Tutaj prezentujemy protokół do oszacowania metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego poprzez dopasowanie wykładniczego wzrostu Saccharomyces cerevisiae do równania wzrostu wykładniczego. Obliczanie parametrów kinetycznych pozwala na badanie przesiewowe wpływu substancji/związków na fermentację lub oddychanie mitochondrialne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki Saccharomyces cerevisiae w fazie wykładniczej podtrzymują swój wzrost, wytwarzając ATP poprzez fermentację i/lub oddychanie mitochondrialne. Stężenie węgla fermentacyjnego decyduje głównie o tym, jak komórki drożdży wytwarzają ATP; w ten sposób zmienność poziomów węglowodanów fermentujących napędza metabolizm energetyczny S. cerevisiae. W artykule opisano wysokoprzepustową metodę opartą na wykładniczym wzroście drożdży w celu oszacowania wpływu zmian stężenia i charakteru źródła węgla na metabolizm oddechowy i fermentacyjny. Wzrost S. cerevisiae mierzy się na mikropłytce lub wstrząsanej kolbie stożkowej, określając gęstość optyczną (OD) przy 600 nm. Następnie budowana jest krzywa wzrostu poprzez wykreślenie OD w funkcji czasu, co umożliwia identyfikację i wybór fazy wykładniczej oraz jest wyposażone w równanie wzrostu wykładniczego w celu uzyskania parametrów kinetycznych. Niskie właściwe tempo wzrostu z dłuższymi czasami podwojenia na ogół reprezentują wzrost układu oddechowego. I odwrotnie, wyższe właściwe tempo wzrostu przy krótszym czasie podwojenia wskazuje na wzrost fermentacyjny. Wartości progowe czasu podwojenia i właściwej szybkości wzrostu szacuje się przy użyciu dobrze znanych warunków oddychania lub fermentacji, takich jak niefermentujące źródła węgla lub wyższe stężenia cukrów fermentujących. Jest to uzyskiwane dla każdego konkretnego szczepu. Na koniec obliczone parametry kinetyczne są porównywane z wartościami progowymi w celu ustalenia, czy drożdże wykazują wzrost fermentacyjny i/lub oddechowy. Zaletą tej metody jest jej względna prostota w zrozumieniu wpływu substancji/związku na metabolizm fermentacyjny lub oddechowy. Należy podkreślić, że wzrost jest skomplikowanym i złożonym procesem biologicznym; W związku z tym wstępne dane uzyskane za pomocą tej metody muszą zostać potwierdzone przez ilościowe określenie zużycia tlenu i akumulacji produktów ubocznych fermentacji. W ten sposób technika ta może być stosowana jako wstępne badanie przesiewowe związków/substancji, które mogą zakłócać lub wzmacniać metabolizm fermentacyjny lub oddechowy.
Wprowadzenie
Wzrost Saccharomyces cerevisiae posłużył jako cenne narzędzie do identyfikacji dziesiątek fizjologicznych i molekularnych mechanizmów. Wzrost mierzy się przede wszystkim trzema metodami: seryjnymi rozcieńczeniami do testów punktowych, liczeniem jednostek tworzących kolonie i krzywymi wzrostu. Techniki te mogą być stosowane samodzielnie lub w połączeniu z różnymi substratami, warunkami środowiskowymi, mutantami i chemikaliami w celu zbadania określonych reakcji lub fenotypów.
Oddychanie mitochondrialne jest procesem biologicznym, w którym kinetyka wzrostu została z powodzeniem zastosowana do odkrywania nieznanych mechanizmów. W tym przypadku suplementacja pożywek wzrostowych niefermentującymi źródłami węgla, takimi jak glicerol, mleczan lub etanol (które są metabolizowane wyłącznie przez oddychanie mitochondrialne), jako jedyne źródło węgla i energii, pozwala na ocenę wzrostu układu oddechowego, co jest ważne dla wykrycia zaburzeń aktywności fosforylacji oksydacyjnej1. Z drugiej strony, skomplikowane jest wykorzystanie modeli kinetycznych wzrostu jako metody rozszyfrowywania mechanizmów stojących za fermentacją.
Badanie fermentacji i oddychania mitochondrialnego jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych stojących za niektórymi fenotypami, takimi jak efekty Crabtree i Warburga2,3. Efekt Crabtree charakteryzuje się wzrostem strumienia glikolitycznego, zahamowaniem oddychania mitochondrialnego i ustanowieniem fermentacji jako głównej ścieżki wytwarzania ATP w obecności wysokich stężeń węglowodanów fermentujących (>0,8 mM)4,5. Efekt Warburga jest metabolicznie analogiczny do efektu Crabtree, z tą różnicą, że w komórkach ssaków głównym produktem fermentacji jest mleczan6. Rzeczywiście, efekt Warburga jest wykazywany przez różne komórki rakowe, wyzwalając wychwyt i konsumpcję glukozy nawet w obecności tlenu7. W związku z tym badanie molekularnych podstaw przejścia od oddychania do fermentacji w efekcie Crabtree ma zarówno reperkusje biotechnologiczne (dla produkcji etanolu), jak i potencjalne skutki dla badań nad rakiem.
Wzrost S. cerevisiae może być odpowiednim narzędziem do badania efektów Crabtree i Warburga. Pomysł ten opiera się na fakcie, że w fazie wykładniczej drożdży centralnymi szlakami wykorzystywanymi do produkcji ATP są oddychanie mitochondrialne i fermentacja, które są niezbędne do utrzymania wzrostu. Na przykład wzrost S. cerevisiae jest ściśle związany z funkcją szlaków generujących ATP. U S. cerevisiae oddychanie mitochondrialne wytwarza około 18 cząsteczek ATP na cząsteczkę glukozy, podczas gdy fermentacja generuje tylko 2 cząsteczki ATP, stąd oczekuje się, że tempo wzrostu ma ścisłe powiązania ze szlakami metabolicznymi wytwarzającymi ATP8. W związku z tym, gdy fermentacja jest główną drogą do wytwarzania ATP, drożdże kompensują niską produkcję ATP poprzez zwiększenie szybkości wychwytu glukozy. Wręcz przeciwnie, zużycie glukozy przez komórki drożdży, które wykorzystują oddychanie mitochondrialne jako główne źródło ATP, jest niskie. Oznacza to, że ważne jest, aby drożdże wyczuły dostępność węglowodanów przed określeniem, w jaki sposób ATP zostanie wygenerowane. Dlatego dostępność glukozy odgrywa ważną rolę w przełączaniu między fermentacją a oddychaniem mitochondrialnym u S. cerevisiae. W obecności dużych ilości glukozy drożdże preferują fermentację jako centralną drogę do wytwarzania ATP. Co ciekawe, gdy drożdże fermentują, właściwe tempo wzrostu utrzymuje się na maksimum. Z drugiej strony, przy niskim poziomie glukozy, S. cerevisiae wytwarza ATP za pomocą oddychania mitochondrialnego, utrzymując niższe tempo wzrostu. W związku z tym zmiany w stężeniu glukozy i wykorzystanie innych źródeł węgla wywołują zmiany w preferencjach drożdży między wzrostem fermentacyjnym a oddechowym. Biorąc pod uwagę ten fakt za pomocą równania wzrostu wykładniczego, można uzyskać biologiczne znaczenie parametrów kinetycznych, takich jak czas podwojenia (Dt) i właściwa szybkość wzrostu (μ). Na przykład niższe wartości μ stwierdzono, gdy drożdże wykorzystują oddychanie mitochondrialne jako główny szlak. Wręcz przeciwnie, w warunkach sprzyjających fermentacji stwierdzono wyższe wartości μ. Metodologia ta może być stosowana do pomiaru prawdopodobnych mechanizmów działania wszelkich substancji chemicznych wpływających na fermentację i oddychanie mitochondrialne u S. cerevisiae.
Celem tego artykułu jest zaproponowanie metody opartej na kinetyce wzrostu do badania wpływu danej substancji/związku na oddychanie lub fermentację mitochondriów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pożywki hodowlane i przygotowanie inokulum
- Przygotuj 100 ml płynnego podłoża z 2% ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) (dodać 1 g ekstraktu drożdżowego, 2 g peptonu kazeinowego i 2 g glukozy do 100 ml wody destylowanej). Dozować 3 ml pożywki do 15 ml sterylizowalnych probówek stożkowych. Autoklawować pożywkę przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 1,5 psi.
UWAGA: Nośnik można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze 4–8 °C. - Zaszczepić stożkową probówkę wypełnioną 3 ml chłodnego, sterylnego 2% bulionu YPD 250 μl komórek S. cerevisiae zakonserwowanych w glicerolu w temperaturze -20 °C. Inkubować przez noc w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30 °C z mieszaniem przy 200 obr./min.
- Na szalce Petriego (60 x 15 mm2) wypełnionej sterylnym 2% agarem YPD (dodać 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu kazeinowego, 20 g glukozy i 20 g agaru bakteriologicznego do 1000 ml wody destylowanej) z komórkami wyhodowanymi w stożkowej probówce za pomocą sterylnej pętli. Inkubować szalkę Petriego w temperaturze 30 °C do momentu, gdy odizolowane kolonie zaczną rosnąć.
- Przygotować pre-inokulum poprzez zaszczepienie pojedynczej izolowanej kolonii do stożkowej probówki wypełnionej 10 ml chłodnego, sterylnego 2% bulionu YPD i inkubować go przez noc w temperaturze 30 °C z ciągłym mieszaniem przy 200 obr./min.
2. Pożywki hodowlane i krzywe wzrostu na mikropłytkach
- Przygotuj 10 ml 1% bulionu YPD (dodać 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 0,1 g glukozy do 10 ml wody destylowanej), 10 ml 2% bulionu YPD (dodać 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 0,2 g glukozy do 10 ml wody destylowanej) i 10 ml 10% bulionu YPD (dodać 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 1 g glukozy na 10 ml wody destylowanej). Autoklawować te pożywki wzrostowe przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 1,5 psi.
UWAGA: Pożywka hodowlana służy do kontroli wzrostu fermentacyjnego. - Przygotuj 10 ml 2% bulionu z ekstraktu drożdżowego, peptonu i etanolu (YPE) i 10 ml 2% bulionu z ekstraktu drożdżowego, peptonu i glicerolu (YPG). Dla 2% YPE: dodaj 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 0,2 ml etanolu do 10 ml wody destylowanej. Dla 2% YPG: dodaj 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 0,2 ml glicerolu do 10 ml wody destylowanej. Autoklawować te pożywki wzrostowe przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 1,5 psi.
UWAGA: Glicerol i etanol są niefermentującymi źródłami węgla, które są metabolizowane wyłącznie przez oddychanie mitochondrialne. Z tego powodu są one używane jako kontrola wzrostu układu oddechowego. Na tym etapie można zmienić rodzaj i stężenie źródła węgla w pożywce hodowlanej w celu zbadania wpływu na fenotyp wzrostu przy użyciu bulionu z ekstraktem drożdżowym i peptonem (YP) (10 g ekstraktu drożdżowego i 20 g peptonu kazeinowego w 1000 ml wody destylowanej) jako bazy. Aby przetestować działanie innych składników odżywczych poza węglem, syntetyczne podłoże kompletne (SC) jest suplementowane zgodnie z celem eksperymentu. Bazą dla pożywki SC jest 1,8 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 5 g siarczanu amonu [(NH4)2SO4], 1,4 g fosforanu sodu (NaH2PO4) i 2 g mieszanki drop-out w 1 000 ml wody destylowanej. Uzupełnij pożywkę o źródło węgla i dodatkowe źródło azotu w potrzebnych stężeniach. - Dodać 145 μl odpowiedniej pożywki hodowlanej do projektu eksperymentalnego do każdego dołka sterylnej mikropłytki (10 x 10-dołkowej) z pokrywką i zaszczepić je 5 μl pre-inokulum.
UWAGA: Jeśli celem jest badanie przesiewowe wpływu substancji/związków na metabolizm energetyczny drożdży, ta substancja/związek powinna zostać dodana na tym etapie. Przydatny powinien być również każdy rodzaj mikropłytki z pokrywką. - Inkubować płytkę wielodołkową w czytniku mikropłytek w temperaturze 30 °C ze stałym mieszaniem przy 200 obr./min przez 48 godzin. Mierzyć gęstość optyczną (OD) przy 600 nm co 30 lub 60 min.
UWAGA: Jeśli czytnik mikropłytek nie ma opcji inkubacji mikropłytki, może ona być inkubowana w wytrząsarce orbitalnej w tych samych warunkach między każdym pomiarem średnicy zewnętrznej.
3. Krzywe wzrostu w wstrząśniętych kolbach stożkowych
- Dodać 4,8 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej do kolb stożkowych o pojemności 20 ml i autoklawu. Zaszczepić każdą kolbę 200 μl kultury pre-inokulum przy OD600nm ~ 2 w chłodnym, sterylnym 2% bulionie YPD. Inkubować je w temperaturze 30 °C ze stałym mieszaniem przy 250 obr./min przez 24 h.
UWAGA: Jeśli okres inkubacji jest dłuższy niż 24 godziny, dodać 12 ml odpowiedniej pożywki do kolb stożkowych o pojemności 50 ml i przetworzyć autoklaw. Zaszczep je 500 μl pre-inokulum. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę kontrolę wzrostu fermentacyjnego (pożywka YP z 1%, 2% lub 10% glukozy) i kontrolę wzrostu układu oddechowego (pożywka YP z 2% glicerolem lub etanolem). - Pobrać 100 μl wstrząśniętej kultury kolby stożkowej i rozcieńczyć ją w 900 μl wody destylowanej w kuwecie spektrofotometru o pojemności 1 ml i delikatnie wymieszać pipetując. Mierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru co 2 godziny. Aby uzyskać rzeczywistą wartość OD, pomnóż wynik przez dziesięć.
4. Przetwarzanie danych i obliczanie parametrów kinetycznych
- Utwórz nowy plik projektu w oprogramowaniu pakietu statystycznego. W sekcji "Nowa tabela i wykres" wybierz opcję "XY".
- Wybierz opcję: "Zacznij od pustej tabeli danych" w sekcji "Przykładowe dane".
- Wybierz typ wykresu "Punkty i linia łącząca". Pozostaw sekcję "X" niezaznaczoną w segmencie "Podkolumny dla powtórzeń lub wartości błędów", a w sekcji "Y" wybierz opcję: "Wprowadź (10) replikuj wartości w podkolumnach obok siebie i wykreśl średnią i błąd SD". Kliknij przycisk tworzenia.
UWAGA: Format tabeli składa się z jednej kolumny X i kilku kolumn Y, z których każda zawiera 10 podkolumn wybranych wcześniej.
- W kolumnie X należy wpisać czas, w którym wykonano pomiary OD (np. 0, 30, 60, 90 min lub 0, 1, 1,5, 2 h). W kolumnach Y wpisz wartości OD uzyskane z kultur.
- Zidentyfikuj fazę wzrostu wykładniczego przekształcającą dane z kolumny Y w logarytmy. Kliknij przycisk "Analizuj", wybierz analizę "Przekształć", wybierz wartości Y za pomocą Y = Log(Y). Przejdź do "Galerii wyników", wybierz tabelę danych "Przekształć", kliknij przycisk "Analizuj" i wybierz analizę "Regresja liniowa". Wyklucz wartości OD, które nie są zgodne z zachowaniem liniowym. Aby wykluczyć wartości, zaznacz je w tabeli danych i wpisz "Ctrl + E".
UWAGA: Ważne jest, aby wykluczyć wartości, które nie są zgodne z fazą wykładniczą, ponieważ równanie wzrostu wykładniczego dobrze pasuje do fazy wykładniczej. - W galerii "Tabele danych" wybierz tabelę danych "Dane 1". Kliknij przycisk "Analizuj" i wybierz analizę "Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej)" spośród "Analiz XY".
- Wybierz zestawy danych do analizy i kliknij przycisk "OK". W zakładce "Dopasowanie" wybierz sekcję "Równanie wykładnicze" i wybierz "Równanie wzrostu wykładniczego" ( , gdzie X to stężenie komórki, X0 to stężenie komórki w czasie zerowym, μ to określona szybkość wzrostu, a t to czas). Użyj metody dopasowania "Dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów" i pozostaw sekcję interpolacji niezaznaczoną. Kliknij przycisk "OK".
UWAGA: Zakładka z wynikami dopasowania nieliniowego znajduje się w "Galerii wyników". Oprogramowanie oblicza czas podwojenia (Dt) i właściwą szybkość wzrostu (μ). Oprogramowanie pokazuje μ jako K w zakładce wyników. - Otwórz nowy plik projektu i w sekcji "Nowa tabela i wykres" wybierz kolumnę. Wybierz opcję "Zacznij od pustej tabeli danych" i wybierz żądany wykres. Wybierz, aby wykreślić średnią za pomocą SD. Wybierz przycisk "Utwórz".
- Skopiuj wartości μ lub Dt z karty wyników dopasowania nieliniowego, która znajduje się w "Galerii wyników" i wklej je w kolumnie. Na koniec wybierz przycisk "Analizuj" i wybierz żądaną analizę w sekcji "Analizy kolumnowe", aby porównać parametry kinetyczne różnych warunków żywieniowych.
UWAGA: Parametry kinetyczne uzyskane z kontroli wzrostu fermentacyjnego (pożywka YP z 1%, 2% lub 10% glukozy) i kontroli wzrostu układu oddechowego (pożywka YP z 2% glicerolem lub etanolem) pomagają ustalić odpowiednio próg oddychania fermentacyjnego i mitochondrialnego. Porównanie parametrów kinetycznych z oznaczonego stanu odżywienia i substancji/związku ze wzrostem oddechowym i fermentacyjnym pomaga określić możliwy wpływ na metabolizm oddechowy lub fermentacyjny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Krzywe wzrostu mogą być wykorzystane do wstępnego rozróżnienia fenotypów oddechowych i fermentacyjnych u drożdży S. cerevisiae. W związku z tym przeprowadzono hodowle okresowe S. cerevisiae (BY4742) z różnymi stężeniami glukozy, o których doniesiono, że indukują wzrost fermentacyjny: 1%, 2% i 10% (w/v)9. Hodowle wykazujące fenotyp fermentacyjny charakteryzują się krótką fazą adaptacyjną oraz fazą wykładniczą o wysokim tempie wzrostu (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Minęło dużo czasu od czasu, gdy J. Monod10 wyraził się, że badanie wzrostu kultur bakteryjnych jest podstawową metodą mikrobiologii. Pojawienie się narzędzi molekularnych opóźnia użycie i badanie wzrostu jako techniki. Pomimo złożoności wzrostu, który obejmuje wiele powiązanych ze sobą procesów, mechanizmy leżące u jego podstaw można opisać za pomocą modeli matematycznych11. Jest to solidne podejście, które może być wykorzystane jako narzędzie uzupełniające do wyjaśnienia n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt był wspierany przez granty Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (grant numer 293940) i Fundación TELMEX-TELCEL (grant numer 162005585), oba dla IKOM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wytrząsarka orbitalna | Thermo Scientific | 4353 | Do inkubacji inokulum lub stożkowych kultur kolbowych |
| Bioscreen | Krzywe wzrostu | C MBR | Do hodowli okresowych na mikropłytkach |
| Glucose | Sigma | G7021 | Do przygotowania bulionu YPD |
| Pepton z kazeiny, trawienie enzymatyczne | Sigma | 82303 | Do przygotowania bulionu YPD |
| Ekstrakt drożdżowy | Sigma | 09182-1KG-F | Do przygotowania bulionu YPD |
| Agar bakteriologiczny | Sigma | A5306 | Do przygotowania agaru YPD |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Do przygotowania bulionu SC |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | Do przygotowania bulionu SC |
| Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów i siarczanu amonu | Sigma | Y1251 | Do przygotowania bulionu SC |
| Syntetyczne podłoże drożdżowe Drop-Out Sigma | Y1501 | Do przygotowania bulionu SC | |
| Granulowany siarczan amonu | J.T. Baker | 0792-R | Do średniej suplementacji przykład |
| Resweratrol | Sigma | R5010 | Dla przykładu średniej suplementacji |
| Galactose | Sigma | G8270 | Dla średniej suplementacji przykład |
| sacharozy | Sigma | S7903 | Dla średniej suplementacji |
| Przykład Absolut ethanol | Merck | 107017 | Dla średniej suplementacji |
| Przykład Glicerol | J.T. Baker | 2136-01 | Przykład średniej suplementacji |
| GraphPad Prism | Oprogramowanie | GraphPad Do analizy danych | |
| Mikropłytki o strukturze plastra miodu | Thermo Scientific | 9502550 | Do kultur mikropłytkowych |
Bibliografia
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25(2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17(2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800(2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
