Artykuł metodologiczny

Mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego

DOI:

10.3791/58224

⸱

1 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry, Center for Molecular Biology of Inflammation, University of Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster, 3Cluster of Excellence 'Cells in Motion', University of Münster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół, który może być wykorzystany do określenia powinowactwa wiązania i sposobu interakcji bezznacznikowego białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z immobilizowanymi dwuwarstwami opartymi na ciele stałym (SLB) poprzez jednoczesny pomiar wychwytu masy i właściwości lepkosprężystych białka anektyny A2.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika dyssypatywnego mikrobalansu kryształu kwarcu to proste i bezznacznikowe podejście do jednoczesnego pomiaru absorpcji masy i właściwości lepkosprężystych wchłoniętej/unieruchomionej masy na powierzchniach czujników, co pozwala na pomiary interakcji białek z powierzchniami opartymi na ciałach stałych, takimi jak dwuwarstwy lipidowe, w czasie rzeczywistym i z wysoką czułością. Aneksyny są wysoce konserwatywną grupą białek wiążących fosfolipidy, które oddziałują odwracalnie z ujemnie naładowanymi grupami głowy poprzez koordynację jonów wapnia. W tym miejscu opisujemy protokół, który został zastosowany do ilościowej analizy wiązania aneksyny A2 (AnxA2) z płaskimi dwuwarstwami lipidowymi przygotowanymi na powierzchni czujnika kwarcowego. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem uzyskiwania solidnych i powtarzalnych danych i zawiera szczegółowy opis krok po kroku. Metodę tę można zastosować do innych białek wiążących błonę i kompozycji dwuwarstwowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błony komórkowe są bardzo dynamicznymi i złożonymi strukturami. Złożona mieszanina lipidów błonowych, wraz z obwodowo i/lub integralnie związanymi białkami błonowymi, łączy się, tworząc mikrodomeny. Skoordynowana organizacja czasowo-przestrzenna tych mikrodomen błonowych jest zaangażowana w kluczowe procesy fizjologiczne1. Dynamika mikrodomen błonowych jest napędzana przez wzajemne oddziaływanie lipidów błonowych, a także przez zdolność białek błony obwodowej do rozpoznawania i interakcji z lipidami wzbogaconymi w mikrodomeny. Rekrutacja białek do określonych lipidów jest często osiągana za pomocą modułów rozpoznawania lipidów, takich jak homologia pleckstrin (PH) lub domeny C22,3. Biofizyczne metody analityczne wykorzystujące błony modelowe są kluczem do zrozumienia podstawowych zasad rządzących tymi procesami na poziomie molekularnym.

Załączniki, duża rodzina wielogenowa, są dobrze znane ze swojej zdolności do wiązania się z ujemnie naładowanymi lipidami błonowymi, głównie fosfatydyloseryną (PS), w sposób kontrolowany przez Ca2+2. Drugą cechą charakterystyczną rodziny aneksin jest obecność konserwatywnego segmentu strukturalnego, powtórzenia aneksyny, który występuje cztery lub osiem razy i zawiera miejsca wiązania Ca2+ i fosfolipidów4. Interakcja lipidowa zależna od Ca2 + umieszcza aneksyny w idealnej pozycji do wyczuwania i przekazywania sygnalizacji za pośrednictwem Ca2 + do błon docelowych. Konsekwentnie, aneksyny są w stanie indukować tworzenie mikrodomen wzbogaconych w cholesterol, fosfatydyloinozytol-4,5-bisfosforan (PI(4,5)P2) i PS, zarówno w komórkowych, jak i / lub sztucznych systemach błonowych5. Protokół ten opisuje podejście do analizy interakcji aneksyna-membrana przy użyciu rozpraszania mikrowagi kryształu kwarcu (QCM-D)6,7,8.

Podstawowym elementem tej mikrowagi jest oscylujący kryształ, który służy jako powierzchnia czujnika. Adsorpcja i/lub wiązanie cząsteczek z powierzchnią czujnika zmniejsza częstotliwość rezonansową (f) proporcjonalnie do wzrostu masy. Jeśli powierzchnia jest równomiernie pokryta folią, wiązanie dodatkowych substancji może zakłócać integralność strukturalną tej warstwy, a takie zmiany lepkosprężystości (współczynnik rozpraszania energii D) mogą być dodatkowo monitorowane. Jest to szeroko rozpowszechniona technika badania interakcji białek z dwuwarstwami lipidowymi. W tym podejściu pęcherzyki lipidowe są absorbowane na odpowiednio pokrytą powierzchnię czujnika. Tworzenie dwuwarstwowych warstw lipidowych jest korzystne w przypadku materiałów na bazie krzemionki9,10, ponieważ pęcherzyki często nie pękają na innych powierzchniach hydrofilowych, takich jak gold11 utlenione po ekspozycji na promieniowanie UV, TiO212, lub Al2O313. Pęknięcie koalescencyjnych pęcherzyków uwalnia fazę wodną, prowadząc do charakterystycznych zmian masy i dysprosacji. Wytwarzanie dwuwarstw podpartych ciałem stałym (SLB) przez fuzję pęcherzyków jest proste i wytrzymałe i może być wykorzystywane do generowania złożonych modeli naśladujących błony komórkowe.

Rozpraszająca mikrowaga kryształu kwarcu jest techniką bezetykietową i czułą. Dużą zaletą jest możliwość powlekania dowolnego materiału, który generuje wystarczająco cienką warstwę na powierzchni, zapewniając tym samym szeroki zakres zastosowań w różnych obszarach badawczych. Interakcja białko-błona jest obserwowana w czasie rzeczywistym, a wyniki mogą być analizowane bezpośrednio. Ta sama powierzchnia czujnika może być wykorzystana w kolejnych pomiarach (po wykonaniu minimalnego czyszczenia zgodnie z opisem w niniejszym protokole), co pozwala na dokładne kontrole wewnętrzne i porównywalność między analitami.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: powinny być filtrowane za pomocą filtra 0,22 μm i odgazowywane przez próżnię przez 1 godzinę.

1. Preparat pęcherzyków lipidowych

  1. Użyj szklanych probówek o pojemności 2 ml. Rozpuścić każdy lipid, 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DOPC), 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (POPC), 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-serynę (POPS) i cholesterol (Chol) w mieszaninie chloroformu/metanolu (50:50 v/v) w celu przygotowania klarownego roztworu lipidowego o stężeniu 5 mM. Rozpuścić 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inozytol-4',5'-bisfosforan) (PI(4,5)P2) w mieszaninie chloroformu/metanolu/wody (20:9:1 v/v).
  2. Połącz rozpuszczone lipidy w pożądanym stosunku molowym POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) i POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tabela 1) w szklanych probówkach o pojemności 10 ml.
    UWAGA: Ostateczna ilość lipidów ogółem wynosi 500 μg.
  3. Odparować rozpuszczalniki organiczne za pomocą suchego strumienia azotu. Pozostawić mieszaninę lipidów w systemie wysokopróżniowym (liofilizacji) na 3 godziny w celu usunięcia wszelkich pozostałości śladów rozpuszczalników.
    UWAGA: W ten sposób powstaje suchy, przezroczysty film.
  4. Zawiesić film lipidowy w 1 ml buforu cytrynianowego (10 mM cytrynianu trisodu, 150 mM NaCl, pH 4,6). Zawiesinę lipidową inkubować w temperaturze 60 °C (temperatura ta jest o około 10 °C wyższa od temperatury przemiany fazowej najwyżej topniejącego lipidu w mieszaninie) przez 30 minut w łaźni wodnej i energicznie wirować co 5 minut
    UWAGA: Powoduje to powstawanie dużych, wielopłytkowych pęcherzyków (MLV). Utrzymać zawiesinę powyżej temperatury przejścia.
  5. Rozgrzej wytłaczarkę (w tym przypadku w temperaturze 60 °C) wyposażoną w membranę poliwęglanową o średnicy porów o średnicy 50 nm powyżej temperatury przejścia (która w tym przypadku wynosi 40 - 50 °C) przez 30 minut.
  6. Załaduj zawieszenie MLV do podgrzanej wytłaczarki i delikatnie przepuść mieszaninę 31x przez membranę poliwęglanową, aby utworzyć małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV)14. Utrzymuj temperaturę powyżej temperatury przejścia.
  7. Przenieść zawiesinę SUV do plastikowego naczynia reakcyjnego o pojemności 2 ml i dodać bufor cytrynianu (patrz krok 1.4), aby doprowadzić końcową objętość do 2 ml.
    UWAGA: W ten sposób uzyska się końcowe stężenie lipidów 250 μg/ml.

2. Obsługa czujników kwarcowych

UWAGA: Zawsze obsługuj czujniki kwarcowe za pomocą pęsety.

  1. Inkubować cztery czujniki umieszczone w uchwycie z politetrafluoroetylenu w 2% roztworze SDS przez ≥ 30 minut. Umyj je dokładnie ultraczystą wodą, aby całkowicie usunąć SDS i pozwól im wyschnąć przy użyciu strumienia suchego argonu lub azotu.
  2. Użyj systemu czyszczenia plazmowego, aby całkowicie usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Włóż suche czujniki do komory czyszczenia plazmowego, opróżnij komorę i przepłucz ją 3x tlenem. Włącz odkurzacz plazmowy. Użyj następujących parametrów procesu: ciśnienie 1 x 10-4 Torr, wysoka częstotliwość radiowa (RF) i 10 minut czasu procesu. Wyłącz maszynę i wyjmij czujniki.

3. Obsługa mikrowagi

UWAGA: Zastosowano system mikrowagi z czterema komorami przepływowymi o kontrolowanej temperaturze w konfiguracji równoległej, podłączonymi do pompy perystaltycznej i ustawionymi na natężenie przepływu 80 μL/min. W trybie przepływu otwartego bufor był pompowany ze zbiornika zasilającego do zbiornika odbiorczego. W trybie pętli zbiornik odbiorczy został połączony ze zbiornikiem zasilającym w celu wygenerowania pętli zamkniętej. Temperaturę ustawiono na 20 °C.

  1. Ostrożnie zanurz oczyszczone plazmowo czujniki w 4 komorach przepływowych za pomocą pęsety. Unikaj nacisku lub skręcania komór i rurek, które mogą powodować wycieki.
  2. Przepłukać układ buforem cytrynianowym (10 mM cytrynian trisodu, 150 mM NaCl, pH 4,6) w trybie otwartego przepływu przez 10 min.
    UWAGA: Wymaga to dokładnie 3,2 ml buforu, ale zaleca się użycie nadmiaru buforu (10 ml).
  3. Uruchom program. Rozpocznij rejestrowanie wszelkich zmian częstotliwości i rozproszenia pierwszego tonu podstawowego (n = 1.) i alikwotów (n = 3 - 13) za pomocą oprogramowania, aż linie bazowe częstotliwości i rozpraszania ustabilizują się (zajmie to około 40 - 60 minut).
    UWAGA: Poziomy szumów o częstotliwości (międzyszczytowe) powinny być niższe niż 0,5 Hz, a dla rozpraszania niższe niż 0,1·10-6, przy maksymalnym dryfcie (w roztworze wodnym) wynoszącym 1 Hz/h w częstotliwości i 0,3·10-6/h w rozproszeniu.
  4. Gdy linie podstawowe są stabilne, nanieść zawiesinę SUV w buforze cytrynianowym (2 ml w małej tubce). Za pomocą naczynia reakcyjnego usunąć 1,5 ml martwej objętości. Następnie zamknij system w trybie przepływu pętlowego. Rejestruj zmianę częstotliwości/rozpraszania przez kolejne 10 minut.
    UWAGA: W tym czasie pęcherzyki rozprzestrzenią się na powierzchnię SiO2 i połączą się, tworząc ciągłą dwuwarstwę15,16 (krok 2 na rysunkach 1, Rysunek 2 i Rysunek 3). Adsorpcja SUV-ów na powierzchni czujnika jest dwufazowa i ma typową minimalną i maksymalną częstotliwość rozpraszania. Stabilna nowa linia bazowa częstotliwości/rozpraszania z charakterystycznym przesunięciem częstotliwości (w zależności od składu lipidowego) w zakresie 26 - 29 Hz (patrz tabela 1) wskazuje na ciągłą dwuwarstwę na powierzchni.
  5. Gdy SLB jest stabilny (patrz krok 3.4), zrównoważyć układ z pracującym buforem (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) przy wymaganych stężeniach Ca2+ (w zakresie od 50 μM do 1 mM CaCl2, w zależności od doświadczenia) w trybie otwartego przepływu przez 40 minut.
  6. Dodaj białko (tutaj AnxA2) do uruchomionego buforu zawierającego Ca2+ (patrz krok 3.5). Wykonaj aplikację białka w trybie przepływu pętlowego, aż do osiągnięcia stanu równowagi (krok 3 w Rysunek 1, Rysunek 2 i Rysunek 3).
    UWAGA: Stężenie białka może wynosić od 1 do 400 nM. Adsorpcja białek powoduje zależne od stężenia przesunięcie częstotliwości odzwierciedlające adsorpcję masy (białka).
  7. Dysocjacja związanego białka przez chelatację jonów Ca2+ z 5 mM EGTA w buforze roboczym w trybie otwartego przepływu (krok 4 na rysunkach 1 i Rysunek 2).
    UWAGA: Powrót częstości i rozpraszania do wartości wyjściowej SLB wskazuje na całkowitą odwracalność wiązania białek. Cykle asocjacji-dysocjacji można powtarzać w celu porównania różnych stężeń lub białek.

4. Czyszczenie mikrowagi

UWAGA: Wykonuj minimalną procedurę czyszczenia po każdym pomiarze.

  1. Zregeneruj układ mikrowagi za pomocą 50 mlddH2O w trybie ciągłego przepływu otwartego, wyjmij probówki ze zbiornika na wodę i pozostaw system do wyschnięcia.
  2. Ostrożnie wyjmij czujnik kryształkowy i wyczyść go 2% roztworem SDS za pomocą uchwytu z politetrafluoroetylenu (patrz krok 2.1).
  3. Osusz widoczne części wnętrza modułu przepływowego, w którym umieszczono czujnik.
    UWAGA: Wykonaj procedurę intensywnego czyszczenia po serii 10 pomiarów.
  4. Wyczyść system 2% roztworem SDS (50 ml) w temperaturze 40 °C (konfiguracja w oprogramowaniu) w trybie ciągłego przepływu otwartego (probówka), używając natężenia przepływu 20 μl/min dla dłuższego kontaktu z detergentem.
  5. Oczyścić 250 ml ddH2O w trybie ciągłego przepływu otwartego przy natężeniu przepływu 160 μl/min.
    UWAGA: Po 4 miesiącach przeprowadź obszerną procedurę czyszczenia zgodnie z instrukcją producenta.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spadek częstotliwości rezonansowej (Δf) koreluje liniowo z zaadsorbowaną masą (Δm), zgodnie z równaniem Sauerbreya. 17

figure-results-1

Tutaj f to częstotliwość rezonansowa, Cf to stała, która zależy od geometrycznych i fizycznych cech danego kwarcu i częstotliwości rezonansowej, a A to pole powierzchni czujnika.

W większości zastosowań, zaadsorbowana warstwa nie jest całkowicie sztywna, ale lepkosprężysta. Wynikające z tego tłumienie drgań czujnika kwarcowego określa się jako rozpraszanie (D). Monitorowane zmiany rozproszenia (ΔD) korelują z właściwościami lepkosprężystymi związanego masy18 i są zdefiniowane w następujący sposób8.

figure-results-2

Tutaj Erozproszone to energia utracona podczas jednego okresu oscylacji, a Ezmagazynowane to całkowita energia swobodnie oscylującego czujnika.

Aby przeanalizować i określić ilościowo parametry wiązania, izotermy częstotliwości są wyprowadzane przez wykreślenie przesunięć częstotliwości równowagi (ΔΔfe) w stosunku do stężeń białka. ΔΔfe definiuje się jako

figure-results-3

Tutaj Δft1 reprezentuje początek adsorpcji białka, a Δft2 stan równowagi. Nieliniowe dopasowanie krzywej można wykonać przy użyciu rozwinięcia Hilla równania Langmuira w następujący sposób6,8.

figure-results-4

Tutaj ΔΔfmax to ΔΔfe stężenia białka skutkującego maksymalnym (nasycającym) wiązaniem, Kd jest pozorną stałą dysocjacji dla kompleksu białko/błona, a n to współczynnik Hilla.

Współczynnik Hilla (n) opisuje kooperatywność wiązania. Dla n = 1 model adsorpcji Hilla jest prostą izotermą Langmuira (równe miejsca wiązania i wszystkie cząsteczki wiążą się niezależnie od siebie z dwuwarstwą lipidową). Jeśli n ≠ 1, związany ligand zmienia powinowactwo wiązania błony do innych ligandów, zwiększając (n > 1, dodatnia kooperatywność) lub zmniejszając (n < 1, ujemna kooperatywność) powinowactwo.

Rysunek 1 pokazuje schemat eksperymentalnego przepływu pracy stosowanego w naszym laboratorium do pomiaru zmian rezonansu i częstotliwości podczas wiązania zależnego od Ca2+ oraz uwalniania AnxA2 do dwuwarstwy lipidowej w fazie ciekłej. Przykładowe nagranie pokazane jest w Rysunek 2. Rysunek 2A pokazuje zapis krzywej częstotliwości, a Rysunek 2B pokazuje przesunięcia rozpraszania. Wyraźny spadek częstotliwości po dodaniu liposomów (Rysunek 2A [krok 1]) wskazuje na ich adsorpcję. Ponieważ pęcherzyki wypełnione buforem nie są sztywne, ale lepkosprężyste, rozpraszanie wzrasta (Rysunek 2B [krok 1]). Następnie dochodzi do pęknięcia zlewających się pęcherzyków. Równoczesne uwalnianie buforu wewnątrz pęcherzyków zmniejsza zaadsorbowaną masę, aż do osiągnięcia stabilnego plateau (Rysunek 2A [krok 2]). Warto zauważyć, że dodanie pęcherzyków powoduje duże przesunięcie dyssypacji, podczas gdy przesunięcie w odpowiedzi na dwuwarstwę jest znacznie mniejsze ze względu na sztywną jednorodną naturę SLB (Rysunek 2B [krok 2]). Krok 3 w Rysunek 2A i 2B rejestruje wiązanie AnxA2 z lipidami, co zwiększa masę, co widać po wyraźnym przesunięciu częstotliwości, ale nie ingeruje w strukturę dwuwarstwową, na co wskazuje jedyna niewielka zmiana w rozpraszaniu. Gdy Ca2+ jest usuwany przez czynnik chelatujący EGTA (Rysunek 1 i Rysunek 2 [krok 4]), AnxA2 dysocjuje od filmu lipidowego. Częstotliwość, jak również zapisy dyssypacji, przesuwają się do poziomów widocznych tylko dla dwuwarstwy (porównaj kroki 2 i 4 w Rysunek 2A i 2B), co wskazuje, że wiązanie AnxA2 jest całkowicie zależne od Ca2+ i że film lipidowy pozostaje nienaruszony.

AnxA2, podobnie jak większość załączników, zależy od ujemnie naładowanych lipidów, takich jak PS. Jest to wyraźnie widoczne, gdy POPS jest nieobecny w dwuwarstwie lipidowej (Rysunek 3). Rysunek 3A pokazuje zapis krzywej częstotliwości, a Rysunek 3B pokazuje przesunięcia rozpraszania. Zauważ, że częstotliwość przesuwa się do stabilnej linii bazowej przy -25 Hz, ale rozpraszanie nie ulega zmianie (Rysunek 3B [krok 2]), co wskazuje na prawidłowe tworzenie się dwuwarstwy. Jednak po dodaniu AnxA2 w obecności Ca 2+ ( Rysunek 3 A) lub rozpraszaniu ( Rysunek 3B) nie obserwuje się żadnych zmian w częstotliwości <(silna klasa = "xfig" Rysunek 3A i 3B [krok 3]) lub EGTA ( Rysunek 3A i 3B [krok 4]), ponieważ AnxA2 nie może wchodzić w interakcje z filmem lipidowym.

figure-results-5
Rysunek 1: Graficzny model eksperymentalnego przepływu pracy. Ten przepływ pracy ilustruje absorpcję pęcherzyków do powierzchni czujnika hydrofilowego (krok 1), fuzję/pęknięcie pęcherzyka prowadzące do powstania SLB (krok 2) oraz adsorpcję zależną od Ca2+ (krok 3) i zależną od EGTA desorpcję AnxA2 (krok 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 2: Przykładowe nagranie. Panele te pokazują (A) zależne od czasu monitorowanie 7. częstotliwości rezonansowej alikwotów oraz (B) przesunięcia rozpraszania czujników kwarcowych podczas pomiaru. Zastosowanie liposomów powoduje szybki spadek wartości bazowej częstotliwości, podczas gdy linia bazowa rozpraszania wzrasta (krok 1). Stabilizacja linii podstawowych wskazuje na tworzenie się dwuwarstwy (krok 2). Adsorpcja AnxA2 (200 nM) (w obecności Ca2+) na dwuwarstwie lipidowej zawierającej POP zwiększa masę bez znaczącej zmiany rozpraszania, co wskazuje, że film lipidowy nie jest zaburzony (krok 3). Odzyskanie wyjściowej częstości po chelatacji Ca2+ za pomocą EGTA wskazuje na całkowitą desorpcję białka (etap 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 3: Eksperyment kontroli negatywnej, wykazujący, że AnxA2 nie wiąże się z SLB przy braku POPS. Panele te pokazują dodawanie liposomów i tworzenie SLB (kroki 1 i 2). Nie widać zmian w częstotliwości (A) lub rozproszeniu (B) po dodaniu AnxA2 (krok 3; 200 nM, w obecności Ca2+) lub EGTA (krok 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

kompozycja ΔΔF/Hz po utworzeniu SLB ΔΔD*10-6 po utworzeniu SLB POPC/POPS
(80 : 20) 26,3 ± 0,2 0,26 ± 0,03 POPC/PI(4,5)P2
(95 : 5) 26,5 ± 0,5 0,31 ± 0,02 POPC/POPS/Chol
(60 : 20 : 20) 29,2 ± 0,2 0,45 ± 0,09 POPC/POPS/ PI(4,5)P2/Chol
(60 : 17 : 3 : 20) 29,6 ± 0,6 0,43 ± 0,10 POPC/DOPC/POPS/ PI(4,5)P2/Chol
(37 : 20 : 20 : 3 : 20) 29,4 ± 0,4 0,39 ± 0,14

Tabela 1: Dane dotyczące składu i tworzenia lipidów w klasie SLB7.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby odpowiedzieć na pytania dotyczące relacji struktura-funkcja błon komórkowych zarówno w sposób ilościowy, jak i jakościowy, biologia komórki czerpie ogromne korzyści z zastosowania podejść biofizycznych opartych na dobrze ugruntowanych i szeroko stosowanych technikach, w tym mikroskopii sił atomowych (AFM), powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) i zastosowanej tu technice QCM-D. Wykazaliśmy w poprzednich badaniach, że białka aneksyny wiążą się w sposób zależny od Ca2 + z unieruchomioną błoną z dużym powinowactwem. Używamy przesunięć częstotliwości i rozproszenia 7. alikwotu (Δf7), ponieważ stanowi to najlepszy kompromis między czułością detekcji a stabilnością oscylacji.

Technika ta pozwala również na ilościowy opis interakcji błona-białko. Wiązanie AnxA2 z błoną charakteryzuje się dodatnią kooperatywnością, w której pośredniczy konserwatywna domena rdzeniowa aneksyny i zależy od obecności cholesterolu. Dane ilościowe uzyskane dla AnxA2 i AnxA8 przedstawiono szczegółowo w innym miejscu 6,8.

W tym protokole jest wiele krytycznych kroków. Użyj liposomów natychmiast; W przeciwnym razie małe pęcherzyki mogą łączyć się w większe pęcherzyki o mniejszym napięciu powierzchniowym, co prowadzi do zahamowania tworzenia dwuwarstwy lipidowej. Podczas pomiarów utrzymuj stałą temperaturę. Każde niewielkie odchylenie temperatury powoduje niebagatelne przesunięcie częstotliwości i rozpraszania. Unikaj pęcherzyków powietrza; W przeciwnym razie system jest niestabilny i nie ustanowi punktu odniesienia.

Równanie Sauerbreya pozwala na bezpośrednie przekształcenie obserwowanych zmian częstotliwości na zmiany masy i dlatego jest szeroko stosowane. Jednak założenie liniowej korelacji między zmianą częstotliwości rezonansowej a dodaną masą jest prawdziwe tylko w przypadku komponentów tworzących sztywną i jednolitą warstwę na powierzchni czujnika. Równania Sauerbreya nie można stosować do adsorbentów lepkosprężystych, takich jak bogate w wodę folie białkowe, warstwy lipidowe z wbudowaną wodą, a nawet zaadsorbowane komórki. W tym przypadku wymagane są bardziej złożone modele matematyczne. Dlatego niezwykle ważne jest jednoczesne monitorowanie zmian częstotliwości i rozpraszania. Aby wykryć zmiany strukturalne podczas pomiaru, można wykreślić stosunek ΔD do Δf, z linią prostą wskazującą brak zmian konformacyjnych.

Dużą zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania jako podłoży bardzo szerokiej gamy materiałów. Co więcej, jest to wiarygodna i bezpośrednia metoda badania szerokiego zakresu oddziaływań makromolekularnych, ponieważ prawidłowe tworzenie się warstw powłoki powierzchniowej (takich jak SLB), a także dalsze interakcje białko-lipid, mogą być monitorowane online.

Protokół ten można zastosować do innych białek oddziałujących z błoną, na przykład białek domeny BAR19, rodziny białek ERM (ezrin, radixin i moesin), która odgrywa ważną rolę w wiązaniu błona-cytoszkielet 20,21,22 lub białek zawierających domeny C2 lub PH. Co więcej, z powodzeniem opublikowano szeroki zakres zastosowań tej techniki do badania materiałów biologicznych, co sprawia, że QCM jest dobrze dopasowaną platformą eksperymentalną do badania interakcji bardziej złożonych zespołów makromolekularnych, a nawet komórek23,24.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft w ramach grantów SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 i SFB 1348/A11.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
CalciumchlorideMerck017-013-00-299%
ChloroformRoth4432.199%
DOPCAvanti850375P
EGTAPanReac AppliChemA087899%
HEPESPanReac AppliChemA1069
MetanolPanReac AppliChemA3493
2Avanti 850155P
POPCAvanti 850457P
POPSAvanti 840034P
Chlorek soduPanReac AppliChemA1149
SDSRoth183
Cytrynian trisodowyPanReac AppliChemA3901
Equipment 
Extruder LiposofastAvestin
Qsense E4 AnalyzerQsense
QSense DfindQsense
Pump IPC 4IsmatecISM 930
QSX 303 SiO2 Dwutlenek krzemu 50nmQsenseQSX 303
PC Membrany 0,05μ mLipidy polarne Avanti610003
OriginProOriginLab Corporationwersja 8 i 9

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).
  2. Gerke, V., Creutz, C. E., Moss, S. E. Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 449-461 (2005).
  3. Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends in Biochemical Science. 37, 526-533 (2012).
  4. Rescher, U., Ruhe, D., Ludwig, C., Zobiack, N., Gerke, V. Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes. Journal of Cell Science. 117, 3473-3480 (2004).
  5. Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: from structure to function. Physiological Reviews. 82, 331-371 (2002).
  6. Heitzig, N., et al. Cooperative binding promotes demand-driven recruitment of AnxA8 to cholesterol-containing membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (4), 349-358 (2018).
  7. Drücker, P., Grill, D., Gerke, V., Galla, H. J. Formation and characterization of supported lipid bilayers containing phosphatidylinositol-4,5-biphosphate and cholesterol as functional surfaces. Langmuir. 30, 14877-14886 (2014).
  8. McConnell, H. M., Watts, T. H., Weis, M. R., Brian, A. A. Supported planar membranes in studies of cell-cell recognition in the immune system. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Biomembranes. 864, 95-106 (1986).
  9. Anderson, T. H., et al. Formation of supported bilayers on silica substrates. Langmuir. 25, 6997-7005 (2009).
  10. Pfeiffer, L., Petronis, S., Koper, I., Kasemo, B., Zach, M. Vesicle adsorption and phospholipid bilayer formation on topographically and chemically nanostructured surfaces. Journal of Physical Chemistry B. 114, 4623-4631 (2010).
  11. Cho, N. J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: a comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  12. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. J. Self-Assembly formation of lipid bilayer coatings on bare aluminium oxide: overcoming the force of interfacial water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  13. Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
  14. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 155 (2), 206-222 (1959).
  17. Rodahl, M., Höök, F., Krozer, A., Brzezinski, P., Kasemo, B. Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3924-3930 (1995).
  18. Drücker, P., Pejic, M., Grill, D., Galla, H. J., Gerke, V. Cooperative binding of annexin A2 to cholesterol-and phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate-containing bilayers. Biophysical Journal. 107 (9), 2070-2081 (2014).
  19. Galic, M., et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  20. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).
  21. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  22. Bianco, M., et al. Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics. Biotechnology Journal. , 1700699(2018).
  23. Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond. Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).
  24. Bragazzi, N. L., et al. Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. Donev, R., et al. 101, Academic Press. 149-211 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Quartz Crystal MicrobalanceDissipative MicrogravimetryAnnexin A2 BindingLipid Bilayer FormationCalcium Dependent BindingSolid supported Lipid BilayersProtein lipid InteractionFrequency Dissipation ShiftVesicle Extrusion MethodPlasma Cleaning System

Powiązane artykuły