Opisano długoterminowy model hodowli bydlęcych komórek ziarnistych w warunkach wolnych od surowicy. Model ten pozwala naukowcom badać wpływ różnych czynników i warunków, takich jak różna gęstość posiewu, na charakterystykę bydlęcych komórek ziarnistych wytwarzających estrogen.
Artykuł metodologiczny
Model hodowli tkankowej pierwotnych komórek ziarnistych bydła wytwarzających estrogen
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki ziarniste jajnika (GC) są głównym źródłem syntezy estradiolu. Wywołane przez przedowulacyjny wzrost hormonu luteinizującego (LH) komórki osłonki, a w szczególności warstwy komórek ziarnistych, głęboko zmieniają swoje cechy morfologiczne, fizjologiczne i molekularne oraz tworzą ciałko żółte wytwarzające progesteron, które jest odpowiedzialne za utrzymanie ciąży. Modele hodowli komórkowych są niezbędnymi narzędziami do badania podstawowych mechanizmów regulacyjnych zaangażowanych w transformację pęcherzykowo-lutealną. Przedstawiony protokół koncentruje się na procedurze izolacji i kriokonserwacji GK bydła z małych i średnich pęcherzyków (< 6 mm). Dzięki tej technice można uzyskać prawie czystą populację GC. Procedura kriokonserwacji znacznie ułatwia zarządzanie czasem pracy hodowli komórkowej niezależnie od bezpośredniego zaopatrzenia w tkankę pierwotną (jajniki). Protokół ten opisuje model hodowli komórkowej bez surowicy, który naśladuje aktywny status estradiolu u bydła. Ważne warunki, które są niezbędne do udanej hodowli komórek aktywnych steroidami, są omawiane w całym protokole. Wykazano, że zwiększenie gęstości posiewu komórek indukuje specyficzną odpowiedź, na co wskazuje zmieniony profil ekspresji genów i produkcja hormonów. Co więcej, model ten stanowi podstawę do dalszych badań nad różnicowaniem GC i innymi zastosowaniami.
Wprowadzenie
Udana owulacja i luteinizacja zależą od precyzyjnie dostrojonych i dobrze zaaranżowanych zmian molekularnych w różnych typach komórek pęcherzykowych somatycznych. Ponieważ szczegóły tych procesów rozwojowych nie są jeszcze w pełni poznane, konieczne są dalsze wyjaśnienia. Metody in vivo są skomplikowane i kosztowne, a w szczególności nie uwzględniają konkretnych mechanizmów molekulogennych, które zachodzą podczas folikulogenezy. W związku z tym potrzebne są również redukcjonistyczne modele in vitro, aby zapewnić wgląd w szczegóły komórkowe i molekularne. Różne badania opisują hodowlę całych pęcherzyków w kontekście technik zapłodnienia in vitro1,2,3. Ponieważ naukowcy interesują się mechanizmami różnicowania, wiele badań koncentruje się na gk grudkowym. Komórki te, bezpośrednio związane z oocytem, są głównymi źródłami produkcji estrogenu, a zatem odgrywają istotną rolę podczas folikulogenezy i luteinizacji4.
Nieśmiertelne linie komórkowe GC zostały opracowane z różnych gatunków. Większość z nich nie wykazuje jednak wystarczającej produkcji hormonów steroidowych5. Do tej pory ustalono tylko jedną linię komórkową GC bydła6, ale linia ta straciła swoją steroidogenną aktywność po kilku przejściach7. W związku z tym, ponieważ steroidogeneza, a w szczególności produkcja estradiolu, jest istotną cechą funkcji GC, wskazane jest zbadanie tych aspektów w pierwotnych modelach hodowli komórkowych. W poprzednich badaniach wykazano, że znaczną produkcję estradiolu można zaobserwować tylko w warunkach hodowli bez surowicy8,9. Idąc dalej, suplementacja prekursora syntezy estradiolu jest kolejnym warunkiem wstępnym, ponieważ GC nie wyraża niezbędnego enzymu, który może przekształcić progesteron w androstendion10. Dodatkowo, synergiczny efekt suplementacji FSH i IGF-1 in vitro ujawnił zoptymalizowaną aktywność aromatazy, kluczowego enzymu syntezy estradiolu11. W niniejszym protokole opisano również inne ważne czynniki, które mają istotny wpływ na model hodowli GC. W szczególności gęstość posiewu komórek ma ogromny wpływ na wynik eksperymentu12. Ponadto można ustalić technikę kriokonserwacji GK bydła, która nie ingeruje znacząco w fizjologię GC w hodowli. Technika ta pomaga poprawić organizację pracy hodowli komórkowych i zoptymalizować preferowaną gęstość posiewu.
Protokół
UWAGA: Jajniki bydlęce zostały pozyskane z komercyjnej rzeźni. Zbieranie produktów ubocznych rzeźni nie wymaga zgody etycznej zgodnie z niemieckim prawem.
1. Warunki pracy i przygotowania
- Aby zagwarantować sterylność, wszystkie prace związane z przygotowaniem pożywek i tkanek, a także wszystkie prace związane z hodowlą należy wykonać w specjalistycznym laboratorium hodowli komórkowych przy użyciu stanowiska z przepływem laminarnym.
- Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4) uzupełnioną 100 j.m. penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny i 0,5 μg/μL amfoterycyny do transportu jajników.
UWAGA: Maksymalny czas między otrzymaniem jajników a wyizolowaniem GC wynosi 2 godziny w tej konfiguracji.
2. Izolacja komórek ziarnistych bydła
- Przemyj jajniki kilka razy w 1x PBS (ze 100 j.m. penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny i 0,5 μg/μl amfoterycyny) w celu usunięcia krwi z powierzchni przed rozpoczęciem procedury izolacji. Użyj zlewki, umieść jajniki w środku, napełnij je 1x PBS i ponownie wyrzuć PBS.
- Powtórz ten etap mycia 3–4 razy, aż jajniki zostaną oczyszczone z pozostałej krwi.
- Przetrzyj jeden jajnik chusteczką laboratoryjną nasączoną 70% alkoholem, aby zminimalizować ewentualne zanieczyszczenia.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igły 18 G odessać GC, nakłuwając małe i średnie pęcherzyki (<6 mm, mierzone linijką) i zebrać płyn pęcherzykowy w jednej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Aby zwilżyć strzykawkę, weź niewielką ilość 1x PBS (ze 100 j.m. penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny i 0,5 μg/μL amfoterycyny). Pomaga to w zbieraniu niewielkich ilości płynu pęcherzykowego i zapobiega zaleganiu komórek wewnątrz strzykawki. - Po nakłuciu kilku mieszków włosowych przepłucz strzykawkę i igłę 1x PBS w celu pośredniego oczyszczenia.
3. Kriokonserwacja komórek
- Użyj barwienia błękitem trypanowym i policz komórki pod hemocytometrem.
- Aby policzyć liczbę żywotnych komórek, przygotuj probówkę z 1,5 μl 0,25% roztworu błękitu trypanowego.
UWAGA: Żywe komórki pozostaną niezabarwione, ponieważ błękit trypanowy może uzyskać dostęp tylko do bariery komórkowej martwych komórek, które następnie wydają się niebieskie. - Dodać 15 μl zawiesiny komórek ziarnistych do roztworu błękitu trypanowego i delikatnie wymieszać.
- Umieść mieszaninę w obu komorach hemocytometru. Policz liczbę żywych (np. niebarwionych) komórek w jednym dużym kwadracie na komorę.
UWAGA: Chociaż niektóre krwinki są widoczne, można je odróżnić po bardzo małym rozmiarze. - Oblicz liczbę żywych komórek na podstawie średniej z obu kwadratów komory zgodnie z ogólnymi wytycznymi; proporcja żywych komórek może się różnić w zależności od jajnika, ale powinna przekraczać 60%13.
- Aby policzyć liczbę żywotnych komórek, przygotuj probówkę z 1,5 μl 0,25% roztworu błękitu trypanowego.
- Pobrać próbkę ze świeżo wyizolowanej puli komórek ziarnistych jako odniesienie do dalszej analizy.
- W zależności od liczby komórek w wyizolowanym GC, należy odłożyć odpowiednią liczbę komórek jako próbki referencyjne do przygotowania RNA, DNA lub białka.
UWAGA: Do izolacji RNA i późniejszej oceny ekspresji genu wystarczy 1 x 105 komórek, podczas gdy inne późniejsze analizy mogą wymagać innej, ogólnie wyższej liczby komórek. - Umieścić jedną lub kilka podwielokrotności komórek odniesienia w świeżej probówce i odwirowywać ją przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i maksymalnej prędkości (12 000 x g) w celu uzyskania osadu komórkowego. Odrzucić supernatant.
- Natychmiast zamrozić próbki w ciekłym azocie. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C.
- W zależności od liczby komórek w wyizolowanym GC, należy odłożyć odpowiednią liczbę komórek jako próbki referencyjne do przygotowania RNA, DNA lub białka.
- Wykonaj krioprezerwację w następujący sposób.
- Przygotuj pożywkę do zamrażania, używając 80% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 20% dimetylosulfotlenku (DMSO).
- W celu delikatnego granulowania GC należy odwirować GC przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i 500 x g.
- Ostrożnie usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 100% FCS (np. 1 ml), aż nie będą już widoczne grudki komórek.
- Dodać 1 objętość (np. 1 ml) przygotowanej pożywki do zamrażania do zawiesiny komórek i przenieść mieszaninę do fiolki kriogenicznej.
UWAGA: Końcowe stężenie pożywek krioochronnych wyniesie 90% FCS i 10% DMSO. - Umieść fiolkę kriogeniczną w specjalistycznym (dostępnym na rynku) pojemniku do zamrażania, który zapobiega szybkiemu zamrożeniu. Szybkość schładzania próbek nie powinna przekraczać -1 °C/min. Przenieść pojemnik do zamrażania do zamrażarki o temperaturze -80 °C na co najmniej 4 godziny.
- W celu dłuższego przechowywania należy umieścić fiolki kriogeniczne w pojemnikach o bardzo niskiej temperaturze (np. pojemnikach z azotem w fazie ciekłej).
UWAGA: W tym miejscu protokół można zatrzymać, ponieważ kriokonserwacja pozwala na dłuższe przechowywanie.
4. Przygotowanie pożywek i płytek hodowlanych do hodowli komórkowej
- Pokryj płytki do hodowli komórkowych 0,02% kolagenem R.
UWAGA: Wiadomo, że kolagen R jest niezbędny do poprawy przyczepiania GC w hodowli.- Przygotuj 0,02% roztwór R kolagenu z oczyszczoną wodą odpowiednią do hodowli komórek.
- Dodać 150 μl na studzienkę do płytki 24-dołkowej (= 2cm2/dołek) i upewnić się, że cała powierzchnia dołka hodowlanego jest pokryta roztworem R kolagenu.
- Pozostaw roztwór do wyschnięcia z otwartą pokrywką na kilka godzin lub na noc w okapie z przepływem laminarnym.
- Gdy płytki hodowlane całkowicie wyschną, naświetl je światłem UV przez 10–15 minut, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
- W razie potrzeby płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
- Przygotuj pożywki i suplementy do pracy z kulturą pod okapem z przepływem laminarnym. Aby pomyślnie odzyskać GC, muszą one zostać przetworzone natychmiast po rozmrożeniu.
- Przygotuj następujące podłoże.
- Suplement α-Minimal Essential Medium (α-MEM) z 2 mM L-glutaminy, 0,084% wodorowęglanem sodu, 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/ml seleninu sodu, 5 μg/ml transferyny, 10 ng/ml insuliny i 1 mM aminokwasów endogennych.
- Dodatkowo dodać do pożywki 100 j.m. penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny.
UWAGA: Antybiotyki po podgrzaniu są stabilne przez około 48 godzin. W związku z tym należy podać żądaną ilość pożywki do konfiguracji kultury i planowanej wymiany pożywki. W łaźni wodnej należy wstępnie podgrzać tylko pożywkę do temperatury 37 °C. Przygotowane podłoża można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 3 miesiące. - Aby indukować aktywność steroidów w hodowli bydła, należy dodatkowo uzupełnić α-MEM o 20 ng/ml hormonu folikulotropowego (FSH), 50 ng/ml R3 IGF-1 i 2 μM androstendion.
UWAGA: Zawsze uzupełniaj te składniki na krótko przed rozpoczęciem wymiany kultury lub pożywki. Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania dla roztworów podstawowych FSH i IGF-1, ponieważ może to zagrozić aktywności sterydów.
5. Praca z kulturą komórkową
- Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 3–4 minuty i przenieść zawiesinę komórek do wstępnie podgrzanej α-MEM o temperaturze 37 °C (bez suplementu hormonalnego). Do wirowania zalecana jest końcowa objętość 10 ml.
- Wirować GC przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i przy 500 x g. Odrzucić supernatant. Dodaj wstępnie podgrzany i uzupełniony α-MEM i ostrożnie ponownie zawieś komórki.
- Zasiać GC o gęstości 1 x 105 lub 1 x 106 komórek na basenik w końcowej objętości 500 μl. Dołączyć kontrpróby techniczne co najmniej trzech baseników hodowlanych na warunki.
- Inkubować hodowlę komórkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 8 dni.
- Wykonuj wymianę mediów co drugi dzień. Wymień tylko dwie trzecie pożywki hodowlanej, aby zmniejszyć stres i ułatwić adaptację komórek do świeżej pożywki.
UWAGA: GC tworzy typowy fenotyp podobny do fibroblastów po kilku dniach w hodowli i ma tendencję do grupowania się. W hodowli o dużej gęstości komórek większe skupiska występują częściej w porównaniu z hodowlą GC o normalnej gęstości (Rysunek 1, lewy i prawy panel).
6. Późniejsza analiza hodowanych komórek ziarnistych
- Aby przeprowadzić analizę hormonów steroidowych, należy zebrać pożywkę i zamrozić ją w temperaturze -20 °C. Należy użyć odpowiednich metod do analizy stężenia estradiolu i progesteronu w zużytych pożywkach [np. test radioimmunologiczny (RIA)]14.
- W celu późniejszej analizy różnych cząsteczek docelowych (RNA, DNA, białka itp.), należy poddać komórki lizie bezpośrednio w naczyniu hodowlanym za pomocą odpowiedniego środka lizującego zgodnie z zaleceniami dostawcy.
UWAGA: W przypadku większości procedur izolacji możliwe jest zatrzymanie protokołu w tym miejscu, ponieważ zlizowane komórki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 1 tygodnia. W przypadku dłuższego przechowywania komórki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. - Aby określić obfitość transkryptów, zsyntetyzuj cDNA i zmierz określone transkrypty za pomocą ilościowych technik reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR)15. Ocena statystyczna powinna obejmować co najmniej trzy powtórzenia różnych kultur komórkowych, pochodzących z różnych preparatów komórkowych (kontrprób biologicznych).
Wyniki
Komórki GC wysiane w zagęszczeniu 1 x 105 komórek/dołek wykazują typowy wygląd fibroblastopodobny, tworząc wypustki komórkowe porównywalne z fibroblastami i mając tendencję do tworzenia skupisk (Rysunek 1a i 1c). Zwiększenie zagęszczenia wysiewu 10-krotnie do 1 x 106 komórek/dołek nie zmieniło morfologii, jednak można zaobserwować więcej skupisk komórek (Rysunek 1b i 1d, strzałki). Jak wykazano już w poprzedniej publikacji, powlekanie naczyń hodowlanych kolagenem znacząco poprawiło adhezję komórek13.
Wstępna kriokonserwacja nie zmieniła w znacznym stopniu charakterystyki fizjologicznej komórek w kulturze w porównaniu z komórkami hodowanymi bezpośrednio z próbek świeżo wyizolowanych. Wykazano to na Rysunku 2, gdzie obfitość transkryptów (zmierzona za pomocą qPCR) kilku genów markerowych nie różniła się podczas porównywania komórek hodowanych, pochodzących odpowiednio z zamrożonych lub świeżo wyizolowanych pul.
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki analizy hormonów steroidowych (pomiar metodą RIA) w komórkach GC bydlęcych hodowanych przy normalnej vs. wysokiej gęstości. Stężenie estradiolu jest znacząco obniżone w hodowli o wysokiej gęstości w porównaniu z hodowlą o normalnej gęstości, natomiast produkcja progesteronu wykazała tendencję wzrostową.
Analiza porównawcza kilku genów (zmierzona za pomocą qPCR) w kulturach o wysokiej vs. normalnej gęstości wykazała istotny efekt (Rysunek 4). Gen CYP19A1, kodujący aromatazę będącą kluczowym enzymem biosyntezy estradiolu, a także receptor gonadotropin FSHR, były istotnie wyciszone. W przeciwieństwie do nich, geny RGS2 i VNN2 wykazały istotną nadekspresję. Wyniki te jednoznacznie sugerują, że zwiększenie gęstości wysiewu komórek indukuje specyficzne procesy różnicowania komórkowego.
Rycina 1: Hodowane komórki granulosa bydlęce przy normalnej (panele lewe) i wysokiej gęstości komórek (panele prawe). (a i c) Komórki hodowane przy gęstości 1 x 105 komórek/dołek wykazały typowy fenotyp fibroblastopodobny. (b i d) Komórki GC hodowane przy wysokiej gęstości wysiewu (1 x 106 komórek/dołek) miały tendencję do częstszego tworzenia dużych skupisk komórkowych (strzałki) w porównaniu do komórek przy normalnej gęstości (panel lewy). Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Porównanie komórek hodowanych bezpośrednio po izolacji oraz po kriokonserwacji. Komórki hodowano przy gęstości 1 x 105 komórek na dołek. Ocena ekspresji genów kilku transkryptów markerowych nie wykazała różnic między komórkami hodowanymi z początkową kriokonserwacją a komórkami bez niej. Wykres pudełkowy przedstawia medianę n = 3. Dwustronny test t-Studenta t-test, ten pUwzględniono wartości p. Rysunek powielono z pracy Baufeld i Vanselow16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Stężenie hormonów steroidowych w komórkach granulosa hodowanych przy różnych gęstościach wysiewu. Stężenie estradiolu (E2) uległo znacznemu obniżeniu, gdy GC hodowano przy wysokiej gęstości komórek, podczas gdy stężenie progesteronu (P4) wykazywało jedynie tendencję wzrostową. Stężenie hormonów skorygowano względem zawartości DNA w celu normalizacji różnic w liczbie komórek. Przedstawiono średnią i SEM dla n = 3. p > 0.05, dwustronny test t Studenta. Rycina ta została powielona z pracy Baufeld et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Obfitość funkcjonalnych kluczowych transkryptów w komórkach granulosa hodowanych przy normalnej vs. wysokiej gęstości wysiewu. Hodowla byczych komórek GC w warunkach bezsurowiczych przez 8 d wykazała specyficzną regulację kilku wybranych genów markerowych. Wykres pudełkowy przedstawia medianę dla n = 3 indywidualnych powtórzeń. p < 0.05, dwustronny test t Studenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dyskusja
Prezentowany model hodowli komórkowej stanowi narzędzie do analizy różnicowania komórek ziarnistych in vitro. Kilka badań wykazało, że uprawa bez surowicy jest warunkiem wstępnym utrzymania aktywności steroidów w hodowli bydła GC lub GC innych gatunków 8,9. Dodatkowo pokrycie szalki hodowlanej składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej (np. kolagenem R)13 znacznie poprawiło przyczepienie komórek. Kolejną ważną cechą jest wydłużony okres hodowli. Ostatnio wykazano, że długotrwała hodowla jest niezbędna do uzyskania wystarczającej aktywności steroidogennej i zrównoważonej ekspresji markerów tożsamości komórek ziarnistych17. Wydaje się, że GK wymagają czasu na regenerację po stresie fizycznym podczas procedury izolacji.
Suplementy pożywki FSH, IGF-1 i androstendionu są znane z indukowania aktywności aromatazy w hodowanym GC. Szczególnie konieczna jest suplementacja androstendionem, ponieważ GK potrzebuje prekursora do syntezy estradiolu. Zostało to opublikowane wcześniej11,18 i dlatego nie było dalej badane w niniejszym badaniu. Jednak adaptacja stężeń FSH, IGF-1 i androstendionu może być konieczna w przypadku innych konfiguracji eksperymentalnych.
Opisana tutaj technika kriokonserwacji może pomóc w poprawie organizacji eksperymentów z hodowlami tkankowymi, uniezależniając je od zmiennego zaopatrzenia jajników. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, kriokonserwacja nie wpływa na fenotyp GC ani produkcję steroidów w hodowli. Również obfitość transkryptów markerowych w hodowanych komórkach nie ujawniła istotnych różnic porównujących próbki przygotowane ze świeżo wyizolowanych komórek z tymi, które wcześniej zostały poddane kriokonserwacji16.
Kluczowym parametrem dla obecnego modelu hodowli GC jest gęstość posiewu komórek. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, zwiększenie gęstości posiewu wywołało niezwykłe zmiany w charakterystyce fizjologicznej i molekularnej. Kilka genów jest regulowanych w specyficzny sposób, przypominający zmiany, które są indukowane przez stymulację LH in vivo 4,19. Fakt, że rosnąca gęstość komórek może napędzać procesy podobne do różnicowania w hodowli bydła GC, musi być skrupulatnie uwzględniony w tym modelu GC in vitro, aby uniknąć sprzecznych wyników między kontrpróbami. W związku z tym sprzeczne wyniki z innymi badaniami mogą być przypisywane różnym gęstościom komórek i powinny być dokładniej zbadane.
Opisany tutaj model hodowli okazał się niereagować na LH, ponieważ transkrypty receptora LHCGR są bliskie granicy wykrywalności. W związku z tym symulacja wyrzutu LH, podobnie jak w sytuacji in vivo , nie zdołała wywołać różnicowania13. Niemniej jednak model ten stanowi pomocne narzędzie do badania GC aktywnego estradiolem w hodowli pierwotnej, w szczególności dlatego, że obecnie nie istnieją funkcjonalne linie GC bydła.
W obecnym modelu hodowli GC można testować różne protokoły leczenia, które pomagają rozwikłać mechanizmy regulacyjne produkcji steroidów lub różnicowania GC. Ponadto poszczególne czynniki, które biorą udział w procesach rozwojowych, mogą być analizowane oddzielnie. W związku z tym ten model kultury stanowi podstawę dla wielu różnych zastosowań.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Veronice Schreiter za doskonałą pomoc techniczną i pomocne modyfikacje uznanej techniki kriokonserwacji i modelu hodowli komórkowych. Ponadto chcielibyśmy podziękować Maren Anders i Swanhild Rodewald za ich doskonałą pomoc techniczną w późniejszej analizie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | pierwotnie zakupiony w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią firmy Merck-Millipore; nr kat. Biochrom nadal istnieje |
| penicylina / streptomycyna (10 000 IU / 10 000 &mikro; g/mL) | Merck-Millipore | A 2213 | pierwotnie zakupiony w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią Merck-Millipore Company; nr kat. Biochrom nadal istnieje |
| amfoterycyna (250 &mikro; g / mL) | Merck-Millipore | A 2612 | pierwotnie zakupiony w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią firmy Merck-Millipore Company; nr kat. Biochrom nadal istnieje |
| strzykawka 3 ml (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
| 18 G igła | Roth | C724.1 | |
| płodowa surowica cielęca | Merck-Millipore | S 0115 | pierwotnie zakupiony w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią firmy Merck-Millipore; nr kat. Biochrom nadal istnieje |
| fiolki do krioprezerwacji (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
| Pojemnik do zamrażania komórek CoolCell LX | Naczynie hodowlane | Corning 432004 | |
| , 24-dołkowe, z płaskim dnem | TPP Faust | TPP 92424 | |
| kolagen R (0,2 %) | Serva | 47254 | |
| α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | pierwotnie zakupiony w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią firmy Merck-Millipore; nr kat. Biochrom nadal istnieje |
| L-glutamina (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | pierwotnie zakupiona w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią firmy Merck-Millipore Company; nr kat. Biochrom nadal istnieje: |
| wodorowęglan sodu | Merck-Millipore | L 1713 | pierwotnie zakupiony w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią firmy Merck-Millipore; nr kat. Biochrom nadal istnieje: |
| BSA | Sigma A3311 | ||
| HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | pierwotnie zakupiony w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią firmy Merck-Millipore Company; nr kat. Biochrom nadal istnieje |
| selenin sodu | Sigma | S9133 | rozpuszczony w sterylnej wodzie |
| transferyna | Sigma | T1283 | rozpuszczona w sterylnej wodzie |
| insulina (10 mg/mL) | Sigma | I0516 | rozpuszczona w 1x PBS |
| NEA | Merck-Millipore | K 0293 | pierwotnie zakupiony w firmie Biochrom AG, która jest obecnie częścią firmy Merck-Millipore Company; nr kat. Biochrom nadal istnieje |
| FSH | Sigma | F4021 | preferujemy stosowanie roztworu podstawowego 2 &mikro; g/ml, rozcieńczony w 0,9 % NaCl |
| LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | używamy roztworu podstawowego 2 &mikro; g/ml, rozpuszczony w 10 mM HCl i 1x PBS z 1 mg/ml BSA |
| androstendionu | Sigma | 46033 | używamy roztworu podstawowego 10 mM, rozcieńczonego w 100 % etanolu |
Bibliografia
- Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro. Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).
- Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture. Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Christenson, L. K., et al. Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes. Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).
- Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. Ovarian granulosa cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).
- Bernath, V. A., et al. Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).
- Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors. Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).
- Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics. Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).
- Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media. Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).
- Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited. Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).
- Silva, J. M., Price, C. A. Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro. Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).
- Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells. Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).
- Schneider, F., Brüssow, K. P. Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts. Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).
- Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15(2018).
- Yenuganti, V. R., Vanselow, J. Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions. Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).
- Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells. Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).
- Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period. Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).
Przedruki i uprawnienia
