Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikroRNA reagujących na zimno

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58242

⸱

20 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 2State Key Lab Breeding Base for Sustainable Control of Plant Pest and Disease, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 4Shanghai Biozeron Biotechnology Co., Ltd

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół efektywnego wykonywania homo- i heterograftów między tykwą arbuza a tykwy butelkowej, oprócz metod pobierania próbek, generowania i analizy danych, do badania mikroRNA reagujących na zimno.

Streszczenie

MikroRNA (miRNA) to endogenne małe niekodujące RNA o wielkości około 20 - 24 nt, znane z odgrywania ważnych ról w rozwoju i adaptacji roślin. Istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że ekspresja niektórych miRNA ulega zmianie podczas szczepienia, co jest praktyką rolniczą powszechnie stosowaną przez rolników w celu poprawy tolerancji upraw na stresy biotyczne i abiotyczne. Tykwa butelkowa jest z natury rośliną odporną na zmiany klimatu w porównaniu z wieloma innymi głównymi dyniowatymi, w tym arbuzem, co czyni ją jedną z najczęściej używanych podkładek dla tych ostatnich. Niedawny postęp w technologiach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości zapewnił ogromne możliwości zbadania miRNA reagujących na zimno i ich wkładu w korzyści płynące z heteroprzeszczepów; Warunkiem wstępnym do osiągnięcia tego celu są jednak odpowiednie procedury eksperymentalne. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wydajnego generowania homo- i heteroprzeszczepów między wrażliwym na zimno arbuzem a tykwą butelkową odporną na zimno, a także metody pobierania próbek, generowania i analizy danych. Przedstawione metody są również przydatne w innych systemach szczepienia roślin, do badania regulacji miRNA w różnych stresach środowiskowych, takich jak upały, susza i zasolenie.

Wprowadzenie

Szczepienie od dawna jest stosowane jako technika rolnicza w celu poprawy produkcji roślinnej i tolerancji na stresy biotyczne i abiotyczne1,2,3. W systemach heteroszczepienia, elitarne podkładki mogą zwiększać pobieranie wody i składników odżywczych przez rośliny, wzmacniać odporność na patogeny glebowe i ograniczać negatywne skutki toksyczności metali4,5, co może nadać szczepieniom zwiększoną wigor wzrostu i zwiększoną tolerancję na stresy środowiskowe. W wielu przypadkach heteroszczepienie może również wpływać na jakość owoców w roślinach ogrodniczych, prowadząc do poprawy smaku owoców i zwiększenia zawartości związków związanych ze zdrowiem6,7. Stwierdzono, że transfer fitohormonów, RNA, peptydów i białek między podkładką a zrazem na duże odległości jest podstawowym mechanizmem modulującym przeprogramowanie wzrostu i rozwoju roślin zrazowych8,9,10. Szczepienie jest szeroko stosowane w badaniach nad sygnalizacją i transportem na duże odległości w odniesieniu do adaptacji do środowiska11. Eksperymenty ze szczepieniami są szczególnie skuteczne w jednoznacznym wykrywaniu przenoszonych cząsteczek w tkance odbiorczej lub soku naczyniowym oraz aktywacji lub tłumieniu celów molekularnych z powodu transmisji sygnału12.

Niekodujące RNA, duża klasa RNA, które pełnią ważne funkcje regulacyjne w komórkach, zostały uznane za odgrywające rolę w ułatwianiu adaptacji roślin do stresu abiotycznego13. miRNA to endogenne małe niekodujące RNA o długości około 20 - 24 nt. Badania wykazały regulacyjną rolę miRNA w różnych aspektach aktywności roślin, takich jak wzrost pędów, Tworzenie korzeni bocznych14,15,16, pobieranie składników odżywczych, metabolizm siarczanów i homeostaza17, oraz reakcje na stres biotyczny i abiotyczny18. Ostatnio ekspresja miRNA i ich docelowych genów była związana z tolerancją stresu solnego u heteroszczepionych sadzonek ogórków19. W przeszczepach międzyodmianowych winogron stwierdzono, że reakcje ekspresji miRNA na stres związany z suszą są zależne od genotypu20.

Szybki rozwój i malejące koszty technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości stworzyły doskonałą okazję do zbadania regulacji miRNA w roślinach agronomicznych. Arbuz (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), ważna roślina dyniowata uprawiana na całym świecie, jest podatna na niskie temperatury. Tykwa butelkowa (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) jest bardziej odporną na zmiany klimatu dyniowatą, powszechnie używaną przez rolników do szczepienia arbuzem. Głównym celem obecnego badania jest ustalenie standardowej, wydajnej i wygodnej metody wykonywania heteroprzeszczepów między arbuzami (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) i tykwa butelkowa (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Protokół ten zawiera również szczegółowy schemat eksperymentalny i procedury analityczne do badania regulacji ekspresji miRNA po szczepieniu, co jest przydatne do ujawnienia mechanizmów leżących u podstaw zalet heteroszczepienia.

Materiały roślinne użyte w tym badaniu obejmują odmianę arbuza i tykwę butelkową. Odmiana arbuza jest odmianą handlową o wysokim plonie, ale podatną na niskie temperatury. Tykwa butelkowa jest popularną podkładką do szczepienia arbuzem, ogórkiem i tykwą butelkową, ze względu na doskonałą tolerancję na niskie temperatury21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sterylizacja i kiełkowanie nasion

  1. W celu sterylizacji powierzchniowej nasion tykwy namocz je w zlewce o pojemności 500 mL wypełnionej wodą o temperaturze 58 °C, okresowo mieszając, aż temperatura wody spadnie do 40 °C.
  2. W międzyczasie umieść 3 kg gleby torfowej w nylonowym worku i w celu jej sterylizacji poddaj autoklawowaniu w temperaturze 120 °C/0,5 MPa przez 20 min.
  3. Kontynuuj namaczanie nasion tykwy przez kolejne 4 - 5 h bez mieszania.
    1. Gdy woda osiągnie temperaturę pokojową, przepłucz nasiona 2 - 3 razy wodą destylowaną.
    2. Odlej nadmiar wody i pozostaw nasiona do wykiełkowania w worku z gazy w temperaturze 28 °C w komorze wzrostowej w ciemności.
    3. Po wykiełkowaniu wysiej nasiona do plastikowych doniczek (6 cm średnicy) wypełnionych wysterylizowaną glebą torfową.
  4. Gdy siewki tykwy rozwiną dwa spłaszczone liście zasiedlone, powtórz kroki 1.1 - 1.3 z nasionami arbuza.
    UWAGA: Taki harmonogram czasowy zapewnia odpowiednie dopasowanie rozmiarów przykwitka i podkładki dla sukcesu szczepienia.

2. Wzrost siewek i szczepienie

  1. Hodować siewki w komorze wzrostowej w cyklu 16 h światła / 8 h ciemności, utrzymując temperaturę 28 °C w dzień (światło) i 22 °C w nocy (ciemność). Podlewać siewki, dodając wodę raz dziennie późnym popołudniem.
  2. Zastosować metodę szczepienia przez cięcie22 w celu wykonania heteroszczepów, gdy siewki tykwy (podkładka) znajdują się w stadium jednego liścia prawdziwego, a kotyledony arbuza (szczep) wykiełkowały (ale nie są jeszcze spłaszczone).
    1. Odciąć podkotyledony siewek arbuza na wysokości 2 - 3 cm poniżej kotyledonów oraz wierzchołki siewek tykwy w miejscu bezpośrednio nad liśćmi prawdziwymi.
    2. Za pomocą wykałaczki wykonać otwór w wierzchołku przyciętych siewek tykwy. Włożyć przycięte siewki arbuza do otworów w siewkach tykwy, aby utworzyć heteroszczepy.
  3. W celu wykonania homoszczepów zastosować metodę analogiczną do przedstawionej w kroku 2.2.
    UWAGA: Kombinacje homo- i heteroszczepienia powinny być zawsze wykonywane jednocześnie (Rycina 1), co w tym przypadku daje następujące wyniki: arbuz/tykwa (WB, heteroszczep), arbuz/arbuz (WW, homoszczep) oraz tykwa/tykwa (BB, homoszczep).

Schemat szczepienia arbuza i tykwy; koncepcje łodyg WB, WW, BB z symbolami roślin.
Rycina 1: Ilustracja kombinacji szczepień i struktur roślin szczepionych. WB = heteroszczepienie arbuza/tykwy; WW = homoszczepienie arbuza/arbuza; BB = homoszczepienie tykwy/tykwy; WB-S = liście przykwitu arbuza/tykwy, które zostały pobrane do próbek; WB-R = liście podkładki arbuza/tykwy, które zostały pobrane do próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Pielęgnacja po szczepieniu, traktowanie zimnem i pobieranie próbek

  1. Owiń zaszczepione siewki przezroczystymi workami z polietylenu, aby utrzymać stosunkowo wysoką wilgotność, i utrzymuj je przez 7 d w warunkach środowiskowych z cyklami 16 h światła / 8 h ciemności, zachowując temperaturę 28 °C w dzień (światło) i 22 °C w nocy (ciemność).
  2. Zdejmij przezroczyste worki z polietylenu w 7. dniu. Pozostaw rośliny do wzrostu na kolejne 7 - 10 dni w tych samych warunkach.
  3. Podziel zdrowe, jednorodne siewki na dwie grupy: jedną do traktowania zimnem (stresowane) i jedną jako kontrolną (niestresowane). W przypadku grupy kontrolnej pozostaw siewki w tej samej komorze wzrostowej (w 28 °C) na dodatkowe 48 h, natomiast w przypadku grupy poddanej stresowi zimnem przenieś siewki do komory wzrostowej ze stałą temperaturą 6 °C, przy warunkach oświetlenia/ciemności opisanych w kroku 2.1.
  4. Pobierz próbki liści z przyszczepu i podkładu z zaszczepionych roślin (Rycina 1). Natychmiast zamroź próbki w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -70 °C do momentu użycia.

4. Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe

  1. Przenieś zamrożone próbki do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL w ciekłym azocie.
  2. Do każdej probówki z tkankami dodaj stalową kulkę (o średnicy 5 mm).
  3. Zhomogenizuj tkanki do postaci drobnego proszku, używając homogenizatora kulkowego przez 30 s.
  4. Dla każdej kombinacji szczepienia pobierz równe ilości (0,1 g) zmielonej próbki z dziesięciu siewek i zmieszaj je w probówce wirówkowej o pojemności 10 mL. Dodaj odpowiednią ilość odczynnika chlorku guanidyny (Tabela materiałów) zgodnie z sugestiami producenta w zależności od masy tkanki.
    1. Usuń zanieczyszczenia genomowym DNA, dodając wolną od RNA DNazę I do 150 U/mL w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  5. Oznacz całkowitą ilość RNA za pomocą systemu mikrokapilarnej elektroforezy, aby upewnić się, że wskaźnik integralności RNA (RIN) > 7,0.
    UWAGA: RIN > 7,0 gwarantuje wysoką integralność próbek RNA.
  6. Przygotuj biblioteki małego RNA przy użyciu komercyjnego zestawu (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Do rozpoczęcia użyj 1 µg całkowitego RNA na próbkę.
    1. Rozmroź odczynniki do normalizacji bibliotek oraz adaptery zgodnie z wytycznymi producenta. Liguj małe RNA z adapterami 5′ i 3′, a następnie je eluuj i oczyszczaj. Następnie przeprowadź odwrotną transkrypcję małych RNA z ligado-adapterami 5′ i 3' zgodnie z wytycznymi producenta.
    2. Przeprowadź amplifikację PCR zgodnie z protokołem producenta. Oceń jakość i ilość bibliotek cDNA za pomocą systemu mikrokapilarnej elektroforezy.
    3. Nałóż 1 µL biblioteki RNA na system mikrokapilarnej elektroforezy, aby upewnić się, że RIN > 7,0.
  7. Zsekwencjonuj biblioteki małego RNA na urządzeniu do wysokoprzepustowego sekwencjonowania, zgodnie z opisem zamieszczonym w innym źródle23.

5. miRNA i przewidywanie genów docelowych

  1. W przypadku każdej kombinacji szczepienia użyj otwartoźródłowego programu UEA sRNA workbench 2.4-plant version24, aby usunąć sekwencje słabej jakości oraz przyciąć sekwencje adaptorów z surowych odczytów. Odrzuć sekwencje krótsze niż 18 nt lub dłuższe niż 32 nt.
  2. Porównaj wysokiej jakości „oczyszczone” sekwencje z otwartoźródłową bazą danych Rfam 11.0, aby zidentyfikować i usunąć odczyty rRNA, tRNA, snoRNA oraz innych snRNA.
  3. Wyrównaj pozostałe odczyty do genomów referencyjnych, korzystając z narzędzia do wyrównywania krótkich sekwencji25. Na tym etapie nie dopuszcza się żadnych niedopasowań (mismatches).
    UWAGA: Do wyrównania odczytów z przyszczepu wykorzystano asemblację genomu arbuza „97103” V126, a do odczytów z podkładki asemblację genomu tykwy „HZ” V127.
  4. Porównaj pozostałe odczyty ze znanymi dojrzałymi miRNA w otwartoźródłowej bazie miRBase 22.028. Odczyty homologiczne do znanych miRNA klasyfikuje się jako konserwatywne miRNA.
  5. Porównaj sekwencje, które nie dopasowały się do znanych prekursorów miRNA, z sekwencją genomu. Użyj algorytmu MIREAP29 z ustawieniami domyślnymi w celu wykrycia potencjalnych nowych miRNA.

6. Analiza różnicowej ekspresji i ontologii genów

  1. Porównać poziomy ekspresji miRNA na podstawie liczby odczytów. miRNA z wartością P (dokładny test Fishera) < 0,05 i wartością bezwzględną log2 > 2 są uznawane za różnicowo wyrażone.
  2. Użyć narzędzia do wyboru miejsc docelowych oligosomów antysensownych (TargetFinder)30, aby przewidzieć potencjalne komplementarne mRNA (geny docelowe miRNA) dla różnicowo wyrażonych miRNA przy użyciu parametrów domyślnych.
  3. Użyć analitycznego narzędzia do wzbogacania ontologii genów (GO)31, aby ujawnić wzorce ontologii (GO) genów docelowych miRNA przy progu wartości P wynoszącym 0,05 dla istotności statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównanie wzrostu roślin w temperaturze pokojowej i 6°C; wyniki eksperymentalnej obróbki zimnem.
Rycina 2: Fenotypy różnych szczepów w temperaturze pokojowej i w warunkach stresu zimna. (a) Ten panel przedstawia siewki homoszczepione i heteroszczepione w temperaturze pokojowej jako kontrolę. (b) Ten panel prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole szczegółowo opisaliśmy wysoce wydajną i powtarzalną metodę wykonywania homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową. Ta metoda, nie wymagająca specjalnego sprzętu, jest bardzo łatwa w obsłudze i zazwyczaj ma bardzo wysoki wskaźnik przeżywalności szczepienia. Metodę można również wykorzystać do wykonania przeszczepów dla innych dyniowatych, takich jak arbuz, ogórek i dynia.

Warto zauważyć, że względna wielkość (wiek) podkładki i zrazu ma kluczowe znaczenie dla uda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Małe dane sekwencjonowania RNA są zdeponowane w GenBanku pod numerem dostępu SRP136842.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31772291), Projekt Badawczy dla Interesu Publicznego w Prowincji Zhejiang (2017C32027), Kluczowy Projekt Naukowy Hodowli Roślin w Zhejiang (2016C02051), oraz Narodowy Program Wsparcia Najlepszych Młodych Profesjonalistów (do P.X.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026
DNaza bez RNA ITakaraD2270A
Truseq Zestaw do przygotowania małych próbek RNAIlluminaRS-200-0012
2100 BionalyserAgilent5067
Polimeraza DNAThermo Fisher ScientificF530S
UEA sRNA wersja 2.4-roślinna  (oprogramowanie)NANA
http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ Rfam 11.0 database ( Strona internetowa)NANA http://rfam.janelia.org
miRBase 22.0 ( Strona internetowa)NANAhttp://www.mirbase.org/
MIREAP(oprogramowanie)NANA https://sourceforge.net/projects/mireap/
TargetFinder ( oprogramowanie)NANAhttp://targetfinder.org/

Bibliografia

  1. Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
  2. Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
  3. Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
  4. Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
  5. Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
  6. Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
  7. Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
  8. Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
  9. Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
  10. Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
  11. Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
  12. Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
  13. Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
  14. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).
  15. Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
  16. Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
  17. Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
  18. Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
  19. Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
  20. Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
  21. Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359(2013).
  22. Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
  23. Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
  24. Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851(2014).
  25. Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
  26. Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
  27. Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306(2018).
  28. Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25(2011).
  29. Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
  30. Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
  31. Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
  32. Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Szczepienie arbuza na tykwieprotok heteroszczepienia i homoszczepieniaanaliza mikroRNA w warunkach stresu zimnatechnika szczepienia ro linmetoda przygotowania siewekprotok ekstrakcji RNAsystem mikrokapilarnej elektroforezysekwencjonowanie wysokoprzepustoweodczynnik z chlorkiem guanidynywarunki w komorze wzrostowej
Generowanie homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikroRNA reagujących na zimno
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.