Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Summary

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Abstract

Triterpeny są jedną z największych i najbardziej zróżnicowanych strukturalnie rodzin naturalnych produktów roślinnych. Wykazano, że wiele pochodnych triterpenów posiada medycznie istotną aktywność biologiczną. Jednak do tej pory potencjał ten nie przełożył się na mnogość leków pochodzących z triterpenów w klinice. Jest to prawdopodobnie (przynajmniej częściowo) konsekwencja ograniczonego praktycznego dostępu do syntezy tej klasy związków, problemu, który może zdławić eksplorację zależności struktura-aktywność i rozwój głównych kandydatów przez tradycyjne przepływy pracy chemii medycznej. Pomimo swojej ogromnej różnorodności, wszystkie triterpeny pochodzą z jednego liniowego prekursora, 2,3-oksydoskwalenu. Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w N. benthamiana może przekierować endogenne zapasy 2,3-oksydoskwalenu w kierunku produkcji nowych, wysokowartościowych produktów triterpenowych, które nie są naturalnie wytwarzane przez tego gospodarza. Agroinfiltracja jest skutecznym i prostym sposobem na osiągnięcie przejściowej ekspresji u N. benthamiana. Proces ten polega na infiltracji liści roślin zawiesiną Agrobacterium tumefaciens niosącą interesujący nas konstrukt ekspresyjny. Jednoczesna infiltracja dodatkowego szczepu A. tumefaciens przenoszącego konstrukt ekspresyjny kodujący enzym, który zwiększa podaż prekursorów, znacznie zwiększa plony. Po upływie pięciu dni naciekany materiał liściowy można zebrać i przetworzyć w celu ekstrakcji i wyizolowania powstałego produktu (produktów) triterpenowego. Jest to proces, który jest liniowo i niezawodnie skalowalny, po prostu poprzez zwiększenie liczby roślin użytych w eksperymencie. W niniejszym artykule opisano protokół szybkiej produkcji triterpenów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej roślinnej platformy. Protokół wykorzystuje łatwe do odtworzenia urządzenie do infiltracji próżniowej, które pozwala na jednoczesną infiltrację do czterech roślin, umożliwiając infiltrację partii setek roślin w krótkim czasie.

Introduction

Triterpeny są jedną z największych i najbardziej zróżnicowanych strukturalnie rodzin naturalnych produktów roślinnych. Pomimo ich ogromnej różnorodności, uważa się, że wszystkie naturalne produkty triterpenowe pochodzą z tego samego liniowego prekursora 2,3-oksydoskwalenu, produktu szlaku mewalonianu w roślinach. Cyklizacja 2,3-oksydoskwalenu jest inicjowana i kontrolowana przez rodzinę enzymów zwanych cyklazami oksydoskwalenu (OSC). Ten etap cyklizacji reprezentuje pierwszy poziom dywersyfikacji, z setkami różnych rusztowań triterpenowych zgłoszonych przez nature¹. Rusztowania te są dodatkowo zróżnicowane poprzez dostosowanie enzymów, w tym między innymi cytochromu p450 (CYP450s)^1,2. Takie szlaki biosyntezy mogą prowadzić do ogromnej złożoności, czasami prowadząc do powstania produktów końcowych, które są ledwo rozpoznawalne z macierzystego triterpenu. Na przykład uważa się, że złożona struktura silnego środka owadobójczego i przeciw paszczemu limonoidowi azadirachtyny wywodzi się z tetracyklicznego triterpenu typu tirucallane³.

Wiele naturalnych produktów pochodzących z triterpenów, nawet tych z stosunkowo niezmodyfikowanymi rusztowaniami macierzystymi, okazało się posiadać medycznie istotną aktywność biologiczną^4,5,6,7. Jednak do tej pory potencjał ten nie przełożył się na mnogość leków pochodzących z triterpenów w klinice. Jest to prawdopodobnie (przynajmniej częściowo) konsekwencja ograniczonego praktycznego dostępu do syntezy tej klasy związków, problemu, który może zdławić eksplorację zależności struktura-aktywność i rozwój głównych kandydatów przez tradycyjne przepływy pracy chemii medycznej.

Przejściowa ekspresja enzymów biosyntezy triterpenów z innych gatunków roślin w liściach N. benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydosqualenu w kierunku produkcji nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości (Rysunek 1). Proces ten można wykorzystać do funkcjonalnego scharakteryzowania enzymów kandydujących i zrekonstruowania szlaków biosyntezy ważnych naturalnie występujących metabolitów. Równocześnie można go również wykorzystać w kombinatorycznych podejściach biosyntezy do wytwarzania nowych produktów triterpenowych, strategii, która może zaowocować bibliotekami strukturalnie powiązanych analogów, umożliwiając systematyczne badanie zależności struktura-aktywność biologicznie aktywnych związków ołowiu^8,9.

Agroinfiltracja jest skutecznym i prostym sposobem na osiągnięcie przejściowej ekspresji w liściach N. benthamiana. Proces ten polega na infiltracji liści zawiesiną A. tumefaciens przenoszącą interesujący nas konstrukt (konstrukty) wyrażeń binarnych. Osiąga się to poprzez zastosowanie ciśnienia, które przetłacza ciecz przez aparaty szparkowe, wypierając powietrze w przestrzeni międzykomórkowej i zastępując je zawiesiną A. tumefaciens. Bakterie przenoszą odpowiednie T-DNA do wnętrza komórek roślinnych, co powoduje zlokalizowaną i przejściową ekspresję białka w infiltrowanej tkance liścia.

Podczas gdy dowolny wektor binarny odpowiedni do generowania roślin transgenicznych może być wykorzystany do ekspresji przejściowej, używamy systemu ekspresji białka hipertranslacyjnego (HT) pochodzącego z wirusa mozaiki cowpea (CPMV)^10,11. W tym systemie interesujący gen jest otoczony przez regiony nieulegające translacji (UTR) z RNA-2 CPMV. 5' UTR zawiera modyfikacje skutkujące bardzo wysokimi poziomami translacji białek bez polegania na replikacji wirusa¹². Technika ta została opracowana w serii wektorów binarnych Easy-And-Quick (pEAQ), która zawiera konstrukcje kompatybilne z protokołem klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca (pEAQ-HT-DEST)^10,11. Większość wektorów pEAQ zawiera również krzaczasty gen tłumiący P19 pochodzący z wirusa karłowatości pomidorów¹³ w części T-DNA kasety ekspresji, co omija potrzebę jednoczesnej filtracji oddzielnego szczepu przenoszącego P19 i zapewnia bardzo wysoką ekspresję białka w komórce rośliny gospodarza^10,11.

Użycie N. benthamiana jako gospodarza wyrażenia ma szczególne zalety podczas pracy z roślinnymi szlakami biosyntezy. Architektura komórki wewnętrznie wspiera odpowiednie przetwarzanie mRNA i białek oraz prawidłową kompartmentalizację, a także posiada niezbędne koenzymy, reduktazy (dla CYP450) i prekursory metaboliczne. Źródłem węgla jest fotosynteza; w ten sposób rośliny można po prostu uprawiać w dobrej jakości kompoście, wymagając jedynie wody, CO₂ (z powietrza) i światła słonecznego jako wkładu. Platforma jest również niezwykle wygodna do jednoczesnej ekspresji różnych kombinacji białek, ponieważ można to łatwo osiągnąć poprzez jednoczesną infiltrację różnych szczepów A. tumefaciens, negując potrzebę budowania dużych kaset ekspresji wielogenowej. Co więcej, proces ten można skalować liniowo i niezawodnie po prostu poprzez zwiększenie liczby roślin użytych w eksperymencie.

Poprzednie prace w naszym laboratorium wykazały użyteczność tej platformy do eksperymentów na skalę preparatywną. Obejmowało to przygotowanie nowych triterpenów do stosowania w testach bioaktywności i zwiększenie skali w celu uzyskania ilości gramowych wyizolowanego produktu. Co więcej, akumulacja heterogenicznych produktów triterpenowych może być kilkakrotnie zwiększona przez koekspresję N-końcowej, niewrażliwej na sprzężenie zwrotne formy reduktazy 3-hydroksy, 3-metyglutary-koenzymu A (tHMGR), enzymu ograniczającego szybkość w szlaku mewalonianu8.

Kluczem do takich eksperymentów na skalę preparatywną jest możliwość wygodnego zwiększenia skali procesu infiltracji. W typowym eksperymencie do osiągnięcia docelowej ilości wyizolowanego produktu mogą być potrzebne dziesiątki do setek roślin. Ręczna infiltracja pojedynczych liści (przy użyciu niepotrzebnej strzykawki) jest wymagająca operacyjnie i często zbyt czasochłonna, co sprawia, że ta metoda jest niepraktyczna w przypadku rutynowego zwiększania skali. Infiltracja próżniowa ma przewagę nad infiltracją ręczną, ponieważ nie jest zależna od poziomu umiejętności operatora i pozwala na infiltrację większego obszaru powierzchni skrzydła. Procedura ta jest stosowana komercyjnie do produkcji białek farmaceutycznych na dużą skalę¹⁴. Protokół ten wykorzystuje łatwe do odtworzenia urządzenie do infiltracji próżniowej, które można skonstruować z dostępnych na rynku części. Pozwala to na jednoczesną infiltrację do 4 roślin, zapewniając szybką i praktyczną infiltrację partii setek roślin w krótkim czasie (Rysunek 2a - 2b). Aparat do infiltracji próżniowej składa się z pieca próżniowego, który tworzy komorę infiltracyjną (Rysunek 2f). Piekarnik jest podłączony do pompy za pomocą zbiornika próżniowego. To znacznie skraca czas potrzebny do osiągnięcia pożądanej próżni w komorze infiltracyjnej. Rośliny są zabezpieczane w specjalnie do tego celu uchwycie i odwracane do 10-litrowej kąpieli wodnej ze stali nierdzewnej wypełnionej zawiesiną A. tumefaciens (Rysunek 2a - 2c). Całkowite zanurzenie nadziemnych części roślin jest ważne dla skutecznej infiltracji. Kąpiel wodna jest następnie umieszczana w komorze infiltracyjnej (Rysunek 2d - 2e), a podciśnienie jest stosowane w celu wyciągnięcia powietrza z przestrzeni śródmiąższowych liści. Po obniżeniu ciśnienia o 880 mbar (proces ten trwa około 1 minuty) komora infiltracyjna jest szybko przywracana do ciśnienia atmosferycznego w ciągu 20 - 30 s poprzez otwarcie zaworu wlotowego pieca, po czym infiltracja jest zakończona.

Pięć dni po infiltracji materiał roślinny jest gotowy do zbioru, a następnie ekstrakcji i izolacji pożądanego produktu(ów). Od tego momentu proces ten polega po prostu na ekstrakcji i oczyszczaniu produktu naturalnego z materiału liściowego, co jest procesem znanym każdemu chemikowi zajmującemu się produktami naturalnymi. Istnieje wiele różnych metod wstępnej ekstrakcji i późniejszego oczyszczania¹⁵. Najbardziej odpowiedni wybór metod i dokładnych zastosowanych warunków zależy w dużym stopniu od szczególnych właściwości chemicznych związku będącego przedmiotem zainteresowania, a także od dostępności umiejętności i/lub sprzętu. Nie jest możliwe włączenie do niniejszego protokołu w pełni uogólnionej, krok po kroku metody dalszego przetwarzania zebranego materiału z liści roślin na wyizolowany produkt, która mogłaby być ślepo stosowana w odniesieniu do jakiegokolwiek produktu triterpenowego będącego przedmiotem zainteresowania, ani też nie byłoby właściwe podejmowanie takich prób. Jednak protokół ten zapewni przegląd podstawowego przepływu pracy stosowanego w naszym laboratorium oraz niektórych metod na wczesnych etapach procesu, które z naszego doświadczenia okazały się możliwe do uogólnienia dla większości utlenionych produktów triterpenowych z aglikonu. Obejmuje to dwie stosunkowo rzadkie techniki, a mianowicie ekstrakcję rozpuszczalnikiem pod ciśnieniem (PSE) oraz wygodną metodę usuwania chlorofilu w fazie heterogenicznej przy użyciu silnie zasadowej żywicy jonowymiennej.

PSE to wysoce efektywna technika ekstrakcji małych cząsteczek organicznych z matryc stałych. Ekstrakcje odbywają się pod ciśnieniem (ok. 100 - 200 bar), a główną zaletą jest możliwość stosowania temperatur złagodzonych, które przekraczają temperaturę wrzenia rozpuszczalnika ekstrakcyjnego. Może to znacznie skrócić czas i ilość rozpuszczalnika wymaganego do osiągnięcia wyczerpującej ekstrakcji, w porównaniu z innymi technikami gorących rozpuszczalników, takimi jak prosty refluks lub ekstrakcja Soxhleta¹⁶. Dostępne są komercyjne stacjonarne urządzenia PSE, które wykorzystują wymienne cele ekstrakcyjne oraz zautomatyzowaną obsługę, podgrzewanie i monitorowanie rozpuszczalników. To sprawia, że ta technika jest niezwykle wygodna. Jest również prawdopodobnie mniej niebezpieczny, szczególnie dla operatorów z ograniczonym doświadczeniem w dziedzinie chemii praktycznej.

Zmydlenie surowych ekstraktów z liści pod refluksem, a następnie podział ciecz/ciecz jest powszechną techniką masowego usuwania chlorofilów przed późniejszym oczyszczaniem lub analizą. Jednak w przypadku większych skal może to być często wymagające pod względem operacyjnym. Ponadto wykrycie granicy faz lub strat produktu spowodowanych tworzeniem się emulsji może być problematyczne. Zastosowanie silnie zasadowych żywic jonowymiennych do przeprowadzenia hydrolizy fazy heterogenicznej może służyć jako wygodna alternatywa. Pigmentowana część hydrolizowanego chlorofilu pozostaje przyklejona do żywicy i może być łatwo usunięta przez filtrację. Protokół ten wykorzystuje adaptację skali preparatywnej wcześniej opisanej procedury analitycznej¹⁷, która wykorzystuje dostępną na rynku podstawową żywicę jonowymienną.

Poniżej opisujemy szczegółowy i szybki protokół do produkcji triterpenów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej platformy opartej na roślinach. Protokół ten jest rutynowo stosowany w naszym laboratorium do przygotowania dziesiątek do setek miligramów wyizolowanego produktu triterpenowego do zastosowań takich jak charakterystyka strukturalna za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i/lub dalszych badań w testach funkcjonalnych.

Protocol

Uwaga: Zanim zastosujesz się do tego protokołu, zapoznaj się z danymi dotyczącymi bezpieczeństwa materiałów dla wszystkich używanych substancji i podejmij odpowiednie środki ostrożności. Należą do nich między innymi: noszenie okularów ochronnych podczas pracy ze szkłem w próżni oraz obchodzenie się z suchym żelem krzemionkowym w dygestorium. Istotne jest również, aby lokalne przepisy dotyczące pracy z materiałem transgenicznym były sprawdzane i przestrzegane, w tym przestrzeganie odpowiednich procedur ograniczających rozprzestrzenianie się wirusa.

1. Generuj szczepy A. tumefaciens do infiltracji

Uwaga: Udostępniamy tutaj uproszczony opis kroków wymaganych do wygenerowania odpowiednich szczepów A. tumefaciens do przejściowej ekspresji. Dalsze szczegóły tych kroków są opisane przez Sainsbury i wsp.⁸.

1. Amplifikować metodą PCR lub zsyntetyzować region kodujący białko genu będącego przedmiotem zainteresowania, otoczony sekwencjami 5' i 3' attB odpowiednimi do wygenerowania klonu wejściowego do użycia z protokołem klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca^18,19.
   1. Użyj startera do przodu: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN, Starter odwrotny: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = sekwencja specyficzna dla sekwencji).
   2. Warunki użycia (reprezentatywne) PCR: Mieszanina reakcyjna (25 μL, ogółem), bufor (5x, 5 μL, patrz Tabela Materiałów), dNTPs (10 mM, 0,5 μL), Starter do przodu (10 μM, 1,25 μL), Starter odwrócony (10 μM, 1,25 μL), Matrycowy DNA (zmienne stężenie, 50 – 250 ng, 0,5 μL), polimeraza DNA (2000 U/mL, 0,25 μL, patrz Tabela Materiałów), Woda wolna od nukleaz (do 25 μL). Uruchomić termocykler w następujący sposób: początkowa denaturacja (98 °C, 30 s); cykl startowy (98 °C, 30 s; 45 – 72 °C, 20 s; 72 °C, 30 s/kb) cykl końcowy; 35 cykli; końcowe przedłużenie (72 °C, 10 min).
   3. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem klonowania rekombinacji specyficznej dla witryny^18,19, aby wygenerować klon wejściowy przy użyciu dowolnego wektora wejściowego nieopartego na kanamycynie (używamy pDONR207, który jest dostępny na rynku).
      nuta: Integralność klonu wejściowego powinna zostać potwierdzona przez sekwencjonowanie przed użyciem do wygenerowania konstrukcji wyrażenia pEAQ-HT-DEST1. pEAQ-HT-DEST1 jest dostępny na życzenie w laboratorium Lomonossoff w John Innes Centre w Norwich w Wielkiej Brytanii.
   4. Wyizolować wektor pEAQ-HT-DEST1 z klonu wyrażenia wygenerowanego w kroku 1.1.3 i przechowywać w temperaturze -20 °C przed użyciem w kroku 1.3.
      nuta: Odpowiedni jest każdy dostępny na rynku, wygodny zestaw do oczyszczania plazmidów oparty na kolumnie wirowej, przeznaczony do ekstrakcji plazmidów z klonowanych szczepów E. coli. Postępuj zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami wybranego zestawu do oczyszczania plazmidu (patrz Tabela materiałów).
2. Przygotować chemicznie kompetentne A. tumefaciens do transformacji.
   1. Zaszczepić selektywną płytkę agarową LB (pożywka Luria-Bertani: 10 g/l bakto-tryptonu, 10 g/l NaCl i 5 g/l ekstraktu drożdżowego, agar 10 g/l pH 7,0) (50 μg/ml ryfampicyny, 100 μg/ml streptomycyny), poprzez smugowanie A. tumefaciens LBA4404 z kultury glicerolu. Inkubować przez noc w temperaturze 28 °C w inkubatorze stojącym.
   2. Zaszczepić 50 ml selektywnej płynnej pożywki LB (50 μg/ml ryfampicyny, 100 μg/ml streptomycyny) próbką komórek LBA4404 A. tumefaciens z kroku 1.2.1. Inkubować przez noc w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   3. Schłodzić kulturę z etapu 1.2.2 na lodzie przez 10 minut, a następnie osadzać komórki A. tumefaciens przez odwirowanie w temperaturze 4 °C i 4500 x g przez 5 minut (odrzucić supernatant).
   4. Zawiesić osad z etapu 1.2.3 w 1 ml lodowatego roztworu wodnego CaCl₂ o stężeniu 20 mM i powtórzyć etap wirowania od kroku 1.2.3 (odrzucić supernatant).
   5. Zawiesić osad z etapu 1.2.4 w 1 ml lodowatego roztworu wodnego CaCl₂ o stężeniu 20 mM i podzielić otrzymaną zawiesinę na partie o objętości 50 μl. Porcje należy błyskawicznie zamrozić w płynie N₂ i przechowywać w temperaturze -80 °C przed użyciem.
3. Przekształć przygotowane LBA4404 A. tumefaciens za pomocą wyizolowanego wektora pEAQ-HT-DEST1 wygenerowanego w kroku 1.2.
   1. Rozmrozić 50 μl zawiesiny A. tumefaciens wytworzonej w kroku 1.2 na lodzie i inkubować z 100 –200 ng wyizolowanego wektora pEAQ-HT-DEST1, wygenerowanego w kroku 1.1, w temperaturze 0 °C przez 5 minut.
   2. Wstrząs termiczny inkubowaną zawiesinę z etapu 1.3.1 w cieczy_N2 przez 30 s, a następnie pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.
   3. Dodać 200 μl pożywki SOC (SOC: 20 g/l bakto-tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,58 g/l NaCl, 0,19 g/l KCl, 2,03 g/l MgCl₂, 2,46 g/l 7-hydratu siarczanu magnezu, 3,6 g/l glukozy) do zawiesiny szokowej na zimno z etapu 1.3.2 i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   4. Zaszczepić selektywną płytkę agarową LB (50 μg/ml ryfampicyny, 50 μg/ml kanamycyny, 100 μg/ml streptomycyny) kulturą SOC z kroku 1.3.3. Dokładnie rozprowadzić i inkubować przez 3 dni w temperaturze 28 °C w inkubatorze stojącym.
   5. Zaszczepić 5 ml selektywnej pożywki LB (50 μg/ml ryfampicyny, 50 μg/ml kanamycyny, 100 μg/ml streptomycyny) pojedynczą kolonią z kroku 1.3.4. Inkubować przez noc w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   6. Dodać 200 μl glicerolu do 1 ml płynnej kultury z kroku 1.3.5, dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      nuta: Kultura ta może zostać ożywiona do przyszłych eksperymentów poprzez smugowanie na płytkach agarowych LB odpowiednimi antybiotykami (opisanymi poniżej).

2. Przygotuj zawieszenie infiltracji

1. Zaszczepić selektywną płytkę agarową LB smugami pożądanych szczepów A. tumefaciens z kultur wyjściowych glicerolu wytworzonych w kroku 1. Inkubować przez noc w temperaturze 28 °C w inkubatorze stojącym.
   nuta: Można również uwzględnić szczep przenoszący tHMGR w wektorze pEAQ-HT-DEST1.
   1. Indywidualnie zaszczepić 50 ml selektywnej pożywki LB próbką każdego szczepu A. tumefaciens wyhodowanego w kroku 2.1 i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   2. Indywidualnie przenieść 50 ml kultur z etapu 2.1.1 do 1000 ml selektywnych pożywek LB (ryfampicyna 50 μg/ml, kanamycyna, 50 μg/ml streptomycyna 100 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   3. A. tumefaciens należy oddzielnie osadzać przez odwirowanie (4000 x g) z płynnych kultur wytworzonych w kroku 2.1.2 (odrzucić supernatant).
   4. Zawiesić ponownie granulki z etapu 2.1.3 w 50 ml świeżo przygotowanego buforu MMA (bufor MMA: 10 mM kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy, pH 5,6 (KOH), 10 mM MgCl₂, 150 μM 3'5'-dimetoksy-4'-acetofenon) i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.
   5. Połączyć odpowiednią objętość każdej zawiesiny MMA A. tumefaciens (wygenerowanej w kroku 2.1.4), aby uzyskać końcową OD₆₀₀ wynoszącą co najmniej 0,2 dla każdego szczepu w całkowitej objętości końcowej 10 l.
   6. Dodać dodatkowy bufor MMA do połączonych zawiesin wygenerowanych w kroku 2.1.5 do końcowej objętości 1 l (użyć natychmiast w kroku 3).
      nuta: Wskazane jest przygotowanie dodatkowych 2 l zawiesiny infiltracyjnej w celu utrzymania poziomu cieczy podczas procesu infiltracji.
   7. Przygotuj 1 l buforu MMA o sile 10x.

3. Wykonaj infiltrację próżniową

Uwaga: Zobacz Rysunek 2 dla opisu budowy aparatu do infiltracji próżniowej. Do kolejnych kroków użyj 5-tygodniowych sadzonek N. benthamiana w doniczkach o wymiarach 9 cm x 9 cm. Sadzonki należy wysiewać w kompoście F1 (np. z Levington) i uprawiać przez 2 tygodnie przed przeniesieniem do pojedynczych doniczek zawierających kompost F2. Rośliny powinny być uprawiane w szklarni w temperaturze 25 °C, z 16 godzinami światła dziennie (w razie potrzeby należy używać dodatkowego oświetlenia), codziennie podlewać, maksymalna gęstość 100 roślin/^{m 2}.

1. Przenieść 1 l zawiesiny infiltracyjnej wytworzonej w kroku 2 i 1 l buforu MMA o sile 10 razy do kąpieli infiltracyjnej, a następnie dodać dodatkowe 8 l wody.
   1. Zdejmij zdejmowane skrzydła z wykonanego na zamówienie uchwytu na rośliny, włóż 4 rośliny (5-tygodniowe rośliny patrz poprzednia uwaga) i ponownie przymocuj skrzydła. Odwrócić uchwyt i umieścić na kąpieli infiltracyjnej tak, aby zanurzyć liście w zawiesinie infiltracyjnej.
      nuta: Upewnij się, że poziom zawieszenia sięga górnej powierzchni uchwytu na rośliny. W razie potrzeby podnieś poziom, dodając dodatkowe zawieszenie infiltracji.
   2. Przenieść wannę rozsączającą z zanurzonymi roślinami do komory rozsączającej i zamknąć drzwiczki. Upewnij się, że zawór wlotu powietrza na infiltratorze jest zamknięty. Włącz pompę próżniową i otwórz zawór liniowy do zbiornika próżniowego, a następnie zawór wlotowy podciśnienia w komorze infiltracyjnej.
   3. Gdy ciśnienie w komorze rozsączającej zmniejszy się o 880 mbar, zamknij zawór wlotu podciśnienia i otwórz zawór wlotu powietrza. Gdy komora infiltracyjna powróci do ciśnienia atmosferycznego, otwórz drzwi i wyjmij wannę rozsączającą.
   4. Podnieś uchwyt na rośliny, aż rośliny nie będą już zanurzone w zawiesinie infiltracyjnej, a następnie delikatnie potrząśnij uchwytem, aby nadmiar zawiesiny spłynął z liści z powrotem do kąpieli infiltracyjnej.
   5. Przywróć uchwyt do pozycji pionowej, zdejmij odłączane skrzydełka i usuń rośliny.
   6. Powtarzaj kroki od 3.1.1 do 3.1.5, aż do uzyskania pożądanej liczby roślin.
   7. Zużytą zawiesinę infiltracyjną należy złożyć w autoklawie przed usunięciem.
   8. Kąpiel infiltracyjną należy przelać w autoklawie przed ponownym użyciem w kolejnych eksperymentach.
   9. Wysterylizuj wnętrze komory infiltracyjnej, czyszcząc ją 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przed ponownym użyciem w kolejnych eksperymentach.

4. Uprawiaj infiltrowane rośliny

1. Ułóż infiltrowane rośliny z kroku 3 w maksymalnej gęstości 100 roślin/^m2 w szklarni.
2. Uprawiaj przez 5 dni w temperaturze 25 °C i 16 godzin światła dziennie (w razie potrzeby używaj dodatkowego oświetlenia) i podlewaj codziennie.

5. Zbierz przeniknięte liście

1. Po 5 dniach wzrostu zbierz liście.
2. Autoklaw odpadów roślinnych, doniczek i gleby przed utylizacją.

6. Wysuszyć zebrane liście

Uwaga: Dokładna procedura liofilizacji opisana poniżej zależy od charakteru dostępnego aparatu do liofilizacji.

1. Liofilizuj zebrane liście aż do wyschnięcia.
   1. Zebrane liście umieść w polipropylenowej torbie o grubości 2 mm. Zebrane liście należy zamrozić, przechowując w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez 30 minut.
   2. Dziurawij torbę z wieloma małymi otworami za pomocą szpilki. Umieść zamrożone liście w workach w centralnej komorze liofilizatora. Upewnij się, że wszystkie krany nasadki kolby są zamknięte, a następnie włącz liofilizator. Upewnij się, że skraplacz osiągnie temperaturę co najmniej -50 °C, a ciśnienie spadnie do co najmniej 0.15 mbar, a następnie pozostaw na noc.
   3. Wyłączyć liofilizator i odpowietrzyć podciśnienie, otwierając kran nasadki kolby. Usuń wysuszone liście z centralnej komory i przejdź do kroku 7.

7. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem pod ciśnieniem

Uwaga: Kolejne kroki odnoszą się do użycia dostępnego na rynku instrumentu PSE (patrz Tabela Materiałów). Proszę zapoznać się z literaturą producenta w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat działania. Przyrząd przeprowadza równolegle 4 ekstrakcje.

1. Zmiel suszone liście na proszek kursowy za pomocą wygodnej metody (np. w przypadku większości interesujących związków triterpenowych użyj domowego robota kuchennego lub ręcznie zmiażdż liście, gdy znajdują się w torbie).
   nuta: Mielenie tłuczkiem i moździerzem pod ciekłym azotem zwykle nie jest konieczne.
   1. Wymieszaj proszek liściowy z piaskiem kwarcowym (0,3 \u2012 0,9 mm, 20% objętości) w odpowiednim pojemniku; działa to jako dyspergator i poprawia wydajność procesu ekstrakcji.
2. Przygotuj 4 komórki ekstrakcyjne (120 ml) do napełnienia. W tym celu odwróć komórki ekstrakcyjne i włóż filtr z włókna szklanego, a następnie metalową frytę i zatyczkę przytrzymującą. Ustaw komórki ekstrakcyjne w pozycji pionowej i dodaj warstwę piasku kwarcowego o głębokości 1 cm (0,3 \u2012 0,9 mm).
3. Wypełnij komórki ekstrakcyjne.
   1. Wypełnić komórki ekstrakcyjne przygotowanym proszkiem liściowym wytworzonym w kroku 7.1 aż do linii napełniania. W razie potrzeby delikatnie ściśnij proszek podczas tego procesu, aby ułatwić dodanie większej ilości w każdej komórce ekstrakcyjnej.
   2. Dodaj niewielką warstwę piasku kwarcowego (0,3 \u2012 0,9 mm) na wierzch zapakowanego proszku i włóż górny filtr celulozowy.
   3. Włóż wypełnione komórki ekstrakcyjne do przyrządu PSE i uruchom żądaną metodę. Użyj następujących ustawień i materiałów; Rozpuszczalnik: 100% octan etylu; temperatura: 100 °C, ciśnienie: 130 bar. Uruchom 3 cykle w następujący sposób: cykl 1: czas podtrzymania 0 min, cykl 2 i 3: czas podtrzymania 5 min, zakończony 2-minutowym płukaniem rozpuszczalnikiem i 12-minutowym płukaniem azotem gazowym.
      nuta: Wskazane jest, aby najpierw zoptymalizować metodę ekstrakcji na małą skalę. Jednak następująca metoda jest często wystarczająca dla większości utlenionych aglikonów triterpenowych. Płyn z każdej komory ekstrakcyjnej może być łączony w tym samym zewnętrznym zbiorniku zbiorczym, określając linię kanalizacyjną jako miejsce docelowe ekstrakcji, zamiast standardowych indywidualnych linii odbioru. Należy pamiętać, że ilość użytego rozpuszczalnika zależy od upakowania komórek ekstrakcyjnych oraz ustawionej temperatury i ciśnienia. Powyższa metoda zwykle generuje około 800 ml płynu ekstrakcyjnego na 4 równoległe ekstrakcje.
   4. Powtarzać kroki od 7.2 do 7.3.3, aż całe sproszkowane liście zostaną przetworzone.
   5. Skoncentrować połączony płyn ekstrakcyjny do sucha, poprzez odparowanie rotacyjne w próżni. Sprawdzić oczekiwaną wydajność (tj. ciemnozieloną gnojowicę).
      nuta: Dokładna procedura może się różnić w zależności od konfiguracji dostępnego parownika obrotowego. Zawsze noś okulary ochronne podczas wykonywania odparowywania obrotowego i sprawdzaj szkło pod kątem uszkodzeń przed poddaniem go warunkom próżniowym.
      1. Włącz recykler agregatu chłodniczego i pozwól, aby ciecz przenosząca ciepło ostygła do co najmniej 5 °C. Włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 35 °C.
      2. Przenieść płyn ekstrakcyjny do kolby odparowującej (nie napełniać więcej niż połowę objętości kolby). Zagęścić partię płynu (w tej samej kolbie), jeśli całkowita objętość przekracza tę objętość. Przymocować napełnioną kolbę parownika do kanału parowego parownika obrotowego (zabezpieczyć klipsem łączącym).
      3. Wyregulować położenie i kąt podnoszenia kolby tak, aby zanurzyć dolną trzecią część kolby parownika w łaźni wodnej pod kątem około 45°. Uruchomić kolbę wirującą z prędkością, która zaczyna rozprowadzać płyn ekstrakcyjny po ściankach kolby.
      4. Upewnij się, że kurek odpowietrzający jest zamknięty i zacznij zmniejszać ciśnienie (za pomocą sterownika pompy próżniowej), aż zaobserwuje się umiarkowane kapanie między skraplaczem a kolbą odbiorczą.
         nuta: Nie pozwól, aby płyn ekstrakcyjny zaczął wrzeć. W takim przypadku zmniejsz siłę próżni, aby opanować destylację.
      5. Monitorować i odpowiednio regulować siłę podciśnienia i prędkość wirowania, aż cały rozpuszczalnik zostanie odparowany.

8. Podstawowa obróbka żywicą jonowymienną w celu usunięcia chlorofilów

Uwaga: Ilości podane w poniższych krokach przyjmują pierwotną skalę roboczą 100 \u2012 150 roślin. Krok 8 nie jest odpowiedni dla produktów zawierających grupy kwasów karboksylowych lub grupy funkcyjne, które uległyby hydrolizie w warunkach podstawowych, takich jak estry.

1. Rozpuścić surowy ekstrakt wytworzony w kroku 7 w minimalnej objętości etanolu.
2. Dodać 50 ml kulek żywicy jonowymiennej (patrz Tabela Materiałów) do wyjścia z kroku 7.1.1 i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 30 min.
   nuta: Nie zastępuj potrząsania użyciem aparatu do mieszania. Magnetyczne lub mechaniczne mieszanie nad głową może zagrozić integralności kulek żywicy. Odpowiednie mieszanie można również wygodnie osiągnąć poprzez powolne obracanie kolby reakcyjnej na wyparce obrotowej z podciśnieniem ustawionym na ciśnienie atmosferyczne lub odłączonym.
3. Dodawaj dodatkowe 50 ml kulek zasadowej żywicy jonowymiennej co 30 minut, aż reakcja przejdzie do zakończenia; kulki żywicy jonowymiennej zmienią kolor z różowego na zielony, a faza ciekła zmieni kolor z zielonego na pomarańczowy lub mętny brązowy w zależności od skali.
   1. W razie wątpliwości, czy reakcja przebiegła w sposób zakończony, należy pobrać próbkę z 0,5 ml cieczy. Przefiltrować próbkę przez małą kolumnę ziemi okrzemkowej i obserwować kolor filtratu; Reakcja przebiega zwykle w ciągu 1,5 godziny.
4. Przefiltrować mieszaninę reakcyjną przez krótką kolumnę ziemi okrzemkowej.
   1. Wykonać to poprzez filtrację próżniową lub za pomocą szklanej kolumny do chromatografii błyskawicznej przy użyciu miecha ręcznego do wywierania ciśnienia. Jeśli szybkość filtracji spada, narusz górną część podkładki z ziemią okrzemkową za pomocą pręta mieszającego. Zebrać filtrat.
5. Opłucz zebrane kulki żywicy etanolem, następnie 1:1 etanol:heksan, a na końcu heksan. Użyj objętości płukania wystarczającej do ponownego zawieszenia koralików na górze kolumny ziemi okrzemkowej.
6. Połączyć filtrat z kroku 8.4 i płukanie z kroku 8.5 i zagęścić do sucha przez obrotowe odparowanie w próżni.

9. Wstępne frakcjonowanie zgrubne

Uwaga: Następująca metoda jest zazwyczaj odpowiednia dla typowych utlenionych aglikonów triterpenowych i wykorzystuje zautomatyzowany instrument do chromatografii flash. Więcej informacji na temat obsługi można znaleźć w literaturze producenta.

1. Adsorbować surowy produkt wytworzony w kroku 8 na żelu krzemionkowym klasy flash (wielkość porów: 60 A, wielkość cząstek: 35 \u2012 75 μm) w celu nałożenia na kartridż chromatografii flash za pomocą metodologii suchego ładowania.
   1. Rozpuścić surowy produkt wytworzony w etapie 8 w minimalnej objętości odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego. Upewnij się, że całkowicie się rozpuścić.
      nuta: Dichlorometan z dodatkiem kilku kropel metanolu jest zwykle odpowiednim wyborem rozpuszczalnika.
   2. Odkręć górną część 100 g wstępnie napełnionego wkładu do chromatografii flash (patrz Tabela materiałów) i wyjmij wkładkę, aby odsłonić suchą przestrzeń głowicy załadowczej. Użyj przestrzeni nad głową, aby odmierzyć odpowiednią objętość żelu krzemionkowego do załadunku na sucho.
   3. Przenieść odmierzoną objętość żelu krzemionkowego do załadunku na sucho do roztworu produktu surowego, a następnie usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie obrotowe w próżni.
      Uwaga: Żel krzemionkowy powinien powrócić do sypkiego proszku. Pod koniec procesu parowania może być konieczne delikatne skrobanie w celu uwolnienia żelu krzemionkowego z boku kolby odparowującej.
   4. Zrównoważyć 100 g kartridż do chromatografii flash przy 100 ml/min z co najmniej 5 objętościami kolumny zawierającej 100% heksanu, ale najlepiej do momentu, gdy zawartość kartridża zostanie całkowicie i równomiernie zwilżona.
   5. Przenieść przygotowany na sucho ładujący żel krzemionkowy wytworzony w kroku 9.1.3 do suchej przestrzeni głowicy załadowczej 100 g z wyrównanym wkładem do chromatografii błyskawicznej, przez wlanie. Zawiesina w heksanie i pipeta z szerokim otworem mogą być używane do wspomagania przenoszenia pozostałego żelu krzemionkowego na sucho.
   6. Zwilż przenoszone złoże z żelu krzemionkowego do ładowania na sucho 100% heksanem, aby usunąć powietrze z suchej przestrzeni załadunkowej.
   7. Uruchom następującą metodę chromatograficzną: Rozpuszczalnik [A]: heksan, Rozpuszczalnik [B]: octan etylu, Natężenie przepływu: 100 ml/min, Gradient: od 0% [B] do 100% [B] powyżej 3000 ml, Zbieranie: Zbierz wszystko, Wielkość frakcji: 250 ml.
   8. Analizuj frakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)⁸ lub chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS)⁸, i zatężaj do wysuszenia frakcji (frakcji) zawierającej interesujący związek poprzez obrotowe odparowanie w próżni
   .
2. Przeprowadzić dokładne oczyszczanie końcowe, aż do osiągnięcia pożądanego poziomu czystości.
   nuta: Dalsze oczyszczanie dokładne jest całkowicie specyficzne dla związku i nie jest możliwe zapewnienie standardowych etapów (patrz sekcja dyskusji).

Results

Typowe izolowane wyniki zależą od badanej kombinacji enzym/enzym, stabilności chemicznej docelowego związku i tego, jak trudny był proces oczyszczania. Wcześniej informowaliśmy o izolowanych plonach pochodnych β-amyryny z naszych eksperymentów biosyntezy kombinatorycznej w zakresie od 0,12 do 3,87 mg na gram suchego proszku z liści N. benthamiana. Związki te różniły się znacznie pod względem stopnia utlenienia i zawierały nienaturalne kombinacje enzymów (Rysunek 3)⁸. Protokół ten jest rutynowo stosowany w naszym laboratorium do produkcji dziesiątek lub setek miligramów oczyszczonego produktu do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektroskopii NMR i dalszych testów funkcjonalnych. Wykazaliśmy również preparatywną użyteczność tej platformy, produkując 0,8 g rusztowania triterpenowego β-amyryny o czystości większej niż 98%. W tym eksperymencie wykorzystano 459 roślin i przedstawiono izolowany plon 3,3 mg na gram suchego proszku z liści N. benthamiana⁸.

Rysunek 1: Schematyczne podsumowanie. Schematyczne przedstawienie procesu wykorzystującego przejściową ekspresję enzymów biosyntetycznych w liściach N. benthamiana w celu przekierowania endogennych dostaw 2,3-oksydoskwalenu w kierunku preparatywnej produkcji nowych wysokowartościowych produktów triterpenowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Budowa i proces infiltracji próżniowej. a) Uchwyt na rośliny na zamówienie, jedno skrzydło odłączane. b) Dołączone na zamówienie skrzydła uchwytu na rośliny. c) Inwersja i zanurzenie roślin. d) Wprowadzenie kąpieli infiltracyjnej. e) Kąpiel infiltracyjna w komorze infiltracyjnej. f) Kompletny infiltrator próżniowy: (1) Pompa próżniowa (2) Podłączenie pompy próżniowej do zbiornika próżniowego (3) Zawór odcinający zbiornika próżniowego (4) Połączenie między zbiornikiem próżniowym a komorą infiltracyjną (5) Manometr (6) Zawór wlotu powietrza (7) Komora infiltracyjna (8) Zbiornik próżniowy. g) Reprezentatywne liście z jednej rośliny naciekanej konstruktem ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) po pięciu dniach po naciekaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wcześniej zgłoszone reprezentatywne wyniki dla preparatywnej produkcji pochodnych β-amyryny przy użyciu tego protokołu⁸. Ta tabela jest uporządkowana według izolowanych plonów. Kolumny są formatowane warunkowo ze wskazaniem koloru wartości względnej. Czerwony = wysoki, zielony = niski (choć pośredni żółty). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Wysokoprzepustowa infiltracja próżniowa pozwala na rutynowe stosowanie tego protokołu w naszym laboratorium do preparatywnej produkcji związków triterpenowych o znaczeniu dla różnych zastosowań końcowych. Opisywany tutaj aparat infiltracji próżniowej jest łatwy do odtworzenia. Dodanie zbiornika próżniowego jest wskazane w celu skrócenia czasu potrzebnego do wytworzenia niezbędnej próżni, jednak możliwe jest po prostu ponowne wykorzystanie niezmodyfikowanego pieca próżniowego jako komory infiltracyjnej. Ochrona pompy próżniowej poprzez dodanie odpowiedniego skraplacza jest teoretycznie sensowna, ale w naszym laboratorium stwierdziliśmy, że nie jest to konieczne.

Pokrycie infiltracji jest zagrożone, jeśli liście nie są całkowicie zanurzone w zawiesinie infiltracyjnej. Problem ten jest minimalizowany poprzez zapewnienie, że poziom zawiesiny sięga górnej powierzchni uchwytu na rośliny i że uchwyt na rośliny jest ściśle dopasowany do kąpieli infiltracyjnej. Należy zauważyć na rysunku 2 , że górna powierzchnia uchwytu na rośliny jest wpuszczona w kąpiel infiltracyjną, gdy jest na miejscu. Osiąga się to za pomocą paneli na środkowych krawędziach uchwytu, które tworzą punkt kotwiczenia z górną częścią wanny rozsączającej. Zawieszenie infiltracji będzie wymagało okresowych uzupełnień w celu utrzymania poziomu zawieszenia. Najlepiej osiągnąć to poprzez dodanie nadmiaru zawiesiny infiltracji, aby zapobiec stopniowej redukcji OD₆₀₀ w trakcie infiltracji dużej partii. Jednak w naszych rękach zastąpienie wody nie wydaje się mieć zauważalnego wpływu na oczekiwane plony w skali preparatywnej, chociaż nie zostało to zbadane ilościowo. To, ile roślin może zostać zinfiltrowanych z jednej partii zawiesiny infiltracji, jest nadal kwestią otwartą. Rutynowo infiltrujemy od 100 do 200 roślin za pomocą jednej partii zawiesiny infiltracyjnej. Ponadto normalne jest, że część gleby wypłukuje się do zawiesiny infiltracji w trakcie procesu infiltracji. Nie stwierdzono, aby miało to zauważalny wpływ na skuteczność infiltracji.

Podczas zbiorów wskazane jest (ale nie krytyczne) zbieranie tylko liści, które zostały naciekane (niektóre liście wyrosną po infiltracji). Selektywny zbiór zapobiega rozcieńczaniu nieproduktywną tkanką, która w przeciwnym razie zwiększyłaby stosunek endogennych zanieczyszczeń w stosunku do interesującego związku. Ma to nominalny wpływ na łatwość dalszego oczyszczania i zwiększa skalę tych procesów. Podczas stosowania tHMGR w celu zwiększenia podaży prekursorów, często obserwuje się nekrozowany fenotyp, który rozwija się w okresie wzrostu po infiltracji. Jest to normalne i faktycznie wspomaga selektywne zbiory i dalszy proces suszenia. Wysuszony proszek z liści można zwykle przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w chłodnym, suchym, ciemnym miejscu, ale najlepiej w eksykatorze pod próżnią. Zależy to od stabilności związku zainteresowanego. Zachowaj ostrożność, jeśli zdecydujesz się na przechowywanie w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Upewnij się, że suszone liście znajdują się w wodoodpornym pojemniku, a po wyjęciu z magazynu, przed otwarciem pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej. Niezastosowanie się do tego spowoduje ponowne zwilżenie liści, co utrudni dalszą obróbkę.

Kroki po zbiorach w tym protokole są przedstawione w celach ilustracyjnych i aby pomóc tym badaczom, którzy mogą mieć ograniczone doświadczenie w chemii praktycznej. Można je zastąpić wieloma innymi technikami ekstrakcji/oczyszczania produktów naturalnych. Jak wskazano we wprowadzeniu, PSE mają wiele zalet, jednak koszt inwestycyjny komercyjnie dostępnej aparatury PSE może być zaporowy i nie jest niezbędny. Podstawowa obróbka żywicą jonowymienną jest bardzo wygodną metodą zastępującą tradycyjne zmydlanie, po którym następuje podział ciecz/ciecz. Nie nadaje się jednak do produktów zawierających grupy kwasów karboksylowych lub grupy funkcyjne, które uległyby hydrolizie w warunkach zasadowych, takich jak estry. Oczekuje się, że produkty te zostaną zatrzymane na zasadowej żywicy jonowymiennej. Istnieje jednak możliwość wykorzystania tego do procedury przechwytywania i uwalniania (nie udokumentowanej tutaj). Tam, gdzie tradycyjne zmydlanie byłoby odpowiednie, podstawową obróbką żywicą jonowymienną stanowi wygodną alternatywę. Stwierdzono, że metoda chromatograficzna opisana w kroku 9 jest uogólniona dla związków opisanych na rysunku 3. Jednak związki o zwiększonej polarności mogą wymagać wydłużonego okresu elucji 100% octanu etylu. W odniesieniu do kroku 9.2, dalsze dokładne oczyszczanie jest całkowicie specyficzne dla związku i zależy również od skali. Powtarzające się rundy chromatografii flash na mniejszą skalę ze zoptymalizowanymi gradientami są zwykle wystarczające do uzyskania czystości odpowiedniej do analizy NMR. Na większą skalę krystalizacja jest często wygodną alternatywą. W trudnych przypadkach można zastosować preparatywną lub półpreparatywną wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) w zależności od pożądanej ilości wyizolowanego związku. Przykłady dalszych procesów oczyszczania dla szeregu reprezentatywnych związków można znaleźć w innym miejscu⁸.

Obecny protokół, przedstawiony tutaj, jest rutynowo stosowany w naszym laboratorium i ma udowodnioną użyteczność. Nadal jednak istnieje znaczne pole do dalszej optymalizacji platformy wyrażeń. W naszym laboratorium trwają prace mające na celu zbadanie, w jaki sposób dalsza inżynieria szlaków i różnicowa kontrola poziomów ekspresji białek mogą jeszcze bardziej poprawić produkcję triterpenów, jednocześnie pośrednicząc w toksyczności dla komórek gospodarza. Istnieje również potencjał do zbadania manipulacji wewnątrzkomórkowymi systemami transportowymi^20,21 oraz kierowania enzymów do różnych przedziałów komórkowych^22,23, co może poprawić wydajność wielu zdarzeń utleniania. Można również zbadać potencjalne korzyści płynące z modyfikacji podstawowej morfologii kluczowych organelli. Na przykład zaobserwowano, że nadekspresja domeny błonowej Arabidopsis thaliana HMGR indukuje przerost retikulum endoplazmatycznego u roślin²⁴; kluczowym miejscem dla aktywności CYP450. Protokół ten idealnie nadaje się do produkcji ilości produktów triterpenowych w skali miligram do grama i może być stosowany w warunkach badawczych w celu uzyskania dostępu do związków do dalszych badań (np. systematyczne badanie zależności struktura-aktywność i wstępne badania właściwości farmakodynamicznych i farmakokinetycznych związków ołowiu o znaczeniu klinicznym). Platforma jest jednak skalowalna liniowo i niezawodnie po prostu poprzez zwiększenie liczby wykorzystywanych roślin, a praktyczność przejściowej ekspresji za pomocą agroinfiltracji została wykazana na skalę przemysłową w produkcji białek farmaceutycznych¹⁴, a zatem istnieje potencjał do rozszerzenia tej platformy na komercyjną produkcję wysokowartościowych triterpenów. Alternatywnie, możliwe jest również wyobrażenie sobie produkcji stabilnych transformantów niosących sfinalizowany pożądany wielogenowy szlak biosyntezy, co pozwoli na masową uprawę i dalsze "hodowlanie" transgenicznych szczepów N. benthamiana wytwarzających różne związki o wartości handlowej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przyrząd GC-MS	dowolny	n/a
Termocykler odpowiedni do przeprowadzania reakcji PCR	dowolny	n/a
Aparatura do elektroforezy żelowej	dowolna	n/a
Regulowane mikropipety o wydatku powietrza (Rozmiary: 1000 i mikro; L, 200 i mikro; L, 100 i mikro; L, 20 i mikro; L, 10 i mikro; L oraz 2 i mikro; L )	dowolna	nie dotyczy
Szeroki górny nośnik ciekłego azotu (rozmiar: 2 L)	dowolny	dotyczy
Mikrowirówka stołowa (Pojemność: 24 x 1,5/2 mL, Max. prędkość: =/> 15000 obr./min)	dowolna	nie dotyczy
Wirówka stołowa (Pojemność: 20 x 50 mL, Max. prędkość: =/> 4000 obr./min)	dowolna	nie dotyczy
Duża wirówka podłogowa (Pojemność: 4 x 1L, Max. prędkość: =/> 4000 obr./min)	dowolna	nie dotyczy
Inkubator stojący	dowolny	n/a
Inkubator z wytrząsaniem (Kolba Rozmiary zacisków: 10 mL, 50 mL, 2 L)	dowolna	nie dotyczy
Butelki wirówkowe (1 L)	dowolna	nie dotyczy
próżniowej	na zamówienie	n/d
9 x 9 cm	dowolna	nie dotyczy
Aparat do liofilizacji (=/> Pojemność skraplacza 8 litrów)	dowolna	nie dotyczy
Buchi SpeedExtractor 914 z komórkami ekstrakcyjnymi 120 ml (przyrząd PSE)	Buchi	SpeedExtractor E-914
Wyparka obrotowa	dowolna	n/a
Kolby parownika (rozmiary: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)	dowolna	nie dotyczy
butelek Duran (Rozmiary: 1 L, 10 L)	dowolna	n/ a
Kolby stożkowe (rozmiary 100 mL, 2 L)	dowolne	nie dotyczy
Szpatułki (różne rozmiary)	dowolne	nie dotyczy
Waga analityczna (5 cyfr)	dowolna	nie dotyczy
Waga (2 cyfry)	dowolna	nie dotyczy
Cylindry miarowe (10 mL, 100 mL, 1 L)	dowolna	Nie dotyczy
A -80 zamrażarka	dowolna	nie dotyczy
Przyrząd Biotage Isolera ze stojakiem na próbki 250 ml i butelkami (automatyczny przyrząd do chromatografii błyskowej	Biotage	ISO-1EW
, Okulary ochronne,	dowolne	nie dotyczy
Fartuch laboratoryjny	dowolny	nie dotyczy
Autoklaw,	dowolny
dotyczyMateriały eksploatacyjne
Końcówki do mikropipet (rozmiary: 1000 i mikro; L, 200 i mikro; L, 100 i mikro; L, 20 i mikro; L, 10 i mikro; L oraz 2 i mikro; L )	dowolna	nie dotyczy
Probówki do mikrowirówek (Rozmiar: 2 ml)	dowolna	nie
Probówki wirówkowe (Rozmiary: 15 mL, 50 ml)	dowolna	bez
Jednorazowe pipety transferowe (rozmiar 2 mL)	dowolna	bez
Szalki Petriego (Rozmiar: 100 ml)	dowolna	nie dotyczy
Biotage® Wkłady flash SNAP KP-SIL 100 g	Biotage	FSK0-1107-0100
Fiolki HPLC (1 ml), wkładki do fiolek i nakrętki	dowolne	Nie dotyczy
Jednorazowe fioletowe rękawiczki nitrylowe	dowolne	nie dotyczy
Filtr górny do E-914, celuloza	Buchi	51249
Filtr dolny do E-916 / 914, włókno szklane	Buchi	11055932
Odczynniki
Piasek kwarcowy, 0,3 - 0,9 mm	Buchi	37689
Celite 545 (ziemia okrzemkowa)	Simga-Alrich	22140-1KG-F
Żel krzemionkowy 60 (0,040 -0,0063 mm)	Merck	1,09385,5000
Kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy	Melford	B2002
MgCl2	Simga-Alrich	208337-100G
KOH	Simga-Alrich	60377-1KG
3' 5'-dimetoksy-4'-acetofenon (acetosyringon)	Simga-Alrich	D134406-1G
Rifampicin	Alfa Aesar	J60836
Siarczan kanamycyny	Gibco	11815-032
Streptomycyna	Simga-Alrich	S6501-100G
Gentamycyna	MP biomedyczne	190057
Żel	Agaroza LEMelford	MB1203
LB bulion Millar	Simga-Alrich	L3522-250G
Agar	Simga-Alrich	A5306-250G
NaCl	Simga-Alrich	S5886-500G
KCl	Simga-Alrich	P9541-500G
MgSO4.7H2O	Sigma-Alrich	M2773-500G
Glukoza	Sigma-Alrich	G7021-100G
Ambersep®   900 wodorotlenek (zasadowa żywica jonowymienna)	Sigma-Alrich	06476-1KG
Hexane	Fisher	H/0406/PB17
Octan etylu	Fisher	E/0900/PB17
Dichlorometan	Fisher	D/1852/PB17
Metanol	Fisher	M/4056/PB17
Bromek etydyny	Sigma-Alrich	E7637-1G
Etanol	VWR	20821-330
Milli-Q	woda bez
Levington F1 Compost	bez
Levington F2 Compost	bez	zestawu
QIAprep Spin Miniprep Miniprep (zestaw do oczyszczania plazmidu).	Qiagen	27104
NEB 5-alpha Kompetentny dostawca E. coli	New England Biolabs Ltd	C2987I
pEAQ-HT-DEST1 wektor	Laboratorium Lomonossoff John Innes Center	n/a
pDONR207	Thermo-Fisher	pDONR207
A. tumefaciens LBA4404	Thermo-Fisher	18313015
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (protokół klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca)	Thermo-Fisher	11791020
GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (protokół klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca)	Thermo-Fisher	11789020
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX	Promega UK Ltd	M7822
PHUSION POLIMERAZA DNA O WYSOKIEJ WIERNOŚCI	New England Biolabs Ltd	M0530S
ZESTAW dNTP 100mm	Thermo-Fisher	10297018
RNEASY PLANT MINI KIT	Qiagen Ltd	74904
RQ1 RNASE-FREE DNASE	Promega UK Ltd	M6101
Invitrogen SuperScript III System syntezy pierwszej nici	Fisher	10308632
Trytone	Sigma-Alrich	T7293-250G
Nicotiana Nasiona Benthamiany	Każdy renomowany dostawca	Nie dotyczy