Artykuł metodologiczny

Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58202

⸱

7 listopada 2018

 , 
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Gastroenterology and Liver Research Laboratory, Ingham Institute, 3German Center for Infection Research (DZIF)

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj generowanie in vitro DNA HBV za pomocą systemu infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B i bardzo czułe wykrywanie jego (1-2 kopii) integracji za pomocą odwrotnego zagnieżdżonego PCR.

Streszczenie

Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest powszechnym patogenem przenoszonym przez krew, powodującym raka wątroby i marskość wątroby wynikającą z przewlekłej infekcji. Wirus na ogół replikuje się przez pośredni episomalny DNA; zaobserwowano jednak integrację fragmentów DNA HBV z genomem gospodarza, mimo że ta forma nie jest konieczna do replikacji wirusa. Dokładny cel, czas i mechanizm(y), za pomocą których zachodzi integracja DNA HBV, nie jest jeszcze jasna, ale ostatnie dane pokazują, że następuje ona bardzo wcześnie po zakażeniu. W tym miejscu szczegółowo opisano wytwarzanie in vitro i wykrywanie integracji DNA HBV. Nasz protokół specyficznie amplifikuje pojedyncze kopie integracji DNA wirusa i komórki i umożliwia zarówno bezwzględną kwantyfikację, jak i rozdzielczość pojedynczej pary zasad sekwencji połączeniowej. Technika ta została zastosowana do różnych typów komórek podatnych na HBV (w tym pierwotnych ludzkich hepatocytów), do różnych mutantów HBV oraz w połączeniu z różnymi ekspozycjami na leki. Przewidujemy, że ta technika stanie się kluczowym testem do określenia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tego klinicznie istotnego zjawiska.

Wprowadzenie

HBV to dwuniciowy wirus DNA, który może powodować przewlekłą infekcję przez całe życie, prowadzącą do marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego (HCC)1,2,3. Chociaż istnieje wiele mechanizmów molekularnych napędzających trwałość HBV4 (np. wysoka stabilność epigenetycznej matrycy transkrypcyjnej wirusa, unikanie nadzoru immunologicznego i niski obrót hepatocytów w wątrobie) i związane z tym ryzyko inicjacji HCC5,6 (np. przewlekłe zapalenie i aktywacja komórkowych szlaków stresu), integracja DNA HBV z genomem komórki gospodarza (opisany mechanizm dla obu tych zjawisk) została słabo zbadana. Głównym powodem jest brak odpowiednich systemów zakażenia in vitro HBV, które umożliwiają niezawodne wykrywanie zdarzeń integracyjnych. W tym miejscu opisujemy niedawno opracowany protokół zarówno do generowania in vitro, jak i wykrywania integracji DNA HBV, który można wykorzystać do wyjaśnienia podstawowych mechanizmów molekularnych i ich konsekwencji.

Replikacja HBV i tworzenie integracji DNA HBV zostały wcześniej szczegółowo przeanalizowane7. Krótko mówiąc, HBV wnika do hepatocytów za pomocą peptydu kotransportującego taurocholan sodu (NTCP) jako głównego receptora komórkowego infekcji8,9. Nukleokapsydy HBV zawierające genom kolistego DNA rozluźnionego przez HBV (rcDNA) wchodzą do jądra, gdzie rcDNA jest przekształcane w episomalny kowalencyjnie zamknięty kolisty DNA (cccDNA). Jądrowe cccDNA działa jako matryca transkrypcyjna dla wirusowych mRNA i pregenomicznego RNA (pgRNA)10. Polimeraza HBV i pgRNA są następnie pakowane w nowo utworzone nukleokapsydy (złożone z dimerów białka rdzeniowego HBV). pgRNA HBV jest transkrybowane wstecznie w nukleokapsydzie, w wyniku czego powstaje genom rcDNA lub genom dwuniciowego liniowego DNA (dslDNA)11,12. Te dojrzałe nukleokapsydy zawierające genomy DNA HBV są ostatecznie otoczone i eksportowane jako wiriony.

Zakażenie hepatocytów przez otoczkowe cząstki zawierające cząsteczki dslDNA może spowodować integrację wirusa z genomem komórki gospodarza13, prowadząc do niekompetentnych form replikacji DNA HBV7,14,15. Integracja DNA HBV zachodzi w miejscu pęknięcia chromosomalnego dwuniciowego DNA15. Coraz więcej dowodów sugeruje, że każde zdarzenie integracji zachodzi w zasadniczo losowej pozycji w genomie komórki gospodarza16,17. Ponadto integracja DNA HBV zachodzi dość rzadko, w tempie 1 na 104 komórek13,18,19,20. Ważne pytania dotyczące integracji DNA HBV pozostają bez odpowiedzi, szczególnie w odniesieniu do dokładnych szlaków molekularnych, zależności od czynników wirusowych i gospodarza, antygenów wirusowych wyrażanych z form zintegrowanych i ich możliwego udziału w trwałości wirusa7. Stworzyliśmy model in vitro, aby rzucić światło na niektóre z tych pytań.

Rzadkość zdarzeń integracji DNA HBV (zarówno w odniesieniu do szybkości integracji na komórkę, jak i liczby kopii każdej unikalnej integracji) w modelach infekcji HBV in vitro sprawia, że są one trudne do wykrycia. Mitoza komórkowa jest ograniczona w naszym systemie in vitro, ponieważ dzielące się komórki nie wspierają skutecznej infekcji. Tak więc, w przeciwieństwie do tkanek wątroby pacjenta, w których występuje znaczna klonalna ekspansja hepatocytów18,19,20, bardzo niewiele (1 do 2) kopii każdej integracji jest obecnych w danej puli komórek zakażonych in vitro. Odkryliśmy również, że integracja zachodzi głównie podczas początkowej infekcji hepatocytów (a nie w sposób ciągły w hepatocytach przewlekle zakażonych)13. W związku z tym integracji DNA HBV nie można zwiększyć poprzez zwykłą hodowlę komórek przez dłuższy czas.

Ogólnie, metody wcześniej używane do wykrywania zintegrowanego DNA HBV, w tym hybrydyzacja Southern blot21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27, ligacja za pośrednictwem kasety PCR28 i sekwencjonowanie całego genomu29,30,31,32,33, nie mają wystarczającej czułości do wykrywania pojedynczych kopii integracji. Wraz z innymi badaczami użyliśmy odwróconego zagnieżdżonego PCR (invPCR) do wykrycia integracji DNA hepadnawirusa w wątrobach zakażonych kaczek, świstaków i ludzi13,14,18,19,34,35,36. Inni wprowadzili modyfikacje proceduralne do techniki invPCR, które mogą zmienić generowanie sygnałów fałszywie dodatnich i ograniczyć zdolność do kwantyfikacji37. Jeśli test jest przeprowadzany zgodnie z opisem w niniejszym protokole, invPCR stanowi specyficzny i czuły test, który identyfikuje i określa ilościowo (w bezwzględnej liczbie kopii) wielokrotne integracje DNA HBV. Połączenie DNA komórki HBV jest sekwencjonowane z rozdzielczością pojedynczej pary zasad, co pozwala na bioinformatyczne badania sekwencji DNA wirusa i gospodarza w miejscach integracji13.

Wcześniej opisaliśmy38 wyniki z invPCR na DNA zakażonej HBV tkanki ekstrahowanej z wielu różnych źródeł, w tym tkanek wątroby zamrożonych w zatrzasku, skrawków wątroby zatopionych w parafinie oraz bardzo małych próbek tkanek wyizolowanych za pomocą laserowej mikrodysekcji19. Protokół ten przedstawia zaktualizowaną wersję testu invPCR z wykorzystaniem DNA wyekstrahowanego z tkanek pochodzących z hodowli komórkowych po zakażeniu in vitro, w którym generowana jest niska liczba kopii integracji (1–2 kopie na integrację). Integracje DNA HBV powstałe in vitro przypominają te znajdujące się w tkankach pacjenta pod względem ich rozmieszczenia w genomie komórkowym i połączenia w sekwencji wirusa, która jest zintegrowana13,16, co sugeruje porównywalną ścieżkę do zakażonej wątroby.

Protokół

1. Zakażenie komórkowe i ekstrakcja DNA

  1. Utrzymuj hodowane komórki Huh7-NTCP 8,9 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 1x penicylina/streptomycyna i 2 mM L-glutamina.
    UWAGA: Zostało to wcześniej szczegółowo opisane40.
  2. Umieść 2 x 105 komórek/ml komórek Huh7-NTCP na 12-dołkowej płytce z 1 ml DMEM.
  3. W przypadku testowania leczenia komórkami (np. inhibitorów HBV), należy je zastosować do supernatantu hodowli 4 godziny po wysiewie (1 dzień przed zakażeniem HBV). W celu kontroli ujemnej należy zastosować 200 nM Myrcludex B (silny inhibitor wnikania HBV41).
  4. Użyj oczyszczonego z kolumny heparyny 42 supernatant z HepAD3843 jako inokulum do infekowania komórek przy 1,000 VGE/komórkę w 500 μL pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 1x penicylina/streptomycyna, 2 mM L-glutamina i 2,5% v/v DMSO), zawierający 4% w/v glikolu polietylenowego 8000 [rozpuszczony w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)].
  5. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C (przy 5% CO2 i wilgotności 90%).
  6. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml sterylnego 1x PBS po 16–24 godzinach od zakażenia.
  7. Pożywkę należy wymieniać co 2 dni po zakażeniu HBV aż do zbiorów.
  8. W 3. dniu po zakażeniu należy potraktować komórki 5 μM dizoproksylu tenofowiru i 10 μM lamiwudyny, aby ograniczyć wytwarzanie replikacyjnych produktów pośrednich HBV, które są amplifikowane przez invPCR.
  9. W 5 dniu po zakażeniu trypsynizuj komórki za pomocą 200 μl trypsyny-EDTA i ponownie zawieś je w 2 ml DMEM (uzupełnionym 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 1x penicylina/streptomycyna i 2 mM L-glutamina), zawierającej również 5 μM dizoproksylu tenofowiru i 10 μM lamiwudyny.
  10. Przenieś zawiesiny komórek na 6-dołkową płytkę, aby wywołać jedną rundę mitozy (która, jak doniesiono, indukuje utratę HBV cccDNA44 i innych produktów pośrednich DNA HBV, które są amplifikowalne przez invPCR).
  11. W 7 dniu po zakażeniu trypsynizuj rozszerzone komórki w 400 μl Trypsyny-EDTA i ponownie zawieś mieszaninę w 1 ml DMEM. Umieścić zawiesinę w probówce o pojemności 1,5 ml, granulować komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut i usunąć supernatant przez aspirację.
  12. (Opcjonalnie) Przechowuj granulki komórek w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do ekstrakcji DNA.
  13. Wyekstrahuj DNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, zgodnie z instrukcjami producenta. Oszacuj końcowe stężenie DNA za pomocą densytometrii optycznej.
    UWAGA: Wydajność DNA w objętości elucji 100 μL wynosi na ogół ~250-400 ng / μL.

2. Odwrócenie DNA

  1. Podwielokrotność ~1,5–2,5 μg całkowitego ekstraktu DNA z etapu 1 do probówki PCR o pojemności 200 μl. Dodać odpowiednią ilość głównej mieszanki enzymów restrykcyjnych, aby uzyskać 40 μl objętości reakcyjnej zawierającej 1x bufor reakcyjny trawienia (np. bufor CutSmart) i 10 U NcoI-HF.
  2. Dokładnie wymieszaj reakcje i odwiruj w małej wirówce probówkowej. Inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w maszynie do PCR w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu uzyskania optymalnej wydajności trawienia.
  3. Dezaktywować enzym restrykcyjny przez inkubację w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
  4. Przenieść całą reakcję enzymu restrykcyjnego do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 400 μl 1x buforu ligazy DNA T4 i 500 U ligazy DNA T4 i dokładnie wymieszać. Duża objętość reakcji sprzyja wewnątrzcząsteczkowej (w przeciwieństwie do międzycząsteczkowej) ligacji strawionych fragmentów DNA.
  5. Inkubować reakcję ligacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby zapewnić pełne podwiązanie.
  6. Dezaktywować ligazę DNA T4 w temperaturze 70 °C przez 20 min.
  7. Dodaj 10 μl 10% w/v dodecylosiarczanu sodu, aby zapewnić całkowitą inaktywację ligazy T4.
  8. Wymieszaj probówki przez wirowanie impulsowe i krótko odkręć mieszaninę reakcyjną. Dodać NaCl do końcowego stężenia 100 mM i dekstran (35–45 kDa) do końcowego stężenia 90 μg/ml. Wymieszaj probówki przez wirowanie impulsowe i krótko odkręć mieszaninę reakcyjną.
  9. Dodać 900 μl 100% etanolu i wymieszać przez odwrócenie. Wytrącić DNA w temperaturze -20 °C przez noc.
  10. Wytrącone DNA osadzać przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant przez aspirację pipetą P200. Przemyć osad 500 μl etanolu o stężeniu 70% v/v i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut.
  11. Usunąć etanol przez aspirację za pomocą pipety P200. Suszyć osad DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  12. Rozpuścić osad w 20 μlH2O. Dodać 20 μl głównej mieszanki enzymów restrykcyjnych, aby uzyskać objętość reakcyjną 40 μl zawierającą 1x bufor reakcyjny do trawienia, 5 U BsiHKAI i 5 U SphI-HF. Inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w bloku grzewczym w temperaturze 37 °C (optymalna temperatura dla SphI-HF) przez 1 godzinę.
  13. Krótko odwirować mieszaninę reakcyjną. Inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w bloku grzewczym w temperaturze 65 °C (optymalna temperatura dla BsiHKAI) przez 1 godzinę.
  14. Krótko odwirować mieszaninę reakcyjną.
  15. Odwrócony DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do następnego etapu.

3. Zagnieżdżony PCR

  1. Usuń potencjalne amplikony z uszczelki maty silikonowej wielokrotnego użytku za pomocą roztworu do degradacji DNA, dokładnie spłucz matę wodą bez DNA i wysusz ją na powietrzu w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania mieszaniny PCR.
  2. Przygotować 1 ml 1x mieszanki PCR zawierającej zewnętrzne startery do przodu (5'-TTC, GCT, TCA, CCT, CTG, CAC G-3') i odwrotnie (5'-AAA, GGA, CGT, CCC, GCG, CAG-3') w stężeniu 0,5 μM.
  3. Dodaj 170 μl 1x mieszanki PCR do dołków A1 i E1 w 96-dołkowej płytce PCR.
  4. Dodać 120 μl 1x mieszanki PCR do studzienek B1 do H1.
  5. Dodaj 10 μl odwróconego DNA z etapu 2 do dołków A1 i E1 (2 różne odwrócone próbki można analizować na tej samej płytce PCR). Wymieszać reakcję w każdym dołku, delikatnie pipetując każdy z nich około 10 razy, używając P1000 ustawionego na 100 μl.
  6. Próbki należy rozcieńczyć seryjnie z dołków A1 do D1 w stosunku 1:3, przenosząc 60 μl na każdym etapie. Mieszać studzienki na każdym etapie, delikatnie pipetując je około 10 razy za pomocą P1000 ustawionego na 100 μl. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Powtórzyć krok 3.6 dla dołka E1, rozcieńczając do dołka H1.
  7. Podwielokrotność 10 μl mieszaniny reakcyjnej za pomocą pipety wielokanałowej z dołków A1-H1 do studzienek A2-H2, A3-H3 i tak dalej, aż do osiągnięcia studzienek A12-H12 płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę PCR suchą matą silikonową z kroku 3.1, mocno dociskając.
  8. Umieścić płytkę w maszynie do PCR i uruchomić następujący program: 10 minut w temperaturze 95 °C; 35 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C, 15 s w temperaturze 54 °C i 3 minuty w temperaturze 72 °C; 7 minut w temperaturze 72 °C; następnie należy trzymać płytkę w temperaturze pokojowej.
  9. Podgrzej piny 96-pinowego replikatora do czerwoności za pomocą palnika Bunsena, a następnie schładzaj przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Napełnij studzienki drugiej płytki PCR 10 μl 1x mieszanki PCR (zawierającej bufor gotowy do obciążenia żelem) oraz wewnętrzną do przodu (5'-CGC, ATG, GAG, ACC, ACC, GTG, A-3') i odwrotnie (5'-CAC, AGC, CTA, GCA, GCC, ATG G-3') w temperaturze 0,5 μM.
  11. Ostrożnie usuń matę silikonową z płytki PCR z płytki 96-dołkowej z pierwszej rundy PCR i unikaj zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami.
  12. Użyć schłodzonego replikatora, aby przenieść produkty PCR z płytki 96-dołkowej z pierwszej rundy PCR na nowo podzieloną płytkę 96-dołkową. Przeprowadzić zagnieżdżony PCR w takich samych warunkach, jak w kroku 3.8, z wyjątkiem zmiany początkowego etapu denaturacji w temperaturze 95 °C z 10 minut na 2 minuty.

4. Izolacja produktu PCR i ekstrakcja żelu

  1. Analizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu 96-dołkowego z 1,3% w/v żelem agarozowym. W przypadku żelu agarozowego o pojemności 100 ml należy pracować pod napięciem 200 V przez 10–15 minut.
  2. Usuń prążki DNA z żeli agarozowych za pomocą jednorazowych słomek do napojów. Dla każdego produktu PCR umieść słomkę i żel agarozowy w probówce o pojemności 1,5 ml i przytnij słomkę na wymiar nożyczkami.
    UWAGA: Wystarczające jest wyizolowanie prążków tylko z tych rozcieńczeń, w których można rozpuścić pojedyncze produkty PCR.
  3. (Opcjonalnie) Przechowuj probówki w temperaturze -20°C do późniejszej ekstrakcji.
  4. Wyrzuć korki agarozowe do każdej rurki, ściskając koniec fragmentu słomy. Do każdej probówki dodać 300 μl żelowego buforu ekstrakcyjnego i 5 μl szlamu z kulkami szklanymi do ekstrakcji żelu.
  5. Wyekstrahuj produkty PCR zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do ekstrakcji żelu (z wyjątkiem użycia połowy objętości do etapów mycia) i wymyj DNA z kulek za pomocą 30 μl wody.
  6. Prześlij oczyszczone DNA do sekwencjonowania Sangera (zgodnie z instrukcjami dostawcy) za pomocą startera Forward użytego w drugiej rundzie zagnieżdżonego PCR.

5. Analiza sekwencji

  1. Potwierdź połączenia DNA wirusa z komórką, wykonując analizę BLAST nukleotydów (przy użyciu ustawień domyślnych dostosowanych do całej kolekcji nukleotydów).
    UWAGA: Reprezentatywne wyniki są szczegółowo opisane w Rysunek 3 poniżej.
    1. Jeśli obserwuje się tylko częściowe wyrównanie sekwencji, należy przyciąć sekwencję 5' DNA HBV przed ponownym uruchomieniem analizy BLAST.
  2. Zastosuj rygorystyczne kryteria wyboru, aby określić, czy dana sekwencja reprezentuje prawdziwe skrzyżowanie całkowania w następujący sposób:
    1. Uwzględnij tylko sekwencje zawierające >20 pz sekwencji komórkowej, aby zapewnić pewne mapowanie do genomu komórkowego.
    2. Zignoruj wszelkie sekwencje, które zawierają miejsca restrykcyjne któregokolwiek z enzymów użytych w promieniu 10 pz od domniemanego połączenia integracyjnego wirus-komórka, ponieważ prawdopodobnie reprezentują one zdarzenia ligacji in vitro, a nie prawdziwe połączenia integracyjne.
    3. Zignoruj wszelkie sekwencje z oczywistymi różnymi poziomami fluorescencji pików po obu stronach domniemanego złącza integracyjnego w chromatografach sekwencjonowania, ponieważ są to prawdopodobne artefakty generowane przez zanieczyszczenie krzyżowe podczas reakcji sekwencjonowania lub chromatografii kapilarnej.
    4. Zdefiniuj unikalne zdarzenia integracyjne jako te, które mają dokładne sekwencje HBV i komórkowe na styku wirus-komórka.
      UWAGA: Powtarzanie się unikalnych zdarzeń integracji może wynikać z klonalnej ekspansji komórek zawierających te integracje lub zanieczyszczenia krzyżowego podczas PCR (które można przetestować przy użyciu reakcji kontroli ujemnej, szczegółowo opisanych w reprezentatywnych wynikach poniżej). Oczekuje się, że powtarzające się integracje z określonymi sekwencjami komórkowymi będą wyświetlać różne miejsca końcowe HBV dla każdego zdarzenia integracji, ponieważ używane są niehomologiczne ścieżki łączenia końców15.
  3. Obliczyć częstotliwość integracji, mnożąc współczynnik rozcieńczenia odwróconych matryc DNA przez liczbę połączeń wirus-komórka wykrytych w tym rozcieńczeniu, a następnie normalizując do ilości całkowitego DNA wprowadzonego do reakcji inwersji. Ogólnie rzecz biorąc, częstotliwość integracji jest rzędu 1:104 komórek.

Wyniki

Schematyczna reprezentacja techniki invPCR przedstawiona jest na Ryc. 1. Przykład elektroforezy w żelu agarozowym dla udanej reakcji invPCR przed i po izolacji produktu PCR pokazano na Ryc. 2. Ryc. 3 przedstawia wyniki analizy BLAST z kroku 5.1 w przypadku (i) amplifikacji miejsca złączenia DNA wirusa z komórką oraz (ii) amplifikacji pośrednika replikacyjnego DNA HBV.

Oczekiwane wyniki dla kontroli pozytywnych: komórki Huh7-NTCP zainfekowane zapasami HBV oczyszczonymi za pomocą heparyny, zgodnie z powyższym opisem (Rycina 1), mogą służyć jako kontrola pozytywna. W tym przypadku pojedyncze produkty PCR powinny zostać uzyskane przy drugim lub trzecim rozcieńczeniu 1:3 każdej próbki (co odpowiada ~104 ekwiwalentom komórek na rozcieńczenie, Rycina 2). Przy tych rozcieńczeniach około 50% produktów będzie reprezentować rzeczywiste połączenia DNA wirus-komórka, natomiast druga połowa będzie reprezentować amplifikację produktów pośrednich DNA HBV (Rycina 3).

W poprzednich badaniach13 stwierdziliśmy niewielką liczbę przypadków powtarzających się złączy wirus-komórka, co sugeruje brak preferencyjnych miejsc w genomie komórkowym dla integracji HBV DNA. Odnotowaliśmy również, że >80% złączy wirus-komórka występuje pomiędzy nukleotydami 1732 a 1832 (zgodnie z numeracją nukleotydową HBV genotypu D, GenBank Accession #U95551.1), gdzie ten ostatni stanowi prawy koniec formy HBV dslDNA. Sekwencje rzeczywistych złączy wirus-komórka, zidentyfikowane za pomocą naszej metody w eksperymentach in vitro, są publicznie dostępne w bazie GenBank (numery akcesyjne od MH057851 do MH058006).

Oczekiwane wyniki dla kontroli negatywnych: Jako kontrole negatywne mogą służyć niezinfekowane komórki Huh7-NTCP lub zinokulowane komórki Huh7-NTCP poddane wstępnej inkubacji z Myrcludex B. Analiza InvPCR DNA wyekstrahowanego z tych komórek nie powinna przynieść żadnych produktów PCR. Przetwarzanie próbek kontroli negatywnej na tej samej płytce PCR co próbki pozytywne pozwala na sprawdzenie obecności zanieczyszczeń krzyżowych podczas procesu nested-PCR. Najbardziej rygorystycznym testem na zanieczyszczenia krzyżowe jest umieszczenie próbki kontroli negatywnej w studzienkach A-D oraz próbki pozytywnej w studzienkach E-H na płytce 96-dołkowej. W takim przypadku najbardziej skoncentrowane rozcieńczenie próbki pozytywnej znajduje się w rzędzie bezpośrednio sąsiadującym z najmniej skoncentrowanym rozcieńczeniem próbki negatywnej. Jeśli w próbkach kontroli negatywnej zostaną zaobserwowane produkty amplifikacji, należy zastosować środki sugerowane w dyskusji w celu zminimalizowania zdarzeń związanych z zanieczyszczeniem krzyżowym.

Schemat linearyzacji i trawienia DNA enzymami NcoI i BsiHKAI oraz ligazą T4.
Rycina 1: Schemat procesu invPCR służącego do wykrywania integracji HBV DNA. Po infekcji HBV tylko mniejszość komórek Huh7-NTCP zawiera HBV dslDNA (czerwony) zintegrowany z genomem komórki gospodarza (czerwony), co przedstawiono w górnej sekcji. Następnie z komórek ekstrahuje się całkowite DNA (krok 1), odwraca jego orientację (krok 2) i przeprowadza amplifikację za pomocą nested PCR (krok 3). Przedstawiono względne położenia miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych (NcoI i BsiHKAI) w wyciętym fragmencie złącza DNA wirusa i komórki. Rycina została zaadaptowana z poprzedniej publikacji13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy żelowej, proces izolacji prążków DNA, porównanie serii rozcieńczeń, analiza eksperymentalna.
Rycina 2: Elektroforeza w żelu agarozowym i następująca po niej ekstrakcja z żelu udanej reakcji invPCR. „M” oznacza marker wielkości DNA. Każdy rząd 12 studni reprezentuje powtórzenia techniczne dla pojedynczego rozcieńczenia na płytce PCR. Na jednej płytce PCR/żelu agarozowym można przeprowadzić analizę dwóch inwertowanych próbek DNA. Produkty PCR dla każdego rozcieńczenia powinny miareczkować się w stosunku ok. 1:3. Wyekstrahowanie produktów z dwóch najmniej stężonych rozcieńczeń, w których można łatwo wyizolować pojedyncze prążki, jest zazwyczaj wystarczające, ponieważ stopień integracji DNA HBV jest określany przez miareczkowanie punktu końcowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat dopasowania sekwencji; złącze wirus-komórka i produkt wirus-wirus; wyniki bioinformatyczne.
Rysunek 3: Analiza BLAST sekwencji produktów invPCR. Dzięki uzyskaniu długich fragmentów sekwencji w metodzie sekwencjonowania Sangera, źródło sekwencji DNA jest zazwyczaj jednoznaczne. Na górnym panelu, w różnych obszarach pliku sekwencji FASTA wygenerowanego z sekwencjonowania Sangera, obserwuje się silne dopasowanie do genomów HBV i komórkowych, co sugeruje obecność rzeczywistego złącza DNA wirus-komórka. Na dolnym panelu sekwencja dopasowuje się jedynie do fragmentów genomu HBV, co sugeruje produkt powstały w wyniku amplifikacji przeorganizowanego genomu HBV DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przed wykonaniem protokołu należy zauważyć, że ten test invPCR jest bardzo czułą techniką, zdolną do amplifikacji pojedynczych kopii matrycy DNA. Dlatego ograniczenie zanieczyszczenia produktami PCR ma ogromne znaczenie. Ogólne strategie ograniczania zanieczyszczenia produktem PCR obejmują następujące elementy. (i) Ustanowić fizycznie oddzielone obszary dla różnych etapów metody. Każdy obszar powinien mieć osobne fartuchy laboratoryjne, a rękawiczki należy zmieniać podczas przemieszczania się między tymi obszarami. Poniżej wymieniliśmy te obszary w kolejności od najbardziej do najmniej prawdopodobnego zanieczyszczenia: obszar przygotowania reakcji ekstrakcji i sekwencjonowania produktu PCR (po PCR); Dodawanie szablonu PCR i obszar przenoszenia palonych szpilek (z dobrymi wynikami użyliśmy kapturów PCR z odkażającą lampą UV); Obszar ekstrakcji i inwersji DNA (pre-PCR); oraz obszar "wolny od matryc DNA" używany wyłącznie do przygotowywania roztworów podstawowych i PCR. (ii) Należy pamiętać o przepływie powietrza w laboratorium jako potencjalnym czynniku powodującym zanieczyszczenie krzyżowe. W szczególności najbardziej prawdopodobne jest zanieczyszczenie krzyżowe reakcji PCR podczas etapu przenoszenia palonego szpilki, co doprowadzi do niedokładnego określenia ilościowego częstotliwości integracji. Kaptury PCR mogą być używane do ograniczania tych prądów krzyżowych. Studzienki kontroli ujemnej (np. próbki poddane działaniu Myrcludex B lub bez kontroli matrycowych) w PCR mogą być również wykorzystywane do badania pod kątem zanieczyszczenia krzyżowego. (iii) Ogranicz potencjalne zanieczyszczenia PCR na pipetach i powierzchniach roboczych poprzez regularne przecieranie ich roztworem degradującym DNA.

Określony tutaj protokół ma na celu wykrycie integracji znanego zakaźnego klonu HBV wygenerowanego z linii komórkowej42 HepAD38. Jeśli użyte inokulum ma inną sekwencję DNA HBV (np. z surowicy pacjenta), wówczas genom HBV powinien zostać najpierw zsekwencjonowany w celu potwierdzenia zgodności starterów PCR i projektu inwersji. We wcześniej opublikowanych badaniach19 użyliśmy 3 zestawów starterów, które wiążą konserwatywne sekwencje DNA HBV flankujące oczekiwane miejsce połączeń integracyjnych DNA HBV. Inne sekwencje starterów i protokoły zostały opisane w celu określenia sekwencji genomowej HBV 44,45,46,47,48 i mogą działać z powodzeniem.

Ponadto można stosować różne komórki wrażliwe na HBV (np. pierwotne ludzkie hepatocyty, zróżnicowane komórki HepaRG, HepG2-NTCP); jednak odkryliśmy, że komórki Huh7-NTCP zapewniają największy stosunek sygnału do szumu, biorąc pod uwagę liczbę połączeń DNA wirus-komórka, które są amplifikowane, w porównaniu z pośrednim DNA wirusa, które jest amplifikowane13. W szczególności końcowo zróżnicowane komórki, takie jak pierwotne ludzkie hepatocyty lub zróżnicowany HepaRG, nie przechodzą skutecznie mitozy, co skutkuje wysokim poziomem amplifikowalnych replikacyjnych produktów pośrednich DNA HBV pozostających w komórkach. Odkryliśmy, że ~ 90% amplifikowanych sekwencji reprezentuje rearanżacje DNA HBV (a nie zdarzenia integracji) w komórkach ostatecznie zróżnicowanych, w porównaniu do 70-50% w liniach komórkowych wątrobiaka13. Produkty te są na ogół genomami DNA HBV zawierającymi duże delecje na powierzchni i otwartych ramkach odczytu rdzenia lub mogą reprezentować quasi-gatunki HBV z dodatkowym miejscem NcoI przed miejscem SphI. Amplifikacja tych gatunków HBV (wraz ze schematem ideowym) została szczegółowo opisana wcześniej13.

Ta metoda ma kilka wad. Ze względu na pracochłonny i wielodniowy charakter tego protokołu, invPCR nie nadaje się do wysokoprzepustowych analiz dużej liczby próbek. Ponadto, ponieważ nasza metoda opiera się na ograniczeniu miareczkowania rozcieńczalnego, nie jest wysoce precyzyjna pod względem ilościowym; Chociaż powinien łatwo mierzyć zmiany częstotliwości integracji na poziomie dziennika.

Co więcej, nasz protokół inwersji nadaje się tylko do wykrywania integracji zachodzących między regionami DR2 i DR1 genomu HBV, ponieważ większość integracji HBV zachodzi w tym regionie49. Analiza NGS tkanek pacjentów z HBV wykazała, że duża mniejszość (do ~50%) może występować również poza tym regionem49. Nowe projekty invPCR są teoretycznie w stanie wykryć te inne miejsca integracji, chociaż (według naszej wiedzy) nie zostały one jeszcze przeprowadzone. W związku z tym, ze względu na niezbędne miejsca enzymów restrykcyjnych wymagane za sekwencją połączenia wirus-komórka do reakcji inwersji, invPCR nie wykrywa wszystkich integracji zachodzących w regionach DR2 i DR1 genomu HBV (tj. Oszacowaliśmy, że ~ 10% wszystkich integracji można wykryć za pomocą symulacji in silico 13). Jednak w przypadku zastosowania do zogniskowanej partii próbek z niewielką liczbą różnych zabiegów, invPCR jest jedną z niewielu praktycznych metod wykrywania zintegrowanego DNA HBV w rozdzielczości pojedynczej pary zasad.

W związku z tym przewidujemy, że zastosowania tej metody będą odgrywać kluczową rolę w poszukiwaniu czynników wirusowych (poprzez mutacje inokulum HBV), komórkowych (poprzez nokaut lub nadekspresję określonych genów komórkowych lub poprzez stosowanie różnych leków) i środowiskowych (np . narażenie na stres oksydacyjny), które indukują integrację DNA HBV. Dzięki tej metodzie i nowo opracowanym systemom zakażeń HBV umożliwiamy bezprecedensową kontrolę tych czynników, dzięki czemu można je dobrze wyizolować i lepiej scharakteryzować. Spodziewamy się również, że doprowadzi to do kluczowego zrozumienia komórkowych konsekwencji integracji DNA HBV, w tym tego, w jakim stopniu antygeny wirusowe (np. HBx lub HBsAg50) są wyrażane z formy zintegrowanej, co kontroluje tę ekspresję i czy integracja HBV znacząco zmienia fenotyp komórkowy w kierunku bardziej proonkogennego. Wyniki tych przyszłych badań będą miały głęboki wpływ na strategie terapeutyczne stosowane w leczeniu przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B oraz na podstawową wiedzę na temat samego wirusa.

Oświadczenia

S.U. jest współwnioskodawcą i współtwórcą patentów chroniących Myrcludex B jako inhibitor przedostawania się wirusa HBV/HDV. T.T. deklaruje, że nie występuje w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca otrzymała finansowanie od Niemieckiego Centrum Badań nad Infekcjami (DZIF), TTU Hepatitis Projects 5.807 i 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15) oraz Australijskiego Centrum Badań nad HIV i Wirusowym Zapaleniem Wątroby.

Jesteśmy wdzięczni profesorowi Williamowi Masonowi za jego wkład w opracowanie oryginalnej metody invPCR i jej zademonstrowanie nam. Chcielibyśmy podziękować doktorom Yi Ni i Florianowi A. Lemppowi za odczynniki (linie komórkowe i inokulum HBV). Dziękujemy Anji Rippert, Franzisce Schlund, Sarah Engelhardt i dr Katrin Schöneweis za pomoc techniczną. Jesteśmy wdzięczni Miriam Kleinig za korektę oraz profesorom Nicholasowi Shackelowi i Ralfowi Bartenschlagerowi za nieustanne wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s PBSPAAH15-002
DMEM mediumThermo Fisher Scientific41965
Płodowa surowica bydlęcaPAAA15-151Inaktywacja termiczna przed użyciem
Penicylina, 10 000 U/ml; Streptomycyna 10 mg / ml, 100 i razy;PAAP11-010
L-glutamina, 200 mMPAAM11-004
Trypsyna, 0,5 mg/ml; EDTA, 0,22 mg / ml, 1 i razy;PAAL11-004
PEG, MW 8000Sigma-Aldrich89510Zapas przy 40% w/v w 1xPBS, autoklaw przed użyciem
DMSO do spektroskopiiMerck102950
Tenofovir disoproxilSigma-Aldrich CDS021622Rozpuścić w DMSO
LamiwudynaSigma-AldrichL1295Rozpuścić w
DMSO Zestaw tkanek NucleoSpinMacherey Nagel740952.250
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometrThermo Fisher ScientificND-2000
NcoI-HFNEBR3193L
Ligaza DNA T4NEBM0202T
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771
Chlorek soduSigma-Aldrich
Dekstran (35-45 kDa)Sigma-AldrichD1662-10G
Absolutny etanolSigma-Aldrich32205-1L-D
BsiHKAINEBR0570L
SphI-HFNEBR3182L
Zestaw Amplitaq Gold TaqThermo Fisher Scientific4331816Użyj po raz pierwszy nest PCR
Silikonowe maty uszczelniające do 96-dołkowych płytek PCRBiorad2239442
DNAZap PCR Roztwór do degradacji DNAThermo Fisher ScientificAM9890
96-dołkowe płytki do PCRSigma AldrichCLS6509 SIGMA
96-pinowy replikatorThermo Fisher Scientific250520
GoTaq Flexi PCRPromegaM8295Stosować do drugiego gniazda PCR, użyć zielonego bufora do łatwego ładowania żelu agarozowego
Biozym LE AgaroseBiozym840004
QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żeluQIAGEN20051
433209

Bibliografia

  1. Lin, X., et al. Chronic hepatitis B virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  2. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  3. Huang, Y. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643-3650 (2011).
  4. Nassal, M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut. 64 (12), 1972-1984 (2015).
  5. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Jilbert, A. R. Conceptual models for the initiation of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Liver International. 35 (7), 1786-1800 (2015).
  6. Tu, T., Buhler, S., Bartenschlager, R. Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biological Chemistry. 398 (8), 817-837 (2017).
  7. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Urban, S. HBV DNA Integration: Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Viruses. 9 (4), (2017).
  8. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, e00049(2012).
  9. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  10. Tuttleman, J. S., Pourcel, C., Summers, J. Formation of the pool of covalently closed circular viral DNA in hepadnavirus-infected cells. Cell. 47 (3), 451-460 (1986).
  11. Staprans, S., Loeb, D. D., Ganem, D. Mutations affecting hepadnavirus plus-strand DNA synthesis dissociate primer cleavage from translocation and reveal the origin of linear viral DNA. Journal of Virology. 65 (3), 1255-1262 (1991).
  12. Wang, G. H., Seeger, C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis. Cell. 71 (4), 663-670 (1992).
  13. Tu, T., Budzinska, M. A., Vondran, F. W. R., Shackel, N. A., Urban, S. Hepatitis B virus DNA integration occurs early in the viral life cycle in an in vitro infection model via NTCP-dependent uptake of enveloped virus particles. Journal of Virology. , (2018).
  14. Yang, W., Summers, J. Integration of hepadnavirus DNA in infected liver: evidence for a linear precursor. Journal of Virology. 73 (12), 9710-9717 (1999).
  15. Bill, C. A., Summers, J. Genomic DNA double-strand breaks are targets for hepadnaviral DNA integration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11135-11140 (2004).
  16. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Sequence Analysis of Integrated Hepatitis B Virus DNA during HBeAg-Seroconversion. Emerging Microbes and Infections. , (2018).
  17. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Cellular genomic sites of HBV DNA integration. Genes. , (2018).
  18. Mason, W. S., Liu, C., Aldrich, C. E., Litwin, S., Yeh, M. M. Clonal expansion of normal-appearing human hepatocytes during chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 84 (16), 8308-8315 (2010).
  19. Tu, T., et al. Clonal expansion of hepatocytes with a selective advantage occurs during all stages of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 22 (9), 737-753 (2015).
  20. Mason, W. S., et al. HBV DNA Integration and Clonal Hepatocyte Expansion in Chronic Hepatitis B Patients Considered Immune Tolerant. Gastroenterology. 151 (5), 986-998 (2016).
  21. Shafritz, D. A., Shouval, D., Sherman, H. I., Hadziyannis, S. J., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into the genome of liver cells in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Studies in percutaneous liver biopsies and post-mortem tissue specimens. New England Journal of Medicine. 305 (18), 1067-1073 (1981).
  22. Hino, O., et al. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinomas in Japan. Hepatology. 4 (1), 90-95 (1984).
  23. Fowler, M. J., et al. Integration of HBV-DNA may not be a prerequisite for the maintenance of the state of malignant transformation. An analysis of 110 liver biopsies. Journal of Hepatology. 2 (2), 218-229 (1986).
  24. Chen, J. Y., Harrison, T. J., Lee, C. S., Chen, D. S., Zuckerman, A. J. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinoma: analysis by hybridization with subgenomic DNA fragments. Hepatology. 8 (3), 518-523 (1988).
  25. Esumi, M., Tanaka, Y., Tozuka, S., Shikata, T. Clonal state of human hepatocellular carcinoma and non-tumorous hepatocytes. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 23 Suppl, S1-S3 (1989).
  26. Murakami, Y., et al. Large scaled analysis of hepatitis B virus (HBV) DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas. Gut. 54 (8), 1162-1168 (2005).
  27. Kimbi, G. C., Kramvis, A., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B. World Journal of Gastroenterology. 11 (41), 6416-6421 (2005).
  28. Tamori, A., et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA. Clinical Cancer Research. 11 (16), 5821-5826 (2005).
  29. Sung, W. K., et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nature Genetics. 44 (7), 765-769 (2012).
  30. Fujimoto, A., et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nature Genetics. 44 (7), 760-764 (2012).
  31. Jiang, S., et al. Re-evaluation of the Carcinogenic Significance of Hepatitis B Virus Integration in Hepatocarcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 7 (9), e40363(2012).
  32. Jiang, Z., et al. The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients. Genome Research. 22 (4), 593-601 (2012).
  33. Kan, Z., et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in hepatocellular carcinoma. Genome Research. 23 (9), 1422-1433 (2013).
  34. Summers, J., et al. Hepatocyte turnover during resolution of a transient hepadnaviral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (20), 11652-11659 (2003).
  35. Mason, W. S., Jilbert, A. R., Summers, J. Clonal expansion of hepatocytes during chronic woodchuck hepatitis virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (4), 1139-1144 (2005).
  36. Mason, W. S., et al. Detection of clonally expanded hepatocytes in chimpanzees with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 83 (17), 8396-8408 (2009).
  37. Chauhan, R., Churchill, N. D., Mulrooney-Cousins, P. M., Michalak, T. I. Initial sites of hepadnavirus integration into host genome in human hepatocytes and in the woodchuck model of hepatitis B-associated hepatocellular carcinoma. Oncogenesis. 6 (4), e317(2017).
  38. Tu, T., Jilbert, A. R. Detection of Hepatocyte Clones Containing Integrated Hepatitis B Virus DNA Using Inverse Nested PCR. Methods in Molecular Biology. 1540, 97-118 (2017).
  39. Ni, Y., Urban, S. Hepatitis B Virus Infection of HepaRG Cells, HepaRG-hNTCP Cells, and Primary Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 15-25 (2017).
  40. Schulze, A., Schieck, A., Ni, Y., Mier, W., Urban, S. Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction. Journal of Virology. 84 (4), 1989-2000 (2010).
  41. Lempp, F. A., et al. Evidence that hepatitis B virus replication in mouse cells is limited by the lack of a host cell dependency factor. Journal of Hepatology. 64 (3), 556-564 (2016).
  42. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  43. Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. , (2017).
  44. Yang, Z. T., et al. Characterization of Full-Length Genomes of Hepatitis B Virus Quasispecies in Sera of Patients at Different Phases of Infection. Journal of Clinical Microbiology. 53 (7), 2203-2214 (2015).
  45. Chook, J. B., et al. Universal Primers for Detection and Sequencing of Hepatitis B Virus Genomes across Genotypes A to G. Journal of Clinical Microbiology. 53 (6), 1831-1835 (2015).
  46. Li, F., et al. Whole genome characterization of hepatitis B virus quasispecies with massively parallel pyrosequencing. Clinical Microbiology and Infection. 21 (3), 280-287 (2015).
  47. Zhou, T. C., et al. Evolution of full-length genomes of HBV quasispecies in sera of patients with a coexistence of HBsAg and anti-HBs antibodies. Scientific Reports. 7 (1), 661(2017).
  48. Long, Q. X., Hu, J. L., Huang, A. L. Deep Sequencing of the Hepatitis B Virus Genome: Analysis of Multiple Samples by Implementation of the Illumina Platform. Methods in Molecular Biology. 1540, 211-218 (2017).
  49. Li, X., et al. The function of targeted host genes determines the oncogenicity of HBV integration in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 60 (5), 975-984 (2014).
  50. Wooddell, C. I., et al. RNAi-based treatment of chronically infected patients and chimpanzees reveals that integrated hepatitis B virus DNA is a source of HBsAg. Science Translational Medicine. 9 (409), (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Integracja HBV DNAzaka enie in vitroodwrotna PCRzagnie d ona PCRelektroforeza elowaekstrakcja DNAenzym restrykcyjnyligaza DNA T4sekwencjonowanie metod Sangerawirus zapalenia w troby B
Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.