Artykuł metodologiczny

Wizualizacja zapadania się stożka wzrostu aksonów i wczesnych efektów β amyloidu w hodowanych neuronach myszy

DOI:

10.3791/58229

⸱

30 października 2018

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono protokół do badania wczesnych skutków β amyloidu (Aβ) w mózgu. To pokazuje, że Aβ indukuje endocytozę za pośrednictwem klatryny i zapadanie się stożków wzrostu aksonów. Protokół jest przydatny w badaniu wczesnego wpływu Aβ na stożki wzrostu aksonów i może ułatwić zapobieganie chorobie Alzheimera.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amyloid-β (Aβ) powoduje zaburzenia pamięci w chorobie Alzheimera (AD). Chociaż wykazano, że terapie obniżają poziom Aβ w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera, nie poprawiają one funkcji pamięci. Ponieważ Aβ agreguje się w mózgu przed pojawieniem się zaburzeń pamięci, celowanie w Aβ może być nieskuteczne w leczeniu pacjentów z AD, którzy już wykazują deficyty pamięci. W związku z tym dalsza sygnalizacja spowodowana osadzaniem się Aβ powinna zostać zablokowana przed rozwojem AD. Aβ indukuje zwyrodnienie aksonów, prowadząc do zakłócenia sieci neuronalnych i upośledzenia pamięci. Chociaż istnieje wiele badań nad mechanizmami toksyczności Aβ, źródło toksyczności Aβ pozostaje nieznane. Aby pomóc w identyfikacji źródła, proponujemy nowatorski protokół, który wykorzystuje mikroskopię, transfekcję genów i obrazowanie żywych komórek do zbadania wczesnych zmian spowodowanych przez Aβ w aksonalnych stożkach wzrostu hodowanych neuronów. Protokół ten ujawnił, że Aβ indukował endocytozę za pośrednictwem klatryny w aksonalnych stożkach wzrostu, po której następowało zapadnięcie się stożka wzrostu, wykazując, że hamowanie endocytozy zapobiega toksyczności Aβ. Protokół ten będzie przydatny w badaniu wczesnych skutków Aβ i może prowadzić do skuteczniejszego i bardziej zapobiegawczego leczenia AD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złogi β amyloidu (Aβ) znajdują się w mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) i są uważane za krytyczną przyczynę AD1, które zakłócają sieci neuronowe, prowadząc do zaburzeń pamięci2,3,4. Wykazano, że wielu kandydatów na leki kliniczne skutecznie zapobiega wytwarzaniu β amyloidu (Aβ) lub usuwa złogi Aβ. Jednak żadnemu z nich nie udało się poprawić funkcji pamięci u pacjentów z AD5. Aβ odkłada się w mózgu jeszcze przed wystąpieniem zaburzeń pamięci6; dlatego obniżenie poziomu Aβ w mózgach pacjentów wykazujących zaburzenia pamięci może być nieskuteczne. Odkładanie się Aβ występuje u przedklinicznych pacjentów z AD; Jednak u tych pacjentów rzadko występują zwyrodnienia neuronów i deficyty pamięci6. Istnieje opóźnienie czasowe między odkładaniem się Aβ a zaburzeniami pamięci. Dlatego kluczową strategią zapobiegania chorobie Alzheimera jest blokowanie sygnalizacji toksyczności Aβ we wczesnych stadiach choroby Alzheimera, przed rozwojem deficytów pamięci. Osadzanie Aβ indukuje degenerację aksonów7,8,9,10,11,12,13, co może prowadzić do zakłócenia sieci neuronowych i trwałego upośledzenia funkcji pamięci. W wielu badaniach badano mechanizmy toksyczności Aβ; na przykład wykazano, że zdegenerowane aksony mózgów myszy z AD mają zwiększoną autofagię14. Aktywacja kalcyneuryny została opisana jako możliwy mechanizm zwyrodnienia aksonów wywołanego przez Aβ15; Jednak bezpośredni czynnik wywołujący zwyrodnienie aksonów pozostaje nieznany.

To badanie skupia się na zapadaniu się zakończeń aksonalnych zwanych stożkami wzrostu. Zapadanie się aksonalnych stożków wzrostu może być spowodowane przez środki odstraszające wzrost aksonów, takie jak semaforyna-3A i efryna-A516,17,18,19,20. W mózgach pacjentów z AD zaobserwowano zapadające się dystroficzne zakończenia aksonów21,22. Dodatkowo, nieprawidłowe funkcjonowanie stożka wzrostu może wywołać zwyrodnienie aksonów23. Nie wiadomo jednak, czy Aβ indukuje zapadanie się stożka wzrostu. Dlatego badanie to przedstawia nowy protokół obserwacji wczesnych skutków Aβ w hodowanych neuronach i zbadania wywołanego przez Aβ zapadania się stożka wzrostu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Kampusie Sugitani Uniwersytetu Toyama i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych na Kampusie Sugitani Uniwersytetu Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. Test zwinięcia

  1. Powłoka poli-D-lizynowa
    1. Pokryć 8-dołkowe szkiełka hodowlane 400 μl 5 μg/ml poli-D-lizyny (PDL) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez noc.
    2. Usuń roztwór PDL i umyj studzienki 3 razy wodą destylowaną.
  2. Kultura neuronów24
    1. Świeżo wyizolowaną korę mózgową od embrionalnych myszy ddY w dniu 14 (E14) za pomocą mikronożyczek w pożywce do hodowli neuronów zawierającej 12% surowicy końskiej, 0,6% glukozy i 2 mM L-glutaminy (pożywka A). Nie dodawać antybiotyków.
      UWAGA: W tym protokole używana jest mysz ddY. Jest to odmiana niekrewniacza powszechnie stosowana w Japonii. Ten protokół hodowli neuronów może być również stosowany do neuronów korowych szczurów7,25.
    2. Odwirować tkanki przy sile 87 x g przez 3 minuty.
    3. Usunąć supernatant. Następnie do granulatu dodaj 2 ml 0,05% trypsyny i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37°C. Mieszaj, stukając co 5 minut.
    4. Dodaj 4 ml pożywki A i wymieszaj, stukając.
    5. Odwirować tkanki przy sile 178 x g przez 3 minuty.
    6. Usunąć supernatant i inkubować tkanki z 600 U/ml DNazy I i 0,3 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej rozpuszczonego w PBS przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Mieszać stukając co 5 minut.
    7. Po inkubacji dodać 4 ml pożywki A i wymieszać, stukając.
    8. Odwirować tkanki przy sile 178 x g przez 3 minuty.
    9. Po usunięciu supernatantu dodać 4 ml pożywki A i rozcierać tkanki za pomocą wypolerowanej pipety Pasteura.
    10. Przefiltruj rozdrobnione tkanki za pomocą siatki o wielkości porów 70 μm. Po filtracji oblicz gęstość komórek za pomocą hemocytometru.
    11. Wyhodować komórki w 8-dołkowym szkiełku hodowlanym w temperaturze 0,8 x 104 komórki/basenik z pożywką A i utrzymać je w inkubatorze CO2 z nawilżoną atmosferą 10% CO2 w temperaturze 37 °C.
    12. Po 4 godzinach hodowli należy wymienić pożywkę hodowlaną na taką, która zawiera 2% suplementu do hodowli neuronów, 0,6% glukozy i 2 mM L-glutaminy (pożywka B).
      UWAGA: Czystość neuronów wynosiła około 75%, jak opisano wcześniej26.
  3. Zwiń test27
    1. Rozpuścić komercyjnie uzyskany amyloid β1-42 (Aβ1-42) o pełnej długości w wodzie destylowanej o stężeniu 0,5 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni. Po inkubacji zagregowany roztwór Aβ1-42 należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -30 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Ta inkubacja jest niezbędna do agregacji i toksyczności Aβ27,28,29,30.
    2. Po 4 dniach hodowli neuronalnej potraktować studzienki 100 μl nowej pożywki B, zawierającej 0,5 μM zagregowanego Aβ1-42 lub roztworu nośnika (woda destylowana) przez 1 h,
      UWAGA: Efekty Aβ1-42 zostały zwiększone w zależności od dawki z 0,1 do 5 μM i osiągnęły szczyt przy 0,5 μM, jak opisano wcześniej27. Podobne wyniki można zaobserwować po leczeniu Aβ1-42 przez 1 godzinę po 3 dniach hodowli neuronalnej31.
    3. Usunąć pożywkę hodowlaną i natychmiast utrwalić neurony 4% paraformaldehydem zawierającym 4% sacharozy w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C na gorącej płycie.
    4. Po utrwaleniu przemyj neurony 3 razy PBS i zamontuj je wodnym podłożem montażowym. Podłoże montażowe suszyć w temperaturze 4 °C przez 2–4 dni.
    5. Uchwyć cały obszar (7,8 x 9 mm2) każdej studzienki za pomocą 20-krotnej suchej soczewki obiektywowej w odwróconym mikroskopie.
    6. Sklasyfikuj najdłuższe neuryty każdego neuronu w stadium 3 lub 4 jako aksony, zgodnie z wcześniejszym opisem32,33.
    7. Klasyfikuj stożki wzrostu według następujących kryteriów: 1) stożki wzrostu aksonów pozbawione blaszkowatych lub 2) posiadające mniej niż trzy filopodia są uważane za stożki wzrostu zapadnięte, jak opisano wcześniej17.
      UWAGA: Zdrowe stożki wzrostu są oceniane jako 0 punktów; Zapadnięte stożki wzrostu są oceniane jako 1 punkt. Średnie wyniki zapadnięcia są obliczane dla każdego zabiegu.

2. Barwienie immunologiczne β amyloidu

  1. Hoduj neurony korowe myszy przez 3 dni, jak opisano w kroku 1.2.
  2. Traktować zagregowanym Aβ1-42 (5 μM) lub podłożem przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
  3. Nie usuwając pożywki, dodać równą objętość 4% paraformaldehydu zawierającego 4% sacharozy w PBS do każdej studzienki i utrzymywać kulturę w temperaturze 37 °C na gorącej płycie przez 5 minut.
  4. Zastąp roztwór 400 μl 4% paraformaldehydu zawierającego 4% sacharozy w PBS i utrzymuj w temperaturze 37 °C na płycie grzejnej przez 1 godzinę. Ten protokół fiksacji został zmodyfikowany w stosunku do poprzedniego raportu34.
  5. Umyj neurony 3 razy za pomocą PBS.
  6. Blok z 5% normalną surowicą kozią w PBS.
  7. Inkubować neurony z mysią antyamyloidem β immunoglobuliną G (IgG) (1:50) i 1% albuminą surowicy bydlęcej w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Umyj neurony 3 razy za pomocą PBS.
  9. Inkubować neurony z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorescencją (1:400) i 1% albuminą surowicy bydlęcej w PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  10. Umyj neurony 3 razy PBS i zamontuj je za pomocą wodnego podłoża montażowego.
  11. Rejestruj obrazy fluorescencyjne i obrazy jasnego pola z ukośnym oświetleniem, używając 40-krotnej suchej soczewki obiektywowej na odwróconym mikroskopie B.

3. Barwienie immunologiczne aksonów27

  1. Przemyj neurony 3 razy PBS po ustabilizowaniu neuronów w hodowli, jak opisano w kroku 1.3.3.
  2. Inkubuj neurony z mysim anty-tau-1 IgG (1:500), króliczym białkiem 2 związanym z antymikrotubulami (MAP2) IgG (1:500) w 5% normalnej surowicy koziej i 0,3% t-oktylofenoksypolietoksyetanolem w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Umyj neurony 3 razy za pomocą PBS.
  4. Inkubować neurony z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi (1:400) i 0,3% t-oktylofenoksypolietylenem w PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  5. Umyj neurony 3 razy PBS i zamontuj za pomocą wodnego podłoża mocującego.
  6. Rejestruj obrazy fluorescencji i różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) za pomocą 20× suchej soczewki obiektywowej w odwróconym mikroskopie A.

4. Obrazowanie na żywo komórek27

  1. Pokryj naczynia szklane 500 μl PDL (5 μg/ml), jak opisano w kroku 1.1.1.
    UWAGA: W tym protokole użyto domowych naczyń szklanych. Dostępne na rynku naczynia szklane mogą być również używane do obrazowania na żywo. Domowe naczynia szklane przygotowywano w następujący sposób: 1) za pomocą ręcznego dziurkacza wykonać otwór o średnicy około 1,4 mm w środku naczynia o średnicy 35 mm oraz 2) przymocować szklane szkiełko nakrywkowe (o średnicy 22 mm) z tyłu naczynia za pomocą silikonu.
  2. Umyć płytki wodą destylowaną, jak opisano w kroku 1.1.2, i wyhodować neurony korowe w szklanym naczyniu w temperaturze 3 x 104 komórki/naczynie z pożywką A, jak opisano w kroku 1.2.
  3. Po 4 dniach hodowli komórkowej zastąp pożywkę 2 ml nowej pożywki B i przenieś naczynie do odwróconego mikroskopu A. Utrzymuj kulturę w wilgotnej atmosferze 10% CO2 w temperaturze 37 °C.

5. Eksperyment z endocytozą

  1. Posadź neurony korowe myszy zgodnie z opisem w kroku 1.2.
  2. Cztery dni później zastąp pożywkę 100 μl nowej pożywki B zawierającej 20 μM sondy z membraną fluorescencyjną na 1 minutę.
  3. Dodać 1 μl 0,05 mM zagregowanego roztworu Aβ1-42 (końcowe 0,5 μM) lub nośnika (woda destylowana) i wymieszać pipetując. Inkubować przez 20 minut.
  4. Usunąć pożywkę i dwukrotnie umyć studzienki pożywką B, która została wstępnie podgrzana do temperatury 37 °C.
  5. Napraw, umyj i zamontuj neurony zgodnie z opisem w krokach 1.3.3 i 1.3.4.
  6. Rejestruj obrazy fluorescencyjne i DIC za pomocą obiektywu olejowego 63X na odwróconym mikroskopie A.
  7. Określ ilościowo gęstość obszaru dodatniego sondy membrany fluorescencyjnej w każdym zdrowym stożku wzrostu za pomocą oprogramowania do obrazowania.

6. Transfekcja genów

  1. Przygotuj neurony korowe zgodnie z opisem w kroku 1.2. Po wykonaniu kroków od 1.2.1 do 1.2.10 należy odwirować neurony przy stężeniu 178 x g przez 3 minuty.
  2. Usunąć sklarowany osad, dodać 4 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (CMF-HBSS) wolnego od Ca2+ i Mg2+ i wymieszać pipetując.
  3. Odwirować komórki przy sile 178 x g przez 3 minuty.
  4. Usunąć supernatant, dodać 4 ml CMF-HBSS i wymieszać pipetując. Następnie oblicz gęstość komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.2.10.
  5. Przenieść 5 x 106 komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1,677 x g przez 1 min.
  6. Usunąć supernatant, dodać 100 μl roztworu do transfekcji z suplementem i 3 μg plazmidu DNA kodującego C-koniec EGFP lub EGFP-AP180 i wymieszać pipetując.
  7. Przenieść powyższy roztwór (krok 6.6) do certyfikowanej kuwety i przetransfekować za pomocą elektroporatora, zgodnie z protokołem producenta.
  8. Natychmiast po transfekcji dodać 500 μl pożywki A do kuwety i przenieść roztwór do probówki o pojemności 1,5 ml z certyfikowaną pipetą. Następnie oblicz gęstość komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.2.10.
  9. Hodować komórki na 8-dołkowym szkiełku hodowlanym w temperaturze 0,8 x 104 komórki/basenik, jak opisano w krokach 1.2.11 i 1.2.12.
  10. Po 4 dniach hodowli komórkowej wykonaj test zapadania się zgodnie z opisem w kroku 1.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, Aβ1-42 inkubowano w temperaturze 37 °C przez 7 dni przed użyciem, ponieważ inkubacja Aβ1-42 była potrzebna do wytworzenia form toksycznych27,28,30,35. Po tej inkubacji zaobserwowano zagregowane formy Aβ (Rysunek 1A). Doniesiono, że podobna inkubacja Aβ1-42 wytworzyła formę fibrylową Aβ36. Po leczeniu t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym badaniu umożliwił obserwację wczesnych zjawisk w stożkach wzrostu aksonów po leczeniu Aβ1-42. Aβ1-42 indukował endocytozę w aksonalnych stożkach wzrostu w ciągu 20 minut, a zapadnięcie się stożka wzrostu obserwowano w ciągu 1 godziny od zabiegu. W tej endocytozie prawdopodobnie pośredniczyła klatryna. Dzięki zastosowaniu tego protokołu potwierdzono, że hamowanie endocytozy za pośrednictwem klatryny zapobiega zapadaniu się stożka wzrostu wywołanemu przez Aβ1-42 i zwyrodnieniu aksonów w hodowanych ne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty badawcze z JSPS (KAKENHI 18K07389), Japonia, Takeda Science Foundation, Japonia, oraz Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japonia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ddY myszySLC
Ośmiodołkowy szkiełko hodowlaneFalcon354108
poli D lizynaWako168-19041
Pożywka hodowlana, pożywka neurobazalnaGibco21103-049
surowica domowaGibco26050-088
glukozaWako049-31165
L-glutaminaWako074-00522
0,05% trypsynaGibco25300-054
DNase IWorthingtonDP
inhibitor trypsyny sojowejGibco17075-029
Filtr z 70 &mikro; m rozmiar oczek, sitko komórkoweFalcon352350
B-27 suplementGibco17504-044
CO2 inkubatorAstecSCA-165DS
Amyloid β 1-42Sigma-AldrichA9810
paraformaldehydWako162-16065
sacharoza Wako196-00015
Wodne medium montażowe, Aqua-Poly/Mount polysciences18606-20
Mikroskop odwrócony ACarl ZeissAxio Observer Z1 Połączony z AxioCam MRm, jednostką grzewczą XL S, modułem CO2 S1 i modułem TempModule S1
Obiektyw Plan-Apochromat 20xCarl Zeiss420650-9901
Obiektyw Plan-Apochromat 63xCarl Zeiss440762-9904
Obiektyw, CFI Plan Apo Lambda 40XNikon
anty-MAP2 IgGAbcamab32454
anty-tau-1 IgGChemiconMAB3420
anty-amyloid i przeciwciało betaIBL10379klon 11A1
normalna surowica koziaWako143-06561
albumina surowicy bydlęcejWako010-25783
t-oktylofenoksypolietylenWako169-21105
kozia anty-mysia IgG skoniugowana z AlexaFluor 594InvitrogenA11032
kozia anty-królicza IgG skoniugowana z AlexaFluor 488InvitrogenA11029
płyta grzejnaNISSINNHP-M30N
osłonoweFisher Scientific12-545-85
Naczynie 35 mmIWAKI1000-035
Silikonowy RTVShin-EtsuKE42T
Dziurkacz ręcznyRoper WhitneyNo. XX
Fluorescencyjna sonda membranowa, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- i Mg2+ bez Zbilansowany roztwór soli HanksaGibco14175-095
Roztwór transfekcyjny, roztwór NucleofectorLonzaVPG-1001
Elektroporator, Nucleofector IAmaxa
Mikroskop odwrócony BKeyenceBZ-X710
Oprogramowanie do obrazowania, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
szkło

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
  3. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  4. Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mount Sinai Journal of Medicine. 77 (1), 32-42 (2010).
  5. Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
  6. Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
  7. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
  8. Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535(2012).
  9. Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
  10. Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
  11. Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
  12. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
  13. Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
  14. Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
  15. Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
  16. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
  17. Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
  18. Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
  19. Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
  20. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  21. Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
  22. Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
  23. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
  24. Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
  25. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
  26. Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
  27. Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
  28. Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
  29. Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
  30. Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
  31. Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805(2017).
  32. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  33. Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
  34. De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
  35. Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
  36. Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
  37. Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
  38. Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
  39. Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
  40. Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
  41. Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
  42. Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
  43. Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
  44. Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
  45. Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

beta amyloidhodowla neuronalnaanaliza mikroskopowafiksacja kom rekimmunobarwieniemarker Tau 1marker MAP 2obrazowanie ywych kom rek

Powiązane artykuły