Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Summary

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Abstract

Zautomatyzowane mikroreaktory (15 ml) mogą być użytecznym narzędziem dla inżynierów zajmujących się hodowlą komórek. Ułatwiają one jednoczesne wykonywanie szerokiej gamy warunków eksperymentalnych, jednocześnie minimalizując potencjalną zmienność procesu. Zastosowania tego podejścia obejmują: badania przesiewowe klonów, zmiany temperatury i pH, optymalizację pożywek i suplementów. Co więcej, małe objętości reaktorów sprzyjają projektowaniu dużych eksperymentów, które badają szeroki zakres warunków. Pozwala to na znaczną optymalizację procesów poprzedzających przed zwiększeniem skali, w przypadku gdy zakres eksperymentów jest bardziej ograniczony ze względu na ograniczenia czasowe i ekonomiczne. Zautomatyzowane systemy bioreaktorów w mikroskali oferują różne zalety w porównaniu z tradycyjnymi jednostkami do hodowli komórkowych na małą skalę, takimi jak kolby do wytrząsania lub kolby obrotowe. Jednak podczas opracowywania procesu na skalę pilotażową należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby korzyści te zostały zrealizowane. Przy ostrożnym uruchomieniu system może umożliwić automatyzację na wysokim poziomie, można go zaprogramować do uruchamiania DOE z większą liczbą zmiennych i może skrócić czas pobierania próbek po zintegrowaniu z analizatorem składników odżywczych lub licznikiem komórek. Integracja przedstawionych tutaj heurystyk wywodzących się od ekspertów z obecnymi zautomatyzowanymi eksperymentami z bioreaktorami w mikroskali może zminimalizować powszechne pułapki, które utrudniają uzyskanie miarodajnych wyników. W skrajnych przypadkach nieprzestrzeganie przedstawionych tutaj zasad może prowadzić do uszkodzenia sprzętu, które wymaga kosztownych napraw. Ponadto systemy mikrobioreaktorów mają małe objętości hodowli, co utrudnia scharakteryzowanie warunków hodowli komórkowych. Liczba i ilość próbek pobieranych w trakcie procesu hodowli w trybie wsadowym jest ograniczona, ponieważ objętość robocza nie może spaść poniżej 10 ml. W ramach tej metody omówione zostaną zalety i wady systemów bioreaktorów w mikroskali.

Introduction

Przeciwciała monoklonalne (mAb) zostały po raz pierwszy wytworzone w mysich komórkach hybrydoma w 1975 roku¹. Od tego czasu nastąpił wzrost produkcji rekombinowanych białek w celu humanizacji mAb w celu zwiększenia bezpieczeństwa i skuteczności in vivo^2,3,4. Większość procesów produkcji białek rekombinowanych wykorzystuje komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) ze względu na łatwość, z jaką można je przystosować do pożywki wolnej od surowicy, ich zdolność do wytwarzania białek o podobnych modyfikacjach potranslacyjnych do wrodzonego białka ludzkiego oraz ich niezawodność jako komórek gospodarza^5,6.

Rośnie zapotrzebowanie na szybsze dostarczanie produktów dla większych populacji pacjentów o stałej jakości. Oprócz korzyści ekonomicznych, repertuar chorób leczonych za pomocą mAb rośnie, który obecnie obejmuje choroby autoimmunologiczne, powikłania potransplantacyjne, zapalenie stawów i nowotwory⁷. Średnie plony dla nowoczesnych komercyjnych linii produkcyjnych mAb mieszczą się zazwyczaj w zakresie 5-6 g/L i nadal rosną⁵. Częściowo udało się to osiągnąć dzięki inżynierii ogniw CHO i ulepszonemu badaniu przesiewowemu linii produkcyjnych przy użyciu bioreaktorów o wysokiej przepustowości⁸. Jednak większość wzrostu produkcji białka przypisuje się ulepszeniom procesów, w tym postępom w optymalizacji pożywek, warunkach hodowli komórkowych i ulepszonych strategiach żywienia^7,9,10. Suplementacja składników odżywczych jest niezbędna nie tylko dla prawidłowego wzrostu komórek, ale także dla wydajnej produkcji wysokiej jakości białka. Co więcej, komórki wymagają stechiometrycznego dodawania określonych składników odżywczych, co wymaga dodatkowej wiedzy w celu optymalizacji strategii żywienia^6,11. Tradycyjne metody optymalizacji obejmują miareczkowanie poszczególnych składników pożywki i mieszanie pożywek z projektami mieszanin. Metody te są jednak czasochłonne, pracochłonne i wiążą się z ryzykiem związanym z błędem ludzkim^12,13.

Badania nad optymalizacją mediów wcześniej opierały się na kolbach do wytrząsania i bioreaktorach o pojemności 1-2 litrów, które mogą być zbyt drogie pod względem surowców i kapitału ludzkiego. Zastosowano również mikropłytki, ale metody te zapewniają ograniczoną skalowalność. Co więcej, może to nadal wymagać wielu czasochłonnych przebiegów, które wprowadzają zmienność między partiami, która zasłania zmienność CQA spowodowaną składem podłoża i strategią podawania^14,15,16. W związku z tym pojawiło się zapotrzebowanie na wysokowydajne i wysoce spójne równoległe systemy bioreaktorów^17,18,19,20.

Biorąc pod uwagę znaczne koszty związane z eksploatacją tradycyjnych bioreaktorów laboratoryjnych (0,5-5 L), mikrobioreaktory stanowią redukującą koszty alternatywę dla oceny produkcji leków pochodzenia biologicznego. ²¹ Bioreaktory z mieszadłem na skalę laboratoryjną są niezawodne i dostarczają gęste dane za pomocą tablic sensorycznych. Systemy sterowania ze sprzężeniem zwrotnym pozwalają na łatwy nadzór nad pracą. Jednak montaż, kalibracja, czyszczenie, koszty pracy, koszty podłoża i wymagania dotyczące sterylizacji sprawiają, że bioreaktory laboratoryjne z mieszadłem są drogie i pracochłonne w eksploatacji. Kolby wstrząsowe i płytki do mikromiareczkowania eliminują niektóre koszty i problemy związane z pracą związaną z bioreaktorami na większą skalę, ale te alternatywy zapewniają słabą kontrolę nad warunkami przetwarzania i generują dane o niskiej gęstości, często tylko pomiary punktu końcowego. ²²

Alternatywnie, mikrobioreaktory wykorzystują małą objętość roboczą, aby zapewnić podejście do rozwoju linii komórkowych i procesów poprzedzających w dół. Skala eksperymentów z mikrobioreaktorami może znacznie obniżyć koszty eksploatacji dzięki mniejszemu wykorzystaniu energii, substratu, pracy, przestrzeni i mediów. ²³ Mikrobioreaktory są jak kolby do wytrząsania, ponieważ są łatwe w obsłudze ze względu na swoje rozmiary, ale zachowują zalety tradycyjnych bioreaktorów laboratoryjnych dzięki kontroli online pH, temperatury, rozpuszczonego tlenu i zużycia kwasu/zasady, a także wyprowadzaniu danych w czasie rzeczywistym dotyczących parametrów jakościowych, w tym składu gazu wyjściowego. Skala mikrobioreaktora pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe, które mogą być przydatne do selekcji klonów i opracowywania procesów. ²⁴

Wykazano, że zaawansowany bioreaktor mikroskalowy jest skutecznym narzędziem do charakteryzowania i rozwoju procesu hodowli komórek CHO¹⁸. W tym przypadku zautomatyzowany system ambr15, składający się z 48 mikrobioreaktorów połączonych równolegle, które okazały się porównywalne z klasycznymi reaktorami zbiornikowymi z mieszadłem w badaniach na dużą skalę, ²⁵ został użyty w sposób analogiczny do wcześniejszych prac, które zoptymalizowały skład pożywki dla linii komórkowej CHO-DG44 produkującej modelową chimeryczną klasę IgG16. Porównano i przeanalizowano wpływ różnych warunków pożywek na wzrost i miano. W artykule przedstawiono ogólne wytyczne dotyczące obsługi systemu mikrobioreaktora i analizy próbek pożywek surowych.

Protocol

1. Rozbudowa pociągu nasiennego

Uwaga: Ten protokół wykorzystuje 1 ml rekombinowanych komórek DG44 CHO, które były przechowywane w gęstości ~ 3 x 10⁷ komórek/ml. Rozcieńczenia i ramy czasowe dla poszczególnych linii komórkowych CHO będą się różnić. Zmierz wcześniej krzywe wzrostu linii komórkowej, która ma być użyta i odpowiednio dostosuj. Komórki są początkowo rozmrażane w kolbach wstrząsowych, a następnie przenoszone do kolby przędzarkowej. Określ liczbę kolb do wytrząsania i kolb obrotowych potrzebnych do eksperymentu w oparciu o liczbę mikrobioreaktorów, które zostaną uruchomione, oraz docelową gęstość wysiewu.

1. Szybko rozmrozić fiolkę (fiolki) z komórkami CHO, zanurzając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko mały odłamek lodu. Odkazić zewnętrzną stronę fiolki za pomocą 70% roztworu etanolu i niestrzępiącej się chusteczki. Przeniesienie do komory bezpieczeństwa biologicznego.
2. Ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść 1 ml do sterylnej 125 ml wentylowanej kolby wstrząsającej zawierającej 29 ml wstępnie podgrzanej pożywki uzupełnionej 8 mM L-glutaminą i 1x penicyliną/streptomycyną.
   nuta: O ile nie wskazano inaczej, termin "nośnik" w niniejszym protokole będzie dalej zdefiniowany jako nośniki OptiCHO.
3. Umieścić kolbę(-i) do wytrząsania w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C i 8% CO₂ . Użyj wytrząsarki orbitalnej, aby mieszać komórki z prędkością 130 obr./min.
4. Codziennie monitoruj gęstość żywotnych komórek (VCD) za pomocą automatycznego urządzenia do liczenia komórek lub ręcznie za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Subkulturować (rozcieńczać) komórki 72 godziny po inokulacji w świeżej pożywce (podgrzać pożywkę do 37 °C za każdym razem, gdy musi być dodana do komórek) tak, aby końcowa objętość wynosiła 100 ml w kolbie wirowej o pojemności 125 ml. Inkubować kultury przędzarki w tych samych warunkach, w jakich stosuje się kultury w kolbach wstrząsowych, z prędkością 70 obr./min.
   nuta: Po subhodowli komórki powinny mieć gęstość 0,7-1 x 10⁶ komórek/ml. Upewnij się, że końcowa gęstość nie jest mniejsza niż 0,5 x 10⁶ komórek/ml. Subhodowla po 96 godzinach, jeśli nie można osiągnąć docelowej gęstości komórek do inokulacji w wirówkach.
5. Trzeciego dnia (jeden dzień przed przygotowaniem inokulum) dodać świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę do kolby wirowej, aby utrzymać ≥ 90% żywotności. Nie przekraczać całkowitej objętości 125 ml. ⁶

2. Uruchamianie zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Wymagania wstępne: Użytkownik musi przejść odpowiednie szkolenie od producenta i musi być zaznajomiony z bezpieczeństwem i warunkami pracy systemu.

1. Inicjalizacja i nawiązywanie połączenia z licznikiem komórek
   1. Zainicjuj oprogramowanie operacyjne systemu. Przed otwarciem oprogramowania upewnij się, że licznik ogniw (patrz Tabela materiałów) działa wraz z odpowiednim oprogramowaniem. Licznik komórek jest zintegrowany z systemem.
   2. Połącz się ze zdalnym połączeniem licznika komórek przed otwarciem oprogramowania. Kliknij ikonę pulpitu zdalnego i kliknij "Połącz". Po podłączeniu zdalnego pulpitu otwórz oprogramowanie licznika komórek. Zainstaluj nowy pakiet odczynników, opróżnij korek błękitu trypanowego i zalej system.
   3. Zminimalizuj połączenie zdalne i otwórz oprogramowanie mikrobioreaktora, używając istniejącego eksperymentu jako szablonu do utworzenia nowego eksperymentu. Nazwij i zapisz eksperyment. Upewnij się, że automatyczny licznik komórek jest podłączony w zakładce stanu w oprogramowaniu. Stan można również sprawdzić w oprogramowaniu licznika komórek.
2. Definiowanie płyt i zbiorników załadowczych
   Uwaga: Proszę zapoznać się z Rysunek 1, aby zorientować się w ładowaniu materiałów eksploatacyjnych i odczynników na stacjach hodowlanych i pokładach. Płyty zaciskowe powinny być autoklawowane w cyklu grawitacyjnym (stosowanym do materiałów stałych) przed użyciem.
   1. Przed rozpoczęciem biegu zdefiniuj płyty używane podczas przebiegu w sekcji naśladowczej oprogramowania. Nazwij każdą użytą płytkę i oznacz każdą płytkę do pokładu na stacji hodowli mikrobioreaktorów.
   2. Użyj 24-dołkowej płytki do ładowania pożywek i umieść ją na wyznaczonym pokładzie stacji hodowlanej. Umieść pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1 ml i 4 ml w sekcjach zgodnie z ilustracją Rysunek 1.
   3. Umieścić 24-dołkową płytkę do zaszczepiania na odpowiednim pokładzie stacji hodowlanej. Umieść jednodołkową płytkę z buforem soli fizjologicznej (PBS) 1X na pokładzie 1. Umieścić jednodołkową płytkę NaOH 1 M na pokładzie 2, a 24-dołkową płytkę przeciwpieniącą na pokładzie 7 (pozycje wskazane na Rysunek 1). Numery talii są przedstawione schematycznie w zakładce "Naśladownictwo" w oprogramowaniu.
   4. Rozpakuj naczynia hodowlane (wyposażone w rozpylacz) wewnątrz pokrywy szafy bezpieczeństwa. Umieść dwanaście sterylnych naczyń hodowlanych na stacji hodowlanej. Umieść autoklawowane płytki zaciskowe na górze naczyń. Upewnij się, że otwory we wkładkach przewidzianych dla mieszadeł są skierowane w tym samym kierunku, co ułatwia umieszczanie.
      nuta: Za pomocą markera permanentnego skategoryzuj naczynia hodowlane przed umieszczeniem ich w stacji hodowlanej, aby zaoszczędzić czas i uniknąć nieporozumień w czasie zbiorów.
   5. O-ringi do płyt zaciskowych są pierwszą częścią, która ulega zużyciu po wielokrotnym autoklawowaniu, dlatego dokładnie sprawdź je przed autoklawowaniem przed każdym eksperymentem. Zaleca się przechowywanie sterylnej płytki zaciskowej jako kopii zapasowej w przypadku awarii pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym.
   6. Umieść płytki mieszające na wierzchu clamp płyty, upewniając się, że każdy kołek jest bezpiecznie włożony. Zabezpiecz clamp płytki za pomocą dostarczonych i pokręteł. Dokręć pokrętła, aż zostaną dokręcone ręcznie. Dokręcaj naprzemiennie lewe i prawe pokrętło, aby równomiernie umieścić płytę zaciskową.
      nuta: Jeśli zacisk nie przylega do powierzchni lub jeśli na końcu płyty zaciskowej są nierównomiernie dokręcone, naczynia będą miały problemy z kontrolą tlenu rozpuszczonego (DO). Jeśli te regulacje nie rozwiążą problemu z DO, sprawdź O-ringi, ponieważ niepełne uszczelnienie płyt może prowadzić do nieefektywnego gazowania kultury.
3. Uruchamianie oprogramowania automatycznego mikrobioreaktora
   Uwaga: Użyj zakładki "Kroki procesu", aby edytować lub tworzyć nowe kroki. Kroki muszą być indywidualnie zaprogramowane, aby rozpocząć i zatrzymać dowolny proces. Kliknij przycisk "Wstaw krok" na karcie kroków procesu, aby utworzyć nowe kroki, lub kliknij dwukrotnie istniejący krok, aby edytować ten krok. Kroki programu są podzielone na dziesięć głównych sekcji: uruchamianie, ładowanie pożywki, dodawanie środka przeciwpieniącego, kontrola DO/pH, dodawanie bazy tła, wstrzymane pH, inokulacja, 5-krotna liczba komórek, 10-krotna liczba komórek, pobieranie próbek analizatora składników odżywczych i wyłączenie stacji hodowli. Czas trwania pracy wynosi zwykle od 7 do 9 dni w przypadku uruchamiania w trybie wsadowym.
   1. System inicjuje się i sprawdza obecność odpowiednich naczyń. Zeskanuj kod kreskowy dostarczony z naczyniami hodowlanymi. Ten sam kod kreskowy można zastosować do stacji hodowlanych z pustymi naczyniami lub naczyniami, które nie są używane.
   2. System rozpocznie pracę z zaprojektowanym programem po sprawdzeniu sterowania DO, gazowania i innych połączeń.
      nuta: Użytkownik może kontynuować działanie programu, nawet jeśli wystąpi błąd, ale robi to na własne ryzyko i jeśli kontynuowanie nie zaszkodzi systemowi i nie przerwie eksperymentu. Na przykład, gazowanie może być wyłączone dla niektórych naczyń nieużywanych w eksperymencie, co objawi się błędem, ale można je ominąć.
4. Uruchamianie i ładowanie nośników
   1. Pierwszy dzień konfiguracji systemu lub dzień ładowania nośnika jest wyznaczony jako dzień 0 czasu hodowli.
   2. W sekcji uruchamiania najpierw załaduj końcówki do pipet, zarówno końcówki o pojemności 1 ml, jak i 4 ml, zgodnie z programem. Jeśli już umieszczone, kliknij kontynuuj. Umieść płytkę z podłożem, 1X PBS, 1 M NaOH, płytkę przeciwpieniącą, płytkę ładującą pożywkę i płytkę inokulacyjną w wyznaczonych pokładach lub, jeśli są już umieszczone, naciśnij kontynuuj, aby przejść do następnego kroku.
   3. W ramach protokołu uruchamiania rozpocznij kontrolę temperatury i ustaw temperaturę na 37 °C. Włącz mieszanie przy 1000 obr./min i monitor DO/pH.
   4. Następnie uruchom program ładowania nośników. Osoba zajmująca się obsługą cieczy w zautomatyzowanym systemie mikrobioreaktora będzie dozować pożywkę z płytki pożywki do naczyń hodowlanych zgodnie z mapowaniem w programie. Dodane medium to OptiCHO o różnych warunkach procesu.
      nuta: Do napełnienia jednego naczynia hodowlanego do pojemności (13 ml) potrzebne są dwie studzienki z płytki 24-dołkowej, ponieważ każda studzienka może pomieścić tylko 8 ml pożywki. Użyj 7-8 ml w każdej studzience, aby zapobiec zasysaniu powietrza, gdy media są mieszane przez manipulator cieczy przed ładowaniem.
   5. Po zakończeniu ładowania pożywki 35 μl środka przeciwpieniącego Ex-Cell zostanie dodane z płytki przeciwpieniącej do naczynia hodowlanego. Odczekać 30 minut, aby pożywka hodowlana została dobrze wymieszana, a optyczne czujniki DO/pH zostały uwodnione.
      nuta: Ta sama objętość środka przeciwpieniącego jest dodawana z przerwami przez cały czas hodowli, gdy wykryte jest pienienie. ⁶ Pianienie jest wykrywane wizualnie, a zbiorniki reaktora są codziennie sprawdzane pod kątem pienienia. Środek przeciwpieniący dodaje się natychmiast po wykryciu.
   6. Następnie włączana jest kontrola DO/pH, aby rozpocząć monitorowanie i rejestrowanie tlenu rozpuszczonego i pH pożywki. Pozwól, aby DO osiągnął nastawę 50%, co zajmuje co najmniej 2 godziny.
   7. Po zrównoważeniu tlenu rozpuszczonego włącz dodawanie zasad w tle, aby osiągnąć nastawę pH 7,1 dla wszystkich naczyń hodowlanych. Pozwól, aby DO i pH zrównoważyły się przez noc i były całkowicie nawodnione.
5. Wstrzymane pH — przesunięcie pH w dniu 1
   1. Następnego dnia (oznaczonego jako dzień 1) wykonaj wstrzymany krok pH, w którym analizowane są wybrane naczynia hodowlane i określane jest przesunięcie korekcyjne pH.
      nuta: Liczba naczyń pH, z których należy pobrać próbki w celu kompensacji pH, jest określana przez użytkownika. Próbka z każdego zbiornika reaktora może nie być konieczna, jeśli masz dobrą reprezentację populacji bioreaktora.
   2. Umieść płytki mocujące probówki na próbki na wyznaczonych pokładach i załaduj probówki do mikrowirówek z otwartymi i schowanymi obok nich nakrętkami. Osoba zajmująca się obsługą cieczy dozuje 600 μl płynu do hodowli komórkowych do probówki, zgodnie z mapą w programie.
   3. Natychmiast usunąć próbkę i zmierzyć pH na bioanalizatorze składników odżywczych, który został prawidłowo skalibrowany i dla którego przeprowadzono kontrolę jakości (patrz poniżej, "Codzienna analiza składników odżywczych i metabolitów").
      nuta: Próbki są badane pojedynczo, natychmiast po pobraniu, aby uniknąć zmian pH spowodowanych wystawieniem na działanie powietrza, ponieważ odgazowanie CO₂ z próbki może spowodować zmiany pH.
   4. Naciśnij "kontynuuj" po każdej próbce, w przeciwnym razie następny krok nie zostanie wykonany.
   5. Wprowadź do oprogramowania zewnętrzne wartości pH pochodzące z FLEX, automatycznie "kompilując" przesunięcia dla badanych naczyń. Ręcznie uśrednić przesunięcia uzyskane dla naczyń na próbki i wprowadzić liczbę w kolumnie przesunięcia pH użytkownika w zakładce "Dane zbiornika". Średnie przesunięcie zostanie następnie zastosowane do wszystkich statków. Pozwól, aby pH się wyrównało przez co najmniej 2-3 godziny, po czym można zaszczepić naczynia hodowlane.
6. szczepienie
   1. Po zmierzeniu VCD przenieść całą zawartość kolby wirowej (kolb) wirowej do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 250 ml i komórek osadu, wirując przez 10 minut przy 140 x g w temperaturze pokojowej. Zdekantować starą pożywkę i ponownie zawiesić w wystarczającej ilości świeżych pożywki, tak aby końcowa gęstość wynosiła 1x10⁶ komórek/ml po dodaniu inokulum do naczynia hodowlanego.
   2. Dodaj zawieszone komórki do wyznaczonego dołka sterylnej płytki 24-dołkowej z pokrywką. Dodać 3 ml inokulum do każdej studzienki, z czego 2 ml zostanie usunięte jako inokulum dla każdego naczynia hodowlanego.
   3. Umieść płytkę inokulum na wyznaczonym pokładzie wewnątrz kaptura. Upewnij się, że spryskałeś zewnętrzną część płytki inokulum z pokrywką 70% alkoholem przed umieszczeniem jej w kapturze.
7. Zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek
   1. Po zaszczepieniu pozwól naczyniom hodowlanym zrównoważyć się przez co najmniej godzinę. Po godzinie wykonaj krok 5-krotnej liczby komórek w programie. 5X wskazuje współczynnik rozcieńczenia używany do odczytu liczby komórek.
      Uwaga: 5-krotna liczba komórek jest używana początkowo, gdy komórki są w fazie opóźnienia. Po tym, jak komórki osiągną fazę wykładniczą, zostanie użyta 10-krotna liczba komórek. Na podstawie objętości próbki i rozcieńczalnika przyrząd automatycznie uwzględnia współczynnik rozcieńczenia i odpowiednio dostosowuje wartość końcową.
   2. Osoba zajmująca się cieczą najpierw dodaje 480 μl 1X PBS do kubka licznika komórek, a następnie dodaje 120 μl płynu do hodowli komórkowych z naczynia hodowlanego. Liczba komórek jest następnie odczytywana za pomocą automatycznego licznika komórek. Ten krok jest powtarzany dla wszystkich statków.
   3. Liczba komórek jest ostatnim krokiem dla 1 dnia czasu hodowli. Wraz z danymi dotyczącymi tlenu rozpuszczonego i pH, oprogramowanie rejestruje codziennie dane dotyczące liczby komórek (gęstość i żywotność komórek).
      nuta: Wyczyść kubek licznika ogniw co najmniej dwa razy w czasie trwania cyklu 70% IPA, aby zapobiec zatykaniu się przewodów. Linie i komora przepływowa są automatycznie czyszczone po każdym zliczeniu komórek.
8. Wstrzymane pH — przesunięcie pH w dniu 2
   1. W 2 dniu czasu hodowli powtórzyć etap "Wstrzymane pH", używając naczyń hodowlanych innych niż te, z których pobrano próbki podczas początkowego etapu pauzy pH.
      nuta: Pobranie większej ilości próbek populacji naczyń pod kątem wstrzymanego pH zapewni lepszą kompensację korekty pH. Dlatego nie należy pobierać próbek z tych samych naczyń, które są używane do zatrzymania pH z poprzedniego dnia.
9. Codzienna analiza składników odżywczych i metabolitów
   1. Próbki zostaną pobrane do analizy składników odżywczych od 2 dnia hodowli do końca eksperymentu i przeanalizowane za pomocą bioanalizatora składników odżywczych.
   2. Umieść płytki mocujące probówki na próbki na wyznaczonych pokładach i załaduj probówki do mikrowirówek z otwartymi i schowanymi obok nich nakrętkami. Osoba zajmująca się obsługą cieczy dozuje płyn z kultur komórkowych do probówki, jak zmapowano w programie.
      nuta: Przez kilka pierwszych dni (dni 2 - 4) ilość próbki pobranej z naczynia hodowlanego wynosi 300 μl. Roztwór rozcieńcza się 300 μl 1X PBS dozowanego przez osobę zajmującą się cieczami. Ma to na celu zachowanie objętości kultury i zapobieżenie spadkowi poziomu poniżej 10 ml. Dodatkowo, wartości składników odżywczych przez pierwsze kilka dni mieszczą się w zakresie wykrywania urządzenia po rozcieńczeniu.
   3. Umieść próbki w tacy analizatora, aby przeprowadzić analizę składników odżywczych.
      nuta: Zamrozić wszystkie próbki, które nie będą analizowane tego samego dnia.
10. Zamykanie systemu
    1. Aby zakończyć bieg, najpierw wyłącz kontrolę temperatury, a następnie mieszanie. Po drugie, zatrzymaj kontrolę DO/pH i dodawanie bazy w tle. Po trzecie, zatrzymaj wszystkie inne kontrolki. Na koniec zatrzymaj monitor systemu.
    2. Odkręć zacisk i płytki mieszające i wyjmij naczynia hodowlane. Wyczyść wnętrze stacji hodowlanej niestrzępiącą się chusteczką. Umieść płytki suszące na stacji hodowlanej i przykręć je.
       nuta: Cykl suszenia jest wymagany dla chłodzonej wersji systemu i nie jest konieczny dla standardowej wersji systemu.
    3. Wykonaj 2-godzinny cykl suszenia w programie. Wyczyść płytki zaciskowe za pomocą ultraczystej wody, a następnie 70% alkoholu izopropylowego (IPA), aby usunąć ewentualną skondensowaną ciecz w przewodach. Przepłukać powietrzem, aby usunąć resztki płynu.
    4. Kliknij "Stop" w oprogramowaniu bioreaktora po zakończeniu cyklu suszenia.

3. Zbiór kultur komórkowych

1. Przenieś płyn do hodowli komórkowych z naczyń reaktora i komórek peletowych o sile 1,962 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Zdekantować supernatant. Za pomocą sterylnego filtra PVDF 0,22 μm przefiltruj zdekantowany płyn do hodowli komórkowych.
3. Podwielokrotność 1 ml sterylnego płynu do hodowli komórkowych rozlać do 1,5 ml probówek Eppendorfa w celu analizy miana. Przechowywać probówki o pojemności 1 ml w temperaturze -20 °C. Resztę zebranego płynu do hodowli komórkowych należy oczyścić za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek. ⁶

4. Pomiar miana IgG

Uwaga: To jest pobieżny przegląd uruchamiania i analizowania próbek za pomocą systemu biosensorów białkowych. Wszystkie parametry badania (np. temperatura, czas odczytu, prędkość obrotowa itp.) muszą być określone empirycznie dla każdego typu próbki.

1. Włącz system i pozwól lampie rozgrzać się przez co najmniej 1 godzinę. Wyjmij próbki z zamrażarki do rozmrożenia i wyrównaj do temperatury pokojowej.
2. W oprogramowaniu systemowym ustaw temperaturę płytki na 26 °C. Wstępnie namocz liczbę końcówek białka A, które mają być użyte w matrycy próbki (np. pożywce komórkowej) przez co najmniej 30 minut.
   nuta: Optymalna temperatura musi być określona empirycznie. Zastosowano tu temperaturę 26 °C, aby zminimalizować parowanie próbki podczas dłuższych czasów analizy i umożliwić urządzeniu utrzymanie stałej temperatury (o kilka stopni powyżej temperatury otoczenia). Próbki muszą być wstępnie zrównoważone do wybranej temperatury testu przed pomiarem poprzez inkubację płytki próbki na stoliku próbki przez ≥ 10 minut.
3. Zbuduj krzywą wzorca białka, używając tego samego przeciwciała stężonego do 10 mg/ml i seryjnie rozcieńcz w matrycy próbki (tj. pożywce) w zakresie, który ma zostać wykryty.
   nuta: Ważne jest, aby uzyskać wysokie stężenie przeciwciała, aby zminimalizować efekty matrycy spowodowane rozcieńczeniem, ale ważne jest również, aby nie zagęszczać nadmiernie przeciwciała i nie indukować agregacji. Preferowane jest przeprowadzenie standardowej krzywej w płycie dla każdej płytki próbki. W minimalnym stopniu należy zastosować kontrolę dodatnią, aby uwzględnić zmienność między wierzchołkami i między płytkami. Dla każdej nowej partii użytych końcówek białka A należy wygenerować nową krzywą wzorcową.
4. Zaprojektuj przykładową płytkę (dla przykładu, zobacz Rysunek 2). W teście białka A, który wykorzystuje regenerację, można przeanalizować do 80 próbek, w tym nieznane próbki hodowli, wzorce i kontrole. Dla każdej analizowanej płytki pojedyncza końcówka białkowa A zostanie użyta do zmierzenia do 10 próbek na całej płytce (kolumny 1-10), z cyklem regeneracji pomiędzy każdą próbką.
   nuta: Zaleca się, aby cały pierwszy rząd tabliczki (rząd A) był używany jako kontrola ujemna i odniesienie. W omawianym tutaj teście rzędy B i C stosuje się do dwóch kontroli dodatnich; jeden na dolnej i jeden na górnej granicy odpowiedzi liniowej. Dzięki temu każda końcówka mierzy kontrole ujemne i dodatnie przed analizą próbek. Taka konfiguracja upraszcza również odejmowanie referencji w oprogramowaniu analitycznym. Pozostałe studnie są następnie wykorzystywane do pobierania nieznanych próbek. Jeżeli w jednym z rzędów znajduje się przerwa na próbkę, musi ona znajdować się w tym studzience matrycy, aby zapobiec wysuszeniu końcówki (tj. studzienki od A2 do G2 mają próbkę, podczas gdy H2 jej nie ma. Upewnij się, że H2 zawiera matrycę próbki, aby upewnić się, że końcówka nie wysycha przed przystąpieniem do pobierania próbki H3). Wreszcie, nie wyczerpuj końcówek, używając jednego zestawu do analizy wielu płyt. Zaleca się stosowanie nowego, nieregenerowanego zestawu dla każdej płyty.
5. Przygotować próbki do analizy, delikatnie mieszając, przez odwrócenie lub pipetowanie, a następnie wirując impulsowo w celu pobrania próbki na dno probówki. W przypadku próbek skoncentrowanych należy utworzyć odpowiednie kontrpróby rozcieńczenia, rozcieńczając je w matrycy próbki.
   nuta: Liniowy zakres wiązania przeciwciała dla pomiarów interferometrii biowarstwy białka A (BLI) będzie się różnić zarówno w zależności od przeciwciała, warunków testu, jak i matrycy. Należy to wcześniej określić empirycznie, aby zapewnić zastosowanie odpowiednich rozcieńczeń próbki.
6. Przygotować 96-dołkowe płytki z próbkami jak najbliżej czasu testu. Upewnij się, że w żadnej ze studzienek nie ma pęcherzyków powietrza. Usunąć pęcherzyki powietrza czystą końcówką pipety lub przez odwirowanie.
7. Załaduj płytkę do systemu i uruchom test przy użyciu domyślnego "Testu o wysokiej czułości z regeneracją" w oprogramowaniu do akwizycji danych. Analiza za pomocą oprogramowania do analizy danych HT.
   nuta: Jeśli płytki mają być przygotowane z wyprzedzeniem ze względu na ograniczenia, należy je szczelnie uszczelnić folią, aby zapobiec parowaniu. W zależności od oczekiwanych mian, może być konieczne dostosowanie wskaźników i czasów akwizycji. Zapoznaj się z instrukcją, aby uzyskać wskazówki.
8. Korzystając z oprogramowania do analizy danych, odejmij odniesienie i oblicz stężenie nieznanych próbek za pomocą krzywej standardowej i funkcji nachylenia początkowego (IS) z liniowym dopasowaniem punkt-punkt.

Results

Monitorowanie krytycznych parametrów procesu i innych parametrów hodowli komórkowych podczas działania kultur komórkowych jest ważnym aspektem w bioprzetwarzaniu. Licznik komórek i analizator składników odżywczych wykorzystano do ilościowego określenia pięciu atrybutów, które charakteryzują wzrost komórek, zużycie składników odżywczych i tworzenie produktów ubocznych. Liczbę komórek uzyskiwano codziennie dla wszystkich warunków hodowli. Średnia gęstość i żywotność żywotnych komórek jest widoczna na Rysunek 3 wraz z ich interwałem SD ±1. Profile składników odżywczych i produktów ubocznych są również pokazane z odstępem ±1 SD w fazie stacjonarnej kultur. Nachylenie tego profilu reprezentuje średnie wskaźniki spożycia glukozy i glutaminy oraz produkcji mleczanu. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują na możliwość monitorowania tych atrybutów w systemie mikrobioreaktora; a także zdolność systemu mikrobioreaktora do utrzymania tych parametrów w wąskim zakresie.

Całkowita produktywność kultur komórkowych została określona ilościowo za pomocą systemu biosensorów białkowych, po tym jak zebrane podłoże do hodowli komórkowych zostało przepuszczone przez filtr PVDF o grubości 0,22 mikrona. Specyficzna wydajność na komórkę wahała się od 0,87 pg/komórkę-d do 1,15 pg/komórkę-d, jak widać na Rysunek 4. Na podstawie tych wyników można zbadać szeroki wachlarz warunków, aby wybrać skład pożywek i strategie żywienia, które maksymalizują ilość wytwarzanego białka przy minimalnej inwestycji w procedury eksperymentalne.

Rysunek 1: Układ systemu mikrobioreaktora z 4 stacjami hodowli (CS) z 12 zbiornikami reaktora każda. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykładowy zestaw płytki próbkowej do podstawowego eksperymentu ilościowego z regeneracją na systemie biosensorów białkowych.wiersz 1 (czerwony "R") jest zarezerwowany dla próbki referencyjnej (tj. matrycy bez analitu); wiersz 2 (akwamaryn) to zestaw wzorców (stężenia podane są w μg/ml); wiersze 3 i 4 (pomarańczowe) są zestawami niskich i wysokich kontroli dodatnich ("odpowiednio PL" i "PH"); Rzędy od 5 do 10 (fioletowe) zawierają nieznane próbki; wiersze 11 i 12 (szare) są domyślnymi pozycjami programu dla regeneracji ("R") i neutralizacji ("N"). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: a) Średnia gęstość żywotnych komórek i profile żywotności w zależności od wieku partii. Wykazano również, że ± 1 SD wskazuje na ścisłą kontrolę wzrostu komórek w systemach mikrobioreaktorów. b) Średni profil składników odżywczych dla glukozy i glutaminy, a także średni profil produktów ubocznych dla mleczanu. Wykazano również, że ± 1 SD wskazuje na ścisłą kontrolę nad składem mediów w systemach mikrobioreaktorów. (N=3, wszystkie warunki przeprowadzono w trzech egzemplarzach). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywny wykres pudełkowy średniej produktywności właściwej różnych warunków mediów. (N=3, wszystkie warunki zostały przeprowadzone w trzech powtórzeniach) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Prawidłowe i wydajne działanie zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów wymaga terminowego wykonania wielu zautomatyzowanych kroków. Jednym z najważniejszych elementów działania systemu jest programowanie oprogramowania. Jeśli podczas pisania programu wystąpi jakikolwiek błąd, w eksperymencie wystąpią poważne błędy, które mogą skutkować nieoczekiwanymi zmianami w procesie, strategii żywienia, strategii pobierania próbek lub jakości produktu końcowego, które mogą unieważnić wyniki badania. Innym ważnym aspektem działania systemu jest prawidłowe umieszczenie i dokręcenie płyty zaciskowej, aby zapewnić prawidłową kontrolę tlenu rozpuszczonego. Najczęstszą oznaką nierównomiernego dokręcenia płyty zaciskowej są nieoczekiwane zmiany w pomiarach DO dla zbiorników 1, 6, 7 i 12 (narożne zbiorniki reaktora). Ogólna niestabilność DO wskazuje na poluzowanie uszczelek na przewodach dolotowych gazu w płytach zaciskowych. Taki scenariusz może utrudnić osiągnięcie wartości zadanej tlenu rozpuszczonego. Inną powszechną pułapką, której należy unikać podczas rozpoczynania eksperymentu, jest pozostawienie komórek zbyt długo podczas etapu inokulacji, co powoduje ich osiadanie. Im mniej czasu komórki spędzają w pozycji siedzącej, tym mniejsza szansa, że stopniowo zmniejszająca się liczba komórek inokulum zostanie dodana chronologicznie do naczyń reaktora, co może wywołać znaczne odchylenie, które nieświadomie szkodzi wynikom badań. Lepiej jest zaszczepiać w wielu etapach, tj. zaszczepiać każdą stację hodowlaną jedna po drugiej, z przerwami pomiędzy nimi, aby komórki nie siedziały na płytce zaszczepiającej dłużej niż 15 minut.

Jeśli chodzi o codzienne użytkowanie, utrzymanie sterylności ma kluczowe znaczenie. Chociaż system znajduje się w komorze bezpieczeństwa biologicznego, sterylność nie jest gwarantowana ze względu na częste ruchy do i z kaptura. W związku z tym wszystko, co trafia do okapu, musi być spryskane 70% IPA. Po drugie, ważne jest, aby podczas hodowli wystąpiło minimalne pienienie; Media mogą zatykać przewody gazowe i wydechowe, prowadząc do uszkodzenia płyty zaciskowej, a nawet podstawowych elementów poniżej. Prewencyjne dodawanie środka przeciwpieniącego ma kluczowe znaczenie w każdym projekcie programu mikrobioreaktora. W przypadku "wypienienia się" korzystne byłoby przestrzeganie protokołu czyszczenia producenta, co może zapobiec trwałemu uszkodzeniu płyt zaciskowych. Alternatywnie, użycie naczyń bez spryskiwania może być korzystne w przypadku mniejszej gęstości komórek lub podczas pracy w trybie wsadowym, ponieważ wyższy stosunek powierzchni do objętości umożliwia wydajne dostarczanie tlenu nawet przy braku rozpylacza. Jednak naczynia bez rozprysku mogą nie być przydatne w hodowlach o dużej gęstości komórek lub perfuzji, ponieważ przestrzeń nad głową jest niewystarczająca, aby nadążyć za rosnącym zużyciem tlenu przez hodowle.

System mikrobioreaktora ma wiele zalet, ponieważ umożliwia równoległe prowadzenie wielu kontrolowanych kultur na małą skalę z większą kontrolą niż w przypadku kolb wstrząsowych. ¹⁷ W związku z tym system ułatwia przeprowadzanie badań przesiewowych, DoE, wysokoprzepustowych badań klonów i badań transfekcji. Zautomatyzowana obsługa cieczy zmniejsza również zmienność między analitykami, jednocześnie minimalizując żmudną i czasochłonną pracę przeszkolonego personelu. Chociaż system ma kilka zalet, istnieje kilka kluczowych wad, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, objętość hodowli wynosząca 15 ml znacznie ogranicza pobieranie próbek w trakcie procesu i końcowego materiału do zbioru, a ostatnio dostępnych jest wiele alternatywnych bioreaktorów na małą skalę (do 500 ml). Jednym z najnowszych osiągnięć systemu jest integracja zautomatyzowanego bioreaktora w mikroskali z analizatorem BioProfile FLEX 2 firmy Nova Biomedical, co łagodzi problem pobierania próbek w trakcie procesu poprzez zmniejszenie objętości próbki do analizy gęstości komórek i składników odżywczych. Korzyści mogą obejmować szybką konfigurację i praktycznie brak czyszczenia, co prowadzi do oszczędności operacyjnych, jednak koszt jednostek jednorazowych powinien być brany pod uwagę w przypadku projektów długoterminowych, ponieważ zakup jednostek może być droższy niż konwencjonalnych systemów wielokrotnego użytku.

Metoda omówiona w tym artykule nadaje się przede wszystkim do hodowli komórkowych w trybie wsadowym, ale może być modyfikowana w zależności od potrzeb użytkownika. Każda stacja hodowli posiada niezależną kontrolę temperatury, natomiast DO i pH mogą być zmieniane na poziomie poszczególnych zbiorników reaktora. Sartorius oferuje również oprogramowanie do planowania DoE, zaprojektowane specjalnie w celu umożliwienia dostosowania eksperymentów do systemu mikrobioreaktorów. Badania DoE na dużą skalę z wykorzystaniem nowego oprogramowania DoE dostarczonego przez producenta mogą pomóc w optymalizacji pożywek i suplementów. Chociaż system mikrobioreaktora nie jest tutaj stosowany, umożliwia również badania partii zasilających. System nie został jeszcze zoptymalizowany pod kątem perfuzyjnych hodowli komórkowych. Przeprowadzono jednak ograniczone badania i próby mające na celu naśladowanie operacji hodowli komórek perfuzyjnych w obecnym systemie mikrobioreaktorów. ²⁶ Metodę tę można zmodyfikować w celu naśladowania kultur perfuzyjnych o dużej gęstości poprzez osadzanie komórek. Zmieniając wysokość, na jaką pipeta jest wkładana do reaktora i optymalizując czas stabilizacji, pożywka może być usuwana i uzupełniana, aby odzwierciedlić tryb obfitości hodowli. W tym rozwijającym się obszarze pojawiają się nowe produkty, które mogą działać lepiej niż przedstawiony tutaj system, jeśli pożądany jest tryb hodowli perfuzyjnej.

Podsumowując, badanie to demonstruje zastosowanie zautomatyzowanych mikrobioreaktorów i związanych z nimi analiz w operacjach hodowli komórek CHO w celu wytworzenia i scharakteryzowania modelowego przeciwciała monoklonalnego IgG1. Podkreślono w nim rolę, jaką mikrobioreaktory na małą skalę odgrywają w produkcji bioprocesowej oraz ich wpływ na rozwój kultur komórkowych i badania przesiewowe pożywek. Chociaż korzystanie ze zautomatyzowanych systemów na małą skalę ma wiele zalet, aby w pełni wykorzystać ich korzyści, konieczne jest zrozumienie procesu i charakterystyka analityczna. Badanie to dostarcza użytkownikowi wskazówek dotyczących korzystania ze zautomatyzowanego systemu reaktora w mikroskali, który może być rozwijany i ulepszany zgodnie z indywidualnymi potrzebami badawczymi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO DG44 Linia komórkowa	Invitrogen	A1100001
Zautomatyzowany system mikrobioreaktorów AMBR 15 Automatyczny mikrobioreaktor	Sartorius	001-2804	Kultura
komórkowa AMBR 15 Jednorazowe bioreaktory - Sparged	Sartorius	001-2B80
1 ml jednorazowe końcówki do pipet, sterylizowane	Pipeta jednorazowa Sartorius	A-0040
5 ml końcówki, sterylizowane	Sartorius	A-0039
24 Płytki głębinowe	Sartorius	A-0038
1 Płytki studzienne	Sartorius	A-0068
Licznik komórek Vi-Cell XR	Beckman Coulter	731050	automatyczny licznik komórek
EX-CELL  Przeciwpieniący (napromieniowany promieniami gamma)	Sigma-Aldrich	59920C-1B
CD OptiCHO AGT Medium	Thermo Fisher Scientific	A1122205
200 mM L-glutamina	Corning	25-005-CV
100X Penicylina/Streptomycyna	Corning	30-001-CI
125 mL Termosy z dnem F (sterylne, wentylowane)	Fisher Scientific	PBV12-5
Szklane kolby obrotowe 125 ml	Corning Life Sciences Glass	4500-125
250 mL PP Stożkowe probówki wirówkowe (sterylne)	Nalgene (Thermo Scientific)	376814
Automatyczny licznik komórek TC20	BioRad Laboratories, Inc.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
10x PBS	Corning	46-013-CM
BioProfile FLEX Analyzer	Nova Biomedical	49418	Analizator składników odżywczych
Octet Red 96	Pall Forté Życiorys	99-0042	Białko A Biosensor
Białko A Zanurz i odczyt Biosensory	Pall Forté Życiorys	18-5010
Polipropylenowa 96-dołkowa mikropłytka, F-bottom, kominowa,	Greiner Bio-One	655209