Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hydrożele na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58176

⸱

24 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 2Department of Bioengineering, Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół trójwymiarowej hodowli komórek glejaka pochodzących od pacjenta w ortogonalnie przestrajalnych biomateriałach zaprojektowanych tak, aby naśladować matrycę mózgu. Podejście to zapewnia platformę eksperymentalną in vitro, która zachowuje wiele cech komórek glejaka in vivo, zwykle traconych w hodowli.

Streszczenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym, a jednocześnie najbardziej śmiertelnym nowotworem ośrodkowego układu nerwowego. W ostatnich latach wiele badań koncentrowało się na tym, w jaki sposób macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) unikalnego środowiska mózgu, takiego jak kwas hialuronowy (HA), ułatwia progresję i inwazję GBM. Jednak większość modeli hodowli in vitro obejmuje komórki GBM poza kontekstem ECM. Powszechnie stosowane są również mysie ksenoprzeszczepy komórek GBM. Jednak modele in vivo utrudniają wyizolowanie udziału poszczególnych cech złożonego mikrośrodowiska guza w zachowaniu guza. W tym miejscu opisujemy trójwymiarową (3D) platformę hodowli na bazie hydrożelu HA, która pozwala naukowcom niezależnie zmieniać stężenie i sztywność HA. HA o wysokiej masie cząsteczkowej i glikol polietylenowy (PEG) zawierają hydrożele, które są sieciowane poprzez addycję typu Michaela w obecności żywych komórek. Hodowle hydrożelowe 3D komórek GBM pochodzących od pacjentów wykazują żywotność i tempo proliferacji tak samo dobre lub lepsze niż w przypadku hodowli jak standardowe glejaki. System hydrożelowy umożliwia również włączenie peptydów mimetycznych ECM w celu wyizolowania efektów określonych interakcji komórka-ECM. Hydrożele są optycznie przezroczyste, dzięki czemu żywe komórki mogą być obrazowane w hodowli 3D. Wreszcie, kultury hydrożelu HA są kompatybilne ze standardowymi technikami analiz molekularnych i komórkowych, w tym PCR, Western blotting i kriosekcja, a następnie barwienie immunofluorescencyjne.

Wprowadzenie

Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli lepiej podsumowują interakcje między komórkami i otaczającą je macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) w tkankach natywnych niż ich dwuwymiarowe (2D) odpowiedniki1,2. Postępy w inżynierii tkankowej zaowocowały zaawansowanymi platformami hodowli 3D, które umożliwiają kontrolowane badania 1) tego, w jaki sposób chemiczne i fizyczne składniki mikrośrodowiska macierzy wpływają na zachowanie komórek oraz 2) skuteczności nowych strategii terapeutycznych w wielu chorobach, w tym nowotworach2. Chociaż modele in vitro nie mogą uwzględniać czynników ogólnoustrojowych, takich jak sygnały endokrynologiczne i immunologiczne, a zatem nie mogą całkowicie zastąpić modeli in vivo, zapewniają one szereg korzyści, w tym odtwarzalność, kontrolę eksperymentalną, przystępność cenową i szybkość. W tym miejscu opisujemy zastosowanie hydrożeli naśladujących mózg, w których hodowle 3D komórek guza mózgu pochodzących od pacjenta rejestrują wiele aspektów fizjologii guza, w szczególności dynamikę nabywania oporności na leczenie3. W porównaniu z innymi metodami in vitro, hodowle te lepiej reprezentują modele nowotworów in vivo i obserwacje kliniczne3.

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym i najbardziej śmiertelnym nowotworem wywodzącym się z mózgu, z medianą przeżycia wynoszącą zaledwie 1-2 lata4,5. W ostatnich latach wiele badań koncentrowało się na wpływie środowiska macierzy nowotworowej na GBM6,7,8. Doniesiono, że unikalny ECM mózgu wpływa na migrację komórek GBM, proliferację i oporność terapeutyczną6,7,8,9,10,11,12. Kwas hialuronowy (HA) jest obficie występującym glikozaminoglikanem (GAG) w mózgu, gdzie oddziałuje z innymi GAG i proteoglikanami, tworząc hydrożelową siatkę13. Wiele badań wykazało nadekspresję HA w guzach GBM i jej późniejszy wpływ na progresję raka8,9,13,14,15,16,17. Inne komponenty ECM również wpływają na wzrost i inwazję guza GBM6,7,15,18. Na przykład fibronektyna i witronektyna, które są zwykle nadmiernie eksprymowane w GBM, indukują heterodimeryzację receptorów integryny na powierzchni komórki poprzez wiązanie się z sekwencją "RGD" i inicjują złożone kaskady sygnałowe, które sprzyjają przeżyciu guza19,20,21. Oprócz wpływów biochemicznych, właściwości fizyczne macierzy tkankowej wpływają również na progresję GBM22,23.

Ciągłe nabywanie oporności na terapie jest jednym z głównych czynników wpływających na śmiertelność GBM4. Leki wykazujące obiecujące wyniki w modelach 2D lub glejakowych zawiodły w kolejnych badaniach na zwierzętach i przypadkach klinicznych3, co wskazuje, że wpływ czynników mikrośrodowiskowych znacząco przyczynił się do odpowiedzi guza GBM1. Podczas gdy modele zwierzęce mogą zapewnić fizjologicznie odpowiednie mikrośrodowisko 3D dla ksenoprzeszczepowanych komórek pacjenta i generować klinicznie istotne wyniki24,25, złożoność mikrośrodowiska mózgu in vivo sprawia, że trudno jest określić, które cechy, w tym interakcje komórka-macierz, są kluczowe dla określonych wyników biologicznych. Identyfikacja nowych celów terapeutycznych będzie korzystna dzięki zastosowaniu uproszczonych platform hodowlanych, w których zdefiniowane zostaną właściwości biochemiczne i biofizyczne.

W przeciwieństwie do wcześniej opisywanych modeli biomateriałowych mikrośrodowiska guza GBM26,27, które nie osiągnęły prawdziwej ortogonalnej kontroli nad indywidualnymi biochemicznymi i fizycznymi cechami ECM, opisana tutaj platforma biomateriałów umożliwia rozdzielenie udziału wielu niezależnych cech w fenotypie komórki GBM. W tym miejscu prezentujemy oparty na HA, ortogonalnie przestrajalny, hydrożelowy system do hodowli 3D komórek GBM pochodzących od pacjenta. Hydrożele powstają z dwóch składników polimerowych: 1) biologicznie aktywnego HA i 2) biologicznie obojętnego glikolu polietylenowego (PEG). PEG jest szeroko stosowanym biokompatybilnym i hydrofilowym materiałem o niskiej adsorpcji białek i minimalnej immunogenności28. W tym przypadku około 5% ugrupowań kwasu glukuronowego na łańcuchach HA jest funkcjonalizowanych grupami tiolowymi, aby umożliwić sieciowanie z dostępnym na rynku 4-ramiennym PEG zakończonym maleimidami poprzez addycję typu Michaela. W swojej najpowszechniejszej postaci w organizmie kwas hialuronowy występuje w łańcuchach o dużej masie cząsteczkowej (HMW). W tym przypadku niski stopień modyfikacji HA HMW (500-750 kDa) pomaga zachować natywne interakcje HA i jego receptorów komórkowych, w tym CD4429. Poprzez zastąpienie tiolu PEG tiolem HA, przy jednoczesnym zachowaniu stałego stosunku molowego całkowitych tioli do maleimidów, stężenie HA można oddzielić od właściwości mechanicznych otrzymanych hydrożeli. Co więcej, kontrole stechiometryczne mogą być stosowane do koniugacji peptydów zakończonych cysteiną do określonej średniej liczby ramion zakończonych maleimidem na każdym 4-ramiennym PEG. Włączenie peptydów adhezyjnych pochodzących z ECM umożliwia interakcje z integrynami na hodowanych komórkach, przez które transdukowane są sygnały biochemiczne i chemiczne1. Addycja maleimidu i tiolu zachodzi bardzo szybko w warunkach fizjologicznych, minimalizując czas potrzebny do enkapsulacji komórek i maksymalizując przeżycie komórek pochodzących od pacjenta. Co więcej, kultury hydrożelowe mogą być traktowane jak typowa próbka tkanki i są kompatybilne ze standardowymi technikami charakteryzacji, w tym Western blotting, cytometrią przepływową i barwieniem immunofluorescencyjnym. Poniższy protokół opisuje procedury wytwarzania hydrożeli, ustanawiania kultur 3D komórek GBM pochodzących od pacjenta oraz techniki analizy biochemicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie etapy pobierania tkanek ludzkich zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.

1. Tiolacja kwasu hialuronowego

Uwaga: Proporcje molowe są podane w odniesieniu do całkowitej liczby grup karboksylowych, chyba że określono inaczej.

  1. Rozpuścić 500 mg hialuronianu sodu (HA, 500-750 kDa) w stężeniu 10 mg/ml w dejonizowanej wodzie destylowanej (DiH2O) w wysterylizowanej autoklawie kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Mieszaj roztwór (~200 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby całkowicie rozpuścić kwas hialuronowy. Użyj mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej, aby utrzymać mieszanie reakcji podczas procedury tiolowania.
  2. Używając 0,1 M kwasu solnego (HCl), dostosuj pH roztworu HA do 5,5. Odważyć 69,6 mg (0,25x stosunek molowy) 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiamidu (EDC).
    UWAGA: Chociaż nierozpuszczony EDC można dodać bezpośrednio do roztworu HA, zazwyczaj łatwiej jest najpierw rozpuścić EDC w 1 ml DiH2O, a następnie szybko dodać roztwór EDC do roztworu HA. Wstępne rozpuszczenie w 1 ml DiH2O można również przeprowadzić za pomocą N-hydroksysukcynimidu (NHS) i dihydrocholordu cystaminy przed dodaniem do reakcji w krokach 1.3 i 1.4.
  3. Dodać 17,9 mg (0,125x stosunek molowy) NHS do reakcji. Dostosować pH roztworu reakcyjnego do 5,5 przy użyciu 0,1 M HCl i inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
  4. Dodać 70,0 mg (0,25x stosunek molowy) dichlorowodorku cystaminy do roztworu reakcyjnego. Użyj 0,1 M wodorotlenku sodu (NaOH), aby dostosować pH do 6,25. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez noc, mieszając.
  5. Następnego dnia użyj 1 M NaOH, aby dostosować pH roztworu reakcyjnego do około 8. Dodać 192 mg (4x stosunek molowy) ditiotreitolu (DTT) do reakcji. Dostosuj pH z powrotem do 8 po dodaniu DTT i pozostaw mieszając na 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Użyj 1 M HCl, aby dostosować pH do 4. Przenieść całą mieszaninę reakcyjną do wstępnie nasączonej membrany dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej około 13 kDa) i dializować z DiH2O wstępnie dostosowanym do pH 4,
    UWAGA: Objętość DiH2O do dializy powinna być co najmniej 40 razy większa od objętości przereagowanego roztworu HA (np. 50 ml próbki w 2 L DiH2O, pH 4).
  7. Roztwór do dializy (DiH2O, pH 4) należy wymieniać dwa razy dziennie przez 3 dni w temperaturze pokojowej.
  8. Przefiltrować dializowany roztwór przez membranowy filtr próżniowy o średnicy 0,22 μm. Roztwór do błyskawicznego zamrażania tiolowanego kwasu hionowego w ciekłym azocie. Użyj liofilizatora do zamrażania suchych próbek przez 2 dni. Tiolowany kwas hialuronowy w postaci suchej może być przechowywany w zamkniętym próżniowo eksykatorze w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
  9. Aby określić stopień tiolacji, użyj testu Ellmana i/lub spektroskopii protonowej NMR30,31.

2. Przygotowanie materiałów sieciujących

  1. Rozpuść tiolowany kwas hiolowany w pożądanym stężeniu (w tym przykładzie 13,3 mg/ml) w soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (20 mM HEPES w buforze soli solnej (HBSS) Hanka, dostosowanym do pH 8-9) w bursztynowej fiolce, aby zminimalizować ekspozycję na światło otoczenia. Utrzymuj roztwór w ciągłym mieszaniu.
    UWAGA: Tworzenie wiązań dwusiarczkowych między tiolami sprzężonymi z HA może wystąpić, jeśli pH jest powyżej 8, stężenie roztworu jest zbyt wysokie lub roztwór pozostawia się w stanie mieszania zbyt długo przed żelowaniem. Aby uniknąć tego problemu, należy użyć poniżej 15 mg/ml tiolowanego kwasu hialuronowego i rozpuścić tiolowany kwas hiolowany w ciągu 2 godzin od utworzenia hydrożeli.
  2. Rozpuścić 4-ramienny PEG-maleimid (PEG-Mal, 20 kDa) i 4-ramienny PEG-tiol (PEG-tiol, 20 kDa) w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej (PBS), pH 7,4, w celu przygotowania 50 mg/ml roztworów podstawowych PEG-Mal i PEG-tiol.
    UWAGA: Całkowite rozpuszczenie odczynników PEG zajmuje co najmniej 1 godzinę.
  3. W przypadku dodawania peptydów pochodzących z ECM, należy rozpuścić peptydy zawierające cysteinę w PBS, aby przygotować roztwór podstawowy.
    UWAGA: Użyj stężenia zapasu 2-4 mM.
  4. Namocz formy z gumy silikonowej w etanolu przez co najmniej 20 minut, aby je wyczyścić, a następnie autoklaw w celu sterylizacji.

3. Sieciowanie hydrożelowe i enkapsulacja komórek

Uwaga: Jako przykład, opisano tutaj enkapsulację czterech pojedynczych, 80 μL hydrożeli z 0,5% (w/v) HA i modułem ściskania 1 kPa 3. Proszę zapoznać się z tabelą 1, aby zapoznać się z przykładowymi recepturami, które dają hydrożele o różnych właściwościach: dwa hydrożele zawierające peptyd wiążący integrynę RGD i dwa hydrożele zawierające kapsle cysteinowe jako negatywną kontrolę aktywności peptydów. Koncentracja wysiewu komórek GBM pochodzących od pacjenta wynosi 500 000 komórek/ml.

  1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy PEG-Mal (50 mg/ml, od etapu 2.2) do 12,5 mg/ml przez dodanie 40 μl roztworu podstawowego do 120 μl PBS. Rozcieńczony roztwór podzielić na dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml tak, aby każda probówka zawierała 80 μl.
  2. Dodać 16 μl podstawowego roztworu RGD (2,8 mM, z kroku 2.3) do jednej probówki i 16 μl podstawowego roztworu cysteiny (2,8 mM, z kroku 2.3) do drugiej probówki. Wirować do mieszania. Roztwory PEG-Mal-RGD lub PEG-Mal-CYS umieścić na lodzie do momentu użycia w kroku 3.9.
    UWAGA: Opisana tutaj procedura daje hydrożele z ~140 μM peptydu. Jest to równoznaczne z tym, że około 1 na 8 dostępnych ramion PEG jest zajęte peptydem. Można to zmienić, zmieniając stosunek molowy peptydów zakończonych cysteiną do dostępnych grup maleimidowych. Ogólnie rzecz biorąc, maksymalne stężenie peptydu wynoszące 280 μM można osiągnąć przy jednoczesnym pozostawieniu wystarczającej liczby grup maleimidowych dostępnych do sieciowania hydrożelowego.
  3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy PEG-tiol (50 mg/ml, od etapu 2.2) do 5 mg/ml przez zmieszanie 4 μl roztworu podstawowego o stężeniu 50 mg/ml z 36 μl PBS. Do mieszaniny dodać 120 μl rozpuszczonego, tiolowanego kwasu hialuronowego z etapu 2.1.
    UWAGA: Roztwory HMW HA są bardzo lepkie. Dlatego zalecamy używanie końcówki do mikropipet o szerokim otworze do przenoszenia roztworów. Pipetę należy pipetować powoli, aby uniknąć przywierania roztworu do ścianek końcówki mikropipety i poprawić dokładność pomiaru.
  4. Umieść czyste, suche formy (przygotowane w kroku 2.4) w każdym dołku 12-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur nietkankowych. Używając czystego, końca końcówki pipety, dociśnij formę żelową i dokładnie sprawdź uszczelnienie między foremkami a dnem płytki studzienki.
    UWAGA: Sprawdź uszczelkę ponownie tuż przed hermetyzacją, aby zapobiec wyciekom.
  5. Pasażowanie hodowane komórki GBM, dysocjują na pojedyncze komórki i określają stężenie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem3.
    UWAGA: Niektórych linii GBM nie można rozdzielić na pojedyncze komórki. W takim przypadku całe glejaki mogą być zamknięte. Należy jednak przygotować zdysocjowane pojedyncze komórki po precyzyjnym zliczeniu komórek, aby poprawić odtwarzalność. Protokół pasażowania glejaka różni się w zależności od różnych laboratoriów, a wiele z nich jest prawdopodobnie kompatybilnych z kapsułkowaniem hydrożelowym.
    1. (Zalecane) Odwirować glejaki przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i dodać 1 ml enzymu dysocjacji komórek do osadu komórkowego. Następnie inkubować przez 5 minut, delikatnie stukając w probówkę, aby zamieszać.
    2. Dodać 4 ml kompletnej pożywki hodowlanej (50 ng/ml EGF, 20 ng/ml FGF-2, 25 μg/ml heparyny, suplementu G21 i 1% penicyliny/streptomycyny w DMEM/F12) do komórek.
    3. Ponownie odwirować przy 500 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki i przepuścić zawieszone komórki przez sitko o wielkości 70 μm. (Zalecane) umyć sitko dodatkowymi 4 ml kompletnego podłoża, aby zmaksymalizować liczbę odzyskanych komórek.
  6. Oszacuj stężenie komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru. Podziel zawiesinę komórek na 2 probówki wirówkowe, z których każda zawiera ~ 80 000 komórek. Wirować przy 500 x g przez 5 min; ogólnie rzecz biorąc, 80 000 komórek składa się z 2 80 μl hydrożeli.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić jedną osadkę w 80 μl roztworu PEG-MAL-RGD, a drugą osadkę w 80 μl roztworu PEG-MAL-CYS (przygotowanego w kroku 3.1).
  8. Za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 200 μl i szerokim otworze dozować 40 μl roztworu HA (z kroku 3.3 powyżej) do każdej formy z gumy silikonowej (przygotowanej w kroku 3.4).
  9. Za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 200 μl i szerokim otworze wymieszać 40 μl roztworu ogniw PEG-MAL-CYS lub PEG-MAL-RGD z roztworem HA w formie. Pipetuj szybko w górę i w dół, nie więcej niż 10 razy. Powtórz te czynności dla każdej przygotowywanej kultury żelowej.
    UWAGA: Ten krok wymaga praktyki, ponieważ początkowe żelowanie następuje szybko (w ciągu 30 sekund). Pipetuj w górę i w dół, przesuwając końcówkę w różne miejsca w foremkach, aby zapewnić równomierne mieszanie. Zawsze utrzymuj końcówkę poniżej poziomu cieczy, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Nie mieszaj roztworu zbyt wiele razy, ponieważ może to spowodować powstanie żelu wewnątrz końcówki mikropipety. PEG-MAL-CYS i PEG-MAL-RGD można łączyć w różnych proporcjach, aby osiągnąć pożądane stężenie peptydu RGD.
  10. Umieścić płytkę studzienkową zawierającą komórki w kapsułkach w żelu w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 5-10 minut, aby zapewnić zakończenie reakcji.
  11. Dodaj 2-2,5 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki z uformowanymi żelami. Użyj sterylnej końcówki do pipety o pojemności 2 μl lub mikroszpatułki, aby delikatnie oddzielić formę od żelu. Użyj wstępnie wysterylizowanych kleszczyków, aby usunąć pleśń z płytki studzienki. Umieścić płytkę studzienki z powrotem w inkubatorze komórkowym (37 °C i 5% CO2 ) w celu przeprowadzenia hodowli i przyszłych eksperymentów.
    UWAGA: Pociągnij formę pionowo do góry, aby uniknąć uszkodzenia kultur żelowych. Ogólnie rzecz biorąc, pożywkę w kulturach żelowych należy wymieniać co 3-4 dni. Uważaj, aby nie zasysać hydrożeli podczas usuwania podłoża. Jeśli jest to problem, zalecamy użycie plastikowej pipety transferowej. Jeśli planowane jest obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia liczby komórek, komórki GBM muszą być transdukowane lentiwirusem kodującym konstytutywnie ekspresję lucyferazy przed enkapsulacją, jak opisano wcześniej3. W przypadku obrazowania bioluminescencyjnego dodaj 1 mM D-lucyferyny do pożywki hodowlanej 1 godzinę przed obrazowaniem luminescencyjnym.

4. Przygotowanie lizatu do Western Blotting

  1. Schłodzić probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml na lodzie (1 na próbkę żelu). Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  2. Usuń pożywkę z płytek studzienkowych. Przenieś żele do wstępnie schłodzonych probówek do mikrowirówek.
  3. Dodać 100 μl buforu RIPA z 1x inhibitorami proteazy/fosfatazy.
  4. Używając strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 20 g, rozdrobnij żel, przepychając całą mieszaninę przez igłę co najmniej 20 razy.
  5. Błyskawicznie odwirować próbkę za pomocą mikrowirówki stołowej i umieścić próbkę z powrotem na lodzie.
  6. Próbki należy wprowadzać na krótko co 5 minut, łącznie przez 20 minut.
  7. Odwirować próbki o masie 14000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Przenieść supernatant do nowych, wstępnie schłodzonych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C (krótkotrwale) lub -80 °C (długotrwale). Wykonaj elektroforezę żelową przy użyciu standardowych procedur, jak opisano wcześniej3.

5. Ekstrakcja pojedynczych komórek z kultur hydrożelowych do cytometrii przepływowej

  1. Usunąć pożywkę i przenieść kulturę żelową (z kroku 3.11) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Inkubować żel z 500 μl enzymu dysocjacji komórek (np. TrypLE Express) w temperaturze 37 °C przez 5 minut, od czasu do czasu przesuwając probówkę w celu zamieszania.
  3. Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z 5 ml kompletnego podłoża. Umieść rurkę na lodzie.
  4. Umieścić igłę 20 g na strzykawce o pojemności 10 ml. Delikatnie przeciągnąć zawiesinę komórkową w górę i w dół przez igłę 8 razy.
  5. Przepuścić mieszaninę przez sitko o pojemności 70 μm do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Nanieść dodatkowe 5 ml kompletnego podłoża przez sitko, aby zebrać pozostałe komórki.
  6. Odwirować próbkę o sile 400 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w żądanym buforze do cytometrii przepływowej (przy użyciu standardowych protokołów3).

6. Kriokonserwacja hydrożeli do sekcji

  1. Usuń pożywkę z kultur żelowych (z kroku 3.11).
  2. Inkubować kultury żelowe z 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  3. Następnego dnia usuń PFA. Dodać 2 ml 5% sacharozy z PBS do żeli i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Zastąp 5% roztwór sacharozy 2 ml 20% sacharozy w PBS i inkubuj przez 30 minut.
  5. Zastąp roztwór sacharozy 2 ml świeżej 20% sacharozy w PBS i inkubuj przez dodatkowe 30 minut.
  6. Po raz trzeci zastąp roztwór sacharozy 2 ml świeżej 20% sacharozy w PBS. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  7. Przygotować 20% sacharozy w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).
    UWAGA: Ze względu na lepkość KOCT, rozpuszczenie sacharozy może zająć trochę czasu (do nocy). Zalecamy umieszczenie mieszaniny na shakerze podczas rozpuszczania, aby utrzymać mieszanie.
  8. Następnego dnia usuń 20% roztwór sacharozy i delikatnie wlej 20% sacharozy w roztworze OCT na żel. Upewnij się, że pokryłeś cały żel. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
  9. Przenieś żel do środka formy do zatapiania za pomocą dużej, płaskiej szpatułki; należy to zrobić ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia żelu.
  10. Schłodzić 2-metylobutan w kriokomorze z nadmiarem suchego lodu.
  11. Napełnij formę do zatapiania czystym OCT (bez sacharozy). Wypełnij tuż poniżej górnej krawędzi formy.
  12. Zamrażać próbkę hydrożelu przez zanurzenie w schłodzonym 2-metylobutanie, a następnie przystąpić do cięcia.
  13. Próbkę należy podzielić na sekcje za pomocą kriostatu; zaleca się grubość przekroju 10-18 μm i temperaturę przekroju około -26 °C.
  14. Wykonaj standardowe procedury barwienia immunologicznego na podzielonej kulturze żelowej, jak opisano wcześniej3.
    UWAGA: PFA jest znany jako czynnik drażniący i rakotwórczy. Prosimy o obchodzenie się z PFA i utylizację zgodnie z lokalnie obowiązującymi normami i przepisami.

7. Całkowita ekstrakcja RNA z próbek w hydrożelu

Uwaga: Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący komercyjny zestaw (zobacz Tabelę Materiałów) do ekstrakcji całkowitego RNA z komórek hodowanych hydrożelem. Zderzaki i cały materiał są dostępne w ramach używanego zestawu.

  1. Usuń pożywkę hodowlaną. Użyj pipety transferowej P1000 z końcówką o szerokim otworze, aby przenieść kulturę hydrożelu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodać 350 μl buforu RLT do kultury hydrożelu.
  3. Za pomocą igły o pojemności 20 g dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml rozdrobnić żel, przepychając całą mieszaninę przez igłę co najmniej 20 razy.
  4. Przenieść całą mieszaninę do kolumny homogenizatora umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować przy 13 000 x g przez 2 min.
  5. Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uważaj, aby nie naruszyć osadu żelu na dnie.
  6. Zmieszać próbkę lizatu z 350 μl 100% etanolu. Przenieść całą próbkę do kolumny wirowej (z zestawu) umieścić w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować przez 1 minutę przy 13 000 x g.
  7. Aby zapoznać się z kolejnymi krokami oczyszczania RNA do PCR, postępuj zgodnie z ogólnym protokołem dostarczonym przez producenta zestawu.
    UWAGA: Po ekstrakcji RNA można zastosować standardowe protokoły PCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dla każdej partii tiolowanego HA należy zweryfikować stopień tiolowania za pomocą H1-NMR lub testu Ellmana. Modyfikacja HA przy użyciu opisanej tutaj procedury konsekwentnie generuje ~5% tiolowania (definiowanego jako stosunek molowy tioli do disacharydów HA) (Rycina 1).

Wdrożenie tej nowej platformy hodowlanej będzie wymagało od każdego laboratorium przeprowadzenia rygor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Generowanie powtarzalnych danych przy użyciu tego systemu hodowli 3D wymaga: 1) konsekwentnej tiolacji HA między partiami, 2) praktyki w celu osiągnięcia wydajnego mieszania prekursorów hydrożelu i obchodzenia się z kulturami hydrożelu w celu zapobiegania uszkodzeniom oraz 3) zoptymalizowanej gęstości wysiewu dla każdej użytej linii komórkowej.

Gdy w hydrożelu pożądany jest określony procent wagowy HA, stopień tiolowania HA określa gęstość usieciowania. Zalecamy stosowanie stałej ilości kwasu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została wsparta funduszami z NIH (R21NS093199) i UCLA ARC 3R's Award. Serdecznie dziękujemy laboratorium dr Harleya Kornbluma za dostarczenie linii komórkowych HK301 i HK157. Dziękujemy również UCLA Tissue Pathology Core Laboratory (TPCL) za kriosekcję, Advanced Light Microscopy/Spectroscopy core facility (ALMS) w California Nanosystems Institute (CNSI) na UCLA za korzystanie z mikroskopu konfokalnego, UCLA Crump Institute for Molecular Imaging za korzystanie z systemu obrazowania IVIS, UCLA Molecular Instrumentation Center (MIC) za zapewnienie spektroskopii rezonansu magnetycznego oraz Flow Cytometry Core w Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) na UCLA za dostarczenie oprzyrządowania do cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pH-metrThermo FisherN/ADowolny pH-metr o czułości pH 2-10
Płytka mieszającaThermo FisherN/AOgólne wyposażenie laboratoryjne
Kolba Erlenmeyera (125 ml)Termo FisherFB-501-125
rurki dializacyjneThermo Fisher21-152-14
Zlewka polipropylenowa 2LThermo FisherS01916
hialuronian soduLifecoreHA700k-5500-750 kDa zakres
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimid (EDC)Thermo FisherPI-22980
N-hydroksysukcynimid (NHS)sigma aldrich130672-5G
Kwas solny (HCl)Thermo FisherSA48-500
Wodorotlenek sodu (NaOH)Thermo FisherSS266-1
Dichlorowodorek cystaminyThermo FisherAC111770250
Ditiolthreitol (DTT)Thermo FisherBP172-25
Odczynnik testowy Ellmana (kwas 5-(3-karboksy-4-nitrofenylo)disulfanylo-2-nitrobenzoesowySigma AldrichD218200-1G
Woda deuterowana (tlenek deuteru)Thermo FisherAC166301000
0,22 i mikro; m Filtr próżniowyCellTreat229706
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo FisherP32080-100T
Zrównoważona sól solna Hanksa (HBSS)Thermo FisherMT-21-022-CV
4-ramię-PEG-maleimidJenKem TechnologyA7029-1masa cząsteczkowa około 20kDa
4-ramię-PEG-tiolJenKem TechnologyA7039-1masa cząsteczkowa około 20kDa
L-cysteina sigma aldrichC7880-100G
RGD ECM peptyd mimetycznyGenscript BiotechN/ANiestandardowy peptyd z sekwencją "GCGYGRGDSPG", N-koniec powinien być acetylowanymi
formami silikonowymiSigma AldrichGBL664201-25EAUżyj żyletki, aby pokroić na pojedyncze kawałki
kompletne podłoże hodowlaneRóżneRóżneDMEM/F12 (Thermofisher) z suplementem bez surowicy (G21 od GeminiBio), naskórkowym czynnikiem wzrostu 50ng/ml (Peprotech), czynnikiem wzrostu fibroblastów 20ng/ml (Pepro Tech) i heprainą 25µ g / ml (Sigma Aldrich), pożywka hodowlana różni się w różnych laboratoriach
komórka GBM pochodząca od pacjenta N/AN/A
igła 20GBDmedyczna 305175
strzykawka 1mLThermo Fisher14-823-434
10mL strzykawkaBD medyczna302995
RIPA BuforThermo FisherPI-89901
proteaza/ inhibitor fosfatazy mini tabletkasigma aldrich5892970001
wytrząsarka wirowaThermo Fisher12-814-5Q
TrypLE expressThermo Fisher12604013
70µ m sitko komórkoweThermo Fisher22-363-548
ParaformaldehydThermo FisherAC416785000Rozpuścić 4% (w/v) w PBS, utrzymać pH 7,4
D-sacharozaThermo FisherBP220-1
Optymalna temperatura cięcia (O.C.T.) związekThermo FisherNC9373881
Inkubator kultur komórkowychThermo FisherN/ADowolny ogólny z 5% CO2 i 37C
lodówko-zamrażarkąThermo FisherN/ADowolny sprzęt General Lab o pojemności -20C i -80C
Jednorazowe formy do zatapianiaThermo Fisher12-20
LyapholizerLabconcoN/ADowolne liofilizatory -105C
HEPESThermo FisherBP310-500
Bursztynowa fiolkaKimble Chase60912D-2
Końcówki do pipet z szeroką kryząThermo Fisher9405120
2-metylobutanThermo Fisher03551-4
Suchy lódN/A/A
N

Bibliografia

  1. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
  2. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  3. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  4. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  5. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
  6. Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
  7. Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
  8. Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
  9. Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. Role of hyaluronan in glioma invasion. Cell adhesion & migration. 2 (3), 202-207 (2008).
  10. Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
  11. Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
  12. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  13. Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
  14. Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
  15. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
  16. Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
  17. Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201(2015).
  18. Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
  19. Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
  20. Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
  21. Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
  23. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  24. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  25. Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327(2014).
  26. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  27. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  28. Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
  29. Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
  30. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
  31. Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
  32. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hydrożele kwasu hialuronowegotrójwymiarowa hodowla komóreksieciowanie hydrożeluenkapsulacja komórekcytometria przepływowaWestern blottingkriosekcjonowaniepeptydy mimetyczne ECMhodowla sfer gliomy
Hydrożele na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.