Artykuł metodologiczny

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

DOI:

10.3791/58210

⸱

20 września 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University of Erlangen-Nuremberg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prowadzenie komórek odpornościowych w jelitach jest ważne dla patogenezy chorób zapalnych jelit (IBD). Zależna od integryny adhezja komórek do adresin jest kluczowym krokiem w tym procesie, a strategie terapeutyczne zakłócające adhezję zostały pomyślnie ustalone. Przeciwciało integrynowe anty-α4β7, wedolizumab, jest stosowane w klinicznym leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (UC), a w ślad za nim prawdopodobnie pojawią się kolejne związki.

Szczegóły procedury adhezji i mechanizmy działania przeciwciał anty-integrynowych są nadal niejasne pod wieloma względami ze względu na ograniczone dostępne techniki badań funkcjonalnych w tej dziedzinie.

Tutaj prezentujemy dynamiczny test adhezji do analizy funkcjonalnej adhezji komórek ludzkich w warunkach przepływu oraz wpływu terapii antyintegrynowych w kontekście IBD. Opiera się na perfuzji pierwotnych komórek ludzkich przez ultracienkie szklane kapilary pokryte adresiną z analizą mikroskopową w czasie rzeczywistym. Test oferuje różnorodne możliwości udoskonaleń i modyfikacji oraz ma potencjał w zakresie odkryć mechanistycznych i zastosowań translacyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruch komórek jest ściśle regulowanym procesem niezbędnym do rozwoju i funkcjonowania organizmów wielokomórkowych, ale jest również zamieszany w patogenezę wielu chorób1. Ostatnio coraz większą uwagę cieszy się procesem naprowadzania komórek odpornościowych z krwiobiegu do tkanek obwodowych, ponieważ przyczynia się on do uzupełniania i ekspansji komórek chorobotwórczych w tkankach objętych stanem zapalnym w chorobach o podłożu immunologicznym2,3. W szczególności wykazano, że homing ma znaczenie translacyjne w chorobach zapalnych jelit (IBD). Terapeutyczne przeciwciało integrynowe anty-α4β7 wedolizumab zakłócające naprowadzanie jelit wykazało skuteczność w dużych badaniach klinicznych4,5 i zostało z powodzeniem zastosowane w rzeczywistej praktyce klinicznej6,7,8. Prawdopodobnie pojawią się kolejne związki9,10. Podobnie, terapeutyczne przeciwciało integryny anty-α4, natalizumab, jest stosowane w leczeniu stwardnienia rozsianego (SM)11.

Jednak nasze funkcjonalne zrozumienie procesu naprowadzania w ogóle, a w szczególności mechanizmu działania takich przeciwciał terapeutycznych, jest nadal ograniczone. Powszechnie wiadomo, że naprowadzanie składa się z kilku etapów, w tym wiązania i zwijania komórek, a następnie adhezji komórek prowadzących do mocnego zatrzymania, po którym następuje migracja śródbłonka trans12,13. Wyżej wymienione przeciwciała neutralizują integryny na powierzchni komórki, zapobiegając interakcji z adresinami na śródbłonku ściany naczynia. Uważa się, że utrudnia to mocne przyleganie komórek14,15. Jednak dopiero zaczynamy rozumieć zróżnicowane znaczenie specyficznych integryn dla naprowadzania komórek różnych podzbiorów komórek. Co więcej, wpływ przeciwciał antyintegrynowych na różne podzbiory komórek i powiązania dawka-odpowiedź jest w dużej mierze nieznany, co prowadzi do wielu otwartych pytań w dziedzinie naprowadzania jelit i terapii przeciwadhezyjnych w IBD.

Dlatego rozpaczliwie potrzebne są wygodne narzędzia do rozwiązywania takich pytań. Wpływ przeciwciał anty-integrynowych na interakcję integryna-adresyna był do tej pory oceniany głównie poprzez ocenę skuteczności wiązania/hamowania wiązania za pomocą cytometrii przepływowej lub poprzez statyczne testy adhezyjne16,17,18,19,20, a więc z pozornym uproszczeniem i odchyleniem od sytuacji fizjologicznej. Niedawno opracowaliśmy dynamiczny test adhezji do badania zależnej od integryny adhezji komórek ludzkich do adresin oraz wpływu przeciwciał anty-integrynowych pod wpływem naprężenia ścinającego2. Zasada działania tej techniki została wcześniej zademonstrowana na mysich komórkach21,22. W tym przypadku został on zaadaptowany i opracowany w celu odpowiedzi na wyżej wymienione pytania translacyjne, otwierając nowe możliwości lepszego zrozumienia mechanizmów terapii przeciwciałami antyintegrynowymi in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w poniższych sekcjach zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Uniwersytetu Friedricha-Alexandra w Erlangen-Norymberdze.

1. Przygotowanie naczyń włosowatych

  1. Podłącz prostokątne kapilary do gumowej rurki, rozciągając rurkę z jednej strony małymi nożyczkami i ostrożnie wkładając kapilar (około 0,5 cm) do rurki. Uszczelnij połączenie między kapilarą a rurką za pomocą plastikowej folii parafinowej.
  2. Pokryj kapilarę 20 μl adresyny (rekombinowana chimera Fc; 5 μg/ml adresyny, np. MAdCAM-1, w buforze powlekającym (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) lub odpowiednim roztworem kontrolnym izotypu za pomocą pipety p20 (płyn wsiąka w kapilarę). Następnie uszczelnić stronę, która nie jest połączona z rurką, folią parafinową z tworzywa sztucznego i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Użyć kapilary wypełnionej wyłącznie buforem powlekającym lub odpowiednią kontrolą izotypu jako kontrolą ujemną.
  3. Usunąć folię parafinową z tworzywa sztucznego z końcówki kapilary, opróżnić powłokę, pozwalając płynowi wypłynąć z kapilary na ręczniku papierowym i zatkać kapilary na co najmniej 1 godzinę 20 μl roztworu blokującego (1x PBS z 5% BSA) w temperaturze 37 °C. Uszczelnić otwartą stronę kapilary folią parafinową z tworzywa sztucznego. Nie usuwaj roztworu blokującego przed przystąpieniem do mikroskopii.

2. Izolacja, leczenie i przygotowanie komórek do mikroskopii

UWAGA: Te kroki mogą być wykonywane podczas okresów inkubacji niezbędnych do przygotowania kapilary.

  1. Pobrać 18 ml pełnej krwi ludzkiej z antykoagulacją za pomocą aseptycznego zestawu do pobierania krwi z żyły łokciowej osób zgłaszających się na ochotnika (np. pacjentów z IBD i/lub zdrowych osób z grupy kontrolnej) po uzyskaniu świadomej pisemnej zgody zgodnie z przepisami lokalnej komisji etycznej.
    UWAGA: Ten krok powinien być wykonywany wyłącznie przez przeszkolony i doświadczony personel medyczny zgodnie z przepisami krajowymi i/lub lokalnymi.
  2. Wlej krew do probówki o pojemności 50 ml i rozcieńcz do objętości 35 ml za pomocą 1x PBS. Następnie mieszaninę krwi i PBS należy podłożyć 10 ml pożywki o gradiencie gęstości.
  3. Wirowanie w gradiencie gęstości należy przeprowadzić przez 15 minut przy 800 x g i temperaturze 24 °C bez przerwy w celu oddzielenia komórek.
  4. Zbierz komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), odsysając warstwę białych krwinek bezpośrednio na warstwę pożywki gradientu gęstości (przezroczysta warstwa środkowa). Przenieść PBMC do świeżej probówki o pojemności 50 ml, napełnić do 50 ml 1x PBS i wirować przez 10 minut przy 300 x g i 10 °C.
  5. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml 1x PBS, a następnie policzyć liczbę komórek, np. za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera.
  6. Opcjonalnie: Aby zbadać adhezję granulocytów, wykonaj następującą procedurę. W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.7 lub 2.8.
    1. Zebrać warstwę granulocytów (najniższą warstwę po odwirowaniu w gradiacji gradientu gęstości, zawierającą również erytrocyty). Zawieś komórki w 40 ml 1x PBS. Następnie dodaj 8 ml 6% dekstranu do 1x PBS, delikatnie wymieszaj i pozwól komórkom osadzać się przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Erytrocyty opadną na dno probówki, podczas gdy granulocyty pozostaną w zawiesinie.
    2. Po 30 minutach zebrać sklarowany osad, przenieść do świeżej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 6 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i poddać lizie pozostałe erytrocyty, dodając 5 ml 0,2% NaCl do ddH2O. Inkubować przez 1 minutę.
    3. Dodać 5 ml 1,4% NaCl do ddH2O i inkubować przez kolejną minutę. Zatrzymać hipotoniczną lizę, dodając 20 ml 1x PBS i wirować przez 6 minut w temperaturze 300 x g i 4 °C.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml 1x PBS. Następnie policz numery komórek za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera.
  7. Opcjonalnie: Aby zbadać adhezję podzbiorów PBMC, należy oczyścić różne typy lub podzbiory komórek (np. Limfocyty T CD4 + i CD8 + lub limfocyty B CD19 +) za pomocą mikrogranulek zgodnie z protokołem producenta lub przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.8.
  8. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 10 °C. Wyrzucić supernatant i wybarwić komórki barwnikiem śledzącym komórki (np. CFSE) zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Następnie odwirować komórki przez 10 minut przy 300 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić w 1x PBS, określić liczbę komórek i ponownie wirować przez 10 minut przy 300 x g.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wybarwione komórki w odpowiedniej ilości buforu adhezyjnego (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) w celu uzyskania zawiesiny 1,5 x 106 komórek/ml. Następnie dodać odpowiednią ilość 100 mM MnCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
    UWAGA: Komórki te są teraz gotowe do mikroskopii.
  11. Opcjonalnie: Traktuj komórki cytokinami, przeciwciałami neutralizującymi lub innymi związkami. W przeciwnym razie przejdź do kroku 3.
    1. Pominąć krok 2.10 i ponownie zawiesić wybarwione osady komórkowe z kroku 2.9 w pożywce RPMI (z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny) w celu uzyskania stężenia 1,5 x 106 komórek/ml.
    2. Odpipetować 1 ml tej zawiesiny komórek do tylu dołków na 48-dołkowej płytce, ile jest warunków do analizy. Zawsze należy przygotować jedną studzienkę z nieleczonymi komórkami, które mają być perfundowane przez niepowlekaną kapilarnę jako kontrola ujemna, a drugą studzienkę z nietraktowanymi komórkami, które mają być perfundowane przez kapilarnę pokrytą adresyną jako kontrola pozytywna.
    3. W przypadku leczenia przeciwciałami antyintegrynowymi należy dodać odpowiednią ilość przeciwciała (np. 10 μg/ml wedolizumabu) do zawiesiny komórek. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. W przypadku leczenia cytokinami należy dodać odpowiednią ilość rekombinowanej cytokiny (np. 10 ng/ml CXCL10) do zawiesiny komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Po inkubacji należy pobrać komórki, kilkakrotnie ponownie je zawieszając za pomocą pipety p1000. Przenieść komórki do probówki o pojemności 2 ml, ponownie dobrze spłukać 1 ml 1x PBS i dodać do probówki o pojemności 2 ml. Określ numer komórki.
      UWAGA: Inkubacja przylegających populacji komórek (np. monocytów) może wymagać dodatkowych środków (np. leczenia trypsyną) w celu oderwania komórek od płytki.
  12. Odwirować komórki przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości buforu adhezyjnego do uzyskania zawiesiny 1,5 x 106 komórek/ml. Następnie dodać odpowiednią ilość 100 mM MnCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. Podczas wstępnego leczenia chemokinami nie należy dodawać MnCl2 do zawiesiny komórek. Komórki te są teraz gotowe do mikroskopii.
    UWAGA: Minimalna objętość użyta do testu zależy od użytej pompy i przewodów. W tym badaniu, przy użyciu pompy perystaltycznej i rurki określonej w Tabeli Materiałów, wymagana była minimalna objętość 400 μL. W razie potrzeby i zastosowania (w zależności od rodzaju komórek i wydajności) stężenie komórek w zawiesinie można zwiększyć, aby zmierzyć wyższą przyczepność w krótszym czasie.
  13. Modyfikacja potencjału: Konkurencyjny test dynamicznej adhezji
    1. Wykonaj wyżej wymienione kroki z różnymi populacjami komórek, które mają być ze sobą porównane (np. limfocyty T regulatorowe i efektorowe wyizolowane przez izolację kulek magnetycznych zgodnie z instrukcjami producenta zgodnie z krokiem 2.7).
    2. Wybarwić każdą populację innym barwnikiem (np. CFSE i FarRed) zgodnie z opisem w krokach 2.8–2.9, aby móc różnicować populacje komórek podczas mikroskopii.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wybarwione osady komórek w odpowiedniej ilości buforu adhezyjnego (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) w celu uzyskania zawiesiny 1,5 x 106 komórek/ml.
    4. Wymieszać równe objętości zawiesin komórkowych (np. 500 μl regulatorowych limfocytów T i 500 μl efektorowych limfocytów T), aby uzyskać końcowe stężenie mieszanych komórek 1,5 x 106 komórek/ml. Następnie dodać odpowiednią ilość 100 mM MnCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. Takie zawiesiny mogą być następnie wykorzystane do konkurencyjnej analizy procesu adhezji poprzez perfuzję różnych populacji komórek przez tę samą kapilarę.

3. Obrazowanie dynamicznych komórek na żywo

  1. Włącz mikroskop i wybierz odpowiedni filtr lub laser do wzbudzenia barwnika (barwników) śledzącego komórki (np. laser 488 nm dla CFSE), odpowiedniego obiektywu (np. 40X) oraz trybu akwizycji umożliwiającego obrazowanie poklatkowe.
  2. Usuń plastikową folię parafinową z końcówki kapilary i połącz kapilarnę z krótkim kawałkiem rurki (około 5 cm długości), rozciągając rurkę z jednej strony małymi nożyczkami i ostrożnie wkładając kapilar (około 0,5 cm) do rurki. Uszczelnij połączenie między kapilarą a rurką za pomocą plastikowej folii parafinowej.
  3. Zamontuj kapilę na tacce mocującej (np. pokrywie z płytki 6-dołkowej z prostokątnym wycięciem nieco krótszym niż długość kapilary) i umieść stałą kapilarnę na uchwycie tacki mikroskopu, tak aby kapilara była wyostrzona i gotowa do mikroskopii.
  4. Włóż gumową rurkę do odpowiedniego wycięcia pompy perystaltycznej i umieść koniec nieprzymocowany do kapilary w odpowiedniej probówce zawierającej zawiesinę komórek. Włóż krótką rurkę po drugiej stronie kapilary do probówki o pojemności 15 ml, aby zebrać przepływ.
  5. Pozwól, aby rurka napełniła się z natężeniem przepływu 500 μl na minutę, aż zawiesina komórek prawie dotrze do kapilary. Następnie pozwól kapilarze napełnić się natężeniem przepływu 100 μl/min.
    UWAGA: Szybkie napełnienie kapilary zapewnia regularne rozprowadzenie zawiesiny komórkowej wewnątrz kapilary.
  6. Gdy kapilara zostanie wypełniona zawiesiną komórek, wyreguluj natężenie przepływu na 10 μl/min.
    UWAGA: Te natężenia przepływu mogą się różnić, gdy używane są kapilary o różnej wielkości lub różne pompy perystaltyczne. W tym badaniu natężenie przepływu wynoszące 10 μl/min zostało zoptymalizowane dla pompy i naczyń włosowatych, aby naśladować przepływ krwi in vivo.
  7. Rób zdjęcia poklatkowe komórek poruszających się powoli przez kapilarnę wzdłuż wewnętrznej ściany pokrytej adresyną co 2 s, łącznie przez 3 minuty
    UWAGA: Interwały i łączny czas mogą się różnić w zależności od typu komórki i pytania, na które należy odpowiedzieć.
  8. Przed wyrzuceniem kapilary należy prześwietlić całą kapilarnę przez okular mikroskopu, aby upewnić się, że przekrój pokazany na filmie jest reprezentatywny. W razie potrzeby wykonaj drugie nagranie.
  9. Odłącz rurkę od pompy i pozwól, aby pozostały płyn spłynął z powrotem do probówki o pojemności 2 ml, a następnie odłącz kapilar i rurkę od tacki mocującej i kontynuuj z następną kapilarą.

4. Ocena i liczenie komórek

  1. Otwórz sekwencję poklatkową za pomocą odpowiedniego oprogramowania i wyeksportuj pierwsze trzy obrazy ("Początek") i ostatnie trzy obrazy ("Koniec") jako pliki TIFF.
  2. Otwórz trzy obrazy "Początkowe" w ImageJ, przekonwertuj je na 32-bitowe ('Obraz | Rodzaj | 32 Bity") i scalić zdjęcia ('Obraz | Kolor | Scalanie kanałów"; Przypisz kolory czerwony, zielony i niebieski do różnych zdjęć). Konwertuj obraz kompozytowy na RGB ('Obraz | Type-RGB') i zapisz jako plik TIFF. Powtórz z obrazami "Koniec".
    Uwaga: W konkurencyjnych dynamicznych testach adhezji z komórkami zabarwionymi różnymi kolorami, najpierw podziel kanały obrazów, aby osobno przeanalizować adhezję różnych populacji komórek.
  3. Policz białe komórki widoczne w kompozycji "Początek" i "Koniec" i odejmij liczbę białych komórek w "Początku" od białych komórek w "Końcu".
    Uwaga: Różnica reprezentuje liczbę nowo przylegających komórek w 3-minutowym przedziale czasu. Na obrazie złożonym komórki, które się przesunęły, są widoczne w określonym kolorze, który został przypisany do odpowiedniej klatki, ponieważ są lokalizowane w innym miejscu w poprzedniej i następnej klatce. W przypadku komórek, które przylegają, sygnały czerwony, zielony i niebieski w tym samym miejscu nakładają się na białe.
  4. Aby lepiej zobrazować wyniki, skompiluj film z sekwencji poklatkowych, np. za pomocą ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda przedstawiona w tym manuskrypcie ma na celu jak najdokładniejsze symulowanie procesu adhezji komórek ludzkich do ściany śródbłonka, aby funkcjonalnie ocenić adhezję komórek i rolę przeciwciał zakłócających. Dlatego ultracienkie naczynia włosowate są powlekane adresynami i perfundowane fluorescencyjnie znakowanymi komórkami ludzkimi za pomocą pompy perfuzyjnej. Korzystając z obrazowania żywych komórek, można obserwować adhezję komórek ludzkich do adresin w czasie rzeczywist...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół opisuje przydatną technikę badania dynamicznej adhezji ludzkich komórek odpornościowych do ligandów śródbłonka. Poprzez zmienność powlekanych ligandów, perfundowanych typów lub podzbiorów komórek, inkubację z dodatkowymi bodźcami lub różnymi przeciwciałami neutralizującymi, ma prawie nieograniczone potencjalne zastosowania. Dlatego takie dynamiczne testy adhezyjne mogą być przydatne do udzielenia odpowiedzi zarówno na podstawowe pytania badań podstawowych, jak i na pytania translacyjne, które mogą pomóc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.F.N. służył jako doradca dla Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda i Boehringer. M.F.N. i S.Z. otrzymały wsparcie badawcze od firm Takeda i Roche.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania CN, IA, MFN i SZ były wspierane przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) oraz program ELAN Uniwersytetu Erlangen-Norymberga, Else Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, Niemiecką Fundację Leśniowskiego-Crohna i Zapalenia Jelita Grubego (DCCV), Grupę Badań Klinicznych CEDER Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (DFG), program tematyczny DFG dotyczący mikrobioty, Emerging Field Initiative oraz Centra Badawcze DFG 643, 796 i 1181.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
48-dołkowa płytkaSarstedt833,923
Bufor adhezyjny: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
Roztwór blokujący: 1x PBS w ddH2O + 5 % BSA
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)ApplichemA1391,0100
CaCl2Merck2382
Kapilary: Prostokątna rurka Boro 0,20 mm x 2,00 mm ID, długość 50 mmCM Scientific3520-050
CCL-2, ludzkienarzędzia immunologiczne11343384
CD4-Microbeads, ludzkieMiltenyi Biotec130-045-101
CellTrace™ Zestaw do proliferacji komórek CFSEThermoFischer ScientificC34554
Wirówka (Rotixa 50 RS)Hettrich
Bufor powłokowy: 150 mM NaCl + 1 mM Mikroskop konfokalny HEPES
(TCS SP8)Leica
CXCL-10, ludzkienarzędzia immunologiczne11343884
Dekstran 500Roth9219.3
EDTA KE/9 mL MonovetteSarstedt
Falcons (50 mL)Sarstedt62,547,004
Fc chimera kontrola izotypuR& D SystemsNatężenia przepływu 110-HG
Pompa perystaltyczna (LabV1)Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPESVWRJ848-100ML
Kontrola izotypu ludzkiej IgGThermoFischer Scientific31154
Międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 1 (ICAM-1) Chimera FcR& D Systems720-IC-050
KolumnyLS Miltenyi Biotec130-042-401
MgCl2Roth
MnCl2Roth
kontrola izotypu IgG myszyMiltenyi Biotec130-106-545
Adresat naczyniowy błony śluzowej Cząsteczka adhezyjna komórek 1 (MAdCAM-1) Chimera FcR& D Systems6056-MC
NaClRoth3957.3
NatalizumabBiogen
Neubauer Komora liczącaRothT729.1
Pancoll, ludzkiPAN BiotechP04-601000
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) BiochromL 182-10w/o Mg i Ca
Plastikowa folia parafinowa: Parafilm (PM-996)VWR52858-000
oczyszczona anty-ludzka CD18Biolegend302102
RPMI Medium 1640Gibco Life Technologies61870-010
Rurka gumowa: SC0059T 3-stopniowa rurka LMT-55, średnica wewnętrzna 1,02 mm, długość 406,4 mmIsmatecSC0059
Pipety serologiczneSarstedt861,254,025
Błękit trypanowyRothCN76.1
Cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych 1 (VCAM-1) Chimera FcBiolegend553706
Wedolizumab (Entyvio)Takeda

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
  2. Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  3. Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
  4. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
  5. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
  6. Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
  7. Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
  8. Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
  9. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
  10. Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
  11. Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
  12. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  13. Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
  14. Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
  15. Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  16. Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
  17. Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
  18. Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
  19. Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
  20. Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
  21. Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
  22. Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
  23. Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
  24. Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
  25. House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
  26. Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
  27. Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  28. Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  29. Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cell Adhesion Under FlowAnti integrin TherapyPeripheral Blood Mononuclear CellsAddressin coated CapillariesReal time Microscopic AnalysisDensity Gradient CentrifugationTime Lapse ImagingIntegrin Addressin Interaction

Powiązane artykuły