Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja kofeiny, aktywność enzymatyczna i ekspresja genów syntazy kofeiny z zawiesin komórek roślinnych

DOI:

10.3791/58166

⸱

2 października 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2CONACYT, Facultad de Ingeniería Química, Campus de Ciencias Exactas e Ingeniería, Universidad Autónoma de Yucatán

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje efektywną metodologię ekstrakcji i kwantyfikacji kofeiny w zawiesinach komórkowych C. arabica L. oraz eksperymentalny proces oceny aktywności enzymatycznej syntazy kofeiny z poziomem ekspresji genu kodującego ten enzym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kofeina (1,3,7-trimetyloksantyna) to alkaloid purynowy obecny w popularnych napojach, takich jak kawa i herbata. Ten wtórny metabolit jest uważany za obronę chemiczną, ponieważ ma działanie przeciwdrobnoustrojowe i jest uważany za naturalny środek owadobójczy. Kofeina może również wywoływać negatywne efekty allelopatyczne, które uniemożliwiają wzrost otaczających roślin. Ponadto ludzie na całym świecie spożywają kofeinę ze względu na jej działanie przeciwbólowe i pobudzające. W związku z zainteresowaniem technologicznymi zastosowaniami kofeiny rozwinęły się badania nad szlakiem biosyntezy tego związku. Badania te koncentrowały się przede wszystkim na zrozumieniu mechanizmów biochemicznych i molekularnych, które regulują biosyntezę kofeiny. Hodowla tkankowa in vitro stała się użytecznym systemem do badania tego szlaku biosyntezy. W tym artykule opisano krok po kroku protokół oznaczania ilościowego kofeiny i pomiaru poziomów transkryptu genu (CCS1) kodującego syntazę kofeiny (CS) w zawiesinach komórkowych C. arabica L., a także jego aktywności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kofeina jest metabolitem wtórnym, który jest biosyntetyzowany przez rośliny z rodzaju Coffea1. Alkaloid ten należy do rodziny metyloksantyny i jest uważany za chemiczną obronę roślin, ponieważ może działać przeciwko niekorzystnym skutkom patogenów i roślinożerców2,3. Ponadto metabolit ten jest odpowiedzialny za stymulujące właściwości napoju kawowego, który jest powszechnie spożywany na całym świecie4,5. Ze względu na jego właściwości kilka grup badawczych jest zainteresowanych badaniem szlaku biosyntezy i katabolizmu kofeiny6,7. Obecnie roślinne hodowle komórek/tkanek in vitro służą jako alternatywa do oceny akumulacji kofeiny w ramach różnych strategii biotycznych i abiotycznych8,9.

Biosynteza kofeiny polega na hydrolitycznym uwalnianiu 7-metyloksantyny z odpowiedniego nukleozydu rybozy, po którym następują uporządkowane N-metylacje w pozycjach 3 i 1. Specyficzna N-metylotransferaza zależna od S-adenozylometioniny (SAM) katalizuje metylację w pozycji 7, podczas gdy syntaza teobrominy (TS) i CS są zaangażowane odpowiednio w metylacji 3 i 1, wytwarzając teobrominę i kofeinę. Badanie genów kodujących różne NMT pozwoliło zrozumieć mechanizm regulujący produkcję kofeiny10,11. CS, który ma aktywność N-metylotransferazy, katalizuje ostatnie dwa etapy szlaku biosyntezy kofeiny11. W siewkach kawowca wykazano, że promieniowanie świetlne może zwiększać aktywność CS, co skutkuje wzrostem biosyntezy kofeiny. Ostatnio wykazaliśmy, że utrzymanie zawiesin komórkowych C. arabica L. pod wpływem promieniowania świetlnego jest optymalnym warunkiem do oceny efektów, które wytwarzają abiotyczne czynniki stresowe wpływające na szlak biosyntezy kofeiny8. Informacje uzyskane w tych badaniach mogą mieć zastosowanie w inżynierii metabolicznej i biologii systemowej w celu maksymalizacji badania szlaku biosyntezy kofeiny w takich systemach in vitro.

Biorąc pod uwagę korzyści płynące z uzyskania odpowiedniego modelu do badania biosyntezy kofeiny, zoptymalizowaliśmy warunki ekstrakcji kofeiny na zawiesinach komórkowych C. arabica L. Udało się również opracować użyteczny protokół do badania aktywności enzymatycznej, a także kroki metodologiczne do oceny poziomu transkryptów genów syntazy kofeiny Coffea 1 (CCS1) kodujących ten enzym. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół ekstrakcji i ilościowego oznaczania kofeiny w zawiesinach komórek C. arabica za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i densytometrii (densytometria TLC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja kofeiny w zawiesinach komórkowych C. arabica L.

  1. Użyj zawiesiny komórek C. arabica9. Utrzymać zawiesiny przez dwutygodniowe subkultury w pożywce Murashige i Skoog o pH 4,3 ze stałą prędkością 100 obr./min, wstrząsając w temperaturze 25 °C w ciągłym świetle (8,3 W/m2).
  2. Zebrać komórki pod filtracją próżniową za pomocą bibuły filtracyjnej o porach 11 μm i lejka Buchnera.
  3. Zarejestrować świeżą masę pobranych komórek za pomocą wagi, zawinąć je w folię aluminiową, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
  4. Liofilizuj zamrożony materiał komórkowy przez 72 godziny.
  5. Zarejestruj masę liofilizowanych komórek w celu oszacowania uzysku suchej masy.
  6. Sproszkowany materiał przechowuj w workach polietylenowych wielokrotnego użytku (9 cm x 7,5 cm). Materiał należy zmacerować na drobny proszek i przechowywać w eksykatorze do czasu użycia.
  7. Odmierzyć 0,5 g suchej masy komórkowej na skali analitycznej i dodać do szklanej kolby (25 ml).
    1. Dodaj 10 ml acetonu do liofilizowanych komórek i mieszaj w mieszalniku wirowym przez 30 sekund w celu homogenizacji. Następnie uszczelnić kolbę folią aluminiową.
    2. Mieszać z prędkością 100 obr./min za pomocą rotatora w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 5 godzin.
  8. Przenieść cały materiał do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 13 000 x g przez 10 minut. Przenieść fazę ciekłą do nowej probówki i zredukować do niej suchość w temperaturze pokojowej w dygestorium.
  9. Zawiesić próbkę w 25 μl acetonu.

2. Warunki oceny kofeiny metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)-densytometrii

  1. Nanieść 1 μl wcześniej zawieszonego ekstraktu kofeiny na fazę stacjonarną.
    Uwaga: Jako fazę stacjonarną stosuje się płytki z żelem krzemionkowym (F254). Przed nałożeniem próbek, płytki wywołano z 10 ml chloroformu-metanolu [9:1 v/v] w komorze chromatograficznej (14 cm x 12 cm x 9,5 cm), a płytki wysuszono w temperaturze pokojowej. Charakterystyka płytki chromatograficznej, na którą nakładane są próbki, jest pokazana na Rysunek 1. Komora była nasycana rozpuszczalnikiem przez 30 minut przed wywołaniem płytki. Płytki TLC należy obsługiwać w rękawiczkach, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Rozwinąć TLC w komorze chromatograficznej z 10 ml cykloheksanu-acetonu w fazie ruchomej [40:50 v/v].
    Uwaga: Ta mieszanina pozwala na oddzielenie kofeiny przy współczynniku retencji (Rf) wynoszącym 0,34.
    1. Wyjmij płytkę TLC z komory i pozostaw do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  3. Wizualizacja pasm kofeiny w świetle ultrafioletowym o krótkiej długości fali (UV, 254 nm). Użyj kompaktowej lampy UV. Dodatkowo na tym etapie użyj gogli z ochroną przed promieniowaniem UV.
  4. Określ ilościowo poziom kofeiny za pomocą densytometrii przy 273 nm. Przyrząd jest sterowany za pomocą oprogramowania chromatograficznego.

3. Izolacja kwasu rybonukleinowego (RNA)

  1. Pobrać zawiesiny komórek z kroku 1.1 i przefiltrować próżniowo za pomocą bibuły filtracyjnej (porów o wielkości 11 μm).
  2. Zebrać materiał komórkowy z bibuły filtracyjnej, odważyć 0,5 g materiału komórkowego na wadze analitycznej i zapakować w folię aluminiową. Zamrażać próbkę ciecząN2.
  3. Próbkę komórkową należy macerować w porcelanowym moździerzu z ciekłym azotem i dodawać 1 ml odczynnika do izolacji RNA aż do homogenizacji.
    Uwaga: Sterylizować moździerze porcelanowe w piecu muflowym w temperaturze 300 °C przez 6 godzin. Odczynnik do izolacji RNA zawiera fenol, izotiocyjanian guanidyny i inne składniki.
    1. Przenieść 500 μl próbki do sterylnej probówki mikrowirówkowej (1,5 ml). Dodać 300 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego (24:1) i 300 μl zrównoważonego fenolu (pH 8,0).
  4. Wymieszać próbkę z mieszalnikiem wirowym, a następnie odwirować ją przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieść 300 μl górnej fazy do probówki mikrowirówkowej. Dodać 200 μl izopropanolu. Inkubować probówkę przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C.
  6. Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie zdekantować fazę ciekłą.
    1. Dodaj 1 ml etanolu (70%), aby utworzyć osad w probówce. Odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut i zdekantować. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  7. Suszyć próbkę przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (25 °C). Zawiesić ekstrakt RNA w 25 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC).
    Uwaga: Do ekstrakcji RNA należy użyć wody uzdatnionej 0,1% DEPC v/v.

4. Inkubacja transkryptu RNA z deoksyrybonukleazą (DNazą)

  1. Do sterylnej probówki do mikrowirówki dodaj 2 μg całkowitego ekstraktu RNA. Dodać 1 μl 10x buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Dodać 1 μl 1 U/μL DNazy.
    1. Doprowadzić reakcję do końcowej objętości 10 μl za pomocą wody uzdatnionej DEPC. Wymieszać próbkę i krótko odwirować przy 2 000 x g przez 1 min.
  2. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. Przerwać reakcję przez dodanie 1 μl 50 mM disodowego etylenodiaminotetraoctanu disodowego dwuwodnego (Na2EDTA) i inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
  4. Przeanalizuj integralność RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    1. Przygotuj standardowy 1% żel agarozowy i zabarwij go 1 μl 3x interkalacyjnego roztworu barwienia kwasu nukleinowego.
    2. Nałóż 500 ng RNA na żel agarozowy i uruchom żel.
    3. Wizualizacja integralności RNA za pomocą systemu dokumentacji fotograficznej żelu.
    4. Użyj RNA jako matrycy do syntezy cDNA przez odwrotną transkryptazę.

5. Komplementarna synteza kwasu dezoksyrybonukleinowego (cDNA)

  1. Dodać 2,5 μg całkowitego RNA do probówki mikrowirówkowej. Dodać 1 μl startera oligodeoksytyminy (dT) i napełnić probówkę do 13 μl końcowej objętości wodą wolną od nukleaz. Wymieszać próbkę, a następnie odwirować 2 000 x g przez 1 minutę.
  2. Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie w temperaturze 4 °C przez 2 minuty.
  3. Dodać 4 μl 5x buforu reakcyjnego używanego do odwrotnej transkryptazy, 2 μl mieszaniny trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP) (10 mM każdego dNTP) i 1 μL odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Delikatnie wymieszać i odwirować przy 2 000 x g przez 1 min.
  4. Inkubować próbkę w temperaturze 45 °C przez 50 minut, a następnie w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  5. Określić ilościowo stężenie cDNA za pomocą spektrofotometru UV.
  6. Użyj cDNA jako matrycy dla reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
    Uwaga: Bufor reakcyjny został użyty odpowiednio jako 10x (krok 4.1.1) i 5x razy skoncentrowany (krok 5.3).

6. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) w celu amplifikacji genu CCS1

  1. Dodać 7,5 μl polimerazy DNA Taq 2x (0,1 U/ml) i 0,1 μM 5-karboksy-X-rodaminy (ROX) do probówki mikrowirówkowej PCR.
    Uwaga: Gorący start Taq DNA polimeraza 2x została użyta jako roztwór 2x skoncentrowany.
    1. Dodaj 5 μl wody bez nukleaz
      2. .
    2. Dodaj po 0,75 μl startera 10 μM do przodu i do tyłu, aby amplifikować gen CCS1 (AB086414) (do przodu: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' i odwrotnie: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Użyj starterów dla tubuliny jako genu utrzymania domu w oddzielnej reakcji (do przodu: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' i odwrotnie: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
    3. Dodaj 600 ng matrycy cDNA.
  2. Przeprowadzić reakcję amplifikacji w temperaturze 50 °C przez 2 minuty i w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Inkubować reakcję w systemie real-time PCR przez 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, w temperaturze 60 °C przez 30 s i w temperaturze 72 °C przez 30 s.
  3. Inkubować próbkę w temperaturze 50 °C przez 30 s i w temperaturze 20 °C przez 10 s.
  4. Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania PCR.
  5. Oblicz wyrażenie względne metodą 2-ΔΔCT opisaną przez Livaka i Schmittgena (2001)12.
    Uwaga: Przeanalizuj reakcję kontrolną, która zawiera wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy DNA (brak kontroli matrycy, NTC), aby odrzucić zanieczyszczone odczynniki lub dimery starterów amplifikacji.

7. Całkowity ekstrakt białkowy z zawiesin komórkowych C. arabica L.

  1. Zawiesiny komórek filtracyjnych pod próżnią za pomocą bibuły filtracyjnej o średnich porach.
  2. Zważ 1 g materiału komórkowego i zapakuj go w folię aluminiową.
    1. Zamrażać próbkę ciekłym azotem. Próbkę należy zmacerować w wysterylizowanym moździerzu porcelanowym, aby uzyskać drobny proszek.
  3. Przenieść próbkę do szklanej fiolki i dodać 2,5 ml buforu ekstrakcyjnego (400 mM chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) o pH 8,0, zawierającego 10 mM β-merkaptoetanolu, 5 mM Na2EDTA i 0,5% (w/v) askorbinianu sodu.
    1. Mieszać próbkę w mieszalniku wirowym przez 2 minuty
      Uwaga: Ważne jest, aby próbka była przechowywana na lodzie, aby zapobiec denaturacji białek.
  4. Odwirować próbkę o masie 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przenieść 500 μl podwielokrotności do fiolek kriogenicznych (2 ml). Próbki należy przechowywać w temperaturze -72 °C do czasu użycia.
  5. Zmierzyć stężenie białka w próbce przy długości fali 562 nm w spektrofotometrze, stosując test kwasu bicinchoninowego z albuminą surowicy bydlęcej jako wzorcem.

8. Test enzymatyczny dla syntazy kofeiny

  1. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce mikrowirówkowej zawierającej 200 μM SAM, 4,07 kBq metylu [3H]-SAM, 200 μM teobrominy, 200 μM MgCl2 i 5 μM kofeiny. Zwiększ objętość do 200 μl za pomocą 100 mM Tris-HCl przy pH 8,0.
  2. Trzymaj probówkę do mikrowirówki na lodzie i dodaj objętość frakcji rozpuszczalnej zawierającej 7-9 mg białka. Następnie wymieszać wirowo i inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C w łaźni termostatycznej/cyrkulatorze. W przypadku partii kilku próbek, każdą próbkę należy inkubować w dwóch egzemplarzach w okresach 1 minuty, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na zatrzymanie reakcji dla wszystkich próbek w dokładnym okresie 30 minut.
    1. Dodać 1 ml chloroformu, aby zatrzymać reakcję, a następnie wstrząsnąć próbką za pomocą mieszalnika wirowego. Potrząsać próbką za pomocą mieszalnika wirowego przez 3 minuty w celu usunięcia radioaktywnej kofeiny z rozpuszczalnika.
  3. Odwirować próbki o masie 11 000 x g przez 5 minut i ostrożnie odzyskać objętość 900 μl. Następnie przenieść próbki do fiolek scyntylacyjnych.
  4. Odparować chloroform do całkowitego wyschnięcia w okapie w temperaturze pokojowej 25 °C. Dodać 5 ml płynu scyntylacyjnego do fiolki i wymieszać próbkę.
  5. Przeanalizuj radioaktywność zawartą w kofeinie w liczniku scyntylacyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakty kofeiny uzyskane w przedstawionym tutaj procesie zostały przeanalizowane za pomocą gęsto-densytometrii TLC, poddając próbki chromatografii płytkowej zgodnie ze schematem pokazanym w Rysunek 1. Aby określić ilościowo poziomy kofeiny w ekstraktach komórkowych, użyto krzywej z różnymi stężeniami standardu handlowego dla tego związku (Rysunek 2A). Wzorzec absorbancji kofeiny analizowano w widmie światła widzialnego (UV-VIS) przy użyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj optymalne warunki do oceny zawartości kofeiny, aktywności CS i poziomów transkryptów w kulturze tkanek roślinnych in vitro, takich jak zawiesiny komórkowe C. arabica. Wcześniejsze doniesienia potwierdziły, że utrzymywanie komórek w warunkach lekkiego napromieniania i w obecności teobrominy w pożywce hodowlanej jest odpowiednim parametrem do zwiększenia poziomu kofeiny, co umożliwia ocenę metod rozdzielania kofeiny za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca naszego laboratorium została sfinansowana z grantu od Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) dla SMTHS. Badania te były również wspierane przez stypendium przyznane RJPK (nr 37938) przez CONACyT i Sistema Nacional de Investigadores (4422). Autorzy dziękują firmie CIATEJ za wykorzystanie jej instalacji podczas pisania tego manuskryptu. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Víctora Manuela Gonzáleza Mendozy za wszystkie zalecenia w sekcji biologii molekularnej oraz Valentína Mendozy Rodrígueza, IFC, UNAM za udogodnienia podczas kręcenia tego artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Murashige & Skoog Mieszanina soli bazowejLaboratoria fitotechnologiczneM524Wielkość opakowania: 50 L
Odczynnik (mg/L)
Azotan amonu (1650)
Kwas borowy (6.2)
Chlorek wapnia, bezwodny (322,2)
Chlorek kobaltu i byk; H2O (0,025)
Siarczan miedzi i byk; 5H2O (0,025)
Na2EDTA• 2H2O (37.26)
Siarczan żelazawy• 7H2O (27,8)
Siarczan magnezu, bezwodny (180,7)
Siarczan manganu• H2O (16,9)
Kwas molibdenowy (sól sodowa) i byk; 2H2O (0,25)
Jodek potasu (0,83)
Azotan potasu (1900)
Fosforan potasu, jednozasadowy (170)
Siarczan i byk; 7H2O (8,6)
Uzupełniony
mio-inozytolem (100)
tiaminą (10)
cysteiną (25)
sacharozą (30000)
kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (3)
puryna 6-benzyloaminowa (1)
KofeinaSIGMAC0750-5GSTANDARD-5g
TeobrominaSIGMAT450020 g
Skaner TLC CAMAG-4Oprogramowanie CAMAG27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager OprogramowanieCAMAG1.4.10
Alkohol izoamylowy (24:1)SIGMAC-0549500 ml
CykloheksanJALMEXC4375-131 L
AcetonJ.T. BAKER4 L
MetanolJ.T. BAKER9093-034 L
ChloroformJALMEXC-4425-153,5 l
żel krzemionkowy TLC 60 F254Merck1.05554.0001Płytka TLC
i beta;-merkaptoetanolM6250SIGMA100 mL
(+)-sodu L-askorbinianA4034SIGMA100 g
Baza TrizmaSIGMAT60661 Kg
Kwas solny 36,5-38%J.T. Baker9535-052,5 l
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAdo 232227Thermo scientificMethyl
[3H]-S-adenozylometioninaPerkin ElmerNET155Specyficzna aktywność 15 Ci/mmol
Fiolki do płynnego scyntylacjiSIGMAZ253081
Termostatyczna kąpiel/cyrkulatorCole Parmer60714
MikroprobówkawirówkowaEppendorfProbówka z
fiolkami kriogenicznymiHeathrow ScientificHS23202AWirówka 2 ml
5804Eppendorf5804 000925
Vortex ThermolyneLR 5947
Moździerz porcelanowyFisherbrandFB961B
Bibuła filtracyjnaWhatmanZ274844Porowatość
PicofugeStratagene4005502000 x g
Waga analitycznaANDHR-120Model HR-120
Licznik scyntylacyjnyBeckman Coulter6500
Żelowy system dokumentacji fotograficznejBio-RadChemic XRSModel Chemic XRS
Kompaktowa lampa UVUVP95002112UVGL-25
Scienceware HDPE Lejek BuchneraMieszalnik SIGMA2419907Typ 37600
Odczynnik TRIzolThermo scientific15596-018200 mL
ReverdAid Odwrotna transkryptazaThermo scientific#EP044110000 U
Oligo (dT)18 podkładThermo scientific#S0131100 µ M
DNaza I, bez RNazThermo scientific#EN05251000 U
Chlorek magnezuThermo scientificEN05251,25 mL
Kwas etylenodiaminotetraoctowyThermo scientificEN05251 mL
dNTP mixThermo scientificR0191R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)Thermo scientificK0251Na 200 reakcji 25 &mikro; L
PikoRealThermo scientific2.2Oprogramowanie
Fenol, pH 8,0, zrównoważony, klasa biologii molekularnej, ultraczystyUSBJ75829100 ml
alkoholu izopropylowegoKaral20401 l
alkoholu etylowegoSIGMA641751 l
pirowęglan dietyluSIGMAD5758100 ml
Rotator laboratoryjnyLW Mod. Naukowy Zobacz materiał LW210
900643 Zestaw 1,5 ml

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
  2. Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
  3. Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
  4. Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
  5. De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
  6. Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
  7. Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
  8. Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
  9. Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
  10. Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
  11. Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
  12. Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
  14. Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
  15. Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
  16. Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
  17. Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
  18. Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Caffeine ExtractionEnzymatic ActivityGene ExpressionCaffeine SynthasePlant Cell SuspensionsTLC DensitometryRNA IsolationReal Time PCRScintillation CounterProtein Assay

Powiązane artykuły