Projektowanie i stosowanie aparatury do ilościowego oznaczania zawiesiny małży zasilających morze

Podsumowanie

Urządzenie przepływowe do wykorzystania metody biodepozycji do ilościowego określania filtracji i żerowania małży zostało zmodyfikowane do użytku na statku. Dwuwymiarowy stół przegubowy zbudowany wokół urządzenia izoluje aparaturę od ruchu łodzi, umożliwiając w ten sposób dokładne ilościowe określenie zmiennych filtracji małży w morskich zakładach akwakultury skorupiaków.

Streszczenie

W miarę jak akwakultura skorupiaków przenosi się z przybrzeżnych zatok i ujść rzek do lokalizacji morskich, potrzeba ilościowego określenia interakcji ekosystemowych małży hodowlanych (tj. małży, ostryg i małży) stawia nowe wyzwania. Dane ilościowe dotyczące zachowań żywieniowych żywiących się zawiesiną są niezbędne do określenia ważnych interakcji ekosystemowych morskich hodowli skorupiaków, w tym ich nośności, konkurencji ze społecznością zooplanktonu, dostępności zasobów troficznych na różnych głębokościach oraz depozycji bentosu. Metoda biodepozycji służy do ilościowego określania zmiennych żywieniowych w małżach żywiących się zawiesiną w naturalnych warunkach i stanowi bardziej realistyczny wskaźnik zastępczy niż eksperymenty laboratoryjne. Metoda ta opiera się jednak na stabilnej platformie, aby spełnić wymagania, że natężenie przepływu wody dostarczanej do skorupiaków pozostaje stałe, a małże pozostają niezakłócone. Urządzenie przepływowe i proces wykorzystania metody biodepozycji do ilościowego określenia karmienia małży zostały zmodyfikowane z formatu lądowego do użytku na statku poprzez zbudowanie dwuwymiarowego stołu gimbala wokół urządzenia. Dane z planimetru ujawniają minimalne nachylenie i odchylenie komór zawierających badane skorupiaki pomimo ruchu łodzi, natężenia przepływu w komorach pozostają stałe, a operatorzy są w stanie zbierać bioosady (kał i pseudokał) z wystarczającą spójnością, aby uzyskać dokładne pomiary klirensu małży, filtracji, selekcji, spożycia, odrzucenia i absorpcji w morskich zakładach akwakultury skorupiaków.

Wprowadzenie

Na całym świecie zmniejsza się liczba połowów dzikich zwierząt¹. W związku z tym przyszły wzrost podaży owoców morza musi wynikać z ekspansji akwakultury. Produkcja owoców morza w akwakulturze rośnie i będzie nadal szybko rosła do 2025 roku, co sprawia, że hodowla zwierząt wodnych jest najszybciej rozwijającym się systemem produkcji żywności². Hodowla małży żywiących się zawiesiną (małży, ostryg, przegrzebków i małży) jest uważana za jedną z najbardziej przyjaznych dla środowiska form akwakultury, ponieważ organizmy te nie wymagają dodatkowego karmienia, ale zamiast tego czerpią składniki odżywcze z naturalnej produkcji fitoplanktonu i przenoszą materię organiczną do organizmów bentosowych^3,4. Rzeczywiście, akwakultura skorupiaków i skorupiaków jest uważana za uzasadnione narzędzie do poprawy jakości wody i struktury troficznej w eutroficznych ujściach rzek^5,6. Pomimo ogólnie korzystnych perspektyw ekspansji akwakultury skorupiaków w przybrzeżnych zatokach i ujściach rzek, konflikty z innymi interesami oceanów przybrzeżnych, takimi jak rybołówstwo komercyjne i rekreacyjne, działalność rekreacyjna oraz estetyczne pragnienia właścicieli ziemskich na wybrzeżu – ograniczenia społeczne zagregowane pod pojęciem "nośności społecznej" – skłoniły niektórych do spojrzenia na "otwarty ocean" w celu ekspansji hodowli skorupiaków na dużą skalę⁷.

Przeniesienie hodowli skorupiaków poza granice morza, na otwarte wody, oferuje ogromny potencjał dla ekspansji akwakultury skorupiaków, ale także stanowi bezprecedensowe wyzwanie dla organizmów w ekosystemie oceanicznym⁸. Po pierwsze, większość hodowlanych, żywiących się zawiesiną gatunków małży to organizmy estuarialne, które wyewoluowały w środowiskach różniących się pod wieloma względami od ekosystemu otwartego oceanu⁹. Sezonowe i dobowe wahania zasolenia, temperatury i składu chemicznego wody oraz intensywna aktywność biologiczna stymulowana przez wysoką i zmienną dostępność składników odżywczych w wodach przybrzeżnych wyselekcjonowały cechy behawioralne i fizjologiczne małży, ostryg, przegrzebków i małży, które mogą przynosić niewielkie korzyści w stosunkowo stałym, rozcieńczonym środowisku oceanicznym¹⁰. Małże są znane z tego, że reagują na te zmiany środowiskowe, regulując swoją filtrację, aby wykorzystać okresy dobrej jakości wody i zoptymalizować pobieranie pokarmu^11,12. W bardziej stabilnym środowisku, takim jak otwarte wody, nie jest jasne, czy małże będą skutecznie regulować tempo pompowania i filtracji, aby utrzymać dodatni bilans energetyczny dla szybkiego wzrostu. Drugie wyzwanie stojące przed hodowlą i na morzu jest również związane ze stosunkowo niską dostępnością pożywienia w oceanie. Biorąc pod uwagę, że gęstość fitoplanktonu jest znacznie niższa na morzu niż w ujściach rzek, czy gatunki małży, które obecnie z powodzeniem hoduje się w ujściach rzek, znajdą wystarczająco dużo jedzenia, aby utrzymać zarówno metabolizm, jak i wzrost? Obecne praktyki wykorzystujące liny, skarpety, klatki lub inne ogrodzenia do przetrzymywania skorupiaków w ujściach rzek skutkują trójwymiarowymi filtrami, które mogą lokalnie zubożać fitoplankton nawet w eutroficznych wodach przybrzeżnych^13,14. Założenia dotyczące projektowania narzędzi hodowlanych, gęstości obsady, odstępów między liniami i czasu cyklu upraw mogą wymagać ponownego przemyślenia na otwartym oceanie, aby zarządzać zarówno zdolnością produkcyjną gospodarstwa, jak i ekologiczną nośnością lokalnego ekosystemu morskiego^15,16. Intensywna hodowla skorupiaków, praktykowana w pobliżu brzegu, może wymagać modyfikacji, aby była zgodna z rozcieńczonym środowiskiem oceanicznym.

Aby pogłębić nasze zrozumienie tego, jak praktyki hodowli skorupiaków na wybrzeżu mogą wymagać modyfikacji, aby odnieść sukces na morzu, niezbędne są dane ilościowe na temat interakcji skorupiaków z sestonami obecnymi w lokalizacjach morskich proponowanych jako potencjalne miejsca hodowli. Opracowano szereg technik ilościowego określania filtracji, klirensu, spożycia, odrzucania i absorpcji cząstek przez małże żywiące się zawiesiną^17,18. Niektóre z tych metod zostały zoptymalizowane pod kątem wykrywania zmian w bardzo krótkich skalach czasowych, wyboru między różnymi typami cząstek lub reakcji fizjologicznych na różne zmiany środowiskowe^19,20,21. Ostatnio udoskonalenia tego, co nazywa się metodą biodepozycji, doprowadziły do zaakceptowania tego podejścia jako uzasadnionego narzędzia do ilościowego określania większości ważnych zmiennych filtracji i karmienia małży, ostryg i małży^17,22.

Ogólnie rzecz biorąc, metoda biodepozycji wykorzystuje podejście oparte na bilansie masy, z nieorganicznym składnikiem seston jako znacznikiem, do ilościowego określenia podziału przez poszczególne skorupiaki organicznych i nieorganicznych składników seston na proporcje wychwycone, odrzucone, spożyte i wchłonięte w skali godzin¹⁷. Aby to podejście było dokładne, niezwykle ważne jest, aby natężenia przepływu wody dostarczanej do poszczególnych skorupiaków były stałe i dokładnie znane oraz aby skorupiaki nie były fizycznie zakłócane, tak aby utrzymywały swoje stałe zachowanie filtracyjne. Konieczne jest również zsynchronizowanie pobierania próbek wody w momencie spożycia małży z pobieraniem próbek kału powstałych po trawieniu (tj. degestii). Te dwa procesy (spożycie i wydalanie) są równoważone przez czas potrzebny na przejście cząstki stałe przez jelito małży. Czas pasażu jelitowego reprezentuje czas, jaki upłynął między spożyciem pokarmu a uwolnieniem niestrawionego materiału w postaci kału. Ponadto, z praktycznego punktu widzenia, biodepozyty muszą być zbierane ilościowo przez badacza, zanim zostaną zdezagregowane przez ruch wody. Z tych powodów aparatura i procedury do ilościowego określania filtracji małży przy użyciu metody biodepozycji zostały ograniczone do miejsc bardzo blisko brzegu, gdzie stabilna platforma - suchy ląd lub stałe molo - znajduje się wystarczająco blisko badanej populacji skorupiaków. Aby metoda biodepozycji mogła być stosowana na morzu, konieczne było znalezienie sposobu na spełnienie wymagań metody dla stabilnej platformy na pokładzie łodzi.

Wieki temu, marynarze szukający rozwiązania tego samego podstawowego problemu, jak odizolować przedmioty pokładowe od ruchu statku, opracowali gimbal. Gimbal wprowadza jeden lub więcej osi między platformą przymocowaną do statku a izolowanym przedmiotem, dzięki czemu izolowany przedmiot reaguje bardziej na grawitację niż na ruch statku. Zastosowaliśmy prawdopodobnie najprostszą konstrukcję gimbala - czopy sworzni pod kątem 90° - w projekcie urządzenia zmodyfikowanego w stosunku do tego zgłoszonego przez Galimany'ego i współpracowników²². W niniejszym raporcie efektywna funkcja aparatu została potwierdzona poprzez pomiar: 1) ruchu stołu z komorami na skorupiaki w porównaniu z ruchem łodzi, 2) spójności natężenia przepływu przez 20 powtórzonych komór na morzu oraz 3) danych dotyczących filtracji z małży testowanych w trzech lokalizacjach przybrzeżnych na pokładzie trzech różnych statków.

Protokół

1. Stolik obrotowy i urządzenie do podawania

1. Zbuduj i zmontuj stół gimbalowy składający się z dwóch ramek, stołu gimbalowego i zbiornika balastowego, jak pokazano na Rysunku 1a.
   1. Wykonaj zewnętrzną ramę o długości 130 cm, szerokości 92 cm i wysokości 90 cm z prętów poli(chlorku winylu) (PVC) o średnicy 0,65 cm. Do złożenia ramy użyj stalowych nakrętek i śrub.
   2. Wykonaj wewnętrzną ramę (o długości 125 cm i szerokości 80 cm) z prętów poli(chlorku winylu) (PVC) o przekroju 4 cm x 10 cm. Wzmocnij sekcje na górnych końcach krótszych boków ramy, aby mogły przyjąć wewnętrzną ramę gimbalową. Trwale zamocuj stalowe kołki, umożliwiające swobodne wahanie się wewnętrznej ramy w obrębie ramy zewnętrznej.
   3. Podobnie wzmocnij sekcje na dłuższych bokach wewnętrznej ramy, aby mogły pomieścić stalowe kołki zamocowane do stołu gimbalowego, umożliwiając jego swobodne wahanie.
   4. Wyposaż sześcian z PVC w wymienny balast. Napełnij zbiornik balastowy 85 kg wody morskiej i umieść 50-kilogramowy odważnik ze stali cynkowej na dnie zbiornika; działa on jako przeciwwaga, tłumiąc – lecz nie ograniczając – ruch stołu.
      UWAGA: Zbiornik balastowy jest przymocowany do stołu gimbalowego za pomocą stalowych nakrętek i śrub.

Rycina 1: Stół obrotowy i urządzenia do dokarmiania opracowane do ilościowego oznaczania filtracji zawiesiny przez skorupiaki za pomocą metody biodepozycji na pokładzie łodzi. (a) Na tym panelu przedstawiono zdjęcie złożonego stołu obrotowego z urządzeniem do dokarmiania. (b) Na tym panelu pokazano schemat złożonego urządzenia do dokarmiania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Zbuduj i zmontuj urządzenie do dokarmiania, składające się z zbiornika głównego i 2 zestawów po 10 komór dokarmiających (Rycina 1b).
   1. Zbuduj zbiornik główny z rury PVC o średnicy 6,5 mm o wymiarach 70 cm długości × 30 cm szerokości × 12 cm wysokości (Rycina 2a). Wywierć otwór o średnicy 25 mm w środku lewej ścianki 30-cm, 3 cm poniżej górnej krawędzi.
   2. Wywierć 10 otworów o średnicy 13 mm przez każdą z dwóch bocznych ścianek PVC o długości 70 cm tak, aby środek każdego otworu znajdował się 2,5 cm nad podłożem. Pierwszy otwór wywierć 40 mm od krawędzi zbiornika głównego; następnie kolejne otwory rozmieść co 69 mm od siebie.
   3. W każdy otwór wkręć plastikowe konektory przejściowe o wewnętrznej średnicy 7 mm, aby umożliwić odpływ wody ze zbiornika głównego. Na konektory załóż wąż silikonowy o wewnętrznej średnicy 6,5 mm. W połowie każdego węża, pomiędzy zbiornikiem głównym a komorami dokarmiającymi, podłącz regulowane zawory, aby kontrolować przepływ wody do komór dokarmiających.
      UWAGA: Aby zapewnić zawieszenie cząsteczek w wodzie w zbiorniku głównym i ich równomierne rozprowadzenie do komór dokarmiających, należy zapewnić napowietnianie całego zbiornika za pomocą kamieni napowietrzających lub węży napowietrzających.
   4. Wewnętrzne wymiary każdej komory dokarmiającej to 17,5 cm długości × 6 cm szerokości × 6 cm wysokości (Rycina 2b). Wywierć jeden otwór o średnicy 13 mm w środku jednej ze ścianek 6-cm, tak aby środek otworu znajdował się 15 mm nad dnem. Na przeciwległej ściance 6-cm każdej komory wywierć otwór o średnicy 13 mm, 45 mm od dna.
   5. Umieść przegrodę wewnątrz każdej komory dokarmiającej; przegroda to element z PVC o wysokości 3 cm i szerokości 6 cm, który należy umieścić 3,5 cm od ścianki 6-cm komory, w której otwór wywiercono 15 mm od dna. Przegrodę przyklej do dna komory, aby woda przepływała nad nią.
   6. Umieść drugi, ruchomy element przegrody o długości 50 mm, w kształcie litery T (58 mm szerokości u podstawy T, 15 mm od góry; rozszerza się do szerokości 72 mm). Taki kształt umożliwia oparcie przegrody na górnej krawędzi ścianek komory dokarmiającej i przepływ wody pod przegrodą w komorze (Rycina 2c). Umieść ruchomą przegrodę 1–2 cm przed skorupiakiem, co zmusza strumień wody do bezpośredniego napływu na skorupiaka na dnie komory.
   7. Umieść zbiornik główny i urządzenie do dokarmiania na stole obrotowym (gimbal table) i ustal je w miejscu za pomocą mata przeciwwślizgowego. Układ zaprojektowano w sposób modułowy, aby ułatwić pakowanie, przewożenie i przechowywanie.

Rycina 2: Szczegółowe pomiary zbiornika głównego i komór żywieniowych. (a) Rysunek zbiornika głównego z naniesionymi szczegółowymi wymiarami. (b) Rysunek jednej z komór żywieniowych z naniesionymi szczegółowymi wymiarami. Prążkowana linia wskazuje położenie stałej przegrody. (c) Rysunek i wymiary ruchomej przegrody. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Kalibracja przepływu dla komór żywienia

1. Aby skalibrować strumienie przepływu, umieść 100-mL szklany lub plastikowy cylinder miarowy na wylocie komory karmienia. Natychmiast rozpocznij pomiar czasu za pomocą stopera.
2. Po 30 s usuń cylinder miarowy i sprawdź objętość zebranego wody. Idealnie, zebrana objętość powinna wynosić 100 mL, co odpowiada przepływowi z zbiornika głównego do komór karmienia na poziomie 12 L h^-1.
   UWAGA: Strumień przepływu 12 L h^-1 został określony w poprzednich eksperymentach laboratoryjnych jako zapewniający jednorodny rozkład cząstek między akwariami bez konieczności recyrkulacji wody.
   1. Jeśli objętość zebranej wody różni się od celu 100 mL o więcej niż 5 mL, skoryguj przepływ, zamykając lub otwierając zawór znajdujący się między zbiornikiem głównym a komorą karmienia. Sprawdź nowy strumień przepływu, ponownie zbierając wodę przez 30 s i powtarzaj ten krok, aż osiągniesz pożądany strumień przepływu.
3. Powtórz tę samą procedurę kalibracji dla każdej komory karmienia, w tym dla komór kontrolnych, przed rozpoczęciem zbierania danych.

3. Przygotowanie filtrów do metody biodepozycji

UWAGA: Oznaczanie całkowitej, organicznej i nieorganicznej materii cząstkowej w wodzie, pseudokaleniach i kaleniach wykonuje się za pomocą filtrów ze szklanego włókna GF/C o średnicy 25 mm. Przed pobraniem próbek należy upewnić się, że filtry zostały przemyte, wysuszone, wyprażone i wcześniej odważone. Podczas wszystkich czynności filtry należy obsługiwać wyłącznie szczypcami o płaskich końcach. Jeśli filtr pęknie lub ma dziurę, należy go odrzucić i nie używać.

1. Aby wypłukać filtry, najpierw dodaj około 10 filtrów do zlewki z 200 mL wody destylowanej i mieszaj ręcznie. Po 15 s zauważ, że dawniej klarowna woda zawiera białe włókna; są to luźne, przypominające kurz włókna szklane uwalniane przez filtry. Przestań mieszać.
2. Odlaj wodę ze zlewki i ponownie dodaj 200 mL wody destylowanej. Całkowicie wypłucz filtry trzykrotnie. Powtarzaj proces płukania, aż uzyskasz wystarczającą liczbę filtrów do przeprowadzenia pełnego eksperymentu żywieniowego, tj. około 48 filtrów do filtracji wody, jeśli eksperyment trwa 2 h i wodę zbiera się co 15 min, oraz 32 filtry do odchodów i fałszywych odchodów 16 małżorąkowych.
3. Wysusz filtry w temperaturze 60 °C przez co najmniej 1 h. Spal suche filtry w piecu muflowym w temperaturze 450 °C przez 4 h, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pochodzenia organicznego. Wyjmij filtry z pieca, przenieś je do desykatora i pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
4. Zważ filtry na wadze analitycznej i zanotuj masy. Dwie możliwe metody śledzenia mas filtrów są następujące:
   1. Oznacz każdy filtr na skrajnym brzegu, poza obszarem, który będzie otrzymywał próbkę podczas filtracji, używając miękkiego ołówka. Zważ filtr po oznaczeniu, zanotuj jego numer i masę w notatniku oraz przechowuj filtry po zważeniu w ich oryginalnym pudełku na filtry.
   2. Zważ każdy filtr indywidualnie, a następnie owiń go w kawałek wyprażonego folii aluminiowej i zanotuj odpowiadającą mu masę na folii. Przechowuj owinięte filtry aż do ich użycia w terenie i zapisz masę w notatniku po zebraniu próbki.

4. Czas przejścia przez przewód pokarmowy

1. Umieść pięć małżów pojedynczo w szklanych lub plastikowych zlewkach wypełnionych 300 mL środowiska morskiego o naturalnej temperaturze, nieprzefiltrowanego.
2. Dodaj 2 mL monocultury Tetraselmis sp. do każdej zlewy i zanotuj czas otwarcia się każdego osobnika małża, sygnalizowany rozwarciem skorupy.
   UWAGA: Monokultura Tetraselmis sp. jest stosowana do wyznaczenia czasu przejścia pokarmu przez przewód pokarmowy, ponieważ jest chętnie pochłaniana przez gatunki małżów, a powstające odchody mają ciemnozielony kolor, co odróżnia je od brązowych kałów powstających po strawieniu naturalnej planktonowej społeczności.
3. Sprawdzaj każdą zlewkę co 3–5 minut, aby upewnić się, że małże pozostają otwarte i produkują odchody.
   1. Sprawdź, czy odchody mają postać gęsto upakowanych, zwartych nitek będących wynikiem procesu trawiennego małży (Ryc. 3) i czy zachowują swoją strukturę podczas pobierania pipetą.
   2. Upewnij się, że zebrane osady to odchody, a nie pseudoodchody (Ryc. 3); jeśli są produkowane, powstają natychmiast w wyniku nadmiaru Tetraselmis sp. Pseudoodchody to luźno upakowane, chmurne osady niepochłoniętych cząstek, które szybko się rozpraszają po zebraniu pipetą.

Rycina 3: Ilustracja różnic w wyglądzie odchodów i fałszywych odchodów dwuskorupków. Lewy panel przedstawia małża żeberkowanego (Geukensia demissa), przy czym strzałki wskazują wytworzone odchody i fałszywe odchody. Prawy panel pokazuje w szczegółach zielone odchody i fałszywe odchody powstałe po filtracji monocultury Tetraselmis sp., oraz brązowe odchody i fałszywe odchody powstałe po filtracji naturalnej populacji fitoplanktonu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Gdy pojawią się zielone kałuże, zanotuj czas dla każdego osobnika skorupiaka. Czas pomiędzy otwarciem skorupiaka a wytworzeniem zielonych kałuż jest czasem przejścia pokarmu przez jelita. Uśrednij czasy przejścia pokarmu przez jelita dla wszystkich pięciu replikat skorupiaków, aby uzyskać średni czas przejścia przez jelita, który będzie używany do określenia przesunięcia czasowego między pobraniem próbek wody a próbek kału.
   UWAGA: Użyj pięciu replikat na wypadek, gdy jeden lub więcej skorupiaków nie otworzy się lub nie wyprodukuje kału. W idealnym przypadku średni czas przejścia przez jelita powinien być oparty na więcej niż trzech replikatach.

5. Zbieranie próbek

1. Zbierz próbki wody wypływającej z zbiornika głównego, wody z komór kontrolnych, które zawierają puste skorupy tego samego gatunku małża wykorzystanego w eksperymentach (po dwa na stronę), oraz kału i pseudokału produkowanego przez każdy małż. Oczyść małże z epibiontów i innych organizmów osiadłych, aby uniknąć filtracji przez inną faunę przed umieszczeniem małży w komorach karmienia.
   NOTE: Małże umieszczone w komorach karmienia mogą się przemieszczać, dlatego w celu ułatwienia zbierania kału i pseudokału, zamocuj je na miejscu w każdej komorze za pomocą zacisków (n.p., Velcro).
   1. Zbieraj 300 mL wody co 15 minut przez 2 godziny. Oddzielnie przefiltruj wodę wypływową i wodę z dwóch zestawów komór kontrolnych przez wcześniej odważone filtry (czyli 3 filtry na każdy punkt czasowy). Opoluj filtry około 5 mL izotonicznego formianu amonowego, gdy filtry nadal znajdują się na układzie filtracyjnym.
   2. Rozpocznij zbieranie biodepozytów z opóźnieniem równym średnim czasem przejścia przez przewód pokarmowy, określonym zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu. Na przykład, jeśli średni czas przejścia przez przewód pokarmowy wynosił 1 godzinę, rozpocznij zbieranie wody natychmiast po otwarciu się małży w komorach karmienia. Po upływie 1 godziny usuń z komór wszystkie wyprodukowane kały i pseudokały, a następnie rozpocznij zbieranie wszystkich kolejnych kałów i pseudokałów.
      1. Zacieniuj małże zarówno w komorach karmienia, jak i w pojemnikach do pomiaru czasu przejścia przez przewód pokarmowy, aby zwiększyć liczbę małży otwierających się do odżywiania.
   3. Zbieraj kały i pseudokały oddzielnie za pomocą pipety szklanej i przechowuj biodepozyty w oddzielnym pojemniku (kolbie lub probówce) dla każdego małża przez cały 2-godzinny okres zbierania. Filtruj indywidualnie biodepozyty z każdego pojemnika na wcześniej odważony filtr i opłucz je 5 mL izotonicznego formianu amonowego.
      NOTE: Na końcu 2-godzinnego okresu zbierania będzie 16 pojemników z zebranymi kalem i 16 pojemników z zebranymi pseudokałami, co daje razem 32 pojemniki do odfiltrowania.
   4. Przechowuj filtry w szkiełkach Petriego lub w aluminiowym foliowanym papierze do transportu do laboratorium. Jeśli do transportu używany jest foliowany papier aluminiowy, najpierw zegnij filtry na pół, z materiałem filtra do wewnątrz zagięcia, aby zapobiec utracie odfiltrowanego materiału w wyniku kontaktu z folią. Wszystkie filtry przechowuj w chłodnicy z lodem.
   5. W laboratorium wysusz wszystkie filtry w piecu przy temperaturze 60 °C przez co najmniej 24 godziny.
   6. Ponownie zważ każdy filtr za pomocą wagi analitycznej. Odejmij wagę początkową od końcowej, aby wyznaczyć całkowitą masę cząstek stałych.
   7. Wypal wszystkie filtry w piecu muflowym przy temperaturze 450 °C przez 4 godziny. Wyjmij filtry z pieca, przenieś je do deszynikatora i pozostaw do osiągnięcia temperatury pokojowej. Zważ ponownie filtry na wadze analitycznej. Odejmij masę wypalonego filtra od masy wysuszonego filtra, aby wyznaczyć masę nieorganiczną cząstek stałych.
      NOTE: Masa organiczna cząstek stałych to różnica między całkowitą masą cząstek stałych a masą nieorganiczną cząstek stałych.

Wyniki

Metoda biodepozycji służąca do ilościowego określania żerowania małżowców jest dobrze uznana i zapewnia mechanizm pozyskiwania kompleksowych danych na temat wydajności filtracji i żerowania małżowców z wykorzystaniem naturalnego sestonu w środowisku polowym. Poprzednie zastosowania metody biodepozycji mogły być przeprowadzane wyłącznie w lokalizacjach brzegowych, ponieważ metoda ta wymaga stabilnej platformy. Badanie filtracji i żerowania małżowców w wodach pełnomorskich wymaga pomiarów z pokładu statku, a statki nie są wystarczająco stabilne, nawet w najspokojniejszych warunkach. Zaprojektowaliśmy i przetestowaliśmy dodanie stołu gimbalowego do istniejącej aparatury do filtracji, aby stworzyć stabilną platformę niezbędną do prawidłowego zastosowania metody biodepozycji.

Oprócz stabilnej platformy do filtracji dla małży, przedstawiamy dane wykazujące równomierny rozkład cząstek pomiędzy poszczególnymi komorami wewnątrz aparatury karmącej (p = 0,97 na podstawie uogólnionego testu Welcha dla średnich przyciętych o 20%²³; Rysunek 4). Ten równomierny rozkład zawiesiny wskazuje, że dostarczanie cząstek z zbiornika głównego do poszczególnych komór jest spójne; w związku z tym wszystkie małże są narażone na tę samą ilość i jakość pokarmu i mogą być uznane za rzeczywiste powtórzenia.

Rysunek 4: Średnia liczebność komórek w każdej komorze zasilającej podczas testów rozkładu cząstek w pustych komorach. Ten panel przedstawia średnią liczbę komórek fitoplanktonu/ml (± SD) w wodzie morskiej pobranej z rurki wylotowej każdej komory dozującej (oznaczone od 1 do 20) podczas prób kontroli jakości w celu zapewnienia równomiernego rozkładu cząstek w systemie przepływowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Przeprowadzono cztery próby pokładowe z udziałem trzech gatunków małży w trzech lokalizacjach o bardzo różnej ilości i składzie sestonu (Rycina 5). Badane gatunki mogą być potencjalnie hodowane w warunkach offshore lub są obecnie hodowane w ten sposób; zastosowano wiele gatunków, aby przetestować ogólną przydatność aparatury. W pierwszym eksperymencie w Connecticut (CT) oraz w Massachusetts (MA) wykorzystano omułka jadalną (Mytilus edulis). W drugim eksperymencie w CT wykorzystano omułkę prążkowaną (Geukensia demissa). W eksperymencie w Kalifornii (CA) wykorzystano omułkę śródziemnomorską (Mytilus galloprovincialis). Dwa eksperymenty przeprowadzono w przybrzeżnym CT, w cieśninie Long Island Sound, 1,5 km od Milford w dniach 12 i 19 czerwca 2013 roku. Trzeci eksperyment przeprowadzono w przybrzeżnym MA, w Vineyard Sound, 1 km od Menemsha 23 lipca 2013 roku. Czwarty eksperyment przeprowadzono w offshore CA, 10 km od Long Beach 20 sierpnia 2013 roku.

Warunki w tych trzech lokalizacjach obejmują zakres wartości, jakich można by się spodziewać w środowiskach morskich poddawanych ocenie pod kątem akwakultury małżowców. Całkowita zawartość materii cząsteczkowej w wodzie była najwyższa w CT, niższa w MA i najniższa w CA (wszystkie p≤ 0,01 na podstawie uogólnionej procedury T3 Dunnetta dla średnich przyciętych oraz techniki bootstrap-t²³). W przeciwieństwie do tego, zawartość organiczna sestonu była najwyższa w CA, niższa w MA i najniższa w CT (wszystkie p≤ 0,01 na podstawie uogólnionej procedury T3 Dunnetta dla średnich przyciętych oraz techniki bootstrap-t²³; Rycina 5).

Rysunek 5: Skład i ilość materii zawieszonej w wodzie w trzech lokalizacjach eksperymentalnych. Ten panel przedstawia średnią zawartość organicznej materii cząsteczkowej (POM) (± SD; dane i słupki błędów w kolorze szarym) oraz średnią zawartość nieorganicznej materii cząsteczkowej (PIM) (± SD; dane w kolorze białym, a słupki błędów w kolorze czarnym) w wodzie pobranej z 3 różnych lokalizacji eksperymentalnych. Pełny słupek (szary + biały) wskazuje całkowitą zawartość materii cząsteczkowej (TPM). CT 1 = eksperyment Connecticut 1; CT 2 = eksperyment Connecticut 2; MA = eksperyment Massachusetts; CA = eksperyment California. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zachowanie żerowania u małży zależy zarówno od gatunku, jak i od warunków środowiskowych. Osobniki dostosowują sposób żerowania do różnic w ilości i rodzaju (organicznej i nieorganicznej) zawiesiny w wodzie. W związku z tym wyniki czterech eksperymentów dotyczących filtracji z trzech lokalizacji odzwierciedlają zarówno plastyczną odpowiedź fizjologiczną na ilość i jakość pokarmu, jak i różnice międzygatunkowe w trzech z czterech eksperymentów. Efektywność wchłaniania u małży była znacząco wyższa w pierwszym eksperymencie w CT niż w drugim, oraz wyższa w pierwszym eksperymencie w CT niż w CA, jednak wszystkie pozostałe porównania parowe nie były istotne, co prawdopodobnie wynika z wysokiej zmienności zaobserwowanej w pomiarach zarówno dla MA, jak i CA (istotność testowano przy α = 0.05, z korektą w celu kontroli wielokrotnych testów; na podstawie uogólnienia procedury Dunnetta T3 dla średnich przyciętych oraz techniki bootstrap-t;²³ Rysunek 6). Proporcja odrzuconego materiału filtrowanego była najwyższa w CT, niższa w MA i wynosiła zero w CA (wszystkie p≤ 0.05 na podstawie uogólnienia procedury Dunnetta T3 dla średnich przyciętych oraz techniki bootstrap-t²³).

Rycina 6: Odrzucanie całkowitej zawiesiny cząsteczkowej i absorpcja materii organicznej przez małże podczas prób pokładowych. Ten panel przedstawia procent odrzutów i absorpcji (± SD) przez omułki w trzech lokalizacjach eksperymentalnych. CT 1 = eksperyment Connecticut 1; CT 2 = eksperyment Connecticut 2; MA = eksperyment Massachusetts; CA = eksperyment California. Omułki błękitne (Mytilus edulis) zostały użyte w CT 1 oraz w MA. Omułki prążkowane (Geukensia demissa) wykorzystano w CT 2. Mulety śródziemnomorskie (Mytilus galloprovincialis) zostały wykorzystane w analizie skupień (CA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Doświadczenia przeprowadzone w MA i CA zilustrowały typowe problemy, które mogą wystąpić podczas zmian warunków środowiskowych. Wysoki stan morza spowodował dużą zmienność względną zmierzonej zawartości materii organicznej w pseudofekaliach w MA.

Rysunek 7: Zawartość materii organicznej w wodzie, kałach i pseudokałach w trzech lokalizacjach doświadczalnych. Ten panel przedstawia średni procent zawartości materii organicznej (± SD) w wodzie, kale oraz pseudokale trzech gatunków małży w czterech różnych eksperymentach przeprowadzonych w 3 lokalizacjach. CT 1 = eksperyment 1 w Connecticut z udziałem małży niebieskich (Mytilus edulis); CT 2 = eksperyment 2 z Connecticut z udziałem mulek prążkowanych (Geukensia demissa); MA = eksperyment z małżami modrakami przeprowadzony w Massachusetts; CA = eksperyment z małżami śródziemnomorskimi przeprowadzony w Kalifornii (Mytilus galloprovincialis). Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Problemy analityczne powszechnie związane z obszarami o niskiej zawartości materii cząsteczkowej zostały zilustrowane w wynikach zachowań żywieniowych z CA, gdzie niektóre małe pseudofekalia zostały początkowo pomylone z fekaliami.

Rycina 8: Wpływ błędnej identyfikacji bioosadów na dane dotyczące zachowań żerowania małży w próbach pokładowych. Ten panel przedstawia przykładowe dane z Kalifornii, ukazujące efekt błędnej identyfikacji niewielkich odchodów jako pseudofekaliów w środowisku o niskiej całkowitej zawartości materii cząsteczkowej (TPM). W tym przypadku TPM była zbyt niska, aby wywołać produkcję pseudofekaliów, lecz odchody były tak małe, że niektóre z nich pomylono z pseudofekaliami. Dane poprawiono poprzez zsumowanie masy odchodów i „pseudofekaliów” i obliczenie wyłącznie ścieżki ingestii. CR = szybkość oczyszczania (Clearance Rate), objętość wody przepływającej przez skrzela małży (L/h); FR = szybkość filtracji (Filtration Rate), masa cząsteczek zatrzymanych w skrzpelach (mg/h); AR = szybkość absorpcji (Absorption Rate), masa pochłoniętej materii cząsteczkowej, która zostaje wchłonięta w układzie trawiennym małży (mg/h). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Studia przypadków przedstawione na Rysunku 7 i Rysunku 8 zostały szczegółowo omówione w sekcji Dyskusja.

Dyskusja

Do badania filtracji i karmienia małży zastosowano różne podejścia zarówno w laboratorium, jak i w terenie. Pomiary wykonane przy użyciu naturalnej sestonu dadzą dawki karmienia najbardziej zbliżone do tych w środowisku naturalnym²⁴. Istniejące przenośne urządzenia podające do pomiaru karmienia małży^25,26 są zależne od stabilnej platformy, takiej jak ląd lub stały dok; W związku z tym ilościowe określenie filtracji i karmienia małży w terenie było do tej pory ograniczone do wód bardzo przybrzeżnych. Zaprezentowane tu nowatorskie urządzenie i metoda stanowią wiarygodne narzędzie do ilościowego określania wydajności żerowania małży w wodach przybrzeżnych, gdzie interakcje między małżami a środowiskiem były wcześniej słabo opisane.

Kluczowe etapy w ramach morskiego zastosowania metody bioosadzania obejmują: (1) napowietrzanie zbiornika czołowego i kalibrację natężeń przepływu we wszystkich komorach zasilających w celu zapewnienia równomiernego rozprowadzania cząstek do małży; (2) dokładne określenie eksperymentalnego czasu pasażu jelitowego przed pobraniem biodepozytów; (3) identyfikację, separację i pełne zbieranie wszystkich kałów i pseudokałów wytwarzanych przez małże, w tym zbieranie wystarczającej ilości bioosadów powodujących przekroczenie granicy wykrywalności dla organicznych i nieorganicznych cząstek stałych. Wysokie natężenia przepływu są niezbędne, aby uniknąć recyrkulacji wody w komorach karmienia, co może nasilać zjawisko redukcji koncentracji pokarmu w wyniku refiltracji 18,25,27,28.

Dokładna identyfikacja i separacja kału i pseudokału może być wyzwaniem w środowiskach morskich. Gromadzenie się kału i pseudokału w wodach Massachusetts zostało prawdopodobnie dotknięte przez wzburzone morze w ostatniej godzinie pomiaru. Pomiary przy użyciu tej metody będą ograniczone stanem morza, co wpłynie na zdolność zbieraczy do czystego oddzielania i dokładnego rozróżniania kału, pseudokału i innych cząstek stałych (tj. mułu lub cząstek) zdeponowanych w komorach karmienia. Ten problem eksperymentalny można zaobserwować w uzyskanych danych, w których zawartość organiczna pseudokału ma większą zmienność w wynikach z Massachusetts niż z pozostałych dwóch lokalizacji (ryc. 7).

Miejsca o bardzo niskiej zawartości cząstek stałych, takie jak Kalifornia, będą stanowić wyzwanie analityczne, ponieważ cząstki stałe zebrane w tym eksperymencie były bardzo bliskie granicy wykrywalności, mimo że 2 l wody zostały przefiltrowane dla każdej próbki wody. Metoda ilościowego określania udziału organicznego i nieorganicznego w całkowitym pyle cząstek stałych opiera się na bilansie masy; W związku z tym niewielkie błędy analityczne w pobliżu granicy wykrywalności mogą skutkować fizjologicznie niemożliwymi wynikami karmienia skorupiaków, takimi jak ujemne wskaźniki odrzucenia lub klirensu. Dane wynikające z tego typu błędu i odpowiedniej korekty przedstawiono na rysunku 8, który przedstawia średnią wartość szybkości usuwania, szybkości filtracji i szybkości wchłaniania z eksperymentu w Kalifornii. Ilość kału w tym miejscu była tak mała, że niektóre z nich zostały pomylone z pseudokałem przez zbieraczy biodepozytów. Bardzo małe ilości zebranych "pseudokałów" były bardzo bliskie granicy wykrywalności wagowo, a uzyskane dane dały ujemne dane dotyczące filtracji i karmienia skorupiaków dla kilku powtórzeń, co jest fizjologicznie niemożliwe, a zatem oczywiście błędne. Cząstki stałe bliskie granicy wykrywalności również wykazały dużą ogólną zmienność w tym pomiarze. Wyniki te mogły być spowodowane błędem w ważeniu filtrów, ale bardziej prawdopodobne było, że było to spowodowane nieprawidłową identyfikacją pseudokału. Ta ostatnia możliwość została dodatkowo poparta obserwacją, że całkowita zawartość cząstek stałych w wodzie była zbyt niska, aby wywołać produkcję pseudokału^22,23. Dane zostały skorygowane poprzez odrzucenie nieprawidłowych danych dotyczących pseudokału i obliczenie tylko ścieżki spożycia (Figura 8).

Aparatura do ilościowego oznaczania karmienia zawiesiną małży metodą biodepozycji na pokładzie łodzi może być modyfikowana i dostosowywana do kilku gatunków małży. Wielkość komór zasilających może się nieznacznie różnić, aby pomieścić szersze lub węższe muszle małży. Należy jednak zauważyć, że modyfikacja wymiarów komór karmienia w stosunku do opisanych tutaj wymaga ustalenia równomiernego rozkładu cząstek w komorach karmienia przed przeprowadzeniem jakichkolwiek pomiarów. Objętość filtrowanej wody należy dostosować w zależności od warunków lokalnych. Środowiska o niskiej gęstości natężenia, takie jak Kalifornia, wymagają większej ilości przefiltrowanej wody, aby przekroczyć granicę wykrywalności dla analizy opartej na masie. Jednocześnie, jeśli przefiltruje się zbyt dużo wody, filtry zapychają się, a czas suszenia (nie temperaturę) w piekarniku należy wydłużyć. Podobnie, może być konieczne wydłużenie zbierania biodepozytów w środowiskach o niskiej gęstości, aby zebrać wystarczającą ilość materiału, aby przekroczyć analityczną granicę wykrywalności. Innym wskaźnikiem problematycznego gromadzenia biodepozytów jest względna zawartość organiczna w wodzie w porównaniu z pseudokałem i kałem. Kał i pseudokał nie mogą zawierać znacznie większego procentu materii organicznej niż woda; Są one produktem przefiltrowanych i przetworzonych cząstek z wody. W pewnych warunkach zawartość organiczna w bioosadach może być nieco większa niż w wodzie ze względu na organiczną inwestycję, jaką małże dokonują w celu przetworzenia cząstek żywności; Jednak inwestycja ta przyniesie co najwyżej niewielki wzrost materii organicznej w kale. Zgłoszony tutaj procent materii organicznej jest znacznie wyższy niż procent, który można przypisać metabolicznej utracie kału. Próbki pseudokału z Massachusetts ilustrują ten potencjalny problem. Jak wspomniano powyżej, zawartość organiczna w pseudokale była dość zmienna, ale niektóre z powtórzeń dały zawartość organiczną, która znacznie przewyższała zawartość substancji organicznych w odpowiednich próbkach wody. Możliwe, że podczas wzburzonego morza w ostatniej godzinie zbierania biodepozytów, pseudokał został połączony z egzogenną materią organiczną, co sztucznie podniosło zawartość substancji organicznych i dało fizjologicznie niemożliwe wyniki (ryc. 7). Jeśli stan pełnego morza jest prawdopodobną możliwością w przyszłych zastosowaniach tej metody, zaleca się dodanie większej liczby powtórzeń przez dodatkowe komory.

Ograniczeniem metody jest to, że aparatura ta jest przeznaczona do ilościowego określania żywienia dorosłych osobników. Dokładne i kompletne zebranie kału i pseudokału z nasion małży jest trudne ze względu na mały rozmiar (pseudo)kału i wymagałoby znacznie dłuższych eksperymentów w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału do przekroczenia analitycznej granicy wykrywalności. Jeśli wykorzystywane są małe osobniki, kilka z nich można zebrać w jednej komorze, aby zwiększyć tempo produkcji kału i pseudokału na komorę. Alternatywnie, urządzenia mogą zostać przeprojektowane ze znacznie mniejszymi komorami doświadczalnymi. Pogoda i stan morza mogą być również istotnymi ograniczeniami, ponieważ będą one miały wpływ na dokładność pobierania próbek z biodepozytów. Ekstremalne temperatury i deszcz mogą zmniejszyć liczbę replik małży, które żerują. Głębokość, na której stosowane są pompy wodne, może być różna w zależności od doświadczenia, aby zapewnić, że seston użyty w doświadczeniach odzwierciedla seston typowy dla głębokości, na której będzie miała miejsce hodowla małży. Pomimo tych potencjalnych ograniczeń, metoda ta oferuje wyjątkową możliwość zbadania filtracji i karmienia małży w warunkach naturalnych, z naturalnym sestonem, w przeciwieństwie do symulowanych warunków w laboratorium. Wygenerowane dane są znacznie bardziej realistyczne niż eksperymenty laboratoryjne i z większym prawdopodobieństwem odzwierciedlają wydajność małży w miejscu zainteresowania. Nowa metoda przeprowadzania pomiarów na statku znacznie rozszerza potencjalny zakres geograficzny.

Rosnące zainteresowanie akwakulturą małży morskich stanowi idealną grupę użytkowników dla przyszłych zastosowań tej metody. Zainteresowane strony zainteresowane optymalizacją lokalizacji nowych operacji akwakultury na morzu mogą wykorzystać to podejście do zbadania wydajności małży w proponowanych lokalizacjach. Przykładem planowanego zastosowania jest przetestowanie hipotez dotyczących optymalnych głębokości dla kultury zawiesiny omułka błękitnego w wodach przybrzeżnych u wybrzeży południowej Nowej Anglii (Mizuta i Wikfors, w przeglądzie).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtry z włókna szklanego GF/C	Whatman	1822-025	Koła o średnicy 25 mm
Zatapialna pompa użytkowa	Utilitech	PPSU33	1/3 HP
Kolektor filtracyjny	Sterlitech	313400	3-miejscowy, PVC
Kleszczyki filtracyjne	Millipore	XX6200006P
Lejek filtracyjny	Ace Glass	D140942	300 ml; szkło
Wspornik fryty	Fisher Scientific	09-753-14	średnica 25mm; szkło
Uchwyty filtrów próżniowych	Fisher Scientific	09-753-4	Do lejków filtracyjnych 25 mm i wsporników fryty
Piec suszący	Fisher Scientific	15-103-0503	Piec konwekcyjny grawitacyjny
	ThermoFisher Scientific	BF51794C
Mrówczan amonu	Fisher Scientific	A666-500
Tetraselmis sp.	Center for Marine Algae and Microbiota		są dostępne w sprzedaży przez NCMA, a konkretny szczep powinien być wybrany na podstawie temperatury planowanych eksperymentów. W związku z tym nie zalecamy tutaj podawania konkretnego numeru katalogowego.
Szklana szalka Petriego	Fisher Scientific	08-747A	o średnicy 60 mm

Szczepy Tetraselmis sp. 119 National