie pokrywki i sonikuj przez 30 minut. Podgrzej gorącą kąpiel wodną 90 °C.
      ostrożność: Wodorotlenek sodu jest mocną zasadą i może powodować oparzenia w kontakcie ze skórą. Chociaż 0,1 M NaOH reprezentuje niskie stężenie, należy nosić rękawice ochronne, aby uniknąć podrażnienia skóry.
    2. Umieść probówki na stojaku w gorącej kąpieli wodnej na 15 minut.
    3. Probówki wirować o masie 15 000 x g przez 10 minut. Odpipetować ciecz sklarowaną nad osadem do nowych, oznakowanych probówek do mikrowirówek, używając nowej końcówki pipety do każdej próbki. Dodać 300 μl 0,1 M NaOH do probówki zawierającej osad i ponownie odwirować przy 15 000 x g przez 10 minut. Ponownie zebrać ciecz sklarowaną nad osadem i połączyć ją z innym płynem sklarowanym nad osadem z tej samej próbki. Jest to potencjalny punkt zatrzymania, a w razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Wytrącić białka roślinne
    1. Zneutralizować pH roztworu sklarowanego nad osadem, dodając 11 μl 5,8 M HCl. Potwierdzić pH ~7, zanurzając papierek lakmusowy w każdym roztworze próbki.
      ostrożność: Kwas solny jest silnie kwasem, który może powodować oparzenia w kontakcie ze skórą (aplikacja na skórę lub wdychanie). Należy nosić rękawice, aby zapobiec podrażnieniu skóry podczas obchodzenia się z HCl.
    2. Dodać 90 μl 100% kwasu trójchlorooctowego (TCA) do każdej probówki i inkubować probówki na lodzie przez 30 minut. Wytrącanie się białek zmieni roztwór z klarownego na nieprzezroczysty. Jeśli nie nastąpi to po 30 minutach, wstaw rurki do lodówki na 1 godzinę. Jest to potencjalny punkt zatrzymania, a w razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
      ostrożność: Kwas trójchlorooctowy jest. Podczas obchodzenia się z produktem należy nosić rękawice, aby zapobiec kontaktowi ze skórą i uniknąć wdychania.
    3. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant TCA, odsysając go za pomocą przewodu próżniowego przymocowanego do końcówki mikropipety z drobnego szkła (ta sama końcówka może być używana do próbek). Nie należy naruszać osadu białkowego, unikając silnego zasysania i zachowując odpowiednią odległość między końcówką pipety a osadem.
    4. Szybko przemyć granulat 100 μl acetonu o temperaturze -20 °C. Ten krok usuwa wszelkie pozostałe TCA z osadu, co może zakłócać późniejszy test Bradforda; Jednak aceton zacznie rozpuszczać osad białka, jeśli pozostanie w kontakcie zbyt długo, dlatego należy dodać aceton, a następnie szybko wyekstrahować go z osadu w ciągu 5 sekund.
    5. Poczekaj, aż aceton odparuje, umieszczając rurki w dygestoriach lub lodówce. Następnie rozpuść osad białka, dodając 1 ml 0,1 M NaOH do każdej probówki. Całkowite rozpuszczenie osadu może wymagać kilku rund ogrzewania w gorącej kąpieli wodnej, wirowania i sonikacji.
      Uwaga: Im dłużej rurki pozostają w dygestoriach lub lodówce i im bardziej suche stają się granulki, tym trudniej będzie je ponownie rozpuszczone. Zaleca się suszenie osadu przez 30 minut, a następnie sprawdzanie obecności acetonu co 10-15 minut, aż stanie się jasne, że aceton wyparował (nie są wykrywalne opary acetonu).
  4. Wymieszać roztwory wzorcowe, rozcieńczyć nieznane roztwory próbek i określić ilościowo całkowitą zawartość białka w nieznanych próbkach za pomocą testu Bradforda.
    1. Przygotować roztwory wzorcowe bydlęcej immunoglobuliny G (IgG) zgodnie ze stężeniami wymienionymi w tabeli 1 (liofilizowany lub podstawowy roztwór IgG można mieszać z wodą dejonizowaną w celu uzyskania każdego stężenia). Przechowywać wzorce w temperaturze 4 °C. Na płytce 96-dołkowej dodać 160 μl każdego roztworu wzorcowego IgG w trzech powtórzeniach, zaczynając od pozycji A1 płytki dołkowej (0 μg/μL w pozycji A1, A2, A3, 0,0125 μg/μL w pozycjach B1, B2, B3 itd.).
    2. Przygotować rozcieńczony roztwór NaOH, dodając 50 μl 0,1 M NaOH do 950 μl wody destylowanej. Jako ślepą próbę kontroli ujemnej dodać 60 μl tego roztworu do płytki dołka w trzech egzemplarzach (pozycje G1, G2, G3).
    3. Przygotować rozcieńczenia nieznanych próbek, dodając 50 μl każdego roztworu próbki do 950 μl wody destylowanej w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Następnie dodać 60 μl każdej rozcieńczonej próbki do płytki studzienki w trzech egzemplarzach, zaczynając od pozycji H1. Płytka 96-dołkowa powinna pozwolić na analizę 6 wzorców, 1 ślepej próby i 25 nieznanych próbek odczytanych w trzech egzemplarzach. Każda analizowana płytka studzienki powinna zawierać własny wzorzec IgG i próbki ślepe.
    4. Dodać 100 μl wody destylowanej do wszystkich ślepych i nieznanych studzienek na próbki. Teraz każda studzienka powinna zawierać łącznie 160 μl. Za pomocą pipety wielokanałowej (8 kanałów) dodaj 40 μl barwnika białkowego Coomassie brilliant blue G-250 do każdego dołka w pierwszej kolumnie płytki dołka. Wymieszaj barwnik z próbkami, zanurzając go kilka razy. Powtórz tę czynność dla wszystkich pozostałych kolumn, wymieniając końcówki pipet, aby uniknąć zanieczyszczenia.
      ostrożność: Coomassie brilliant blue G-250 jest drażniący i należy unikać kontaktu ze skórą, oczami lub płucami. Proszę nosić rękawice, aby zapobiec kontaktowi ze skórą. Jeśli dojdzie do kontaktu ze skórą, produkt ten będzie plamił.
    5. Użyj igły, aby przebić wszelkie pęcherzyki obecne w studzienkach, ponieważ mogą one zakłócać odczyt spektrofotometru mikropłytki. Wyczyść igłę, aby uniknąć zanieczyszczenia między studzienkami. Pozostaw mikropłytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    6. Za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego zapisać wartości absorbancji dla każdej studzienki przy długości fali 595 nm.
    7. Zapisać średnią absorbancję dla trzech studzienek ślepej próby i odjąć tę wartość od każdego z odczytów próbki wzorcowej i nieznanej. Następnie należy zapisać średnią absorbancję dla każdej próbki wzorcowej i nieznanej.
      Uwaga: Aby obliczyć ilość białka obecnego w każdej nieznanej próbce przy użyciu krzywej wzorcowej, najłatwiej jest dokonać regresji średniej absorbancji każdego wzorca w stosunku do mikrogramów białka obecnego w każdym wzorcu, ale w razie potrzeby można wykreślić stężenie białka (μg/μL) każdego wzorca. Poniższe obliczenia odnoszą się jednak do standardowej krzywej opartej na mikrogramach, a nie na stężeniach (μg/μl).
    8. Wykreślić średnią absorbancję każdego wzorca w stosunku do całkowitej ilości białka obecnego w każdym basenie wzorcowym (Tabela 1). Dopasuj linię regresji liniowej do tych danych i użyj równania do obliczenia ilości białka (μg) w każdej nieznanej próbce studzienki na podstawie średniej absorbancji (Rysunek 1a).
      Uwaga: Współczynnik korelacji (wartość r) tej linii powinien być większy niż 0,98 i rutynowo bliski 0,99. Regresja standardowa będzie specyficzna dla każdej płytki, stąd nieznane dołki na próbki w każdej płytce muszą być analizowane osobno.
    9. Po obliczeniu średniej ilości białka dla każdej nieznanej próbki studzienki, należy użyć następującego równania, aby obliczyć całkowitą ilość białka (μg) w każdej oryginalnej próbce:
      Mp = (((Wp/60) x 1000)/50)*1000
      Mp = μg białka w próbce pierwotnej
      Wp = μg białka w nieznanej próbce studzienki
      1. Następnie użyj poniższego równania, aby określić procentową zawartość białka w każdej próbce:
        Pp = ((Mp/1000)/Mi)*100
        Pp =%białko w próbce
        Mi = masa początkowa próbki (mg)
        Uwaga: W niektórych przypadkach próbka może przekroczyć górny próg absorbancji. Jeżeli tak, roztwory próbek mogą wymagać dalszego rozcieńczenia na etapie 2.4.3.
        Dodatkowe rozcieńczenia muszą być następnie uwzględnione w kolejnych obliczeniach. Niektóre marki czytników mikropłytek zapewniają również oprogramowanie komputerowe, które automatycznie oblicza średnie stężenie białka w każdej nieznanej próbce na podstawie danych z krzywej standardowej.

3. Test strawnych węglowodanów

  1. Przygotowanie próbki
    1. Odważyć powtórzone próbki każdej tkanki, około 20 mg każda, do szklanych probówek o pojemności 15 ml z gumowymi nakrętkami (o długości 100 mm). Próbki te będą następnie określane jako próbki nieznane. Oznaczyć probówki wodoodpornym markerem lub taśmą opisową na wieczkach i zanotować dokładną masę każdej próbki, ponieważ informacje te będą wymagane do obliczenia zawartości %węglowodanów w każdej nieznanej próbce.
  2. Ekstrahować strawne węglowodany z każdej nieznanej próbki.
    1. Dodać 1 ml 0,1 M H2SO4 do każdej probówki i mocno zakręcić nakrętki na probówkach. Umieść we wrzącej łaźni wodnej na 1 godzinę.
      ostrożność: Kwas siarkowy jest bardzo. Podczas obsługi H2SO4 należy nosić rękawice, okulary i fartuch i wykonać tę czynność w dygestorium.
    2. Schłodzić rurki w letniej kąpieli wodnej. Wlej zawartość probówki do oznaczonych 1,5 ml probówek do mikrowirówek (nie martw się, jeśli w szklanych probówkach pozostanie trochę materiału roślinnego).
    3. Probówki wirować o masie 15 000 x g przez 10 minut. Usunąć ciekłość sklarowaną nad osadem za pomocą mikropipetora i umieścić w nowych, oznakowanych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. W tym momencie rurki można schłodzić przez noc. Jeśli kontynuujesz badanie, zapoznaj się z krokiem 3.3.2.
  3. Zmieszać roztwory wzorcowe i określić ilościowo całkowitą zawartość węglowodanów strawnych w nieznanych próbkach.
    1. Przygotować roztwory wzorcowe glukozy D(+) o stężeniach podanych w tabeli 2. Przygotować sześć szklanych probówek zawierających 400 μl każdego roztworu wzorcowego.
    2. Pobrać pipetę po 15 μl z każdej nieznanej próbki do osobnej probówki i dodać do każdej z nich 385 μl wody destylowanej, co daje całkowitą objętość 400 μl w każdej probówce. W dygestorium dodać 400 μl 5% fenolu do każdej probówki z próbką wzorcową i nieznaną, a następnie szybko odpipetować 2 ml stężonegoH2SO4 do każdej probówki. Nie dotykaj zawartości probówki końcówką pipety, wystarczy dodać do powierzchni roztworu (najlepiej sprawdza się do tego pipeta powtarzalna).
    3. Pozwól probówkom inkubować przez 10 minut, a następnie ostrożnie wiruj probówki, aby wymieszać zawartość. Inkubować przez dodatkowe 30 minut.
      ostrożność: Fenol i kwas siarkowy są substancjami drażniącymi. Aby chronić się przed narażeniem na kontakt ze skórą, oczami i wdychaniem ten krok należy wykonywać w okapie oparów chemicznych przy użyciu odpowiednich środków ochrony indywidualnej, które obejmują: osłonę twarzy lub gogle do oczu, gumowe rękawice, fartuch laboratoryjny i buty. Mieszanie fenolu z kwasem siarkowym powoduje również reakcję egzotermiczną, która spowoduje nagrzewanie się rurek.
    4. Pobrać pipetę 800 μl próbki z każdej probówki do każdej z 3 polistyrenowych półmikrokuwet o pojemności 1,5 ml (3 kontrpróby techniczne na próbkę). Ustaw spektrofotometr na odczyt przy 490 nm. Kalibrację do ślepej kuwety zawierającej wodę destylowaną przed odczytem wzorców lub nieznanych próbek oraz z przerwami podczas odczytów próbek. Przepuść każdą kuwetę przez spektrofotometr i zapisz absorbancję. Średnia z prób technicznych dla każdej nieznanej próbki.
      Uwaga: W niektórych przypadkach próbki mogą przekroczyć górny próg absorbancji. W takim przypadku próbki należy rozcieńczyć na etapie 3.2.3. Rozcieńczenia muszą być również uwzględnione w późniejszych obliczeniach.
    5. Oblicz średnią absorbancję dla każdego wzorca.
      Uwaga: Aby obliczyć ilość całkowitych strawnych węglowodanów obecnych w każdej nieznanej próbce przy użyciu krzywej wzorcowej, najłatwiej jest dokonać regresji średniej absorbancji każdego wzorca w stosunku do mikrogramów D(+)glukozy obecnej w każdym wzorcu, ale w razie potrzeby można również wykreślić stężenie D(+) glukozy (μg/μL) każdego wzorca. Poniższe obliczenia odnoszą się jednak do standardowej krzywej opartej na mikrogramach, a nie na stężeniach (μg/μl).
    6. Obliczyć krzywą wzorcową, wykreślając średnią absorbancję w stosunku do całkowitej ilości D(+)glukozy (μg) w każdym roztworze wzorcowym. Dopasuj linię regresji liniowej do tych danych, a następnie użyj poniższego równania, aby obliczyć całkowitą ilość węglowodanów (μg) w każdej nieznanej próbce:
      Mc = (((Ax – b)/m)/(15))*1000
      Mc = μg węglowodanów w próbce
      Ax = średnia absorbancja nieznanej próbki
      b = punkt przecięcia z osią Y (standardowa linia regresji)
      m = nachylenie (standardowa linia regresji)
      Współczynnik korelacji tej linii powinien być większy niż 0,98 i rutynowo bliski 0,99. Następnie użyj poniższego równania, aby określić procentową zawartość węglowodanów w każdej próbce:
      Pc = ((Mc/1000)/(Mi))*100
      Pc =%węglowodany
      Mi = masa początkowa próbki (mg)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby pokazać przydatność tych metod, przeanalizowaliśmy zawartość rozpuszczalnego białka i strawnych węglowodanów w czterech różnych tkankach pól i kukurydzy cukrowej, które służą jako różne potencjalne źródła pożywienia dla roślinożerców. Zebraliśmy kłosy kukurydzy z trzech regionów rolniczych w Stanach Zjednoczonych (Minnesota, Karolina Północna i Teksas), obejmujących pięć różnych odmian kukurydzy cukrowej (tj. genotypy) i jedną odmianę kukurydzy polowej jako grupę zewnętrzną. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łącząc sprawdzone testy kolorymetryczne ze skutecznymi protokołami ekstrakcji specyficznymi dla roślin, zaprezentowane tutaj testy zapewniają rozsądną i dokładną metodę pomiaru zawartości rozpuszczalnych w roślinach białek i strawnych węglowodanów. Nasze wyniki, wykorzystując kukurydzę jako przykład, ilustrują, w jaki sposób te protokoły mogą być wykorzystane do uzyskania precyzyjnych pomiarów w różnych biologicznie istotnych skalach przestrzennych. Na przykład byliśmy w stanie wykryć różnice w zawartości rozpuszczalnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim naszym współpracownikom, którzy pomogli w zbieraniu słodkiej kukurydzy, w tym Dominicowi Reisigowi i Danowi Mottowi z North Carolina State University, oraz Patowi Porterowi z Texas A&M University w Lubbock, TX. Podziękowania dla Fiony Clissold za pomoc w optymalizacji protokołów i za wprowadzenie zmian w tym rękopisie. Prace te były częściowo wspierane przez Texas A&M C. Everette Salyer Fellowship (Departament Entomologii) oraz konkurencyjny grant Biotechnology Risk Assessment Grant Program nr 2015-33522-24099 z Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (przyznany GAS i STB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mikropłytek (spektrofotometr)Bio-RadModel 680 XR
Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnika barwnikowegoBio-Rad#5000006450mL
czytnik

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson, S. J., Raubenheimer, D. The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (2012).
  2. Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
  3. Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
  4. Chapin, F. S. III The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
  5. Marschner, H. Marschner's Mineral Nutrition of Higher Plants. , Academic press. London, UK. (1956).
  6. Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
  7. Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
  8. Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
  9. Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
  10. Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
  11. Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
  12. Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
  13. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. 78, 105-109 (2002).
  14. Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
  15. Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
  16. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
  18. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
  19. Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
  20. Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
  21. Cui, S. W. Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (2005).
  22. Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
  23. Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
  24. Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
  25. Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
  26. Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
  27. Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
  28. Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
  29. Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
  30. Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie bia ek rozpuszczalnychoznaczenie w glowodan w strawnychanaliza tkanek ro linnychkolorymetryczne oznaczanie bia ekmetoda kwasu fenolo siarkowegoCoomassie Brilliant Bluepomiar spektrofotometrycznyanaliza zawarto ci makrosk adnik wilo ciowe oznaczanie makrosk adnik w w ro linachmetody ekologii ywieniowej

Powiązane artykuły