Artykuł metodologiczny

Niedrożność tętnicy środkowej mózgu umożliwiająca reperfuzję poprzez wspólną naprawę tętnicy szyjnej u myszy

19.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58191

⸱

23 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Psychology and Behaviour, University of Leicester, 2Preclinical Imaging Facility, Core Biotechnology Services, University of Leicester, 3School of Psychology, University of Nottingham

W tym artykule

Podsumowanie

Wewnątrzświateł okluzja włókien środkowej tętnicy mózgowej jest najczęściej używanym modelem in vivo eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Wykonuje się tutaj alternatywne podejście chirurgiczne umożliwiające naprawę tętnicy szyjnej wspólnej, które umożliwia reperfuzję tętnicy szyjnej wspólnej i pełną reperfuzję do obszaru tętnicy środkowej mózgu.

Streszczenie

Udar niedokrwienny jest główną przyczyną długotrwałej niepełnosprawności i zgonów dorosłych na całym świecie. Obecnie dostępne metody leczenia są ograniczone, a tylko tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest zatwierdzonym lekiem ukierunkowanym na udary niedokrwienne. Obecne badania w dziedzinie udaru niedokrwiennego mózgu koncentrują się na lepszym zrozumieniu patofizjologii udaru mózgu w celu opracowania i zbadania nowych celów farmaceutycznych. Wiarygodne eksperymentalne modele udaru mózgu mają kluczowe znaczenie dla postępu potencjalnych metod leczenia. Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest klinicznie istotny i jest najczęściej stosowanym chirurgicznym modelem udaru niedokrwiennego u gryzoni. Jednak wyniki tego modelu, takie jak objętość zmian, są związane z wysokim poziomem zmienności, szczególnie u myszy. Opisany tutaj alternatywny model MCAO umożliwia reperfuzję tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) i zwiększoną perfuzję terytorium tętnicy środkowej mózgu (MCA) przy użyciu podkładki tkankowej z uszczelniaczem na bazie fibrynogenu w celu naprawy naczynia oraz poprawę dobrostanu myszy poprzez unikanie podwiązania tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Zmniejsza to zależność od koła Willisa, o którym wiadomo, że jest wysoce zmienny anatomicznie u myszy. Reprezentatywne dane pokazują, że zastosowanie tego alternatywnego podejścia chirurgicznego zmniejsza zmienność objętości zmian między tradycyjnym podejściem MCAO a alternatywnym podejściem opisanym tutaj.

Wprowadzenie

Główną przyczyną udaru mózgu jest ogniskowe niedokrwienie na obszarze tętnicy środkowej mózgu. Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest jedynym dostępnym leczeniem farmakologicznym o udowodnionej skuteczności, pomimo licznych badań klinicznych leków ukierunkowanych na udar niedokrwienny1,2. Jednak ze względów bezpieczeństwa i wąskiego okna terapeutycznego (< 4,5 godziny), tylko ~15% wszystkich pacjentów z udarem kwalifikuje się do otrzymania tPA, a wskaźniki rekanalizacji mogą wynosić < 50%3,4.

Powtarzalne i klinicznie istotne modele zwierzęce udaru mózgu są uważane za niezbędne do informowania o rozwoju nowych i potencjalnych metod leczenia udaru mózgu. Jednak ze względu na obawy dotyczące spójności i zmienności wyników z modelami zwierzęcymi, ważne jest, aby udoskonalić istniejące modele in vivo, aby poprawić przełożenie badań przedklinicznych na kliniczne. Brak przełożenia z przedklinicznej skuteczności eksperymentalnej potencjalnych terapii na zastosowanie kliniczne jest ciągłym problemem dla badań nad udarem5. Przyczyny niepowodzenia translacji mogą być wielorakie i mogą być związane na przykład z projektem badania, opóźnieniami w leczeniu, niejednorodnością kliniczną udaru mózgu oraz ograniczeniami zastosowanych modeli zwierzęcych6. Kluczowym wyzwaniem dla badań nad udarem mózgu pozostaje opracowanie bezpiecznych i skutecznych metod leczenia.

Zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCAO) przez wprowadzenie filamentu śródświetlnego jest najczęściej używanym modelem eksperymentalnego udaru u gryzoni in vivo. Model ten umożliwia przywrócenie przepływu krwi po indukcji niedokrwienia, naśladując zdarzenia zachodzące w ludzkim udarze mózgu7. Jednak, w szczególności u myszy, niejednorodne objętości zmian o różnych odchyleniach standardowych występują, mimo że stosowane są określone protokoły chirurgiczne8,9,10. Typowy jest bimodalny rozkład małych objętości zmian prążkowiowych i dużych objętości zmian prążkowiowo-korowych11. Aby wywołać niedokrwienie, włókno jest zwykle wprowadzane przez nacięcie CCA lub ECA, które następnie pozostają trwale podwiązane12. Trwałe podwiązanie CCA zapobiega przywróceniu przepływu krwi do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), a następnie do terytorium MCA. Powoduje to, że reperfuzja jest zależna od dostaw ubocznych w Kręgu Willisa (Krowa). Struktura krowy wykazuje zmienność anatomiczną między poszczególnymi zwierzętami, szczególnie u myszy C57BL/6 - szczepu zwykle używanego w badaniach nad udarem in vivo13. Alternatywna metoda, polegająca na wprowadzaniu włókien przez ECA, pozwala na ciągłą perfuzję przez CCA, ale ta metoda zagraża dopływowi tętnic na terytorium ECA, co wykazano u szczurów ma szkodliwy wpływ na dobrostan zwierzęcia14.

Poleganie na CoW w zakresie dostarczania zabezpieczeń i reperfuzji w ustalonym modelu MCAO może, częściowo, tłumaczyć zmienność objętości zmian po okluzji. Opisujemy alternatywną procedurę chirurgiczną na myszy, w której unika się podwiązania ECA, a nacięcie CCA jest naprawiane, umożliwiając w ten sposób reperfuzję przez CCA, niezależnie od CoW. Wcześniej wykazano, że naprawa nacięcia CCA u szczurów skutkuje udaną reperfuzją za pomocą CCA15. Z powodzeniem zastosowaliśmy to podejście u myszy11 i podajemy tutaj protokół, który skutkuje zmniejszoną zmiennością objętości zmiany, główną miarą wyników stosowaną w eksperymentalnych badaniach nad udarem.

W tym protokole pokazujemy, jak przeprowadzić MCAO poprzez wprowadzenie filamentu do naczynia CCA, a następnie naprawę naczynia CCA, co obejmuje nałożenie podkładki tkankowej i uszczelniacza, aby umożliwić reperfuzję.

Protokół

Ten protokół i raportowane dane zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku (licencja projektu 60/4315) i po instytucjonalnym zatwierdzeniu etycznym. Wszystkie eksperymenty są raportowane zgodnie z wytycznymi Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE)16.

1. Przygotowanie

  1. Dorosłe samce myszy C57BL/6 należy zapoznać z opieką pooperacyjną (np. środowiskiem, ściółką, pokarmami regeneracyjnymi) co najmniej 48 godzin przed zabiegiem.
    UWAGA: Zwierzęta po MCAO często mają trudności z jedzeniem i piciem po operacji.
    1. Aby zapobiec nadmiernej utracie masy ciała po operacji, przyzwyczaj zwierzęta do każdej diety po MCAO, na przykład umieszczając żel nawadniający, karmę w żelu i namoczone/mokre granulki normalnej diety bezpośrednio na podłodze klatki.
    2. Zmień ściółkę klatki na ściółkę pooperacyjną, taką jak biały papier.
  2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed rozpoczęciem operacji lub zabiegów.
    1. W tym celu należy sterylizować narzędzia w autoklawie (w temperaturze co najmniej 121 °C, 15 psi przez 15 minut) lub użyć tlenku etylenu (zgodnie z instrukcjami producenta, przez 8–10 godzin).
    2. Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie przed rozpoczęciem zabiegu. Przykryj wszystkie powierzchnie sterylnymi obłożeniami chirurgicznymi lub folią autoklawowaną w przypadku przedmiotów, które wymagają obsługi podczas operacji. Przez cały czas trwania zabiegu należy stosować technikę aseptyczną.
      UWAGA: Folia autoklawizowana może być używana do przykrycia narzędzi lub sprzętu, który musi być trzymany podczas zabiegu. Za pomocą sterylnych rękawiczek i technik można nałożyć folię, a następnie przedmiot można umieścić w sterylnym polu. Następnie konieczna będzie sterylna wymiana rękawic.

2. Chirurgia niedrożności tętnicy środkowej mózgu

  1. Należy użyć dorosłego samca myszy C57BL/6 o wadze 24–31 g w czasie operacji. Wywołać znieczulenie za pomocą 5% izofluranu w 2 l/minO2 w czerwonej plastikowej komorze anestezjologicznej.
  2. Po indukcji należy zredukować izofluran, aby utrzymać odpowiednią głębokość znieczulenia do zabiegu (np. 1,5–2% w 70% N2O2/30% O2), podawaną za pomocą maski na twarz połączonej z systemem zmiatającym w celu zmniejszenia ekspozycji chirurga na izofluran.
    UWAGA: Podtlenek azotu (N2O2) może być stosowany w połączeniu z tlenem (O2) w celu zmniejszenia wymaganej ilości izofluranu w celu uzyskania odpowiedniej głębokości znieczulenia.
  3. Analgezję ogólnoustrojową należy podawać przedoperacyjnie [karprofen, 10 mg/kg podskórnie (sc.)] i znieczulenie miejscowe do miejsca nacięcia (bupiwakaina, 2 mg/kg mc., rozcieńczona w stosunku 1:10 w 0,9% soli fizjologicznej) w okresie okołooperacyjnym
    4. .
  4. Podawać płyny przez wstrzyknięcia dootrzewnowe (ip.) 200 μl sterylnego, wstępnie podgrzanego 0,9% roztworu NaCl przed operacją.
  5. Ogol sierść prawej okolicy skroniowej i brzusznej okolicy szyi za pomocą małych maszynek do strzyżenia włosów, aby odsłonić skórę. Zdezynfekuj obszar skóry po operacji, używając 5% roztworu chlorheksydyny przez 3 minuty. Nałóż lubrykant do oczu na oba oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu.
    UWAGA: Jeśli jest to wymagane do odczytów pulsoksymetrii w celu monitorowania nasycenia krwi tlenem, tętna i częstości oddechów, użyj kremu do depilacji, aby oczyścić tylną nogę z włosów. Nałóż krem za pomocą czystych patyczków kosmetycznych, a po depilacji umyj obszar rozcieńczonym roztworem chlorheksydyny. Wykonaj ten krok w obszarze przedoperacyjnym, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia sterylnego pola operacyjnego luźnym futrem. Badacze mogą preferować stosowanie innych preparatów miejsca operowanego zgodnie z lokalną praktyką.
  6. Przenieś mysz na obszar operacyjny i umieść ją w pozycji leżącej na homeotermicznej macie grzewczej przykrytej sterylną serwetą. Utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego. Włóż sondę doodbytniczą, aby monitorować temperaturę ciała myszy i utrzymywać ją na poziomie 37,0 ± 0,6 °C.
    1. Przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć chirurgicznych należy sprawdzić odruch wycofania tylnej łapy i odruch mrugania, aby potwierdzić głębokość znieczulenia.
  7. Podłącz laserową sondę przepływomierza dopplerowskiego (LDF), aby zarejestrować przepływ krwi do terytorium MCA.
    1. Za pomocą stereoskopu preparacyjnego wykonaj nacięcie < 1 cm w połowie drogi między prawym okiem a uchem na odsłoniętej skórze skroniowej za pomocą skalpela nr 15. Tępo wypreparuj leżącą pod spodem tkankę pokrywającą czaszkę, delikatnie zeskrobując ją z kości i osuszając powierzchnię sterylnymi wacikami.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić mięśnia skroniowego.
    2. Chwyć za elastyczną pojedynczą sondę światłowodową o średnicy 0,7 mm przymocowaną do monitora LDF, odetnij jej koniec za pomocą ostrego skalpela, aby uzyskać płaską krawędź, przepchnij ją przez uchwyt sondy w kształcie pączka i umieść niewielką ilość żelu optycznego na końcu światłowodu.
    3. Umieść niewielką ilość wodoodpornego, super adhezyjnego kleju wokół dolnej krawędzi uchwytu sondy; pozwól mu częściowo wyschnąć i stać się lepkim.
    4. Osusz czaszkę powyżej kości skroniowej i umieść niewielką ilość miejscowego kleju tkankowego w okręgu do kości, tylko tyle, aby pomieścić uchwyt sondy.
    5. Umieść uchwyt sondy, gdy sonda światłowodowa jest już na miejscu, w tym obszarze (6 mm z boku i 2 mm dystalnie od bregmy).
    6. Poczekaj, aż klej wyschnie; po wyschnięciu i przymocowaniu rozpocznij rejestrowanie danych LDF.
  8. Delikatnie obróć zwierzę do pozycji leżącej, uważając, aby podeprzeć laserową sondę dopplerowską i zapobiec jej odłączeniu. Delikatnie przyklej dwie przednie łapy mikroporowatą taśmą medyczną, wsuwając parę wacików (lub coś podobnego, takiego jak zamknięte kleszcze) pod szyję, aby podnieść obszar i wytworzyć napięcie. Przykryj mysz sterylną serwetą, aby zachować aseptyczne pokrycie.
  9. Rozpocznij sekcję i odsłonięcie CCA.
    1. Wykonaj 1,5 cm nacięcie w linii środkowej na odsłoniętej szyi brzusznej za pomocą ostrza skalpela nr 15.
    2. Stosując delikatne techniki preparowania, delikatnie cofnij gruczoły ślinowe na boki, odsłaniając tchawicę.
    3. Stosując preparowanie, wypreparuj CCA z otaczającej tkanki i nerwu błędnego.
      UWAGA: Unikaj bezpośredniego dotykania nerwu błędnego, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie nerwu błędnego może upośledzać mobilność, karmienie i oddychanie.
  10. Przełóż dwa małe (2 cm) odcinki nierozpuszczalnego szwu 6-0 poniżej CCA, grzbietowo do naczynia i brzusznie do nerwu błędnego. Przyciągnij jeden jedwabny krawat bliżej chirurga i zawiąż go ciasno wokół CCA (krawat proksymalny). Luźno zawiązać drugą jedwabną krawat (dystalną krawat) w kierunku rozwidlenia ICA/ECA.
  11. Aby rozpocząć izolowanie odcinka CCA, przyłóż klips mikronaczyniowy tuż nad dystalnym wiązaniem, ale nie blokując rozwidlenia. Za pomocą nożyczek micro Vannas zrób mały otwór w CCA.
    UWAGA: Europejski Trybunał Obrachunkowy musi przez cały czas pozostać patentem. Nacięcie CCA nie może być większe niż 40% szerokości naczynia i w łatwo dostępnym miejscu brzusznym; Będzie to odgrywać ważną rolę na etapie naprawy statku po MCAO.
  12. Włóż monofilament pokryty silikonem 7-0 do CCA, przesuwając się w kierunku klipsa mikronaczyniowego.
    UWAGA: Rozmiar filamentu musi być ustalony na podstawie wagi myszy przed zabiegiem; Zapoznaj się z wytycznymi producenta.
    1. Dokręć dystalną opaskę na tyle, aby przymocować żarnik na miejscu, nie uszkadzając go. Zdejmij zacisk mikronaczyniowy za pomocą uchwytów na klipsy.
      Uwaga: W tym momencie nie powinna być widoczna utrata krwi. Jeśli występuje cofanie się krwi, opaska przytrzymująca włókno nie jest wystarczająco ciasna.
  13. Przesuń żarnik do ICA.
    1. Upewnij się, że włókno pozostaje w ICA i nie przechodzi do tętnicy skrzydłowo-podniebiennej (PPA). Zrób to, lekko podnosząc i ciągnąc CCA, za pomocą jednego z jedwabnych opasowań, na zewnętrzną stronę ciała zwierzęcia i kierując włóknem tak, aby wygiął się poza wewnętrznie skierowany otwór PPA.
      Uwaga: Po przejściu do punktu początkowego gałęzi MCA, na wartościach LDF widoczny będzie spadek względnego przepływu krwi do dostarczonego terytorium; Potwierdza to umiejscowienie filamentu.
  14. Zabezpiecz filament na miejscu za pomocą dystalnej jedwabnej opaski, wiążąc ją mocniej. Pozostaw go na miejscu na czas trwania okluzji.
    UWAGA: W zależności od indywidualnych protokołów, zwierzę może zostać przeniesione do klatki rekonwalescencji, po zszyciu rany, w celu powrotu do zdrowia lub pozostać w znieczuleniu przez cały okres okluzji. W tym drugim przypadku upewnij się, że rana nie wysycha, używając sterylnej, wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej o stężeniu 0,9% NaCl.

3. Po okluzji

  1. Pod koniec okresu MCAO natychmiast wycofaj żarnik, aż biała główka żarnika będzie wyraźnie widoczna.
  2. Następnie poluzuj dystalną opaskę CCA na tyle, aby całkowicie wyjąć głowicę żarnika z naczynia.
    UWAGA: W tym momencie włókno można całkowicie usunąć, jeśli chirurg jest pewny szybkości, aby zawiązać dystalną opaskę, aby zapobiec utracie krwi.
  3. Umieść jeden klips mikronaczyniowy w pozycji poziomej w kierunku rozwidlenia CCA obok dystalnego krawata. Poluzuj dystalną opaskę i całkowicie wyjmij filament. Dodaj kolejny klips mikronaczyniowy poniżej proksymalnego krawata CCA w kierunku chirurga.
    UWAGA: Upewnij się, że naczynie jest wystarczająco głęboko w zęby clamp, aby zapobiec poślizgowi. Rozmieszczenie klipsów jest niezbędne, aby zapewnić łatwy dostęp do narzędzi do usuwania klipsów podczas późniejszych kroków. Klipsy mogą być używane do podnoszenia naczynia, aby umożliwić lepsze prześwitywanie i umieszczanie łaty tkankowej, umieszczając klipsy poziomo w poprzek otaczających mięśni.
  4. Ostrożnie usuń oba jedwabne krawaty za pomocą kleszczyków Dumont #5 lub nożyczek micro Vannas i osusz obszar za pomocą sterylnych patyczków kosmetycznych.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie przeciąć naczynia.
  5. Na sterylnej szalce Petriego dodać roztwory fibrynogenu i trombiny 1 i 2 (patrz Tabela Materiałów), upewniając się, że te dwie substancje pozostają oddzielone, gotowe do późniejszego wymieszania.
    UWAGA: Wymagane są tylko bardzo małe objętości środków (< 0,25 ml każdy). Trzymanie roztworów oddzielnie zapobiega przedwczesnej reakcji między dwoma składnikami. Upewnij się, że nasadka została założona w taki sam sposób, w jaki została zdjęta, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu obu strzykawek, co mogłoby spowodować reakcję środka i osadzenie się w strzykawce. Przed użyciem roztwory należy przechowywać w temperaturze -20 °C. W razie potrzeby do pierwszego zabiegu rozmrozić szczeliwo do temperatury pokojowej. Nie zamrażaj ponownie szczeliwa; Musi pozostać w temperaturze pokojowej i w ten sposób może być przechowywany. Strzykawka może być używana w wielu operacjach, co czyni ją opłacalną; Zalecamy jednak, aby nie używać tej samej fiolki dłużej niż 1 tydzień, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  6. Użyj cięcia wzdłuż mięśnia za pomocą kleszczy Dumont nr 5 i mikronożyczek Vannas, aby uzyskać cienki brzuszny plasterek mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego do użycia jako podkładka tkankowa, upewniając się, że plaster nie ma więcej niż 1 mm grubości i biegnie wzdłuż górnych włókien mięśnia.
    UWAGA: Nie przecinaj mięśnia na wylot, ponieważ znacznie upośledz to jego funkcję. Tkanka musi być wystarczająco duża, aby wygodnie pokryć nacięcie CCA.
  7. Za pomocą kleszczyków Dumont #5 weź podkładkę tkankową i równomiernie wymieszaj tkankę w dwóch roztworach fibrynogenu i trombiny, tworząc kanał między dwoma odczynnikami. Koagulacja nastąpi szybko; gdy tylko rozpocznie się krzepnięcie, usuń podkładkę tkankową do nacięcia CCA. Umieść podkładkę higieniczną płasko z średnio mocnym naciskiem i otwórz kleszcze.
    1. Szybko zdejmij dystalny klips mikronaczyniowy, jednocześnie delikatnie przytrzymując opuszkę tkankową na miejscu.
      Uwaga: Pozwala to na pewien cofanie się krwi w celu dalszej aktywacji odczynników uszczelniających fibrynogen i trombinę. Wymagany jest wystarczający nacisk, aby utrzymać podkładkę na miejscu, ale nie do całkowitego zablokowania naczynia.
    2. Powoli zmniejszaj nacisk z poduszki tkankowej, umożliwiając przepływ krwi pod obszarem nacięcia. Teraz powoli i delikatnie zwolnij nacisk z bliższego klipsa mikronaczyniowego i całkowicie usuń.
    3. UWAGA: Aby zapewnić, że naczynie stanie się w pełni opatentowane, umieszczenie podkładki tkankowej i usunięcie klipsów mikronaczyniowych musi nastąpić szybko, aby zapobiec uszczelnieniu się podkładki tkankowej do wnętrza CCA. Jeśli jednak wyciek krwi jest niewielki, ponownie lekko dociśnij opuszkę tkankową, aby dać więcej czasu na utworzenie się skrzepu i uszczelnienie. Jeśli wyciek krwi jest znaczny lub wkładka tkankowa nie wydaje się uszczelniać, utrzymuj ciśnienie, aby zapobiec utracie krwi i wymień oba klipsy mikronaczyniowe CCA, aby odizolować nacięcie i zapobiec dalszej utracie krwi.
  8. W przypadku, gdy opaska tkankowa nie przylega do naczynia, można podjąć drugą próbę, wykonując kroki 3.3–3.7.3.
  9. Po uszczelnieniu naczynia zszyj ranę za pomocą rozpuszczalnych szwów 6-0. Jeśli zapis LDF był kontynuowany przez cały czas operacji, usuń LDF z czaszki i zszyj ranę za pomocą rozpuszczalnego szwu 6-0.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Umieścić zwierzę w wstępnie ogrzanej klatce (umieszczonej na podgrzewanej półce/macie w temperaturze 35 °C lub w ogrzewanej komorze).
    UWAGA: Badacze mogą preferować stosowanie innych temperatur i czasów trwania zgodnie z lokalną praktyką.
  2. Dostarczyć wszystkim zwierzętom 200 μl podgrzanego 0,9% roztworu soli fizjologicznej NaCl bezpośrednio po operacji, po 4 godzinach od operacji i 2 razy dziennie przez 72 godziny
    UWAGA: Podawanie podgrzanego 0,9% NaCl jest prowadzone przez zwierzęta. Jeśli potrzeba więcej, można podać więcej płynów, aby zapewnić dobrą regenerację.
  3. W klatce regeneracyjnej zapewnij zwierzętom nieograniczony dostęp do rozmoczonych granulek dietetycznych, suchych granulek dietetycznych, żelu nawadniającego i karmy w żelu, a także dostępu ad libitum do wody.
  4. Powtórzyć wstrzyknięcie karprofenu po 24 godzinach od operacji (patrz krok 2.3).
    UWAGA: Wszystkie zwierzęta otrzymały taką samą dawkę karprofenu; Jakiekolwiek działanie neuroprotekcyjne może być znikome.
  5. W regularnych odstępach czasu przez 48 godzin wykonuj pooperacyjny grymas myszy scoring17, aby ocenić poziom bólu, aby pomóc w podjęciu decyzji o podaniu dalszej analgezji.
  6. Zważ zwierzęta bezpośrednio przed operacją, a następnie codziennie po zabiegu. Wykonuj codzienne obserwacje i wypełniaj arkusze dobrostanu, aby monitorować spożycie pokarmu i wody oraz objawy kliniczne.
  7. Wykonaj obserwacje funkcjonalne po 24 godzinach i 48 godzinach po operacji. Oceń myszy na ogniskowej skali deficytu. Oceń ich symetrię ciała, obowiązkowe krążenie, chód, wspinanie się pod kątem 45°, zachowanie podczas krążenia, asymetrię kończyn przednich i reakcję na dotyk wąsa18,19,20.

5. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego i przetwarzanie obrazów

  1. Zmierz objętość zmiany (LV) za pomocą obrazowania strukturalnego rezonansu magnetycznego (MRI).
    UWAGA: Alternatywne metody, takie jak barwienie histologiczne chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC), były już wcześniej stosowane i korelują ze strukturalnymi danymi MRI. Metodę tę można jednak stosować tylko w punkcie końcowym badania, a nie w ujęciu podłużnym. Korzystanie z podłużnego rezonansu magnetycznego zmniejszy liczbę zwierząt potrzebnych do badania.
    1. Po 48 godzinach, po indukcji MCAO, znieczulij mysz izofluranem (5% izofluranu w 1 l/minO2 do indukcji, 1,5–2% izofluranu do podtrzymania).
    2. Przenieś mysz do podstawki do rezonansu magnetycznego, umieść ją na czujniku oddechu w celu monitorowania częstości oddechów i wszczepij sondę temperatury doodbytniczo, aby monitorować jej temperaturę podczas skanowania. Umieść 2-kanałową cewkę odbiorczą RF z mózgiem myszy nad mózgiem, aby uzyskać sygnał i umieść kołyskę w skanerze z otworem poziomym 9,4 T.
      UWAGA: W tym przypadku do transmisji RF zastosowano cewkę objętościową o średnicy wewnętrznej 72 mm.
    3. Uzyskuj skany zależne od T2 za pomocą szybkiej sekwencji echa spinowego. Ustaw czas powtarzania (TR) na 3 000 ms, a czas echa (TE) na 40 ms. Użyj 18 mm x 18 mm jako pola widzenia (FOV) i uzyskaj matrycę akwizycji 256 x 256 z warstwami 18 mm x 0,8 mm i trzema średnimi sygnałami w ciągu około 10 minut.
    4. Pozyskiwanie obrazów tensorów dyfuzji (DTI) za pomocą szybkiej sekwencji spin-echo. Ustaw TR na 1,730 ms, TE na 35 ms, FOV na 20 mm x 20 mm i uzyskaj matrycę akwizycji 128 x 128 z warstwami 16 mm x 1 mm, dwoma średnimi sygnałów, 14 kierunkami kodowania dyfuzji i maksymalną wartością b 1,024 s/mm2.
    5. Zmierz LV na obrazach T2-zależnych za pomocą pakietu oprogramowania do wyświetlania obrazu i pomiaru. Zmierz obszar zmieniony chorobowo, zestawiając wartości razem, aby obliczyć całkowitą objętość zmiany, biorąc pod uwagę grubość warstwy MRI (ustawioną podczas badania MRI).
    6. Weź pod uwagę wszelkie obrzęki i procent objętości zmian obszarowych podczas pomiaru pełnej półkuli przeciwległej i ipsilateralnej. Skoryguj obrzęk mózgu spowodowany obrzękiem za pomocą metody pośredniej, aby zmierzyć objętość zmiany, jak opisano wcześniej21,22. Uwzględnij tylko wycinki, które zawierają tkankę kory mózgowej, a nie płat czołowy lub tkankę móżdżku, zgodnie ze standardowym atlasem mózgu myszy, aby uniknąć nadmiernej korekcji.
  2. Zmierz parametry dyfuzji zmian i uzyskaj interesujące Cię obszary rdzenia i półcienia.
    1. Wygeneruj mapy pozornego współczynnika dyfuzji (ADC) i anizotropii frakcyjnej (FA) na podstawie obrazów tensora dyfuzji za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy MRI.
    2. Wyrównaj obrazy DTI z obrazami ważonymi T2 za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, które jest w stanie wykonać liniową rejestrację obrazów. Po rejestracji odejmij maski zmian dyfuzyjnych (rdzeń niedokrwienny) od masek zmian T2-zależnych (rdzeń niedokrwienny i półcień), aby oszacować obszar półcienia. Zastosuj wynikowe maski (rdzeń i półcień) do map ADC i FA, aby określić ilościowo parametry dyfuzji w rdzeniu i półcieniu.
    3. Przesuń rdzeń ipsilateralny i maski półcienia wokół linii środkowej mózgu, aby uzyskać kontralateralne wartości ADC i FA do porównania.

Wyniki

W badaniu wykorzystano łącznie 24 dorosłe samce myszy szczepu C57BL/6 o masie ciała od 24 do 31 g w momencie operacji. Jedno zwierzę padło po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO), a jedno zostało wykluczone z powodu powikłań chirurgicznych. Przedstawione tutaj dane pochodzą z wcześniej opublikowanej pracy autorów. Zostały one wykorzystane do zilustrowania wpływu naprawy naczynia na wyniki po MCAO.11Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Normalność rozkładu danych oceniono statystycznie za pomocą testu normalności D'Agostino-Pearsona. Dane parametryczne porównano za pomocą testu t Studenta t-test (dla dwóch średnich) oraz jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem Sidaka (dla wielu średnich). Dane nieparametryczne porównano za pomocą testu U Manna-Whitneya. Zmienność danych parametrycznych oceniono za pomocą F-test, a zmienność danych nieparametrycznych oceniono za pomocą testu Levene'a.

Typowo w procedurach MCAO filament zamykający jest wprowadzany do CCA, a ECA jest podwiązywana, aby zapobiec przesunięciu się filamentu do ECA zamiast do ICA. Rezygnacja z podwiązania ECA oraz zastosowanie leków przeciwbólowych wykazały tendencję do zmniejszenia utraty masy ciała 48 h po MCAO w porównaniu z danymi z poprzednich badań przeprowadzonych przez tego samego chirurga dla tego samego czasu MCAO z zastosowaniem podwiązania ECA i bez leków przeciwbólowych, podczas gdy LV wydawała się nie być dotknięta, patrz Rysunek 1.

Myszy poddano 60-minutowej ischemii indukowanej MCAO, po której nastąpiła reperfusja z naprawą naczynia CCA lub z zastosowaniem typowego podejścia z ligacją CCA. Schemat naprawionej CCA ligowanej i nieligowanej przedstawiono na Rysunku 2.

Do potwierdzenia perfuzji przepływu krwi w obszarze MCA podczas MCAO, przed i po naprawie naczynia CCA, wykorzystano laserową dopplerometrię przepływu. Rysunek 3 pokazuje, że 5 min po usunięciu filamentu regionalny mózgowy przepływ krwi (rCBF) uległ znacznemu zwiększeniu w obszarze mózgu zaopatrywanym przez MCA. Perfuzja była utrzymywana aż do momentu naprawy naczynia, a po naprawie naczynia CCA odnotowano wzrost perfuzji w obszarze MCA, co sugeruje, że naprawa CCA umożliwiła zwiększenie perfuzji krwi w obszarze niedokrwiennym w porównaniu do polegania wyłącznie na kręgu Willisa.

Do określenia całkowitej objętości zawału lewej komory (LV) wykorzystano MRI ważone T2, a do określenia rdzenia LV – skany DTI, 48 h po MCAO. Rycina 4A nie wykazuje istotnych różnic w całkowitej objętości ani w rdzeniu LV pomiędzy grupą z procedurą naprawczą a grupą z ligaturą. Jednakże zmienność danych dla całkowitej objętości i rdzenia LV, oceniana za pomocą testu Levene'a dla danych nieparametrycznych lub testu F dla danych parametrycznych, była istotnie mniejsza w grupie z naprawą CCA. Całkowitą objętość LV podzielono na LV korową i podkorową, co przedstawiono na Rycini 4B. Część korowa charakteryzowała się istotnie mniejszą zmiennością w grupie z naprawą CCA, podczas gdy część podkorowa zmiany nie wykazywała różnic pomiędzy dwiema grupami proceduralnymi.

Analiza mocy wykazała, że do wykazania 30% redukcji LV po MCAO przy zastosowaniu naprawy CCA w porównaniu z typową procedurą z podwiązaniem CCA byłoby wymagane mniej zwierząt w grupie zabiegowej, patrz Tabela 1. Do analizy mocy przyjęto założenie o mocy 1-β= 0,8 i poziomie istotności α = 0,05 oraz przewidywaną 30% redukcję LV pomiędzy hipotetyczną grupą kontrolną a grupą badawczą. Ponadto założono równość wariancji między grupami. Tabela 1 przedstawia liczbę zwierząt wymaganych dla grup badawczej i kontrolnej w przypadku zastosowania typowej metody z podwiązaniem CCA lub zaktualizowanej metody naprawy CCA, opisanej w niniejszej pracy. Należy zauważyć, że grupa badawcza odnosi się do hipotetycznej leczonej grupy zwierząt, a grupa kontrolna do hipotetycznej grupy kontrolnej; obie grupy zostaną poddane MCAO.

Porównanie masy ciała i objętości zmiany po MCAO w grupie z podwiązaniem ECA oraz bez podwiązania, wykres eksperymentalny.
Rycina 1: Wpływ łącznego leczenia przeciwbólowego i pominięcia podwiązania ECA na wyniki po MCAO. (A) Masa ciała, przedstawiona jako procent masy przed MCAO, spadła w ciągu pierwszych 2 d po MCAO w obu grupach. W grupie bez podwiązania ECA (leczonej przeciwbólowo, bez podwiązania ECA podczas MCAO) zaobserwowano tendencję do mniejszego spadku masy ciała w drugim dniu po MCAO. (B) Ten panel przedstawia objętość zmiany (mm3) zmierzoną za pomocą standardowego barwienia chlorkiem trifenylotetrazolium (TTC) 48 h po MCAO. Przedstawione dane to średnia ± odchylenie standardowe. ECA podwiązane: n = 17, ECA niepodwiązane: n = 10. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Trotman-Lucas et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat standardowego protokołu i protokołu naprawczego arteriotomii; nacięcie naczynia i wkładka tkankowa z uszczelniaczem.
Rycina 2: Schemat przedstawiający standardową metodę CCA oraz alternatywną metodę naprawczą CCA po MCAO. (A) Ten schemat przedstawia trwałe podwiązanie CCA przy użyciu nierozpuszczalnych szwów założonych po obu stronach nacięcia CCA, co skutkuje permanentnym podwiązaniem prawej tętnicy szyjnej wspólnej (CCA). (B) Ten schemat przedstawia alternatywną metodę naprawczą CCA. Mała wkładka tkankowa pokryta uszczelniaczem z fibrynogenu i trombiny jest używana do zakrycia nacięcia CCA, uszczelniając je, aby umożliwić pełną perfuzję prawej CCA. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Trotman-Lucas et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy przedstawiający % zmiany sygnału LDF podczas MCAO w porównaniu do stanu po MCAO; CCA podwiązana w porównaniu do naprawionej.
Rycina 3: Parametry regionalnego przepływu krwi w mózgu (rCBF) po MCAO. rCBF uległ zmianie 5 min po usunięciu filamentu MCAO w obu grupach: z podwiązaną CCA i z naprawioną CCA (po MCAO), w odniesieniu do rCBF mierzonego podczas MCAO. Ten panel przedstawia dane rCBF bezpośrednio przed naprawą naczynia CCA (przed naprawą) i 5 min po naprawie CCA (po naprawie). Istotne wzrosty rCBF widoczne są 5 min po usunięciu filamentu (po MCAO) w obu grupach. Dodatkowy wzrost rCBF widoczny jest po naprawie CCA (po naprawie) w grupie z naprawioną CCA. Nie wykazano różnic w rCBF między 5 min po MCAO a stanem przed naprawą. Przedstawione dane stanowią skrót analizowanych danych z przebiegu czasowego dla kluczowych punktów czasowych, podanych tutaj jako średnia ± odchylenie standardowe. CCA podwiązana: n = 10, CCA naprawiona: n = 10; **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: brak istotności statystycznej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Trotman-Lucas et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza objętości zmiany, rdzeń T2 i DTI; porównanie CCA naprawionej/podwiązanej; wykres słupkowy, obraz mózgu.
Rycina 4: Analiza objętości zmiany uzyskana za pomocą technik MRI. (A) Na tym panelu przedstawiono objętość zmiany (LV; mm3) w 48. godzinie po MCAO, całkowita objętość zawału (Total LV) wyznaczona na podstawie obrazów MRI w sekwencji T2 oraz rdzeń zawału (Core LV) wyznaczony na podstawie skanów i analiz DTI. Reprezentatywne obrazy przedstawiają całkowitą objętość zawału z przekroju skanu T2 z nałożoną maską objętości rdzenia zawału z DTI. Zmienność wewnątrz grup została istotnie zredukowana zarówno dla całkowitej objętości zawału (P = 0,015, naprawa CCA: n = 10, podwiązana tętnica szyjna wspólna (CCA): n = 10, F-test) oraz rdzeń LV (P = 0,043, naprawa CCA: n = 9, podwiązana tętnica szyjna wspólna: n = 6, test Levene'a), oceniono za pomocą F-test dla danych parametrycznych lub test Levene'a dla danych nieparametrycznych. (B) Panel ten przedstawia lewą komorę (LV) 48 h po MCAO, na podstawie obrazów MRI ważonych w czasie T2, z podziałem na korowe i podkorowe obszary uszkodzeń. Naprawa CCA znacząco zmniejszyła zmienność danych (P = 0.03, F-test) w korowej części zmiany, jednak nie wykazano wpływu na zmienność danych w części podkorowej zmiany. Naprawa CCA: n = 10, podwiązana tętnica szyjna wspólna (CCA): n = 10. Przedstawione dane stanowią średnią ± odchylenie standardowe. #P < 0.05 (F-test), Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.P < 0,05 (test Levene'a). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Trotman-Lucas i inni11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

MetodaObjętość zmiany
(LV; mm3; średnia ± s.d.)		MocPoziom istotnościPrzewidywana różnicaWymagana liczebność grupy
CCA podwiązana (metoda tradycyjna)94,08 ± 53,790,80,0530%n = 58
CCA naprawiona (nowa metoda)51,73 ± 22,780,80,0530%n = 35

Tabela 1: Reprezentatywna analiza mocy porównująca tradycyjne podwiązanie CCA z alternatywną metodą naprawy CCA opisaną w niniejszym materiale. Tabela ta przedstawia analizę mocy przeprowadzoną w celu obliczenia przewidywanej liczebności grup niezbędnej do wykrycia istotnej różnicy w LV pomiędzy grupą kontrolną, grupą z zastosowaniem podejścia tradycyjnego lub alternatywnego (nowego) a grupą badawczą (przewidywaną). Tabela wskazuje liczebność grup wymaganą przy założeniu mocy 0,8, poziomie istotności 0,05 oraz przy założeniu, że przewidywana grupa badawcza wykaże 30% różnicy w LV w porównaniu z grupą kontrolną. W tabeli przedstawiono wyniki dla obu podejść MCAO (podwiązania CCA oraz naprawy CCA), aby ustalić, czy istnieje różnica w liczbie zwierząt wymaganych do uzyskania 30% różnicy w LV. Dla obu metod przyjęto równość wariancji pomiędzy grupą badawczą a grupą kontrolną. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Trotman-Lucas et al.11.

Dyskusja

Indukcja włókien przejściowego MCAO u gryzoni jest najczęściej stosowanym eksperymentalnym modelem udaru, ponieważ umożliwia reperfuzję do dotkniętego obszaru, naśladując występowanie zdarzeń po klinicznym udarze niedokrwiennym7. Opisano tutaj alternatywne podejście chirurgiczne do tradycyjnej metody przejściowego MCAO indukowanego włóknem u myszy. Alternatywne podejście, obejmujące leczenie przeciwbólowe, unikanie podwiązania ECA i naprawę nacięć CCA, skutkuje zmniejszoną zmiennością lewej komory przy ocenie zarówno przy użyciu metod MRI, jak i barwienia histologicznego11.

Tradycyjne podejścia do indukcji MCAO w dużej mierze opierają się na przecięciu lub przynajmniej podwiązaniu ECA, które, jak wykazano, u szczurów wpływa na zachowania związane z piciem i wzrost utraty masy ciała po MCAO14. Protokół opisany tutaj u myszy, z unikaniem podwiązania ECA i dodawaniem środka przeciwbólowego, sugerował zmniejszenie utraty masy ciała po MCAO bez wpływu na objętość zmiany. W większości eksperymentalnych badań nad udarem mózgu unika się stosowania analgezji lub przynajmniej nie jest jej zgłaszano, ze względu na możliwy zakłócający wpływ na wynik eksperymentu. Jednak całkowite unikanie analgezji nie zawsze jest uzasadnione i istnieje potrzeba zrównoważenia potrzeb w zakresie dobrostanu zwierząt z osiągnięciem celów naukowych.

Sugeruje się, że różnice w wielkości zwierząt, szczepie i anatomii naczyń mózgowych, a także różnice w wielkości i rodzaju włókien, wpływają na wyniki udaru23,24. Opisane tutaj alternatywne podejście pozwala uniknąć polegania na krowie podczas reperfuzji, zmniejszając w ten sposób, przynajmniej częściowo, zmienność obserwowaną między zwierzętami w objętości zmian. Anatomia krów jest bardzo zmienna u myszy, w szczególności w szczepie C57BL/6, który jest często stosowany w eksperymentalnych badaniach nad udarem. 90% myszy C57BL / 6 ma niekompletną CoW z powodu zróżnicowanej drożności tylnej tętnicy łączącej (PcomA), co może mieć wpływ na objętość uszkodzenia niedokrwiennego z powodu niewystarczającej perfuzji struktur poza terytorium MCA13,25. Naprawa CCA u myszy, jak pokazano tutaj, powoduje przywrócenie przepływu krwi przez CCA do obszaru niedokrwiennego, jak opisano wcześniej u szczurów15. Reprezentatywne dane pokazują, że naprawa CCA zwiększa reperfuzję, chociaż przepływ krwi w CCA nie był bezpośrednio mierzony. Chirurg może jednak uwidocznić reperfuzję CCA z krwią po naprawie naczynia, ponieważ powraca ona do stanu pulsującego i pełnego wzdłuż tułowia, proksymalnie i dalej do miejsca naprawy. To wizualne potwierdzenie, wraz z odczytami laserowego przepływomierza dopplerowskiego obszaru niedokrwiennego, może być wykorzystane do potwierdzenia udanej naprawy naczynia. Czas między nałożeniem podkładki tkankowej a usunięciem klipsa naczynia z CCA może mieć wpływ na wynikową drożność CCA, ponieważ skrócenie czasu między nałożeniem podkładki tkankowej a usunięciem klipsa zapobiegnie przyleganiu podkładki tkankowej do przeciwnej strony CCA. Chociaż jest to wyzwanie techniczne, opisana tutaj alternatywna procedura MCAO nie wymaga żadnych dodatkowych umiejętności poza tymi, które są wymagane do przeprowadzenia chirurgicznej indukcji MCAO u myszy.

Eksperymentalne badania nad udarem mózgu, tradycyjnie kojarzone z dużą zmiennością miar wyników, mogą mieć tendencję do niewystarczającej mocy. Wymogi etyczne i dobrostanowe w połączeniu z kwestiami ekonomicznymi i praktycznymi mogą przyczyniać się do tego, że badania są niedostatecznie zasilane. Zmniejszając zmienność wyników, a tym samym uzyskując bardziej spójne wyniki zmian w całej grupie eksperymentalnej, można przeprowadzić bardziej efektywne obliczenia mocy, a ostatecznym celem badań jest odpowiednia moc.

Podsumowując, ta alternatywna procedura naprawy CCA u myszy powoduje mniejszą zmienność objętości zmiany po eksperymentalnym udarze i umożliwia wymaganie mniejszych grup eksperymentalnych do testowania efektu leczenia, gdy stosuje się odpowiednie obliczenia mocy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Narodowe Centrum Wymiany, Udoskonalania i Redukcji Zwierząt w Badaniach (NC3Rs; NC/M000117/1 do CG). Autorzy dziękują personelowi Wydziału Usług Biomedycznych Uniwersytetu w Leicester za opiekę nad zwierzętami doświadczalnymi oraz Marii Viskaduraki za jej porady statystyczne. Reprezentatywne wyniki zostały dostosowane za zgodą Disease Models & Mechanisms11.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Elastyczna pojedyncza sonda światłowodowa 0,7 mmMoor Instruments, Wielka BrytaniaP10dUżywaj z kodem sondy głównej: VP10M200ST
7-0 monofilament powlekany silikonemDoccol, USA701956PKRePozycja zależna od wielkości i wagi zwierzęcia - skorzystaj z wytycznych producenta. Kod produktu w tym miejscu został użyty dla reprezentatywnych wyników pokazanych w artykule.
Przedkliniczny system MRI 9.4TAgilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USAMY11520101Wyposażony w cewki gradientowe i RF odpowiednie do obrazowania mózgu myszy
Sprzęt do monitorowania i bramkowania zwierzątSA Instruments, Stony Brook, Nowy Jork, USA22124005Monitorowanie temperatury i oddychania zgodne z MRI
Bupiwakainy, Stoke-on-trent, Wielka Brytania512345Myszy Marcaine
C57BL/6 CharlesRiver, Oksford, Wielka BrytaniaB6JSIMA49D
CarprofenNorbrook Laboratories143658Carprieve 5% w/v Roztwór do wstrzykiwań dla małych zwierząt
4% roztwór do mycia rąkVWR International Ltd, Lutterworth, Wielka Brytania MOLN10008780HibiScrub Antybakteryjny środek do mycia rąk, Molnlycke Health Care
Patyczki kosmetyczneKrajowe Służby Weterynaryjne, Stoke-on-trent, Wielka Brytania213512Każdy plastikowy korpus, końcówka wacika nadaje się do sterylizacji w autoklawie.
Stereoskop preparacyjnyCarl ZeissOPMI99Resident element wyposażenia.
Odpowiedni będzie każdy stereoskop dwuokularowy o powiększeniu x1-x5.
rozpuszczalne szwy 6-0National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK9544Szwy wchłanialne Ethicon Coated Vicryl 6/0 (kod Ethicon: W9981)
Uchwyt sondy DonutMoor Instruments, Wielka BrytaniaPHDOUchwyt sondy do myszy, wymagany do użycia z pojedynczą sondą światłowodową, gdy jest używany z laserową maszyną przepływową dopplera.
kleszcze dumont #5World Precision Instruments, Hertfordshire, Wielka Brytania500342
Uszczelniacz fibrynogenu i trombinyBaxter, Berkshire, Wielka Brytania1502243TISSEEL Gotowe do użycia roztwory do uszczelniacza 2 ml
żeluspożywczego Datesand group, Manchester, Wielka Brytania72065022Diet Gel Recovery
Pakiet oprogramowania do wyświetlania i pomiaru obrazu3D Slicerhttps://www.slicer.org/Wersja 4.0
Pakiet oprogramowania do wyświetlania obrazu i pomiaruNIH, Maryland, USAhttps://imagej.nih.gov/ij/index.htmlNIH/ImageJ
Monitor LDFMoor Instruments, Wielka BrytaniamoorNożyczki VMS-LDF
micro vannasInterFocus Ltd, Linton, Wielka Brytania15000-08Jako alternatywę można użyć innych nożyczek sprężynowych microvannas, chociaż wymagane są cienkie końcówki.
Klips mikronaczyniowyWorld Precision Instruments, Hertfordshire, Wielka Brytania1591110 G Vessel
Clip uchwyty na klipsy mikronaczynioweWorld Precision Instruments, Hertfordshire, Wielka Brytania14189
Oprogramowanie do akwizycji i analizy MRIAgilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USAVnmrJ Wersja 4.2Wersja A
nr 15 skalpelMateriały do laboratoriów naukowych, Nottingham, Wielka BrytaniaINS4678Sterylny skalpel No15 - numer producenta P305. Inni dostawcy są dostępni.
Nierozpuszczalny szew 6-0Krajowe służby weterynaryjne, Stoke-on-trent, Wielka BrytaniaW529Ethicon Mersilk Szwy
Smar do oczuKrajowe służby weterynaryjne, Stoke-on-trent, Wielka Brytania847288Lacrilube (5100G13)
Żel do dopasowania optycznegoMoor Instruments, Wielka BrytaniaPMG
Czytnik pulsoksymetriiStarr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USAMouseOxMouseOx - szczur i pulsoksymetr myszy i pulsoksymetr monitor fizjologiczny
Do użytku z czujnikiem uda myszy.
Żel nawadniającyDatesand group, Manchester, Wielka Brytania70015022HydroGel
Małe maszynki do strzyżenia włosówvetproductsuk.comHS61Contura Bezprzewodowe trymery/maszynki do strzyżenia
Sterylne 0,9 % roztwór NaClVWR International Ltd,
Lutterworth, Wielka Brytania		LOCA3528286CHLOREK SODU 0,9% W/V INFUZJA DOŻYLNA BP 500 ML W ECOFLAC½ PLUS
sterylna szalka PetriegoVWR International Ltd, Lutterworth, Wielka Brytania5168021sterylna szalka Petriego 50 mm. Każda marka jest odpowiednia. Wymagana jest minimalna średnica 50 mm.
Miejscowy klej tkankowyWorld Precision Instruments, Hertfordshire, Wielka Brytania503763GLUture Miejscowy klej tkankowy
Wodoodporny superglueLoctiteLoctite Superglue Precision MaxDostępne w większości sklepów z narzędziami.
Chip z białego papieruDatesand group, Manchester, Wielka BrytaniaCS1BPBPure-O'Cel
Krajowe Służby Weterynaryjne

Bibliografia

  1. O'Collins, V. E., et al. 1,026 Experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  2. Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for Ischaemic Stroke: Translation from the Bench to the Bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
  3. Reeves, M. J., et al. Acute Stroke Care in the US: Results from 4 Pilot Prototypes of the Paul Coverdell National Acute Stroke Registry. Stroke. 36 (6), 1232-1240 (2005).
  4. Wardlaw, J. M., Murray, V., Berge, E., del Zoppo, G. J. Thrombolysis for acute ischaemic stroke. Cochrane Database of Systematic Reviews. (7), CD000213(2014).
  5. Pangalos, M. N., Schechter, L. E., Hurko, O. Drug development for CNS disorders: strategies for balancing risk and reducing attrition. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (7), 521-532 (2007).
  6. Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathologica. 47 (3), 213-227 (2009).
  7. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-289 (1992).
  8. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRX. 2 (3), 396-409 (2005).
  9. Dirnagl, U. Bench to Bedside: The Quest for Quality in Experimental Stroke Research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (12), 1465-1478 (2006).
  10. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6, 21086(2016).
  11. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
  12. Macrae, I. M. Preclinical stroke research - advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1062-1078 (2011).
  13. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Research. 997 (1), 15-23 (2004).
  14. Trueman, R. C., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Translational Stroke Research. 2 (4), 651-661 (2011).
  15. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Experimental Neurology. 195 (2), 372-378 (2005).
  16. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. Plos Biology. 8 (6), e1000412(2010).
  17. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-479 (2010).
  18. Orsini, F., et al. Targeting Mannose-Binding Lectin Confers Long-Lasting Protection With a Surprisingly Wide Therapeutic Window in Cerebral Ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
  19. Simoni, M. G. D., et al. Neuroprotection by Complement (C1) Inhibitor in Mouse Transient Brain Ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (2), 232-239 (2003).
  20. Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline Treatment for Experimental Intracerebral Hemorrhage in Mice. Stroke. 29 (10), 2136-2140 (1998).
  21. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of Brain Edema on Infarct Volume in a Focal Cerebral-Ischemia Model in Rats. Stroke. 24 (1), 117-121 (1993).
  22. Loihl, A. K., Asensio, V., Campbell, I. L., Murphy, S. Expression of nitric oxide synthase (NOS)-2 following permanent focal ischemia and the role of nitric oxide in infarct generation in male, female and NOS-2 gene-deficient mice. Brain Research. 830 (1), 155-164 (1999).
  23. Connolly, E. S., Winfree, C. J., Stern, D. M., Solomon, R. A., Pinsky, D. J. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
  24. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse Strain Differences in Susceptibility to Cerebral Ischemia are Related to Cerebral Vascular Anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  25. Kitagawa, K., et al. Cerebral Ischemia after Bilateral Carotid Artery Occlusion and Intraluminal Suture Occlusion in Mice: Evaluation of the Patency of the Posterior Communicating Artery. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model udaru niedokrwiennegotechnika reperfuzjiuszczelniacz w postaci podk adki tkankowejregionalny przep yw krwi w m zguzmienno obj to ci zmianykr g Willisauszczelniacz fibrynogenowo trombinowyoperacja udaru u myszy
Niedrożność tętnicy środkowej mózgu umożliwiająca reperfuzję poprzez wspólną naprawę tętnicy szyjnej u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.