Tutaj prezentujemy metodę, w której ludzkie neutrofile o niskiej gęstości (LDN), odzyskane z pooperacyjnego płynu z płukania otrzewnej, wytwarzają ogromne pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) i skutecznie zatrzymują wolne komórki nowotworowe, które następnie rosną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aktywowane neutrofile uwalniają zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET), które mogą wychwytywać i niszczyć mikroby. Ostatnie badania sugerują, że NET są zaangażowane w różne procesy chorobowe, takie jak choroba autoimmunologiczna, zakrzepica i przerzuty nowotworowe. Tutaj pokazujemy szczegółową technikę in vitro do wykrywania aktywności NET podczas uwięzienia wolnych komórek nowotworowych, które rosną po przyłączeniu do NET. Najpierw pobraliśmy neutrofile o niskiej gęstości (LDN) z pooperacyjnego płynu z płukania otrzewnej od pacjentów, którzy przeszli laparotomię. Krótkotrwała hodowla LDN spowodowała masowe tworzenie się siatki, którą uwidoczniono za pomocą zielonego fluorescencyjnego barwienia jądrowego i przeciwbarwnika chromosomowego. Po jednoczesnej inkubacji ludzkich linii komórkowych raka żołądka MKN45, OCUM-1 i NUGC-4 z NET, wiele komórek nowotworowych zostało uwięzionych przez NET. Następnie przyłączenie zostało całkowicie zniesione przez degradację NET za pomocą DNazy I. Film poklatkowy ujawnił, że komórki nowotworowe uwięzione przez NET nie umierały, ale zamiast tego rosły energicznie w ciągłej hodowli. Metody te mogą być stosowane do wykrywania oddziaływań adhezyjnych między NET a różnymi typami ogniw i materiałów.
Wprowadzenie
Polimorficzne neutrofile jądrowe w krążącej krwi są zazwyczaj oddzielane od komórek jednojądrzastych za pomocą metody przygotowania gradientu gęstości. Jednak niektóre neutrofile znane jako neutrofile o niskiej gęstości (LDN), z fenotypami CD11b(+), CD15(+), CD16(+) i CD14(-), są jednocześnie oczyszczane z komórkami jednojądrzastymi. Względna liczba LDN znacznie wzrasta w różnych stanach patologicznych, w tym chorobach autoimmunologicznych1,2, sepsa3 i cancer4,5. Wcześniejsze badania wykazały, że LDN są fenotypowo i funkcjonalnie odrębną klasą neutrofili6. Należy zauważyć, że LDN w krążącej krwi jest bardziej skłonny do wytwarzania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) niż neutrofile o normalnej gęstości2,7. NET to struktury przypominające sieć złożone z kwasów nukleinowych, histonów, proteaz oraz białek ziarnistych i cytozolowych, które mogą skutecznie więzić i niszczyć patogeny8.
Ostatnio wykazano, że NET wychwytują nie tylko mikroby, ale także płytki krwi i krążące komórki nowotworowe, które mogą pomóc w tworzeniu skrzepliny9 i przerzuty do nowotworów10,11. Jednak mechanizmy molekularne stojące za oddziaływaniami adhezyjnymi między NET a płytkami krwi lub komórkami nowotworowymi są nadal niejasne. Niedawno test adhezji in vitro ujawnił, że komórki białaczki szpikowej (K56212) i komórki raka płuc (A54913) przyłączają się do NET za pośrednictwem integryn β1 i β3. Autorzy wykorzystali materiał NET wyizolowany z neutrofili i aktywowany przez 12-mirystynian forbolu 13-octan (PMA) jako substrat adhezyjny14. Chociaż test ten pozwala na wykrycie rzeczywistych interakcji ze składnikami NET przy braku neutrofili, można się spierać, czy "bezkomórkowy zasób NET" wyizolowany przez szybkie wirowanie zachowuje strukturę molekularną identyczną z NET wytwarzanymi in vivo. Ostatnio odkryliśmy, że płyn z płukania otrzewnej po operacji jamy brzusznej zawierał wiele dojrzałych LDN, które generowały masywne NET i przyczepiały się do komórek nowotworowych, powodując przerzuty do otrzewnej15. W tym badaniu z powodzeniem zbadaliśmy adhezję komórek nowotworowych do nienaruszonych NET bez żadnej fizycznej manipulacji. W tym miejscu przedstawiamy szczegóły techniki wykrywania interakcji adhezyjnych między NET a wolnymi komórkami nowotworowymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
LDN zostały uzyskane od pacjentów włączonych do tego badania i zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Medycznego Jichi.
1. Izolacja LDN z płukania jamy brzusznej i wykrywanie NET
- Pobieranie próbek
- Wlać 1,000 ml normalnej sterylnej soli fizjologicznej bezpośrednio do jamy brzusznej przed zamknięciem rany u pacjentów, którzy przeszli operację jamy brzusznej z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego.
UWAGA: Próbki uzyskano od pacjentów, którzy przeszli resekcję żołądka, kolektomię lub przełyk bez uprzedzeń ze względu na wiek lub płeć. Sól fizjologiczną przeniesiono do pojemnika i wlano do całego brzucha w ciągu jednej minuty. Jest to rutynowo wykonywane jako pooperacyjne płukanie otrzewnej bez znaczącego wpływu na pacjentów. - Intensywnie płukać jamę brzuszną przez co najmniej 1 minutę.
UWAGA: Zaleca się, aby podawany płyn był powoli mieszany rękami chirurga, aby próbki były jednolite. - Odzyskaj 200 ml płynu do płukania za pomocą czterech strzykawek o pojemności 50 ml.
UWAGA: Czasami do pobierania płynów używa się gumowego łącznika.
- Wlać 1,000 ml normalnej sterylnej soli fizjologicznej bezpośrednio do jamy brzusznej przed zamknięciem rany u pacjentów, którzy przeszli operację jamy brzusznej z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego.
- Wykonaj oczyszczanie LDN otrzewnowej za pomocą mAb specyficznego dla granulocytów, CD66b16.
UWAGA: Ponieważ warstwa pośrednia po wirowaniu w gradionym spadku gęstości zawiera wiele komórek jednojądrzastych, przeprowadzono pozytywną selekcję polimorficznych neutrofili przy użyciu mAb CD66b.- Przenieść płyn z płukania otrzewnowej do probówki o pojemności 50 ml.
UWAGA: Na tym etapie przepuść płyny przez nylonowy filtr 100 μm, aby usunąć zanieczyszczenia. - Odwirować płyn otrzewnowy o sile 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
- Ponownie zawiesić granulki w 5 ml PBS z 0,02% EDTA.
- Ostrożnie nałożyć 5 ml zawiesiny komórek na 3 ml roztworu gradientu gęstości.
- Wirować przy 1 700 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez żadnych przerw.
- Zebrać ~ 2 - 3 ml roztworu zawierającego warstwy pośrednie (Rysunek 1A) za pomocą pipety i wymieszać z 10 ml PBS z 0,02% EDTA.
- Odwirować płyn otrzewnowy o sile 400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
- Dodać kolejne 10 ml PBS z 0,02% EDTA i odwirować przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
- Rozpuść osad komórkowy (1 x 107) w 60 μl buforu do zestawu do magnetycznej separacji komórek.
- Dodać 20 μl bloku Fc do granulek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodać 20 μl anty-CD66b sprzężonego z mikrogranulkami i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przemyć i ponownie zawiesić granulki w 500 μl buforu MACS.
- Zawiesinę komórek nanieść na kolumnę magnetyczną w polu magnetycznym odpowiedniego separatora magnetycznego i zebrać przepływowe komórki zawierające CD66b(-) poprzez przemycie kolumny 15 ml buforu.
- Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i natychmiast wypłucz magnetycznie oznaczone ogniwa CD66b(+), mocno wciskając tłok do kolumny.
UWAGA: Populacja komórek CD66b(+) składa się głównie z neutrofili, jak określono w analizie FACS wskazującej, że >95% frakcji CD66(+) jest dodatnie dla CD11b, CD15 i CD16, ale ujemne dla CD14.
- Przenieść płyn z płukania otrzewnowej do probówki o pojemności 50 ml.
- Generowanie sieci NET
- Po odwirowaniu przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić wyizolowany LDN (5 x 106) w 1 ml RPMI1640 z 10% FCS.
- Hodować LDN na 6-dołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną (o średnicy 6 cm) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
- Dodać zielone fluorescencyjne barwienie przeciwbarwiące (nieprzepuszczalny dla błony barwnik do barwienia jądra i chromosomów) o końcowym stężeniu 5 μM.
- Natychmiast obserwuj morfologię NET (zewnątrzkomórkowych składników DNA wydalanych z LDN pod mikroskopią fluorescencyjną).
2. Barwienie komórek nowotworowych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym łącznikującym komórki
- Przygotuj ludzkie linie komórek rakowych MKN45, NUGC i OCUM-1.
- Przemyć 1 x 107 komórek PBS + 0,02% EDTA w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 1 ml roztworu do barwienia barwnika do granulek i delikatnie odpipetować.
- Rozpuścić 4 μl barwnika Red Fluorescent Cell Linker w 1 ml roztworu do barwienia i wymieszać z zawiesiną komórek z kroku 2.2.
- Inkubować granulki przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 4 ml DMEM (10% FBS), aby zatrzymać reakcję barwienia.
- Odwirować 270 x g przez 7 minut i odrzucić supernatant.
- Powtórz kroki 2.6 i 2.7 dwukrotnie.
- Sprawdź za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (wzbudzenie = 551 nm, emisja = 567 nm), czy komórki nowotworowe są zabarwione na czerwono.
3. Analiza adhezji komórek nowotworowych do sieci NET
- Ponownie zawiesić wybarwione na czerwono fluorescencyjne komórki nowotworowe (1 x 106) w 1 ml RPMI 1640 uzupełnionym 0,1% BSA.
- Dodaj komórki nowotworowe do hodowli LDN, która wytworzyła NET, jak opisano w kroku 1.3.
- Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, co umożliwia komórkom nowotworowym kontakt z NETs.
UWAGA: Długa inkubacja indukuje adhezję komórek nowotworowych do LDN lub do płytek. - Usuń pożywkę i delikatnie umyj studzienki, dodając 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża (0,1% BSA + RPMI 1640) i obracając naczynie.
- Powtórz procedurę prania opisaną w kroku 3.4 dwukrotnie.
UWAGA: Ponieważ siatki słabo przylegają do płytki, mycie należy wykonywać tak delikatnie, jak to możliwe, aby uniknąć wyjęcia samych siatek. - Dodać zielony barwnik fluorescencyjny do barwienia jądra i chromosomów w końcowym stężeniu 5 μg/ml w celu wizualizacji NETs.
- Obserwuj NET i przyłączone komórki nowotworowe za pomocą odpowiednich filtrów (zielony, wzbudzenie = 504 nm, emisja = 523 nm; czerwony, wzbudzenie = 551 nm, emisja = 567 nm).
- Scal rysunki, aby pokazać komórki nowotworowe, które są uwięzione przez NETs.
UWAGA: W niektórych eksperymentach enzym degradacji DNA dodawano do kultury LDN (końcowe stężenie 100 U/ml) 5 minut przed współinkubacją przez 5 minut.
4. Analiza wideo poklatkowego uwięzionych komórek nowotworowych
- Hodować LDN otrzewnowej w okrągłym naczyniu o średnicy 35 mm pokrytym poli-L-lizyną, jak opisano w kroku 1.3.
- Dodaj zielony barwnik fluorescencyjny do barwienia jądra i chromosomów, aby uwidocznić NET, jak opisano w kroku 1.3.
- Po 1 minucie inkubacji usuń pożywkę i dodaj 2 ml 0,1% BSA + RPMI 1640.
- Usuń pożywkę i dodaj niebarwione ogniwa 1 x 106 MKN45 zawieszone w 0,1% BSA + RPMI 1640. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usuń wszelkie nieprzyłączone komórki nowotworowe, delikatnie myjąc zgodnie z opisem w kroku 3.4 i dodaj DMEM z 10% FCS uzupełnionym 100 μg / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny.
- Zamontuj naczynie hodowlane w systemie obserwacji komórek z pełnym widokiem i wybierz odpowiednie pole, w którym komórki nowotworowe są uwięzione przez NET.
- Kontynuuj wspólną hodowlę przez dodatkowe 2 dni i rób ciągłe zdjęcia pola co 6 minut w normalnym świetle i fluorescencji, która wykrywa odpowiednio komórki MKN45 i NET.
- Nakładaj obrazy w każdym punkcie czasowym i twórz filmy poklatkowe za pomocą oprogramowania Image Viewer.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W 2-godzinnej hodowli CD66b(+) LDN pochodzące z płynu z płukania otrzewnej wykazywały struktury nitkowate barwione zielonym barwnikiem fluorescencyjnym dla jąder i chromosomów (Ryc. 1B), podczas gdy komórki mononuklearne CD66b(-) ich nie wykazywały (Ryc. 1C). Jednak po wstępnym potraktowaniu hodowli LDN 100 U/mL DNase I charakterystyczna struktura została zniszczona (Ryc. 1D), co wskazuje, że składał...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wcześniejsze badania wykazały, że krążące komórki nowotworowe mogą być uwięzione przez substraty NET in vivo10,11. Wykazano, że komórki raka piersi z przerzutami stymulują neutrofile i indukują tworzenie NET, co pomaga we wzroście komórek nowotworowych w narządzie docelowym17. Ponadto odkryliśmy, że krótkoterminowe hodowle LDN z pooperacyjnego płynu płukanego wytwarzały masywne NET, które mogły skutecznie więzić komórki nowotworow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Pani J. Shinoharze i I. Niedzie za pracę techniczną i biurową. Dziękujemy również doktorom Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina i Kazuya Takahashi za współpracę przy pobieraniu próbek na sali operacyjnej. Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid na badania naukowe z Ministerstwa Edukacji, Nauki, Sportu i Kultury Japonii oraz Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (17K10606).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SZWECJA | 17-1440-02 | |
| Prosto z handlu; Mikrogranulki CD66b z krwi pełnej | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130-104-913 | |
| Blok Fc | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130-059-901 | |
| Roztwór płuczący MACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130-091-222 | |
| Roztwór podstawowy MACS BSA | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130-041-306 | |
| Separator magnetyczny MACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130-042-501 | |
| SYTOX zielony roztwór kwasu nukleinowego 5mM w DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Zestaw łączników komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego etykietowania błony komórkowej | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Rozcieńczalnik C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średnio-wysoki poziom glukozy (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| Roztwór 0,5 mol/l-EDTA (pH 8,0) | nacalai tesque, Japonia | 06894-14 | |
| Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDA | gibco by life technologies, Meksyk | 10437-028 | |
| Surowica bydlęca Albumina liofilizowana w proszku, ≥ 96% (elektroforeza w żelu agarozowym) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicylina Streptomycyna | Life Technologies Japonia | 15140-122 | |
| Plazmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Pokryta poli-L-lizyną MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japonia | 4810-040 | |
| MIKROPŁYTKA POKRYTA poli-L-lizyną 24 dołki | IWAKI, Japonia | 4820-040 | |
| stereoskop fluoresceinowy | BX8000, Keyence, Osaka Japonia | BZ-X710 | |
| System obserwacji komórek z pełnym widokiem | Nikon, Kanagawa, Japonia | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 ludzka linia komórkowa raka żołądka | Riken, Tukuba, Japonia | N/A | |
| NUGC-4 ludzka linia komórkowa raka | żołądka Riken, Tukuba Japonia | Nie | |
| linii komórkowej ludzkiego raka żołądka OCUM-1 | Uniwersytet Miejski w Osace, Japonia | Nie dotyczy | Prezent od dr M. Yashiro |
Bibliografia
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
