Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Ekstrakty cytoplazmatyczne przygotowane z jaj Xenopus laevis stanowią jeden z najbardziej dominujących modeli do biochemicznych badań cykli komórkowych, biorąc pod uwagę dużą objętość oocytów, szybki postęp cyklu komórkowego i zdolność do odtwarzania zdarzeń mitotycznych in vitro^1,2. System ten pozwolił na wstępne odkrycie i mechanistyczną charakterystykę podstawowych regulatorów cyklu komórkowego, takich jak czynnik sprzyjający dojrzewaniu (MPF), a także dalsze procesy mitotyczne, w tym składanie wrzeciona i segregacja chromosomów^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Ekstrakty z jaj Xenopus zostały również wykorzystane do szczegółowej analizy sieci regulacyjnych cyklu komórkowego clock^8,12,13,14 oraz do badań punktu kontrolnego uszkodzenia/replikacji DNA¹⁵ oraz punktu kontrolnego zespołu wrzeciona mitotowego^16,17,18.

Te badania cykli komórkowych z użyciem ekstraktów z jaj Xenopus opierały się głównie na pomiarach masowych. Jednak konwencjonalne masowe testy reakcji mogą nie naśladować rzeczywistych zachowań komórek, biorąc pod uwagę dużą rozbieżność w ich wymiarach i subkomórkowym przestrzennym podziale cząsteczek reakcyjnych. Co więcej, masowe pomiary aktywności mitotycznej mają tendencję do podawania ograniczonej liczby cykli przed szybkim tłumieniem⁸. Te wady reakcji masowych uniemożliwiły systemowi ekstrakcji dalsze zrozumienie złożonych właściwości i funkcji dynamicznych zegara. Ostatnie badania zamknęły bezkomórkowe ekstrakty Xenopus z zatrzymanym czynnikiem cytostatycznym (CSF)^19,20 w zdefiniowanych rozmiarach przedziałach przypominających komórki, co pomogło wyjaśnić, w jaki sposób rozmiar wrzeciona jest modulowany przez objętość cytoplazmatyczną. Jednak ten system in vitro jest zatrzymywany w metafazie mejozy II przez działanie czynnika cytostatycznego¹, a do dalszych badań oscylatora cyklu komórkowego potrzebny jest system zdolny do długotrwałych, utrzymujących się oscylacji na poziomie pojedynczej komórki.

Aby badać oscylacje cyklu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki, opracowaliśmy wysokoprzepustowy system do rekonstytucji i jednoczesnego pomiaru wielu samopodtrzymujących się mitotycznych procesów oscylacyjnych w pojedynczych kropelkach mikroemulsji. W tym szczegółowym protokole wideo demonstrujemy tworzenie sztucznego systemu oscylacji mitotycznych poprzez enkapsulację cyklicznej cytoplazmy jaj Xenopus laevis w mikroemulsjach o rozmiarach od 10 do 300 μm. W tym systemie udało się odtworzyć oscylacje mitotyczne, w tym kondensację i dekondensację chromosomów, rozpad i reformację otoczki jądrowej oraz degradację i syntezę substratów anafazowych (np. securyny-mCherry w tym protokole).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Przygotowanie materiałów do rekonstytucji i detekcji cyklu komórkowego

1. Klonowanie zespołu Gibsona w celu budowy plazmidowego DNA i oczyszczania mRNA securin-mCherry
   1. Przygotuj trzy fragmenty DNA, w tym szkielet wektora pMTB2, sekurynę i mCherry poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i oczyszczanie żelu^21,22.
   2. Zmierzyć stężenia fragmentów za pomocą fluorospektrometru. Połącz 100 ng szkieletu z wkładkami sekuryny i mCherry w stosunku molekularnym 1:1:1 i dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować całkowitą objętość reakcji do 5 μl.
   3. Przygotuj 6 ml 5x buforu reakcyjnego zespołu izotermicznego z 3 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 μL 1 M MgCl₂, 600 μL 10 mM dNTP, 300 μL 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000 i 20 mg NAD²³.
   4. Dodać połączone fragmenty do 15 μl 1x podwielokrotności buforu reakcyjnego zespołu izotermicznego. Inkubować reakcję w probówce reakcyjnej do PCR w temperaturze 50 °C przez 15 minut.
   5. Przygotuj 0,8% żel agarozowy i uruchom pod napięciem 10 V/cm, aby sprawdzić skuteczność wyżarzania tych fragmentów.
   6. Oczyść zbudowany plazmid i eluuj za pomocą 15 μl wody wolnej od RNaz. Przekształć 1 μl oczyszczonego plazmidowego DNA w 50 μl komórek E. coli kompetentnych DH5α²⁴ do wykorzystania w przyszłości.
   7. Ekstrahuj i oczyść plazmidowe DNA securin-mCherry z komórek E. coli kompetentnych DH5α.
   8. Transkrybuj zlinearyzowane DNA plazmidu sekuryny-mCherry na mRNA i oczyść mRNA. Za pomocą spektrofotometru sprawdzić, czy stężenie mRNA przekracza 100 ng/μl, a stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm wynosi około 2,0.
2. Przygotowanie zdemembranowanego DNA plemnika Xenopus laevis<br /> UWAGA: Na podstawie Murray 1991¹.
   1. Poddaj eutanazji dorosłego samca Xenopus laevis²⁵ i wypreparuj jądra czterech samców żab^26,27.
   2. Umieść jądra czterech żab na tej samej 100 ml szalce Petriego. Przepłukać jądra trzykrotnie w 50 ml zimnego roztworu 1x MMR (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).
   3. Usunąć nadmiar krwi i tłuszczu z jąder na 100 ml szalki Petriego, a następnie przemyć dwukrotnie w zimnym buforze do przygotowania jądrowego (NPB) (250 mM sacharozy, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,5 mM trichlorowodorku spermidyny, 0,2 mM tetrachlorowodorku sperminy).
   4. Usunąć bufor do przygotowania jądra (NPB) i pokroić jądra na kawałki o długości mniejszej niż 0,2 cm za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych na 100 ml szalki Petriego. Dodaj 8 ml zimnego NPB do jąder w celu dalszego rozkładu.
   5. Użyj nylonowych tkanin siatkowych o wielkości porów 70 μm, aby przefiltrować jądra i pobrać próbkę nasienia do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odkręcać zebrane plemniki w temperaturze 1 730 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
   6. Dostarczyć plemnikom 1 ml NPB i 50 μl lizolecytyny 10 mg/ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu demembranacji plemników.
   7. Przemyj zdemembranowane DNA plemników 10 ml zimnego NPB z 3% roztworem BSA trzy razy.
   8. Zmierz gęstość DNA plemników za pomocą hemocytometru.
   9. Zamrozić DNA plemników w 5 μl porcji w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Optymalne stężenie DNA plemników wynosi około 105 jąder/μl.
3. Oczyszczanie białek z sygnału lokalizacji jądrowej GFP (GFP-NLS)
   1. Przekształć plazmid GFP-NLS oznaczony GST w kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3)⁵.
   2. Inkubować komórki bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie rozprowadzić na płytce z agarozą LB ze 100 μg/ml ampicyliny.
   3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 14-18 godzin, aby wyhodować komórki w pojedyncze kolonie. Pobrać i zaszczepić pojedyncze kolonie w 4 ml pożywki LB ze 100 μg/ml ampicyliny. Wstrząsać komórkami w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
   4. Przygotować autoklawowane podłoże YT (16 g bakto-tryptonu, 10 g ekstraktu bakto-drożdżowego, 5 g NaCl) i podgrzać podłoże YT do 37 °C.
   5. Zaszczepić 1 ml inkubowanych przez noc komórek w pożywce LB w 250 ml podgrzanej pożywki YT ze 100 μg/ml ampicyliny i wstrząsać przez 2 godziny w celu zwiększenia gęstości komórek.
   6. Mierz gęstość optyczną komórki (OD) co 30 minut za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm. Dodaj 0,1 mM IPTG do komórek, aby indukować ekspresję białka GFP-NLS, gdy wartość OD osiągnie 0,1.
   7. Wstrząśnij komórkami w temperaturze 18 °C przez noc, aby zmniejszyć tempo wzrostu komórek i umożliwić lepszą ekspresję i syntezę białek.
   8. Wirować komórki w temperaturze 34,524 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.
   9. Zawiesić osady komórkowe w 40 ml buforu PBS (dostarczanym z 800 μl lizozymu 50 mg/mL, 100 μl 0,2 M PMSF, 13,2 μl mieszaniny leupeptyny, pepstatyny i chymostatyny 10 mg/ml oraz 8 μl 0,5 M EDTA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   10. Rozbij komórki za pomocą sonikatora o częstotliwości 20 kHz przez 4 x 30 s, z 30-sekundowymi przerwami między każdą sonikacją, aby uwolnić ekspresję białka GFP-NLS.
   11. Wiruj w 20 000 x g przez 35 minut, aby usunąć uszkodzone komórki.
   12. Użyj chromatografii powinowactwa do ekstrakcji i oczyszczenia białka GFP-NLS.
   13. Przemyć zawiesinę z kulkami o objętości 1,5 ml trzykrotnie 15 ml buforu PBS i inkubować 250 ml lizatu z kulkami przez 4 godziny w temperaturze 4 °C z odwróceniem.
   14. Odkręć kulki o masie 2000 x g przez 5 minut i dodaj 10 ml roztworu myjącego (25 mM zasady Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl i 5 mM DTT) do kulek. Inkubować kulki w 700 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM zredukowanego glutationu i 5 mM DTT) z rotacją w temperaturze 4 °C. Zebrać podwielokrotność elucji o objętości 50 μL.
   15. Zmierz stężenie zebranego białka, uruchamiając Coomassie blue gel²⁸.
   16. Eluować białka za pomocą kolumn PD-10 z 3 ml buforu magazynującego (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glicerolu, pH 7,7) poprzez wymianę buforową.

2. Przygotowanie cyklicznych ekstraktów z Xenopus

UWAGA: Ogólna procedura przygotowania ekstraktów jest zilustrowana w Rysunek 1A. Na podstawie Murray 1991¹.

1. Wstrzyknąć trzem dojrzałym samicom Xenopus laevis gonadotropinę surowicy ciężarnej klaczy o stężeniu 66 j.m. (PMSG) na 10 dni przed złożeniem jaj.
2. Wstrzyknij tym żabom Xenopus 500 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) w celu wywołania składania jaj na 18 godzin przed przygotowaniem ekstraktów rowerowych.
3. Wyrzuć złożone jaja na noc. Na podstawie eksperymentów (dane nie pokazane), ekstrakty przygotowane ze świeżo wyciśniętych jaj generują długotrwałą aktywność niż ekstrakty przygotowane ze złożonych jaj tej samej samicy żaby. Wyciśnij jaja każdej samicy żaby na 100-milimetrowe szalki Petriego zawierające 10 ml 0,2-krotnego buforu MMR i zbadaj pod mikroskopem stereoskopowym.
4. Wyrzuć partie jaj, które mają niejasne granice między biegunami zwierzęcymi i roślinnymi lub mają nieregularne białe plamy na słupach zwierzęcych.
5. Wybrać partię jaj od jednej samicy żaby prezentującej jednorodną populację jaj z wyraźnie zróżnicowanymi biegunami zwierzęcymi i roślinnymi i przenieść jaja do zlewki o pojemności 600 ml.
6. Wylej nadmiar 0,2x buforu MMR i delikatnie dodaj 250 ml 2 g na 100 ml cysteiny (pH 7,7) do 1x buforu ekstraktu (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 50 mM sacharozy, pH 7,7) do jaj.
7. Energicznie potrząśnij jajami ręcznie i usuń galaretki z jaj podczas trzech myć o łącznej objętości 800 ml buforu cysteinowego przez 3 minuty lub do momentu, gdy jaja zgromadzą się i osiądą na dnie zlewki, co wskazuje, że usunięcie galaretki zakończyło się pomyślnie.
8. Umyj jajka 1 litrem 0,2x roztworu MMR ponad cztery razy.
9. Zbieraj i wyrzucaj jaja, które stają się białe, za pomocą szklanej pipety transferowej.
10. Wylać bufor MMR i dostarczyć jajom 200 ml 0,1 μg/ml roztworu jonoforu wapnia A23187 w 0,2 buforze MMR w celu aktywacji.
11. Użyj szerokiej strony szklanej pipety, aby delikatnie wymieszać jajka, aż jaja zostaną aktywowane i usuń roztwór jonoforu wapnia.
12. Sprawdź skuteczność aktywacji po tym, jak jaja osiądą na dnie zlewki. Dobrze aktywowane jaja mają około 25% bieguna zwierzęcego i 75% bieguna roślinnego.
13. Umyj aktywowane jaja dwukrotnie 50 ml 1x buforu ekstraktu uzupełnionego inhibitorami proteazy (po 10 μg / ml leupeptyny, pepstatyny i chymostatyny).
14. Ostrożnie przenieś jaja do mikroprobówki zatrzaskowej o pojemności 0,4 ml, a następnie zapakuj jaja przez wirowanie w temperaturze 200 x g przez 60 sekund, a następnie 600 x g przez 30 sekund.
15. Usuń dodatkowy bufor z wierzchu jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura, aby zmniejszyć rozcieńczenie ekstraktów.
16. Rozdrabniać jajka w temperaturze 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
17. Przetnij rurki żyletką, aby oddzielić trzy warstwy zmiażdżonych jaj i utrzymać surową cytoplazmę w środkowej warstwie.
18. Przenieś surową cytoplazmę do nowych probówek ultrawirówkowych i uzupełnij inhibitorami proteazy i cytochalazyną B w stężeniu 10 μg/ml każdy.
19. Ponownie odwirować surową cytoplazmę w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 ° C przez 5 minut, aby dalej oczyścić cytoplazmę poprzez usunięcie nadmiaru lipidów i żółtka.
20. Świeżo przygotowane ekstrakty należy przechowywać na lodzie.

3. Generowanie kropel

1. Przygotowanie szklanej komory 2D
   UWAGA: Prostokątne szklane rurki służą jako komory, które ograniczają kropelki w jednej 2-wymiarowej płaszczyźnie, co pozwala na łatwiejszą obserwację i zbieranie danych.
   1. Pokrój prostokątne rurki szklane o wymiarze wewnętrznym 2 mm x 100 μm na kawałki o długości 4 mm. Użyj ostrej krawędzi osełki, zaznacz żądane granice na zewnętrznej powierzchni szklanej rurki za pomocą lekkich wytrawień, a następnie delikatnie dociśnij po obu stronach wytrawień, aby odłamać kawałki szklanych rurek.
   2. Podgrzej inkubator w suchej kąpieli do temperatury 95 °C. Wyjmij blok grzewczy i umieść go w eksykatorze próżniowym z poliwęglanu.
   3. Umieścić 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej 30 μl trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu w bloku grzewczym. Pocięte szklane rurki umieścić wewnątrz eksykatora próżniowego na wysokości około 5 cm od bloku grzewczego.
   4. Podłączyć eksykator do pompy próżniowej. Włącz pompę na 1 minutę, aby osiągnąć żądany poziom próżni, a następnie zamknij zawór 3-drogowy, aby uszczelnić eksykator i pozwól, aby para trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan pokryła wewnętrzną ściankę szklanych rurek. Stworzy to hydrofobowe środowisko do stabilizacji kropel.
   5. Pozostawić szklane probówki wewnątrz eksykatora w celu powlekania przez noc. Probówki będą gotowe do użycia następnego dnia.
2. Wytwarzanie kropelek i obrazowanie
   UWAGA: Procedury generowania kropel i obrazowania zilustrowano na rysunkach 1B i 1C.
   1. Dostarcz ekstrakty przygotowane w kroku 2 z 10 ng/μl mRNA securin-mCherry do prostych eksperymentów z cyklem komórkowym tylko cytoplazmatycznym. Alternatywnie, podaj ekstrakty z demembranowaną chromatyną plemnika (250 na μl ekstraktu), 10 μM GFP-NLS białka i 10 ng/μL mRNA securin-mCherry, aby utworzyć kropelki wykazujące okresowe zmiany morfologii jąder.
   2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszaj 20 μl ekstraktu zaopatrzonego w rekombinowane białko lub mRNA z 200 μl 2% fluorosurfaktantu perfluoropolieterowo-glikolu polietylenowego (PFPE-PEG) w HFE7500 oleju fluorowanym.
   3. Generuj kropelki za pomocą miksera wirowego. Zakres rozmiarów kropel może być modulowany przez prędkość i czas trwania wiru. Aby wytworzyć kropelki o promieniu od 50 do 200 μm, należy ustawić prędkość wiru na 56 x g (3 200 obr./min przy promieniu 4,9 mm) i delikatnie docisnąć probówkę do mikrowirówki zawierającą mieszaninę ekstraktu i środka powierzchniowo czynnego na mieszalniku przez 3,5 sekundy. Sprawdź wzrokowo, czy kropelki są jednakowej wielkości.
   4. Za pomocą pipety o pojemności 20 μl przenieś unoszące się na wierzchu kropelki i równą objętość środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG do probówki PCR. Zanurz przygotowaną przez schodek rurkę w warstwie kropelek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i poczekaj, aż kropelki wypełnią około 75% probówki, a następnie wepchnij probówkę w dół do warstwy środka powierzchniowo czynnego, aż probówka zostanie całkowicie napełniona. Obniży to gęstość kropel i pozwoli kropelkom uformować jedną warstwę wewnątrz komory bez nakładania się lub zniekształceń kształtu spowodowanych przepełnieniem.
   5. Napełnij naczynie ze szklanym dnem o średnicy 40 mm olejem mineralnym. Zanurz rurki wypełnione kropelkami w oleju, delikatnie dociskając je w dół za pomocą drobnej pęsety.
   6. Po załadowaniu wszystkich próbek użyj szklanej pipety, aby usunąć wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub wyciekające kropelki. Dodaj więcej oleju mineralnego, jeśli rurki nie są lub nie będą całkowicie zanurzone w procesie obrazowania.
   7. Przeprowadzić obrazowanie kropel na mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stolik x-y (patrz tabela materiałów). Używaj obiektywu pneumatycznego 4X do wszystkich rodzajów obrazowania. Do obrazowania fluorescencyjnego należy użyć lampy rtęciowej o krótkim łuku o mocy 130 W jako fluorescencyjnego źródła światła do oświetlenia oraz zestawu filtrów GFP (wzbudzenie 482/35 nm i emisja 514/LP nm) i zestawu filtrów mCherry (wzbudzenie 562/40 nm i emisja 641/75 nm) do obrazowania sygnałów GFP-NLS i securin-mCherry.
   8. Nagrywaj filmy poklatkowe w jasnym polu i wielu kanałach fluorescencyjnych co 6 do 9 minut, aż kropelki stracą swoją aktywność.

4. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

1. Segmentacja i śledzenie kropel
   1. Importuj zarejestrowane dane w formacie ".tif" lub ".oif" do oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów).
   2. Segmentuj pojedyncze krople za pomocą kanału jasnego pola. Obraz w jasnym polu pokaże kropelki jako jasne koła z ciemnymi granicami. Zastosuj progi do obrazu. Dodaj powierzchnię śledzenia do każdej kropli, dostrajając próg między ciemnymi i jasnymi pikselami tak, aby każda powierzchnia obejmowała cały obszar odpowiedniej kropli.
   3. Automatycznie śledź segmenty między sąsiednimi klatkami za pomocą algorytmu ruchu autoregresyjnego. Dostosuj dopuszczalną maksymalną odległość przemieszczania się kropli między dwiema sąsiednimi klatkami, aby była mniejsza niż promień większości kropel, aby dokładnie śledzić małe kropelki.
   4. Sprawdź wizualnie wszystkie ścieżki w całym filmie, aby wykryć nieprawidłowe segmentacje, które segmentują pustą przestrzeń między kroplami zamiast rzeczywistych kropel. Ręcznie usuń nieprawidłowe ścieżki.
   5. Segmentuj i śledź obszar tła bez żadnych kropel, aby uzyskać intensywność fluorescencji tła. Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, odejmij intensywność tła od intensywności fluorescencji kropel w każdej klatce czasowej.
   6. Eksportuj zmierzone parametry dla każdej ścieżki w czasie, w tym średnią i odchylenie standardowe intensywności fluorescencji oraz obszar kropli, do plików ".csv".
2. Analiza danych dotyczących wielkości kropli i okresu oscylacji
   1. Załaduj pliki ".csv" do R, aby utworzyć wykresy intensywności fluorescencji w czasie dla każdej kropli. Zapisz identyfikator kropli w pliku ".csv".
   2. Zaimportuj pliki ".csv" wyeksportowane z oprogramowania analitycznego oraz plik ".csv" z listą identyfikatorów kropli do Matlaba i zapisz jako pliki ".mat" w celu dalszej analizy danych.
   3. Oblicz objętość skompresowanej kropli na podstawie informacji o wyeksportowanym obszarze kropli po segmentacji i wysokości szklanej komory¹⁹. Użyj objętości, aby obliczyć promień kropli jako kuli.
   4. Wyodrębnij punkty czasowe szczytów i minimów za pomocą algorytmu wykrywania szczytu/minimum. Wykonuj ręczne korekty położenia szczytów i dołków, aby upewnić się, że są one dokładnie wykrywane.
   5. Aby obliczyć okres cyklu komórkowego, oblicz czas interwału między dwoma sąsiednimi pikami. Weź średnią ze wszystkich przedziałów dla każdej kropli jako okres cyklu komórkowego.

W Rysunek 2, pokazujemy, że ten protokół powoduje oscylacje mitotyczne zarówno w prostych, wolnych od jądra komórkach, jak i skomplikowanych komórkach z jądrami, gdzie oscylator napędza cykliczną przemianę powstawania i deformacji jąder. Krople pozbawione jąder generują oscylacje mitotyczne do 30 nietłumionych cykli w ciągu 92 godzin, na co wskazuje okresowa synteza i degradacja reportera fluorescencji sekuryny-mCherry (Rysunek 2A). Securin jest substratem kompleksu APC/C promującego anafazę. Degradacja securyny-mCherry podczas anafazy wskazuje zatem na aktywność APC/C.

Aby zbadać zdolność oscylatora mitotycznego do napędzania dalszych zdarzeń mitotycznych, dodatkowo dostarczyliśmy do ekstraktów cytoplazmatycznych demembranowaną chromatynę plemnika, oczyszczony sygnał lokalizacji jądra białka zielonej fluorescencji (GFP-NLS) oraz barwniki Hoechst 33342. Rysunek 2B pokazuje autonomiczną przemianę różnych faz cyklu komórkowego, interfazy (niebieskie paski) i mitozy (czerwone paski), podczas których zmiany morfologii jądrowej są napędzane przez samopodtrzymujący się oscylator mitotyczny. Wszystkie zdarzenia mitotyczne, tj. dekondensacja i kondensacja chromosomów zgłoszone przez Hoechst 33342 ( Rysunek 2B, pierwszy wiersz), tworzenie jądra i rozpad otoczki jądrowej przez GFP-NLS ( Rysunek 2B drugi wiersz) oraz aktywność oscylatora cyklu komórkowego przez syntezę i degradację sekuryny-mCherry ( Rysunek 2B, trzeci wiersz), pokrywały się ze sobą. Obrazy wykonano za pomocą poklatkowego wielokanałowego mikroskopu fluorescencyjnego. Nasze wyniki eksperymentalne pokazują, że zrekonstruowany system cyklu komórkowego jest w stanie zrekonstruować oscylator mitotyczny Cdk1 i APC/C, który może napędzać szereg dalszych zdarzeń, w tym rozpad i reformację otoczki jądrowej oraz zmianę morfologii chromosomów.

Rysunek 3 pokazuje oscylacje wskazane przez średnią intensywność fluorescencji securin-mCherry przed i po usunięciu szumów. Szczyty i dołki stały się bardziej wyraźne po usunięciu szumu tła, zwłaszcza w przypadku pierwszych dwóch oscylacji, co wskazuje, że usuwanie szumów może pomóc w poprawie sygnału do szumu do dalszej analizy.

Rysunek 1. Eksperymentalna procedura generowania kropelkowych komórek mitotycznych. ZA. Ekstrakty cytoplazmatyczne zbiera się przez ultrawirowanie. Ur. Ekstrakty są dostarczane z wieloma składnikami w celu odtworzenia i raportowania oscylacji mitotycznych. Za pomocą metody wirowania ekstrakty i olej powierzchniowo czynny są mieszane w celu wytworzenia kropelek. C. Kropelki są ładowane do probówki pokrytej trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanem, a następnie obrazowane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Detekcja dynamiki cyklu komórkowego za pomocą reporterów fluorescencyjnych. ZA. Przebieg w czasie średniej intensywności fluorescencji securin-mCherry wybranej kropli, wskazujący 30 nietłumionych oscylacji w ciągu 92 godzin. Rysunek na wstawce przedstawia obraz fluorescencyjny z wybraną kroplą otoczoną białym kropkowanym okręgiem. Podziałka skali wynosi 100 μm. B. Seria czasowa migawek kropli w kanałach fluorescencyjnych (trzy górne rzędy) i jasnym polu (ostatni rząd). Cykliczny postęp zegara cyklu komórkowego i jego dalsze procesy mitotyczne są jednocześnie śledzone przez wiele reporterów fluorescencyjnych. Substrat anafazowy securin-mCherry wskazuje na aktywność regulatora zegara APC/C, barwienie Hoeschta wskazuje na zmiany morfologii chromosomów, a GFP-NLS wskazuje na rozpady i reformacje otoczki jądrowej. Otoczki jądrowe (zaznaczone białymi strzałkami) są również wykrywalne na obrazach w jasnym polu, co odpowiada lokalizacji jąder wskazanych przez GFP-NLS. Podziałka wynosi 50 μm. Interfaza i faza mitotyczna są oznaczone odpowiednio niebieskimi paskami i czerwonymi paskami nad obrazami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Odejmowanie tła dla średniej intensywności fluorescencji sekuryny-mCherry. ZA. Przebieg czasu oscylacji przed usunięciem szumów tła. Ur. Przebieg czasu oscylacji po usunięciu szumów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nie mamy nic do ujawnienia.