Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

DOI:

10.3791/58240

⸱

27 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar oscylacji w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki jest ważny dla odkrycia mechanizmów działania zegarów biologicznych. Chociaż masowe ekstrakty przygotowane z jaj Xenopus laevis były skuteczne w analizowaniu sieci biochemicznych leżących u podstaw progresji cyklu komórkowego, ich średni pomiar zespołu zazwyczaj prowadzi do stłumionych oscylacji, pomimo utrzymania każdego pojedynczego oscylatora. Wynika to z trudności w idealnej synchronizacji między poszczególnymi oscylatorami w hałaśliwych systemach biologicznych. Aby odtworzyć dynamikę pojedynczej komórki oscylatora, opracowaliśmy sztuczny system komórkowy oparty na kropelkach, który może odtwarzać cykle mitotyczne w przedziałach przypominających komórki, zawierających cykliczne ekstrakty cytoplazmatyczne z jaj Xenopus laevis. Te proste komórki cytoplazmatyczne wykazują ciągłe oscylacje przez ponad 30 cykli. Aby zbudować bardziej skomplikowane komórki z jądrami, dodaliśmy zdebłonowaną chromatynę plemników, aby wywołać samoorganizację jąder w systemie. Zaobserwowaliśmy okresową progresję kondensacji/dekondensacji chromosomów i rozpadu/reformacji obwiedni jąder atomowych, jak w prawdziwych komórkach. Oznacza to, że oscylator mitotyczny działa wiernie, kierując wieloma dalszymi zdarzeniami mitotycznymi. Równolegle śledziliśmy dynamikę oscylatora mitotycznego i dalszych procesów w poszczególnych kropelkach za pomocą wielokanałowej poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Sztuczny system cyklu komórkowego zapewnia wysokowydajne ramy do ilościowej manipulacji i analizy oscylacji mitotycznych z rozdzielczością pojedynczej komórki, co prawdopodobnie dostarcza ważnych informacji na temat mechanizmów regulacyjnych i funkcji zegara.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakty cytoplazmatyczne przygotowane z jaj Xenopus laevis stanowią jeden z najbardziej dominujących modeli do biochemicznych badań cykli komórkowych, biorąc pod uwagę dużą objętość oocytów, szybki postęp cyklu komórkowego i zdolność do odtwarzania zdarzeń mitotycznych in vitro1,2. System ten pozwolił na wstępne odkrycie i mechanistyczną charakterystykę podstawowych regulatorów cyklu komórkowego, takich jak czynnik sprzyjający dojrzewaniu (MPF), a także dalsze procesy mitotyczne, w tym składanie wrzeciona i segregacja chromosomów1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Ekstrakty z jaj Xenopus zostały również wykorzystane do szczegółowej analizy sieci regulacyjnych cyklu komórkowego clock8,12,13,14 oraz do badań punktu kontrolnego uszkodzenia/replikacji DNA15 oraz punktu kontrolnego zespołu wrzeciona mitotowego16,17,18.

Te badania cykli komórkowych z użyciem ekstraktów z jaj Xenopus opierały się głównie na pomiarach masowych. Jednak konwencjonalne masowe testy reakcji mogą nie naśladować rzeczywistych zachowań komórek, biorąc pod uwagę dużą rozbieżność w ich wymiarach i subkomórkowym przestrzennym podziale cząsteczek reakcyjnych. Co więcej, masowe pomiary aktywności mitotycznej mają tendencję do podawania ograniczonej liczby cykli przed szybkim tłumieniem8. Te wady reakcji masowych uniemożliwiły systemowi ekstrakcji dalsze zrozumienie złożonych właściwości i funkcji dynamicznych zegara. Ostatnie badania zamknęły bezkomórkowe ekstrakty Xenopus z zatrzymanym czynnikiem cytostatycznym (CSF)19,20 w zdefiniowanych rozmiarach przedziałach przypominających komórki, co pomogło wyjaśnić, w jaki sposób rozmiar wrzeciona jest modulowany przez objętość cytoplazmatyczną. Jednak ten system in vitro jest zatrzymywany w metafazie mejozy II przez działanie czynnika cytostatycznego1, a do dalszych badań oscylatora cyklu komórkowego potrzebny jest system zdolny do długotrwałych, utrzymujących się oscylacji na poziomie pojedynczej komórki.

Aby badać oscylacje cyklu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki, opracowaliśmy wysokoprzepustowy system do rekonstytucji i jednoczesnego pomiaru wielu samopodtrzymujących się mitotycznych procesów oscylacyjnych w pojedynczych kropelkach mikroemulsji. W tym szczegółowym protokole wideo demonstrujemy tworzenie sztucznego systemu oscylacji mitotycznych poprzez enkapsulację cyklicznej cytoplazmy jaj Xenopus laevis w mikroemulsjach o rozmiarach od 10 do 300 μm. W tym systemie udało się odtworzyć oscylacje mitotyczne, w tym kondensację i dekondensację chromosomów, rozpad i reformację otoczki jądrowej oraz degradację i syntezę substratów anafazowych (np. securyny-mCherry w tym protokole).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Przygotowanie materiałów do rekonstytucji i detekcji cyklu komórkowego

  1. Klonowanie zespołu Gibsona w celu budowy plazmidowego DNA i oczyszczania mRNA securin-mCherry
    1. Przygotuj trzy fragmenty DNA, w tym szkielet wektora pMTB2, sekurynę i mCherry poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i oczyszczanie żelu21,22.
    2. Zmierzyć stężenia fragmentów za pomocą fluorospektrometru. Połącz 100 ng szkieletu z wkładkami sekuryny i mCherry w stosunku molekularnym 1:1:1 i dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować całkowitą objętość reakcji do 5 μl.
    3. Przygotuj 6 ml 5x buforu reakcyjnego zespołu izotermicznego z 3 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 μL 1 M MgCl2, 600 μL 10 mM dNTP, 300 μL 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000 i 20 mg NAD23.
    4. Dodać połączone fragmenty do 15 μl 1x podwielokrotności buforu reakcyjnego zespołu izotermicznego. Inkubować reakcję w probówce reakcyjnej do PCR w temperaturze 50 °C przez 15 minut.
    5. Przygotuj 0,8% żel agarozowy i uruchom pod napięciem 10 V/cm, aby sprawdzić skuteczność wyżarzania tych fragmentów.
    6. Oczyść zbudowany plazmid i eluuj za pomocą 15 μl wody wolnej od RNaz. Przekształć 1 μl oczyszczonego plazmidowego DNA w 50 μl komórek E. coli kompetentnych DH5α24 do wykorzystania w przyszłości.
    7. Ekstrahuj i oczyść plazmidowe DNA securin-mCherry z komórek E. coli kompetentnych DH5α.
    8. Transkrybuj zlinearyzowane DNA plazmidu sekuryny-mCherry na mRNA i oczyść mRNA. Za pomocą spektrofotometru sprawdzić, czy stężenie mRNA przekracza 100 ng/μl, a stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm wynosi około 2,0.
  2. Przygotowanie zdemembranowanego DNA plemnika Xenopus laevis<br /> UWAGA: Na podstawie Murray 19911.
    1. Poddaj eutanazji dorosłego samca Xenopus laevis25 i wypreparuj jądra czterech samców żab26,27.
    2. Umieść jądra czterech żab na tej samej 100 ml szalce Petriego. Przepłukać jądra trzykrotnie w 50 ml zimnego roztworu 1x MMR (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).
    3. Usunąć nadmiar krwi i tłuszczu z jąder na 100 ml szalki Petriego, a następnie przemyć dwukrotnie w zimnym buforze do przygotowania jądrowego (NPB) (250 mM sacharozy, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,5 mM trichlorowodorku spermidyny, 0,2 mM tetrachlorowodorku sperminy).
    4. Usunąć bufor do przygotowania jądra (NPB) i pokroić jądra na kawałki o długości mniejszej niż 0,2 cm za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych na 100 ml szalki Petriego. Dodaj 8 ml zimnego NPB do jąder w celu dalszego rozkładu.
    5. Użyj nylonowych tkanin siatkowych o wielkości porów 70 μm, aby przefiltrować jądra i pobrać próbkę nasienia do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odkręcać zebrane plemniki w temperaturze 1 730 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    6. Dostarczyć plemnikom 1 ml NPB i 50 μl lizolecytyny 10 mg/ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu demembranacji plemników.
    7. Przemyj zdemembranowane DNA plemników 10 ml zimnego NPB z 3% roztworem BSA trzy razy.
    8. Zmierz gęstość DNA plemników za pomocą hemocytometru.
    9. Zamrozić DNA plemników w 5 μl porcji w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Optymalne stężenie DNA plemników wynosi około 105 jąder/μl.
  3. Oczyszczanie białek z sygnału lokalizacji jądrowej GFP (GFP-NLS)
    1. Przekształć plazmid GFP-NLS oznaczony GST w kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3)5.
    2. Inkubować komórki bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie rozprowadzić na płytce z agarozą LB ze 100 μg/ml ampicyliny.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 14-18 godzin, aby wyhodować komórki w pojedyncze kolonie. Pobrać i zaszczepić pojedyncze kolonie w 4 ml pożywki LB ze 100 μg/ml ampicyliny. Wstrząsać komórkami w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
    4. Przygotować autoklawowane podłoże YT (16 g bakto-tryptonu, 10 g ekstraktu bakto-drożdżowego, 5 g NaCl) i podgrzać podłoże YT do 37 °C.
    5. Zaszczepić 1 ml inkubowanych przez noc komórek w pożywce LB w 250 ml podgrzanej pożywki YT ze 100 μg/ml ampicyliny i wstrząsać przez 2 godziny w celu zwiększenia gęstości komórek.
    6. Mierz gęstość optyczną komórki (OD) co 30 minut za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm. Dodaj 0,1 mM IPTG do komórek, aby indukować ekspresję białka GFP-NLS, gdy wartość OD osiągnie 0,1.
    7. Wstrząśnij komórkami w temperaturze 18 °C przez noc, aby zmniejszyć tempo wzrostu komórek i umożliwić lepszą ekspresję i syntezę białek.
    8. Wirować komórki w temperaturze 34,524 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.
    9. Zawiesić osady komórkowe w 40 ml buforu PBS (dostarczanym z 800 μl lizozymu 50 mg/mL, 100 μl 0,2 M PMSF, 13,2 μl mieszaniny leupeptyny, pepstatyny i chymostatyny 10 mg/ml oraz 8 μl 0,5 M EDTA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    10. Rozbij komórki za pomocą sonikatora o częstotliwości 20 kHz przez 4 x 30 s, z 30-sekundowymi przerwami między każdą sonikacją, aby uwolnić ekspresję białka GFP-NLS.
    11. Wiruj w 20 000 x g przez 35 minut, aby usunąć uszkodzone komórki.
    12. Użyj chromatografii powinowactwa do ekstrakcji i oczyszczenia białka GFP-NLS.
    13. Przemyć zawiesinę z kulkami o objętości 1,5 ml trzykrotnie 15 ml buforu PBS i inkubować 250 ml lizatu z kulkami przez 4 godziny w temperaturze 4 °C z odwróceniem.
    14. Odkręć kulki o masie 2000 x g przez 5 minut i dodaj 10 ml roztworu myjącego (25 mM zasady Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl i 5 mM DTT) do kulek. Inkubować kulki w 700 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM zredukowanego glutationu i 5 mM DTT) z rotacją w temperaturze 4 °C. Zebrać podwielokrotność elucji o objętości 50 μL.
    15. Zmierz stężenie zebranego białka, uruchamiając Coomassie blue gel28.
    16. Eluować białka za pomocą kolumn PD-10 z 3 ml buforu magazynującego (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glicerolu, pH 7,7) poprzez wymianę buforową.

2. Przygotowanie cyklicznych ekstraktów z Xenopus

UWAGA: Ogólna procedura przygotowania ekstraktów jest zilustrowana w Rysunek 1A. Na podstawie Murray 19911.

  1. Wstrzyknąć trzem dojrzałym samicom Xenopus laevis gonadotropinę surowicy ciężarnej klaczy o stężeniu 66 j.m. (PMSG) na 10 dni przed złożeniem jaj.
  2. Wstrzyknij tym żabom Xenopus 500 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) w celu wywołania składania jaj na 18 godzin przed przygotowaniem ekstraktów rowerowych.
  3. Wyrzuć złożone jaja na noc. Na podstawie eksperymentów (dane nie pokazane), ekstrakty przygotowane ze świeżo wyciśniętych jaj generują długotrwałą aktywność niż ekstrakty przygotowane ze złożonych jaj tej samej samicy żaby. Wyciśnij jaja każdej samicy żaby na 100-milimetrowe szalki Petriego zawierające 10 ml 0,2-krotnego buforu MMR i zbadaj pod mikroskopem stereoskopowym.
  4. Wyrzuć partie jaj, które mają niejasne granice między biegunami zwierzęcymi i roślinnymi lub mają nieregularne białe plamy na słupach zwierzęcych.
  5. Wybrać partię jaj od jednej samicy żaby prezentującej jednorodną populację jaj z wyraźnie zróżnicowanymi biegunami zwierzęcymi i roślinnymi i przenieść jaja do zlewki o pojemności 600 ml.
  6. Wylej nadmiar 0,2x buforu MMR i delikatnie dodaj 250 ml 2 g na 100 ml cysteiny (pH 7,7) do 1x buforu ekstraktu (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM sacharozy, pH 7,7) do jaj.
  7. Energicznie potrząśnij jajami ręcznie i usuń galaretki z jaj podczas trzech myć o łącznej objętości 800 ml buforu cysteinowego przez 3 minuty lub do momentu, gdy jaja zgromadzą się i osiądą na dnie zlewki, co wskazuje, że usunięcie galaretki zakończyło się pomyślnie.
  8. Umyj jajka 1 litrem 0,2x roztworu MMR ponad cztery razy.
  9. Zbieraj i wyrzucaj jaja, które stają się białe, za pomocą szklanej pipety transferowej.
  10. Wylać bufor MMR i dostarczyć jajom 200 ml 0,1 μg/ml roztworu jonoforu wapnia A23187 w 0,2 buforze MMR w celu aktywacji.
  11. Użyj szerokiej strony szklanej pipety, aby delikatnie wymieszać jajka, aż jaja zostaną aktywowane i usuń roztwór jonoforu wapnia.
  12. Sprawdź skuteczność aktywacji po tym, jak jaja osiądą na dnie zlewki. Dobrze aktywowane jaja mają około 25% bieguna zwierzęcego i 75% bieguna roślinnego.
  13. Umyj aktywowane jaja dwukrotnie 50 ml 1x buforu ekstraktu uzupełnionego inhibitorami proteazy (po 10 μg / ml leupeptyny, pepstatyny i chymostatyny).
  14. Ostrożnie przenieś jaja do mikroprobówki zatrzaskowej o pojemności 0,4 ml, a następnie zapakuj jaja przez wirowanie w temperaturze 200 x g przez 60 sekund, a następnie 600 x g przez 30 sekund.
  15. Usuń dodatkowy bufor z wierzchu jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura, aby zmniejszyć rozcieńczenie ekstraktów.
  16. Rozdrabniać jajka w temperaturze 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Przetnij rurki żyletką, aby oddzielić trzy warstwy zmiażdżonych jaj i utrzymać surową cytoplazmę w środkowej warstwie.
  18. Przenieś surową cytoplazmę do nowych probówek ultrawirówkowych i uzupełnij inhibitorami proteazy i cytochalazyną B w stężeniu 10 μg/ml każdy.
  19. Ponownie odwirować surową cytoplazmę w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 ° C przez 5 minut, aby dalej oczyścić cytoplazmę poprzez usunięcie nadmiaru lipidów i żółtka.
  20. Świeżo przygotowane ekstrakty należy przechowywać na lodzie.

3. Generowanie kropel

  1. Przygotowanie szklanej komory 2D
    UWAGA: Prostokątne szklane rurki służą jako komory, które ograniczają kropelki w jednej 2-wymiarowej płaszczyźnie, co pozwala na łatwiejszą obserwację i zbieranie danych.
    1. Pokrój prostokątne rurki szklane o wymiarze wewnętrznym 2 mm x 100 μm na kawałki o długości 4 mm. Użyj ostrej krawędzi osełki, zaznacz żądane granice na zewnętrznej powierzchni szklanej rurki za pomocą lekkich wytrawień, a następnie delikatnie dociśnij po obu stronach wytrawień, aby odłamać kawałki szklanych rurek.
    2. Podgrzej inkubator w suchej kąpieli do temperatury 95 °C. Wyjmij blok grzewczy i umieść go w eksykatorze próżniowym z poliwęglanu.
    3. Umieścić 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej 30 μl trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu w bloku grzewczym. Pocięte szklane rurki umieścić wewnątrz eksykatora próżniowego na wysokości około 5 cm od bloku grzewczego.
    4. Podłączyć eksykator do pompy próżniowej. Włącz pompę na 1 minutę, aby osiągnąć żądany poziom próżni, a następnie zamknij zawór 3-drogowy, aby uszczelnić eksykator i pozwól, aby para trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan pokryła wewnętrzną ściankę szklanych rurek. Stworzy to hydrofobowe środowisko do stabilizacji kropel.
    5. Pozostawić szklane probówki wewnątrz eksykatora w celu powlekania przez noc. Probówki będą gotowe do użycia następnego dnia.
  2. Wytwarzanie kropelek i obrazowanie
    UWAGA: Procedury generowania kropel i obrazowania zilustrowano na rysunkach 1B i 1C.
    1. Dostarcz ekstrakty przygotowane w kroku 2 z 10 ng/μl mRNA securin-mCherry do prostych eksperymentów z cyklem komórkowym tylko cytoplazmatycznym. Alternatywnie, podaj ekstrakty z demembranowaną chromatyną plemnika (250 na μl ekstraktu), 10 μM GFP-NLS białka i 10 ng/μL mRNA securin-mCherry, aby utworzyć kropelki wykazujące okresowe zmiany morfologii jąder.
    2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszaj 20 μl ekstraktu zaopatrzonego w rekombinowane białko lub mRNA z 200 μl 2% fluorosurfaktantu perfluoropolieterowo-glikolu polietylenowego (PFPE-PEG) w HFE7500 oleju fluorowanym.
    3. Generuj kropelki za pomocą miksera wirowego. Zakres rozmiarów kropel może być modulowany przez prędkość i czas trwania wiru. Aby wytworzyć kropelki o promieniu od 50 do 200 μm, należy ustawić prędkość wiru na 56 x g (3 200 obr./min przy promieniu 4,9 mm) i delikatnie docisnąć probówkę do mikrowirówki zawierającą mieszaninę ekstraktu i środka powierzchniowo czynnego na mieszalniku przez 3,5 sekundy. Sprawdź wzrokowo, czy kropelki są jednakowej wielkości.
    4. Za pomocą pipety o pojemności 20 μl przenieś unoszące się na wierzchu kropelki i równą objętość środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG do probówki PCR. Zanurz przygotowaną przez schodek rurkę w warstwie kropelek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i poczekaj, aż kropelki wypełnią około 75% probówki, a następnie wepchnij probówkę w dół do warstwy środka powierzchniowo czynnego, aż probówka zostanie całkowicie napełniona. Obniży to gęstość kropel i pozwoli kropelkom uformować jedną warstwę wewnątrz komory bez nakładania się lub zniekształceń kształtu spowodowanych przepełnieniem.
    5. Napełnij naczynie ze szklanym dnem o średnicy 40 mm olejem mineralnym. Zanurz rurki wypełnione kropelkami w oleju, delikatnie dociskając je w dół za pomocą drobnej pęsety.
    6. Po załadowaniu wszystkich próbek użyj szklanej pipety, aby usunąć wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub wyciekające kropelki. Dodaj więcej oleju mineralnego, jeśli rurki nie są lub nie będą całkowicie zanurzone w procesie obrazowania.
    7. Przeprowadzić obrazowanie kropel na mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stolik x-y (patrz tabela materiałów). Używaj obiektywu pneumatycznego 4X do wszystkich rodzajów obrazowania. Do obrazowania fluorescencyjnego należy użyć lampy rtęciowej o krótkim łuku o mocy 130 W jako fluorescencyjnego źródła światła do oświetlenia oraz zestawu filtrów GFP (wzbudzenie 482/35 nm i emisja 514/LP nm) i zestawu filtrów mCherry (wzbudzenie 562/40 nm i emisja 641/75 nm) do obrazowania sygnałów GFP-NLS i securin-mCherry.
    8. Nagrywaj filmy poklatkowe w jasnym polu i wielu kanałach fluorescencyjnych co 6 do 9 minut, aż kropelki stracą swoją aktywność.

4. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

  1. Segmentacja i śledzenie kropel
    1. Importuj zarejestrowane dane w formacie ".tif" lub ".oif" do oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów).
    2. Segmentuj pojedyncze krople za pomocą kanału jasnego pola. Obraz w jasnym polu pokaże kropelki jako jasne koła z ciemnymi granicami. Zastosuj progi do obrazu. Dodaj powierzchnię śledzenia do każdej kropli, dostrajając próg między ciemnymi i jasnymi pikselami tak, aby każda powierzchnia obejmowała cały obszar odpowiedniej kropli.
    3. Automatycznie śledź segmenty między sąsiednimi klatkami za pomocą algorytmu ruchu autoregresyjnego. Dostosuj dopuszczalną maksymalną odległość przemieszczania się kropli między dwiema sąsiednimi klatkami, aby była mniejsza niż promień większości kropel, aby dokładnie śledzić małe kropelki.
    4. Sprawdź wizualnie wszystkie ścieżki w całym filmie, aby wykryć nieprawidłowe segmentacje, które segmentują pustą przestrzeń między kroplami zamiast rzeczywistych kropel. Ręcznie usuń nieprawidłowe ścieżki.
    5. Segmentuj i śledź obszar tła bez żadnych kropel, aby uzyskać intensywność fluorescencji tła. Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, odejmij intensywność tła od intensywności fluorescencji kropel w każdej klatce czasowej.
    6. Eksportuj zmierzone parametry dla każdej ścieżki w czasie, w tym średnią i odchylenie standardowe intensywności fluorescencji oraz obszar kropli, do plików ".csv".
  2. Analiza danych dotyczących wielkości kropli i okresu oscylacji
    1. Załaduj pliki ".csv" do R, aby utworzyć wykresy intensywności fluorescencji w czasie dla każdej kropli. Zapisz identyfikator kropli w pliku ".csv".
    2. Zaimportuj pliki ".csv" wyeksportowane z oprogramowania analitycznego oraz plik ".csv" z listą identyfikatorów kropli do Matlaba i zapisz jako pliki ".mat" w celu dalszej analizy danych.
    3. Oblicz objętość skompresowanej kropli na podstawie informacji o wyeksportowanym obszarze kropli po segmentacji i wysokości szklanej komory19. Użyj objętości, aby obliczyć promień kropli jako kuli.
    4. Wyodrębnij punkty czasowe szczytów i minimów za pomocą algorytmu wykrywania szczytu/minimum. Wykonuj ręczne korekty położenia szczytów i dołków, aby upewnić się, że są one dokładnie wykrywane.
    5. Aby obliczyć okres cyklu komórkowego, oblicz czas interwału między dwoma sąsiednimi pikami. Weź średnią ze wszystkich przedziałów dla każdej kropli jako okres cyklu komórkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 2, pokazujemy, że ten protokół powoduje oscylacje mitotyczne zarówno w prostych, wolnych od jądra komórkach, jak i skomplikowanych komórkach z jądrami, gdzie oscylator napędza cykliczną przemianę powstawania i deformacji jąder. Krople pozbawione jąder generują oscylacje mitotyczne do 30 nietłumionych cykli w ciągu 92 godzin, na co wskazuje okresowa synteza i degradacja reportera fluorescencji sekuryny-mCherry (Rysunek 2A). Securi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy nowatorską metodę opracowania wysokoprzepustowego systemu sztucznej komórki, który umożliwia rekonstytucję in vitro i długoterminowe śledzenie samopodtrzymujących się oscylacji cyklu komórkowego na poziomie pojedynczej komórki. Istnieje kilka krytycznych kroków, które sprawiają, że ta metoda jest skuteczna. Po pierwsze, świeżo wyciśnięte jaja Xenopus o dobrej jakości, w porównaniu z jajami złożonymi, mają tendencję do wytwarzania ekstraktów o długotrwałej aktywności oscylacyjnej. Po drug...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Madeleine Lu za skonstruowanie plazmidu securin-mCherry, Lap Man Lee, Kenneth Ho i Allen P Liu za dyskusje na temat generowania kropel, Jeremy'emu B. Changowi i Jamesowi E. Ferrellowi Jr za dostarczenie konstrukcji GFP-NLS. Prace te były wspierane przez National Science Foundation (Early CAREER Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688) oraz Sloan Research Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Xenopus laevis żabyXenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep zestaw do miniprepQIAGEN27104
QIAquick PCR Purification Kit (250)QIAGEN28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiAmbionAM1340
BL21 (DE3)-T-1 kompetentna komórkaSigma-AldrichB2935
Jonofor wapniaSigma-AldrichA23187
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261Toksyczny
TrichloroSigma-Aldrich448931Toksyczny
(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan
PFPE-PEG Środek powierzchniowo czynny RanBiotechnologies008-FluoroSurfaktant-2wtH-50G
GE Opieka zdrowotna Glutation Sepharose 4B koralikiSigma-AldrichGE17-0756-01
Kolumna PD-10Sigma-AldrichGE17-0851-01
VitroCom miniaturowe rurki szklane VitroComVitroCom5012
Mikroskop stereoskopowy Olympus SZ61Mikroskop Olympus
Olympus IX83Mikroskop
Olympus FV1200Spektrofotometr Olympus
NanoDropThermofisherND-2000
0,4 ml mikroprobówki typu snap-capE& K Scientific485050-B
PureLink RNA Mini KitThermoFisher (Ambion)12183018A
Fisherbrand Analogowy mikser wirowyFisher Scientific2215365
ImarisBitplanew wersji 7.3Oprogramowanie do analizy obrazu
konfokalny Olympus

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788(2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6(2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253(2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689(2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System bezkom rkowykrople mikroemulsjioscylacje mitotycznemikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie time lapsesamomonta j drakondensacja chromosom wekstrakty cytoplazmatycznesystem oparty na kroplach

Powiązane artykuły