Method Article

Ilościowe określanie ostrych zmian w aktywności nerek współczulnych w odpowiedzi na manipulacje ośrodkowego układu nerwowego u znieczulonych szczurów

DOI:

10.3791/58205

⸱

September 11th, 2018

 , 
1Department of Biobehavioral Health Science, College of Nursing, University of Illinois at Chicago, 2Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin and Zablocki VA Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody pomiaru reakcji układu współczulnego i sercowo-naczyniowego na manipulacje ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są ważne dla rozwoju neuronauki. Protokół ten został opracowany, aby pomóc naukowcom w pomiarze i ilościowym określeniu ostrych zmian w aktywności nerkowego nerwu współczulnego (RSNA) u znieczulonych szczurów (brak przeżycia).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywność nerkowego nerwu współczulnego (RSNA) i średnie ciśnienie tętnicze są ważnymi parametrami w badaniach sercowo-naczyniowych i autonomicznych; jednak istnieją ograniczone zasoby kierujące naukowcami w technikach pomiaru i analizy tych zmiennych. Protokół ten opisuje metody pomiaru RSNA i średniego ciśnienia tętniczego u znieczulonych szczurów. Protokół obejmuje również metody dostępu do mózgu podczas nagrań RSNA w celu manipulacji ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Technika zapisu RSNA jest kompatybilna z farmakologiczną, optogenetyczną lub elektryczną stymulacją OUN. Podejście to jest przydatne, gdy badacz będzie mierzył krótkoterminowe (od min do h) odpowiedzi autonomiczne w eksperymentach bez przeżycia, aby skorelować anatomicznie z jądrami OUN. Podejście to nie jest przeznaczone do stosowania w celu uzyskania przewlekłych (przeżytych) zapisów RSNA u szczurów. Wyładowania w RSNA, uśrednione rektyfikowane RSNA i średnie ciśnienie tętnicze można określić ilościowo i dalej analizować za pomocą parametrycznych testów statystycznych. W artykule opisano również metody uzyskiwania dostępu żylnego, telemetrycznego rejestrowania średniego ciśnienia tętniczego oraz fiksacji mózgu do przyszłej analizy histologicznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedkliniczne odkrycia dotyczące autonomicznej kontroli układu sercowo-naczyniowego informują o strategiach radzenia sobie z zaburzeniami, takimi jak nadciśnienie, niewydolność serca i przewlekła choroba nerek. Nadmierna aktywność współczulnego układu nerwowego i obniżone napięcie nerwu błędnego serca przyczyniają się do podwyższonego ciśnienia krwi (BP)1. Przewlekle podwyższony odpływ współczulny nerek zwiększa wydzielanie katecholamin i zmniejsza przepływ krwi przez nerki, co ma szkodliwe konsekwencje dla układu sercowo-naczyniowego/nerkowego2,3. Aby zdefiniować szlaki neurobiologiczne prowadzące do dysfunkcji autonomicznej, badania na gryzoniach są ważne dla określenia, w jaki sposób neurony ośrodkowego układu nerwowego (OUN) regulują parametry współczulne. Celem tego protokołu jest dostarczenie informacji technicznych na temat pomiaru aktywności nerkowego nerwu współczulnego (RSNA) i ciśnienia tętniczego oraz nakreślenie technik ilościowego określania ostrych zmian współczulnych w odpowiedzi na manipulacje OUN u znieczulonych szczurów.

Ostre (nieprzeżycia) pomiary RSNA (trwające od min do h) są przydatne, gdy naukowcy będą badać OUN farmakologicznie, elektrycznie lub optogenetycznie u znieczulonych szczurów, aby określić funkcje określonych jąder. Za pomocą tych metod zbadano struktury takie jak pojedyncze jądro, szarość okołowodociągowa, nakrywka szypułkowa i rostralny rdzeń brzuszno-boczny w celu zdefiniowania szlaków neurobiologicznych regulujących parametry współczulne4,5,6,7. Podejście to jest ważne dla identyfikacji celów OUN, które mają być dalej badane w przewlekłych modelach dysfunkcji autonomicznej8,9. Aby przeprowadzić te eksperymenty, laboratorium potrzebuje lutownicy, mikroskopu chirurgicznego, ramy stereotaktycznej, wzmacniacza mikroelektrod i monitora audio. W zależności od czynników obecnych w laboratorium, które przyczyniają się do szumu elektrycznego, obszar chirurgiczny/nagrywający może wymagać klatki Faradaya/paska uziemiającego w celu zmniejszenia szumu elektrycznego w nagraniu RSNA. Jeśli analiza mózgu będzie wymagała utrwalenia tkanki, wymagana jest pompa perfuzyjna i wyciąg. Dane mogą być digitalizowane i rejestrowane za pomocą wielu jednostek oprogramowania fizjologicznego/akwizycji danych (przetwornik analogowo-cyfrowy)4,5, z różnymi opcjami analizy i kompatybilnością w zakresie włączania sygnałów telemetrycznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Illinois w Chicago.

1. Utwórz bipolarne elektrody RSNA

  1. Aby utworzyć elektrodę, wytnij dwa kawałki drutu ze stali nierdzewnej o długości około 18 mm każdy. Wytnij jeden kawałek rurki polietylenowej (PE-50) o długości około 15 mm. Włóż oba kawałki drutu do rurki, pozostawiając drut wystający z obu końców.
  2. Usuń izolację z końców przewodów; przytnij przewody, pozostawiając 2-3 mm odsłoniętego drutu. Z jednej strony zaciśnij męskie piny na odsłoniętym przewodzie. styki bezpiecznie do przewodu, zabezpiecz styki wewnątrz listwy łączącej i zakryj połączenie żywicą epoksydową.
    UWAGA: Alternatywnym podejściem, które pozwala uniknąć, jest użycie szybkozłączek/zwalniaczy krokodylkowych.
  3. Na przeciwległym końcu elektrody usuń izolację z końców przewodów, pozostawiając 2-3 mm odsłoniętego drutu. Zegnij tę część przewodów, aby utworzyć małe haczyki w kształcie litery "V" w nieizolowanym przewodzie.
    UWAGA: Jest to część elektrody, która będzie miała kontakt z nerkowym nerwem współczulnym. Ważne jest, aby uszczelnić ten koniec, aby zapobiec przedostawaniu się płynów do rurki. Skutecznie można użyć silikonu lub żywicy epoksydowej.

2. Podać znieczulenie i przygotować miejsca operacji

  1. Podaj znieczulenie samcowi szczura Sprague Dawley (w wieku 9-11 tygodni, o wadze 150-400 g). Pentobarbital sodu należy podawać w dawce 50 mg/kg mc. we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP). Aby ocenić stabilną płaszczyznę znieczulenia podczas operacji, sprawdzaj odruch szczypania palców u nóg co 15 minut i w razie potrzeby ponownie dozuj znieczulenie.
    UWAGA: Pentobarbital sodu (Nembutal) był używany w poprzednich badaniach w celu uzyskania trwałej płaszczyzny znieczulenia bez zakłócania modulacji RSNA4,5,6. Protokół ten jest przeznaczony do operacji bez przeżycia, więc nie ma okresu rekonwalescencji/monitorowania pooperacyjnego.
  2. Przygotuj miejsce operacji zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami (tj. ogol brzuch, grzbiet i głowę szczura; oczyść skórę 10% roztworem jodu powidonu; nałóż lubrykant do oczu i umieść szczura na poduszce grzewczej). Podczas eksperymentów utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C.

3. Kantonacja żyły udowej (do dostępu dożylnego)

  1. Dodaj heparynę do 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej (aby uzyskać 20 jednostek/ml). Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml heparynizowaną solą fizjologiczną za pomocą igły 22G. Podłącz 15 cm rurki PE-50 do igły i napełnij rurkę roztworem.
  2. Gdy szczur leży na wznak, wykonaj 2 cm poziome nacięcie w okolicy pachwinowej. Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką wypreparuj tkankę łączną, aby odsłonić żyłę udową i tętnicę. Aby utrzymać nacięcie otwarte, należy zastosować elastyczne szpilki chirurgiczne z pojedynczym haczykiem przymocowane do pola operacyjnego za pomocą jedwabnej taśmy lub użyć małych hemostatów.
  3. Użyj hemostatów, aby zgiąć końcówkę igły 22G pod kątem 90°, aby służyła jako wprowadzacz cewnika10.
  4. Wizualizuj naczynia pod mikroskopem. Delikatnie oddziel żyłę i tętnicę za pomocą zakrzywionych kleszczy. Umieść dwa jedwabne szwy 5-0 o długości 12 cm pod żyłą (jeden dystalny i jeden proksymalny); Szew należy umieścić w ten sam sposób pod tętnicą.
    1. Zawiąż dystalny (dolny) szew, aby zamknąć żyłę; przymocuj krawędzie tego szwu do pola operacyjnego za pomocą jedwabnej taśmy lub małych hemostatów. Delikatnie pociągnij żyłę, ale nie z taką siłą, aby naczynie się rozerwało. Ustaw żyłę prostopadle do dominującej ręki chirurga.
  5. Użyj luźnego półwęzła od góry w proksymalnym szwie, aby na krótko zamknąć żyłę. Za pomocą delikatnych kleszczyków hemostatycznych delikatnie zaciśnij ten szew, aby zablokować przepływ krwi. Trzymaj igłę 22G z zagiętą końcówką w niedominującej ręce; Zapnij rurkę kleszczami, używając dominującej ręki.
  6. Nakłuć mały otwór w żyle za pomocą wprowadzacza cewnika (krok 3.3) i włożyć rurkę PE-50 (wstępnie wypełnioną heparynizowaną solą fizjologiczną) do naczynia; użyj wygiętej igły, aby otwór w naczyniu był otwarty i aby pomóc w umieszczeniu końcówki cewnika w naczyniu10.
    1. Zwolnij szew proksymalny i delikatnie wsyp 0,2 ml heparynizowanego soli fizjologicznej do żyły; przesunąć cewnik. Sprawdź powrót krwi z żyły, aby upewnić się, że jest prawidłowo umieszczona. Uzupełnij węzeł proksymalny i za pomocą dystalnej opaski do szwów zabezpiecz rurkę wewnątrz żyły.
  7. Podczas eksperymentów należy używać dostępu żylnego do podawania dodatkowego znieczulenia lub leków oraz do pobierania krwi. Dołącz 3-drożne złącze, jeśli konieczne będą regularne wlewy dożylne i pobieranie krwi. Sprawdzaj szkodliwy odruch szczypania palców u nóg co 15 minut, aby miareczkować znieczulenie.

4. Kantonacja tętnicy udowej w celu monitorowania średniego ciśnienia tętniczego

  1. Wizualizuj tętnicę pod mikroskopem. Podobnie jak w przypadku metody stosowanej do kaniulacji żylnej, zawiąż szew dystalny (krok 3.4), aby zamknąć tętnicę; Przymocuj krawędzie tego szwu do pola operacyjnego za pomocą jedwabnej taśmy i ustaw tętnicę prostopadle do dominującej ręki chirurga.
  2. Dostęp tętniczy w przypadku korzystania z przetwornika ciśnienia/systemu infuzyjnego
    1. Podłącz przetwornik/rurkę ciśnienia do worka z solą fizjologiczną o pojemności 500 ml 0,9%. Przepłucz rurkę solą fizjologiczną, usuwając wszystkie pęcherzyki, i umieść worek w worku z induktorem ciśnienia, aby zwiększyć ciśnienie w systemie.
    2. Jak opisano w kroku 3.1, napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml hemarynizowanym soli fizjologicznej przez igłę 22G i podłącz 15 cm PE-50 do igły (rurka do płukania z heparynizowaną solą fizjologiczną).
    3. Użyj luźnego półwęzła w proksymalnym szwie, aby na krótko zamknąć tętnicę. Trzymać wprowadzacz cewnika (krok 3.3) w ręce niedominującej; trzymaj dystalną końcówkę PE-50 za pomocą kleszczy kaniulacyjnych naczyń w ręce dominującej. Nakłuć otwór w tętnicy wygiętą igłą 22G i wprowadzić kaniulę do naczynia.
    4. Zwolnij szew proksymalny i delikatnie wlej 0,2 ml heparynizowanej soli fizjologicznej do tętnicy i wsuń cewnik tak daleko, jak to możliwe. Sprawdź, czy krew tętnicza wraca, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie. Uzupełnij węzeł proksymalny i za pomocą opaski do szwów dystalnych zabezpiecz rurkę wewnątrz tętnicy. Podłącz przewód tętniczy do przetwornika/rurki ciśnienia.
      UWAGA: Dystalną część rurki można przykleić taśmą do tylnej kończyny szczura, aby zabezpieczyć linię tętniczą. Alternatywne podejście do kaniulacji naczyń opisano przez Jespersen i wsp.; 11 ich protokół różni się tym, że używają retraktorów do rozprowadzania nacięcia, kleju - zamiast szwu - do zabezpieczenia rurki, a podejście nie obejmuje wprowadzacza wygiętej igły.
  3. Dostęp do tętnic w przypadku korzystania z telemetrii
    1. Sprawdź cewnik wykrywający ciśnienie w dużym powiększeniu przed kaniulacją tętniczą. Upewnij się, że cewnik jest wolny od pęcherzyków/zanieczyszczeń i ma nienaruszoną łąkotkę między elementami wypełnionymi płynem (proksymalnym) i żelem (dystalnymi). Przed każdą implantacją należy uzupełnić żel na dystalnej końcówce cewnika. Włącz nadajnik za pomocą magnesu; monitorować ciśnienie krwi podczas operacji, aby wytrzymać idealne umieszczenie.
    2. Użyj luźnego półwęzła od góry w proksymalnym szwie, aby na krótko zamknąć tętnicę udową. Trzymaj wprowadzacz cewnika (krok 3.3) w ręce niedominującej. Przytrzymaj końcówkę kaniuli jednostki telemetrycznej za pomocą kleszczy do kaniulacji naczyń, aby uniknąć wyparcia żelu z końcówki.
    3. Nakłuć otwór w tętnicy wygiętą igłą 22G i wprowadzić kaniulę do tętnicy za pomocą kleszczy do kaniulacji naczyń, aby uniknąć wyparcia żelu z końcówki. Przesuń kaniulę tak daleko, jak to możliwe. Za pomocą pasaży do szwów proksymalnych i dystalnych zabezpiecz cewnik ciśnieniowy.
    4. Wsuń korpus implantu telemetrycznego do boku przylegającego do nacięcia i zamknij to nacięcie za pomocą nylonowego szwu 4-0 na igle tnącej. Wyłącz urządzenia telemetryczne za pomocą magnesu po zakończeniu okresu nagrywania, aby wydłużyć żywotność baterii.

5. Umieść szczura w ramce do operacji stereotaktycznej, aby uzyskać dostęp do mózgu

  1. Delikatnie przesuń szczura do pozycji leżącej w ramie do operacji stereotaktycznej.
  2. Umieść szczura między nausznikami i wyreguluj siekacz, aby wyrównać wysokość lambdy i bregmy. Pozycjonowanie może zależeć od szczepu szczura, wagi i lokalizacji celów OUN.
  3. Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie skalpela rostrocaudal przez linię środkową skóry głowy. Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką mocno usuń tkankę łączną z powierzchni czaszki. Nałóż nadtlenek wodoru na czaszkę, aby pomóc w wizualizacji szwów bregma, lambda i linii środkowej.
  4. Korzystając z atlasu mózgu szczura, aby poprowadzić targeting12, wywierć w czaszce osteotomię z otworem w kształcie zadziorów, dostosowanym do dostępu do elektrody.

6. Izolacja nerkowych nerek współczulnych

  1. Podłącz drutową elektrodę RSNA (kroki 1.1-1.3) do 10X pre-amplifier i mikroelektroda amplifier.
  2. Odizoluj nerwy nerkowe przez nacięcie zaotrzewnowe przed lub po zabezpieczeniu szczura w ramie stereotaktycznej. Ustaw elektrody RSNA, gdy szczur znajdzie się w ramce stereotaktycznej. Wykonaj nacięcie skalpela rozciągające się od 4-5 cm poniżej żeber w kierunku ogonowym, lekko bocznie do kręgosłupa. Tępo rozetnij nacięcie, aby uwidocznić mięśnie przykręgosłupowe.
  3. Użyj nożyczek, aby wykonać bardzo powierzchowne 1-2 cm nacięcie rostrocaudalne w miejscu, w którym tłuszcz styka się z mięśniem. Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką rozprowadź tłuszcz z dala od mięśnia, aby uwidocznić nerki. Ważne jest, aby nie wchodzić do przestrzeni otrzewnej.
  4. Użyj retraktorów, aby delikatnie oddzielić nerkę od mięśni przykręgosłupowych, aby uwidocznić tętnicę nerkową i aortę brzuszną. Nie należy nadmiernie rozciągać naczyń krwionośnych, aby uniknąć uszkodzenia nerwów nerkowych. Użyj bawełnianego gazika o wymiarach 2 x 2 cale nasączonego solą fizjologiczną, aby chronić nerkę przed uszkodzeniem.
  5. W dużym powiększeniu zidentyfikuj nerwy nerkowe w kieszonce nacięcia. Pęczki nerwowe są najłatwiej widoczne w kącie prostym utworzonym przez aortę i tętnicę nerkową. Nerwy nerkowe ściśle podążają za tętnicą nerkową od aorty do nerek.
  6. Wybierz segment pęczka nerwowego, który zostanie umieszczony na elektrodzie rejestrującej. Delikatnie wypreparuj włókna nerwowe z otaczającej tkanki/naczynia za pomocą pęsety do mikropreparowania.
  7. Zabezpiecz drucianą elektrodę RSNA w uchwycie (np. zacisku krokodylkowym przymocowanym do stojaka nośnego). Opuść elektrodę do poziomu segmentu nerwowego. Użyj haczyka nerwowego, aby delikatnie podnieść odcinek nerwu nerkowego na elektrodę bez rozciągania nerwu.
    UWAGA: Nerw powinien spoczywać wewnątrz obu haczyków w kształcie litery "V" w nieizolowanym przewodzie, równolegle do nerwu. Przewody elektrod nie mogą dotykać żadnych innych tkanek, krwi ani płynu limfatycznego.
  8. Wypełnij nacięcie olejem mineralnym, aby zapobiec wysuszeniu odsłoniętego nerkowego nerwu współczulnego. Użyj klipsa uziemiającego tak, aby jednym końcem znajdował się na skórze nacięcia, a drugi był przymocowany do klatki Faradaya.
  9. Skieruj sygnał do wzmacniaczy za pomocą filtrowania górno- i dolnoprzepustowego (10 Hz i 3 kHz). Dostosuj wzmocnienie do 10 K. Dołącz monitor audio, aby ocenić wzór pękania RSNA. Używaj częstotliwości próbkowania w zakresie od 2 000 do 10 000 Hz4,5,6,7,8. Użyj zwiększonej częstotliwości próbkowania, gdy przypuszcza się, że manipulacja OUN powoduje szybkie/krótkie reakcje współczulne.

7. Rejestruj dane

  1. Oceń jakość zapisu RSNA, wywołując barorerefleks za pomocą wstrzyknięcia dożylnie w bolusie 1 ml soli fizjologicznej lub 10 μg/ml fenylefryny (w 0,1 ml). Jak pokazano w Rysunek 1, infuzja powinna zwiększać ciśnienie krwi i hamować RSNA. Wzrost średniego ciśnienia tętniczego o 60-80 mmHg jest wystarczający do zahamowania współczulnego nerek4,13,14.
  2. W razie potrzeby wyreguluj położenie elektrod, aby poprawić sygnał. Repozycja jest wymagana, jeśli nerw nie styka się z obydwoma haczykami elektrody lub jeśli jakakolwiek tkanka, krew lub płyn limfatyczny stykają się z przewodami.
    UWAGA: Potrzeba zmiany pozycji zależy od charakterystyki słuchowej wyładowań nerwowych.
    1. Jeśli impulsy RSNA nie występują cyklicznie w cyklu pracy serca i jeśli występują jakiekolwiek zakłócenia w zapisie, należy ostrożnie zmienić położenie elektrody.
    2. Ponieważ ruchy oddechowe mogą również wpływać na jakość zapisu RSNA, popraw sygnał, delikatnie przesuwając elektrodę do pozycji, w której ruchy mięśni nie zakłócają elektrody podczas oddychania.
  3. Po uzyskaniu wyraźnego sygnału zabezpiecz elektrodę RSNA na miejscu, pobierając olej mineralny i nakładając żel krzemionkowy w celu zakrycia połączenia nerw/elektroda w kieszonce nacięcia. Nie ruszaj szczura, dopóki żel nie stwardnieje całkowicie.
  4. Wykonuj protokoły manipulacji OUN, jednocześnie stale rejestrując RSNA i średnie ciśnienie tętnicze. Jeśli mikroiniektor/pulsator jest używany do manipulacji pniem mózgu, sygnał logiczny z tego urządzenia może zostać wprowadzony do nagrań RSNA/BP w celu udokumentowania czasu manipulacji OUN
    5. .
  5. Po zakończeniu eksperymentu określ poziom hałasu, miażdżąc nerw proksymalnie do elektrod rejestrujących między żelem krzemionkowym a mięśniem rdzeniowym. Zapisz co najmniej 30 s tej wartości "zero" dla RSNA4,5,6. Jako alternatywne podejście do ilościowego określania szumu należy podać krótko działający bloker zwojowy, taki jak atropina, heksametonium, chlorisondamina lub winian pentoliny8,15,16,17.
  6. Ostrożnie wyjmij elektrodę RSNA i usuń wszelkie ślady żelu krzemionkowego z drutów elektrodowych. Zachowaj elektrodę do ponownego użycia. Wyłącz nadajnik telemetryczny i wyjmij go, uważając, aby nie uszkodzić końcówki cewnika.

8. Eutanazja (perfuzja przezsercowa)

  1. Zidentyfikuj miejsca manipulacji OUN poprzez wstrzykiwanie barwników lub fluorochromów, tworzenie zmian elektrolitycznych lub wykrywanie ekspresji c-fos.
  2. Jeśli analiza mózgu będzie wymagała fiksacji, przygotuj szczura do perfuzji przezsercowej. Oceń odruch szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że szczur pozostaje głęboko znieczulony. W razie potrzeby zapewnij dodatkowe znieczulenie. Wykonać przezsercową perfuzję utrwalacza paraformaldehydu w dygestorium.
    UWAGA: Działa drażniąco na skórę/oczy.
  3. Włóż rurkę do pompy perfuzyjnej i zalej 0,9% solą fizjologiczną.
  4. Wykonaj boczne nacięcie o długości 5-6 cm przez skórę i ścianę brzucha bezpośrednio pod klatką piersiową i otwórz jamę klatki piersiowej. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony. Wykonaj małe nacięcie w przeponie za pomocą zakrzywionych nożyczek. Wstrzyknąć 0,1 ml heparyny bezpośrednio do lewej komory.
  5. Przełóż igłę perfuzyjną do lewej komory (igła do zgłębnika ze stali nierdzewnej dobrze sprawdza się na tym etapie), nakłuwając ją do serca lub wycinając małe nacięcie ostrymi nożyczkami i przepuszczając igłę przez zgłębnik tak, aby końcówka była widoczna przez ścianę aorty (ale nie powinna sięgać do łuku aorty). Użyj klipsa chirurgicznego lub elektrycznego, aby zabezpieczyć igłę na miejscu.
  6. Za pomocą pompy infuzyjnej podać 0,9% soli fizjologicznej (temperatura pokojowa). Natychmiast wykonaj 2-3 mm nacięcie w prawym przedsionku, aby stworzyć ujście dla płukanki z soli fizjologicznej. Nie przecinaj aorty zstępującej. Kontynuuj płukanie solą fizjologiczną, aż wątroba zmieni kolor z czerwono-brązowego na bladożółty, napar około 400 ml przez 2-3 minuty.
  7. Zatrzymaj pompę. Zmienić perfuzat na utrwalacz (np. 10% formaliny lub 4% paraformaldehydu); Zaparzać 400 ml przez 2-3 minuty. Usunąć mózg i przechowywać próbkę w roztworze utrwalającym przez noc w temperaturze 4 °C przed przeniesieniem tkanki do 30% sacharozy (30 ml sacharozy rozpuszczonej w 100 ml 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem) przez co najmniej 3 dni lub do momentu, gdy mózg opadnie, w celu krioprotekcji przed sekcją kriogenetyczną18.

9. Analizuj dane

  1. Pełna fala prostuje surowy RSNA, aby uzyskać wartości bezwzględne. Pełnookresowy prostuje 10-sekundowy segment surowego sygnału szumu. Ważne jest, aby wykluczyć wszelkie badania, na które wpływ miał niski stosunek sygnału do szumu. W badaniach kwantyfikujących RSNA badacze zastosowali kryteria a priori, takie jak wymóg, aby stosunek sygnału do szumu przekraczał od 2:1 do 6:117,19,20.
  2. Obliczyć średnią wyprostowaną RSNA dla nienakładających się na siebie segmentów (μV) i odjąć oszacowany hałas (μV). W zależności od celów eksperymentu, badacze mogą wybrać interwały, takie jak 10 s (Rysunek 1) lub 1 s. Obliczanie średnich za pomocą opcji analizy kształtu fali w oprogramowaniu fizjologicznym lub eksportowanie danych do arkuszy kalkulacyjnych w celu obliczenia średnich dla wybranych przedziałów czasowych.
  3. Aby znormalizować dla różnych zwierząt, należy wyrazić wartości do dalszej analizy jako procentową zmianę w stosunku do linii bazowej. Używanie statystyk parametrycznych do przeprowadzania porównań grup.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje przykładowy zapis RSNA i BP od szczura znieczulonego Nembutalem. Dożylne wstrzyknięcie fenylefryny zastosowano w celu wywołania wzrostu średniego ciśnienia tętniczego i wywołania barorerefleksu oraz przejściowego hamowania układu współrzędnościowego4,6. Aby określić ilościowo RSNA, surowy RSNA został skorygowany i uśredniony dla nienakładających się na siebie odcinków 10 s; Oszacow...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki pomiaru RSNA obejmują: (1) unikanie rozciągania tętnicy nerkowej i nerwów podczas oddzielania nerki od mięśnia przykręgosłupowego i podczas umieszczania segmentu nerwowego na elektrodach rejestrujących, (2) staranne wypreparowanie włókien nerwowych nerek z otaczającej tkanki/naczynia, (3) upewnienie się, że druty elektrod są wolne od tkanki, krwi, lub płyn limfatyczny oraz (4) zapobieganie wysychaniu nerwu poprzez stosowanie oleju mineralnego na nerw nerwowy i żelu krzemionkowego na jednostkę nerwowo-elek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anne M. Fink jest członkiem Rady Doradczej ds. Klientów w Data Sciences International.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez National Institute for Nursing Research (K99/R00NR014369).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Drut ze stali nierdzewnejA-M Systems; Sequim, WA791000Elektroda RSNA
Rurka z polietylenu (PE-50) VWR; Radnor, PA63019-048Elektroda RSNA; kaniulacja naczyń
Miniaturowe złącze pinoweA-M Systems; Sequim, WA520200Elektroda RSNA
Narzędzie do zaciskaniaDaniels Manufacturing Corp.; Orlando, FLM22520Elektroda RSNA
Listwa łączącaAmphenol; Clinton Township, MI221-2653Elektroda RSNA
J-B Kwik EpoxyJ-B Weld, Sulphur Springs, TX8270Elektroda RSNA
SilikonPermatex; Hartford, CT2222Elektroda RSNA
Heparyna sodowa; Do wstrzykiwań (fiolka 10 mL, 1000 U/mL)KV Zaopatrzenie weterynaryjne; David City, NEP03466Drożność linii żylnej
Fenylefryna HCl; Do wstrzykiwań (fiolka 1 ml; 10 mg/ml)ACE Zaopatrzenie chirurgiczne; Brockton, MA950-6312Testowanie hamowania współczulenia nerek
Elastyczne staniki chirurgiczne z pojedynczym hakiemAparat Harvarda; Holliston, MA72-2595Nacięcie
Jedwabna taśma chirurgiczna3M, Minneapolis, MN1538-0Bezpieczne igły chirurgiczne
, 20 GSigma-Aldrich; St. Louis, MOZ192554-100EAKaniulacja naczyń
Dumont #7 zakrzywione kleszczeNarzędzia do nauki pięknej; Foster City, CA11274-20Kaniulacja naczyń
5-0 jedwabne opaski do szwówBraintree Scientific; Braintree, MASUT-S 106Kaniulacja naczyń
Delikatne kleszcze hemostatyczneRoboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MDRS-7117Kanituacja naczyń i chirurgia RSNA
Kleszcze hemostatyczne CrileNarzędzia do nauki pięknej; Foster City, CA13004-14do gięcia igieł
Data Sciences International; Minneapolis, MNPA-10Monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego (telemetria)
Strzykawka do ponownego żelowaniaData Sciences International; Minneapolis, MN276-0038-001Ponowne użycie nadajnika (telemetria)
Jednorazowy przetwornik ciśnieniaTranspac; San Clemente, CAMI-1224Monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego
Zaparzacz ciśnieniowy Clear-CuffMILA International Inc.; Florencja, KY2281339Monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego
Kleszcze do kaniulacji naczyńNarzędzia do nauki pięknej; Foster City, CA00574-11Wprowadzenie cewnika
monofilamentowy nylon 4-0 szew na igle do odwrotnego cięciaMcKesson Medyczno-Surgical; San Francisco, CAS661GXBezpieczny nadajnik telemetryczny
Odbiornik telemetrycznyData Sciences International; Minneapolis, MNRPC-1Monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego (telemetria)
LabChart Pro (oprogramowanie), PowerLab (sprzęt do akwizycji)AD Instruments; Colorado Springs, COML846, MX2 matrix 2.0 (kompatybilna z telemetrią Data Science International)3 opcje oprogramowania/sprzętu do akwizycji
SciWorks (oprogramowanie), DataWave (sprzęt do akwizycji)DataWave Technologies, Loveland, CON/A
Spike 2 (oprogramowanie), Micro1401-3Cambridge Electronic Design Ltd., Londyn Wielka Brytania1401-3
Micro-drillRoboz Instrument chirurgiczny Co.; Gaithersburg, MDRS-6300Chirurgia OUN
Rama do chirurgii stereotaktycznejStoelting; Wood Dale, IL51600chirurgia CNS
Wzmacniacz mikroelektrod z 10-krotnym przedwzmacniaczemA-M Systems; Sequim, WA1800-2RSNA Zwijacze do nagrywania
Narzędzia do nauki pięknej; Foster City, CA17009-07Chirurgia RSNA
Pęsety do mikropreparacjiFine Science Tools; Foster City, CA11251-10RSNA chirurgia
MikrohakNarzędzia do nauki pięknej; Foster City, CA10064-14Chirurgia RSNA
Olej mineralnyFisher Scientific; Waltham, MA8042-47-5Chirurgia RSNA
Monitor audioSystemy AM; Sequim, WA3300RSNA chirurgia
Żel krzemionkowyWacker, München; NiemcyRT601A-BChirurgia RSNA
Klipsy elektryczneTyco Electronics; Schaffhausen, SzwajcariaEB0283-000Nożyczki do uziemiania lub zabezpieczania igły perfuzyjnej
Bonn, proste/ostre końcówkiRoboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MDRS-5840Igła do perfuzji
AparatHarvarda; Holliston, MA75-0286Pompa perfuzyjna
MasterflexCole-Parmer; Vernon Hills, IL7524-10Perfusion
Masterflex rurka silikonowa utwardzana platyną, Cole-Parmer; Vernon Hills, IL96410-15Perfuzja
Formalina (10% roztwór buforowy; 4 L)Sigma-Aldrich; St. Louis, MOHT501128Perfuzja
SacharozySigma-Aldrich; St. Louis, MOS0389Krioprotekcja
Nadajnik telemetryczny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
  2. Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
  3. Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767(2011).
  4. Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956(2017).
  5. Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
  6. Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
  7. Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
  8. Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
  9. Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
  10. Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
  11. Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496(2012).
  12. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
  13. Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
  14. Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
  15. Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
  16. Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
  17. Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
  18. Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
  19. DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
  20. Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
  21. Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
  22. Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
  23. Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
  24. Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
  25. Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
  26. Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
  27. Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
  28. Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
  29. Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
  30. Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Renal Sympathetic Nerve ActivityMean Arterial PressureCentral Nervous SystemAnesthetized RatsRSNA RecordingStereotaxic SurgeryBaroreflex AssessmentTelemetry ImplantationNerve DissectionAutonomic Regulation

Related Articles