Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58244

⸱

13 września 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Streszczenie

platformy przesiewowe oparte na interferencji RNA i edycji genomu były szeroko stosowane do identyfikacji czynników komórek gospodarza, które ograniczają replikację wirusa. Jednak te badania przesiewowe są zwykle przeprowadzane w komórkach, które są naturalnie permisywne dla badanego patogenu wirusowego. W związku z tym solidna replikacja wirusów w warunkach kontrolnych może ograniczać zakres dynamiczny tych ekranów. Co więcej, badania te mogą nie być w stanie łatwo zidentyfikować komórkowych szlaków obronnych, które ograniczają replikację wirusa, jeśli wirus jest dobrze przystosowany do gospodarza i zdolny do przeciwdziałania obronie przeciwwirusowej. W tym artykule opisujemy nowy paradygmat badania interakcji wirus-gospodarz za pomocą badań przesiewowych, które koncentrują się na naturalnie nieudanych infekcjach arbowirusami, takimi jak wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV). Pomimo zdolności VSV do replikacji w szerokim zakresie owadów muchówek i ssaków, VSV ulega nieudanej infekcji po wprowadzeniu w różne linie komórkowe pochodzące od owadów z rzędu Lepidoptera, takich jak cygańska (Lymantria dispar). Jednak te nieudane infekcje VSV można "uratować", gdy obrona przeciwwirusowa komórek gospodarza jest zagrożona. Opisujemy, w jaki sposób szczepy VSV kodujące wygodne geny reporterowe i restrykcyjne linie komórkowe L. dispar mogą być sparowane w celu skonfigurowania badań przesiewowych w celu identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w ograniczenie arbowirusa. Ponadto pokazujemy również przydatność tych narzędzi przesiewowych w identyfikacji czynników kodowanych wirusowo, które ratują replikację VSV podczas koinfekcji lub ekspresji ektopowej, w tym tych kodowanych przez wirusy ssaków. Naturalne ograniczenie replikacji VSV w komórkach L. dispar zapewnia wysoki stosunek sygnału do szumu podczas badań przesiewowych pod kątem warunków, które sprzyjają ratowaniu VSV, umożliwiając w ten sposób zastosowanie uproszczonych testów opartych na luminescencji i fluorescencji do monitorowania zmian w replikacji VSV. Metodologie te są cenne dla zrozumienia wzajemnych zależności między odpowiedziami przeciwwirusowymi gospodarza a wirusowymi czynnikami unikania odporności.

Wprowadzenie

Zdolność wirusa do produktywnej replikacji w określonym gospodarzu jest częściowo zależna od dostępności czynników komórek gospodarza, które wspierają wnikanie wirusa i jego replikację1. Zakres wirus-gospodarz może być również podyktowany zdolnością wirusa do przeciwdziałania komórkowej obronie przeciwwirusowej, która w przeciwnym razie utrudniałaby replikację wirusa2,3. To właśnie wynik tych złożonych interakcji wirus-gospodarz ostatecznie decyduje o tym, czy wirus będzie w stanie zakończyć swój cykl życiowy w danym gospodarzu. Biorąc pod uwagę potencjalnie patogenne konsekwencje dla gospodarza w przypadku replikacji wirusa, kluczowe znaczenie ma opracowanie strategii eksperymentalnych, aby pogłębić nasze zrozumienie kluczowych interakcji wirus-gospodarz, które mogą przechylić równowagę między infekcjami nieudanymi i produktywnymi. Wyjaśnienie cech molekularnych interakcji między wirusem a gospodarzem będzie miało zasadnicze znaczenie dla opracowania nowych i alternatywnych strategii leczenia przeciwwirusowego.

Wraz z pojawieniem się interferencji RNA (RNAi)4,5 i narzędzi do edycji genomu (np. CRISPR-Cas9, nukleazy palców cynkowych, TALENs)6,7, eksperymentalnie wykonalne stało się zmienianie ekspresji czynników komórkowych w skali całego genomu i badanie wpływu tych zmian na replikację wirusa. Rzeczywiście, przeprowadzono liczne badania przesiewowe oparte na RNAi i edycji genomu w typach komórek gospodarza bezkręgowców i kręgowców, które ujawniły nowe aspekty interakcji wirus-gospodarz8,9,10,11,12. Badania te zazwyczaj wykorzystują reportery kodujące wirusy, takie jak lucyferazy świetlików (LUC) lub białka fluorescencyjne (np. GFP, DsRed), które zapewniają wygodny sposób ilościowej oceny ekspresji genów wirusa jako odczytu dla replikacji wirusa9,12. Ta strategia pozwala naukowcom zidentyfikować czynniki gospodarza, które promują lub antagonizują replikację wirusa, o czym świadczy odpowiednio wzrost lub spadek sygnałów reporterowych wirusa9,12. Jednak w zdecydowanej większości przypadków badania przesiewowe zostały przeprowadzone przy użyciu wirusów, które są dobrze przystosowane do typu komórki gospodarza, w której są badane. Chociaż strategia ta może być ważna dla zrozumienia koewolucyjnych relacji między patogenami wirusowymi a ich naturalnymi gospodarzami, stwarza fundamentalne obawy dotyczące ich wykorzystania w odkrywaniu czynników przeciwwirusowych gospodarza. W takich przypadkach poszukuje się wzmocnienia sygnału reporterowego wirusa po knockdown RNAi lub inaktywacji czynnika komórkowego, który normalnie utrudnia replikację wirusa. Po pierwsze, jeśli wirus jest już zdolny do solidnej replikacji w komórce gospodarza badanej w warunkach kontrolnych, zakres dynamiczny ekranu (tj. zdolność do rozróżnienia między sygnałami reporterowymi tła i wzmocnionymi sygnałami reporterowymi wirusa) może być ograniczony. Po drugie, problem ten jest dodatkowo spotęgowany przez sytuacje, w których wirus jest dobrze przystosowany do komórki gospodarza i skutecznie przeciwdziała szlakom obronnym gospodarza, które są celem w ekranie.

Ze względu na powyższe obawy dotyczące tradycyjnych metod badania interakcji wirus-gospodarz, opracowaliśmy nowy paradygmat do badania interakcji wirus-gospodarz, który wykorzystuje naturalnie nieudane infekcje arbowirusowe w komórkach owadów lepidoptera. Strategia ta wywodzi się z obserwacji, że dobrze przebadany ludzki arbowirus, VSV, ulega nieudanej infekcji w komórkach pochodzących od cygańskiej (L. dispar)13. VSV jest naturalnie przenoszony przez muchówki (tj. muchy piaskowe) na gospodarzy ssaków i wykazano eksperymentalnie, że infekuje szeroki zakres bezkręgowców i kręgowców zarówno w hodowli komórkowej, jak i in vivo14. Jednoniciowy genom RNA VSV o ujemnym znaczeniu o długości 11 kb koduje pięć subgenomowych mRNA, z których każdy ulega translacji na białka tworzące wirion otoczkowy. Jednak systemy odwróconej genetyki VSV pozwoliły na stworzenie szczepów kompetentnych do replikacji, kodujących LUC lub białka fluorescencyjne, oprócz pięciu naturalnych produktów genu VSV15,16,17. Ponieważ te białka reporterowe nie są włączane do wirionu VSV, zapewniają wygodny odczyt ekspresji genu VSV, która zachodzi po wejściu. Używając szczepów VSV kodujących GFP lub LUC, wykazaliśmy wcześniej, że ekspresja genu VSV jest poważnie ograniczona po wejściu komórek LD652 i że miano VSV nie wzrasta przez 72 godziny po infekcji (hpi). Natomiast koinfekcja komórek LD652 VSV i wirusem ospy ssaków, wirusem krowianki (VACV), prowadzi do logarytmicznego wzrostu zarówno ekspresji genu VSV, jak i miana do tego punktu czasowego. VACV ulega wczesnej ekspresji genów, replikacji DNA i późnej ekspresji genów w infekcjach komórek LD652, ale cykl replikacji VACV jest ostatecznie nieudany z powodu niepełnej morfogenezy wirionu18. Duży ~192-kb genom DNA VACV koduje > 200 białek, z których wiele wykazuje właściwości immunomodulujące, które promują replikację wirusa poprzez supresję odpowiedzi immunologicznej gospodarza19. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że "uratowanie" replikacji VSV w komórkach LD652 przez koinfekcję VACV było prawdopodobnie pośredniczone przez immunomodulatory VACV, które hamowały odpowiedzi L. dispar, normalnie ograniczając replikację VSV. Na poparcie tego, traktowanie komórek LD652 inhibitorem polimerazy II RNA gospodarza aktynomycyną D również ratuje replikację VSV w komórkach LD652, co wskazuje, że zależne od transkrypcji odpowiedzi gospodarza blokują replikację VSV po wejściu13.

Powyższe obserwacje sugerują, że naturalnie restrykcyjna natura komórek LD652 do infekcji VSV może stanowić stosunkowo niskie tło podczas badań przesiewowych pod kątem warunków, które wzmacniają sygnały reporterowe kodowane przez VSV (tj. te, które hamują obronę przeciwwirusową gospodarza). W tym miejscu przedstawiamy metody stosowania testów fluorescencyjnych lub opartych na LUC do badań przesiewowych w kierunku stanów, które łagodzą ograniczenie VSV w komórkach Lepidoptera. Po pierwsze, pokazujemy, w jaki sposób te testy można wykorzystać do identyfikacji kodowanych wirusowo czynników immunomodulujących, które łamią ograniczenie VSV podczas eksperymentów z koinfekcją lub poprzez ektopową ekspresję potencjalnych czynników wirusowych. Jako przykład ilustrujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy te techniki przesiewowe do identyfikacji białek A51R kodowanych przez pokswirusa jako nowej rodziny czynników immunomodulujących, które ratują replikację VSV przy braku innych czynników poxvirus13. Po drugie, pokazujemy, w jaki sposób badania przesiewowe RNAi w restrykcyjnych infekcjach komórkowych VSV-LD652 mogą być wykorzystane do bezpośredniej identyfikacji eukariotycznych czynników gospodarza zaangażowanych w ograniczenie arbowirusa13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek i wirusów General Lymantria dispar (LD652)

  1. Hodowla i posiew komórek LD652
    1. Aby wyhodować komórki LD652 pochodzące z L. dispar, należy utrzymać monowarstwę komórek w pożywce wzrostowej (tabela materiałów) inkubowanej w temperaturze 27 °C w normalnej atmosferze. Utrzymuj komórki w 10-centymetrowych naczyniach poddanych kulturze tkankowej i przechodź komórki po osiągnięciu 80% zlewności.
    2. Aby uzyskać płytkę, usuń przylegające komórki LD652 z płytki, wielokrotnie pipetując pożywkę na monowarstwę (komórki te nie wymagają trypsynizacji do usunięcia) i rozcieńczyć próbkę w pożywce wzrostowej do przybliżonej gęstości 1 x 105 komórek/ml. Odpipetować 1 ml rozcieńczonej kultury/dołka z 24-dołkowej płytki. Wysiewać co najmniej trzy kontruplikowane studzienki/rodzaj zasiewu dla każdego punktu czasowego (maksymalnie osiem zabiegów/płytkę).
    3. Pozwól komórkom osiąść przez co najmniej 1 godzinę.
  2. Preparat wirusa krowianki
    1. Aby przygotować zapasy wirusa VACV, amplifikuj wirusa w komórkach HeLa20 lub komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy (komórki BSC-1 lub BSC-40)20,21,22.
      UWAGA: Szczep VACV Western Reserve (VACV-WR) działa dobrze w opisanych tutaj testach.
    2. Miareczkować szczep VACV za pomocą testu płytki nazębnej na komórkach BSC-1 lub BSC-4020,22.
      UWAGA: Wszystkie wskazane wielokrotności infekcji VACV (MOI) opisane tutaj dla zakażeń komórkami LD652 są oparte na mianach uzyskanych z testów płytek BSC-40.
  3. Preparat wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej
    1. Aby przygotować zapasy VSV, amplifikuj wirusa w komórkach BHK23.
    2. Miareczkowanie VSV za pomocą testu płytkiowego na monowarstwach komórek BSC-40 lub BHK13,23.
      UWAGA: Wszystkie opisane tutaj MOI VSV dla zakażeń komórkami LD652 są oparte na mianach uzyskanych z testów płytek BSC-40.

2. Test ratunkowy VSV oparty na fluorescencji z wykorzystaniem koinfekcji i obrazowania żywych komórek

  1. Wysiew i infekcja komórek LD652
    1. Płytka 40 000 komórek LD652 / studzienka w komorze 8-dołkowej.
    2. Do obrazowania żywych komórek na podstawie fluorescencji należy użyć szczepów VSV kodujących białka fluorescencyjne. Przedstawione tutaj eksperymenty wykorzystują VSV-DsRed17, rekombinowany szczep VSV, który wyraża wolne białko DsRed, które nie jest połączone z żadnym innym białkiem VSV.
      UWAGA: Zakażenie VSV komórek LD652 nie jest cytopatyczne o 96 hpi, a zatem śmierć komórki nie jest czynnikiem zakłócającym przy ocenie replikacji VSV w tym przedziale czasowym.
    3. Przygotować VSV-DsRed i VACV-FL-GFP w pożywce bez surowicy (SFM; Tabela materiałów) przy MOI wynoszącym odpowiednio 1 i 25.
      UWAGA: VACV-FL-GFP to rekombinowany szczep VACV, który wyraża fuzję między LUC i GFP24. Użycie MOI 25 lub więcej dla szczepów VACV zapewnia, że wszystkie komórki LD652 są zainfekowane13. W przypadku korzystania z innego wirusa koinfekującego, MOI będzie musiał zostać określony empirycznie przez użytkownika. Każde leczenie infekcji powinno być skonfigurowane w zduplikowanych studzienkach i obejmować leczenie pozorowane zakażeniem, w którym do komórek dodaje się tylko SFM.
    4. Inkubować komórki w 0,2 ml inokulum przez 2 godziny w temperaturze 27 °C.
    5. Umyj komórki 0,5 ml / studzienkę pożywki wzrostowej.
    6. Inkubować komórki w 25 μM barwnika żywotności komórek (tabela materiałów) w pożywkach wzrostowych przez 45 minut w temperaturze 27 °C.
    7. Zassać pożywkę i umyć studzienki 1x 0,5 ml / studzienkę, aby usunąć nadmiar barwnika.
    8. Utrzymuj komórki w 0,3 ml / studzienkę pożywki wzrostowej.
  2. Przechwytywanie obrazu komórki na żywo
    1. Włącz mikroskop konfokalny z 30-minutowym wyprzedzeniem i załaduj 8-dołkową miskę komorową.
      UWAGA: Ogniwa LD652 można obrazować w temperaturach pokojowych w zakresie 20–25 °C, ale dla optymalnych warunków temperaturę w pomieszczeniu należy dostosować do 27 °C.
    2. Ustaw odpowiednie ustawienia wzbudzenia/emisji dla każdego białka markera fluorescencyjnego, które ma być obrazowane, a także ustawienia obrazu kontrastu fazowego.
    3. Dostosuj intensywność lasera dla każdego kanału.
      UWAGA: Może to wymagać przeprowadzenia eksperymentu pilotażowego w celu określenia zakresu intensywności sygnału fluorescencyjnego obserwowanego w całym czasie, który ma być wykorzystany w końcowym eksperymencie.
    4. Korzystając z obiektywu 10X, rejestruj obrazy kontrastu fazowego i fluorescencji każdej studzienki co 1–5 godzin przez cały czas trwania infekcji do pożądanego punktu czasowego (np. 48–72 hpi).
      UWAGA: Ważne jest, aby uchwycić wiele pól widzenia w każdym dołku, aby dokładnie oszacować wskaźniki infekcji w całej hodowli.
  3. Analiza obrazu
    1. Używaj oprogramowania do analizy obrazu do automatycznej analizy obrazu odpowiednich kanałów fluorescencyjnych (np. 405 nm, 488 nm, 568 nm).
    2. Aby obliczyć odsetek komórek, które są zakażone, podziel całkowitą liczbę komórek fluorescencyjnych wskazujących na zakażenie VSV (np. komórki DsRed-dodatnie dla infekcji VSV-DsRed) przez całkowitą liczbę żywych komórek znakowanych barwnikiem żywotności komórek dla każdego pola widzenia we wszystkich zabiegach.

3. Ogólny protokół infekcji wirusowych dla testów ratunkowych VSV opartych na luminescencji w komórkach LD652

  1. Przygotowanie inokulum
    1. 30 minut przed zakażeniem rozmrozić zapasy VSV-LUC16 (rekombinowany szczep VSV, który wykazuje ekspresję wolnego białka lucyferazy świetlika, które nie jest połączone z żadnym innym białkiem VSV). W przypadku testu na ratunek VSV-LUC podczas koinfekcji VACV, należy również rozmrozić wirusa VACV-WR na lodzie.
      UWAGA: Inne wirusy (oprócz VACV-WR) mogą uratować VSV-LUC podczas koinfekcji, ale będzie to musiało zostać ustalone empirycznie przez każdego użytkownika.
    2. Przygotować inokulum przez rozcieńczenie VSV-LUC w obecności lub bez VACV-WR do SFM tak, aby MOI wynosił odpowiednio 10 i 25 przy dodawaniu całkowitej objętości inokulum 0,2 ml / studzienkę.
  2. Zakażenie komórek
    1. Ostrożnie odessać dojrzałe pożywki LD652, aby uniknąć naruszenia monowarstwy i zaszczepić 0,2 ml wirusa/studzienkę. Czas ten jest definiowany jako 0 hpi. Dodać sterylną SFM do dodatkowych studzienek, aby służyły jako "pozorowane zakażenie" w ramach leczenia kontroli negatywnej.
    2. Inkubować komórki w inokulum przez 2 godziny w temperaturze 27 °C.
    3. Przy 2 hpi usunąć inokulum przez aspirację i zastąpić 1 ml / dołkiem LD652 pożywką wzrostową.
    4. Pozwól, aby infekcja postępowała 24–72 hpi.

4. Test lucyferazy

  1. Przygotowanie lizatów komórkowych
    1. Ostrożnie odessać supernatant i dodać 1 ml buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco/studzienkę.
    2. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml zeskrobać komórki do DPBS.
    3. Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki i wirować przy 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    4. W międzyczasie przygotować 1x rozcieńczenie 5x buforu reporterowego do lizy (RLB) w sterylnymH2O.
    5. Po odwirowaniu odessać DPBS bez naruszania osadu komórkowego.
    6. Ponownie zawiesić każdą pastylkę w 150 μL 1x RLB.
    7. Zamrażać i rozmrażać próbki 1 raz, stosując 5-minutową inkubację w zamrażarce o temperaturze -80 °C, a następnie szybko rozmrażać w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania do analizy.
  2. Test lucyferazy
    1. Rozmrozić lizaty na lodzie.
    2. Odpipetować 20 μl lizatu do dołka z stałą czarną lub białą 96-dołkową mikropłytką.
    3. Dodaj 100 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy do każdego dołka.
    4. Natychmiast zmierz natężenie światła za pomocą luminometru (odpowiednie ustawienia dla konkretnych luminometrów będą musiały zostać określone empirycznie przez użytkownika).
  3. Analiza testu lucyferazy
    1. Normalizuj sygnały LU dla każdego zabiegu do odczytów LU uzyskanych z zabiegów kontrolnych (wyniki reprezentatywne). Po przeprowadzeniu co najmniej trzech niezależnych eksperymentów, średnia LU uzyskana z każdej grupy poddawanej działaniu substancji/grupy kontrolnej może być analizowana za pomocą odpowiednich testów statystycznych.

5. Immunoblot

  1. Stosować lizaty ekstrahowane do testów LUC dla SDS-PAGE i późniejszego immunoblottingu, używając odpowiednich odczynników i oprzyrządowania.

6. Miano VSV z hodowli komórkowych LD652

  1. Płytka LD652 ogniwa zgodnie z krokiem 1.1.
  2. Wirus infekuje komórki zgodnie z krokiem 3.
  3. W żądanych punktach czasowych zebrać supernatanty do sterylnych probówek do mikrowirówek.
  4. Osadzać komórki przy użyciu 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatanty do nowych probówek.
  5. Przechowywać supernatanty w temperaturze -80 °C lub przystąpić do miareczkowania za pomocą testu płytkiowego na komórkach BSC-40.
    UWAGA: W przypadku miareczkowania VSV z kultur komórkowych LD652, które zawierały VACV, zaleca się dodanie 100 μg/ml arabinozydu cytozyny (AraC) do pożywki hodowlanej BSC-40 w ciągu 2 hpi, aby zapobiec tworzeniu się płytek resztkowych cząstek VACV na monowarstwach BSC-4013. AraC jest wirusowym inhibitorem polimerazy DNA, który blokuje replikację DNA VACV25, ale nie wpływa na replikację VSV.

7. Warianty testów ratunkowych VSV opartych na luminescencji w komórkach LD652: eksperymenty z transfekcją RNAi i plazmidu

  1. Przygotowanie dsRNA do knockdownu transkryptów wirusa lub gospodarza za pośrednictwem RNAi
    1. Zaprojektuj startery specyficzne dla genu z ogonem na końcu 5' z sekwencją promotora T7 (TAATACGACTCACTATAGGG), aby celować w wirusa koinfekującego (np. VACV) lub interesujące nas transkrypty mRNA L. dispar. Te startery powinny wytwarzać produkt PCR o stężeniu 400–600 pz, aby zapewnić skuteczne knockdown za pośrednictwem RNAi. Patrz Gammon et al.13 dla sekwencji starterów używanych poniżej do eliminacji transkryptów VACV lub L. dysparują transkrypty za pośrednictwem RNAi za pośrednictwem dsRNA w komórkach LD652.
      UWAGA: Transkrypty mRNA L. dispar można zidentyfikować na podstawie opublikowanych baz L. dispar class="xref">26,27,28.
    2. Wygenerowanie matrycy DNA za pomocą RT-PCR (synteza cDNA: 1 cykl w temperaturze 50 °C przez 30 min; PCR: 40 cykli po 94 °C przez 15 s, 50 °C przez 30 s i 68 °C przez 45 s każdy).
    3. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
    4. Używając oczyszczonego produktu PCR jako matrycy, transkrybuj i oczyszczaj dsRNA in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji i oczyszczania in vitro.
  2. Transfekcja dsRNA lub plazmidowego DNA do komórek LD652
    1. Wysiewaj 1 x 105 komórek/dołek z 24-dołkowej płytki i pozwól komórkom osiąść przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Dla każdej studzienki, która ma być transfekowana, rozcieńczyć 4 μl odczynnika do transfekcji w 100 μl SFM. Inkubować do 15 minut w temperaturze pokojowej. Można to przeskalować, aby uzyskać miks wzorcowy dla wszystkich transfekcji, które mają być wykonane.
    3. Rozcieńczyć do 1 μg dsRNA lub całkowitego plazmidowego DNA 100 μl SFM dla każdej studzienki, która ma być transfekowana. Inkubować do 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Wcześniej odkryliśmy, że transfekcja 1 μg komórek dsRNA/105 LD652 jest wystarczająca do >80% knockdown transkryptów wirusa lub gospodarza13, ale dawki dsRNA potrzebne do zmodyfikowanych układów/warunków eksperymentalnych będą musiały zostać określone empirycznie.
    4. Połączyć odczynnik do transfekcji i rozcieńczenia dsRNA/plazmidowego DNA w stosunku 1:1 (np. 100 μl rozcieńczonego dsRNA miesza się ze 100 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    5. W międzyczasie umyj studzienki 1 ml / studzienkę SFM, a następnie dodaj 500 μl SFM do każdej studzienki.
    6. Powoli dodawaj kroplami mieszaninę odczynnika do transfekcji dsRNA (lub plazmidowego DNA) do każdej studzienki.
    7. Inkubować odczynnik do transfekcji z komórkami przez 5 godzin.
      1. W przypadku eksperymentów RNAi polegających na knockdown transkryptów kodowanych przez wirusa współinfekującego (np. VACV), odczynnik do transfekcji po 5-godzinnym okresie inkubacji transfekcji należy zastąpić inokulum wirusa zawierającym VSV-LUC (z lub bez VACV lub innego wirusa współinfekującego) (etap 3). Następnie zastąp inokulum wirusa zawierające VSV-LUC kompletną pożywką wzrostową 2 hpi. Testy LUC (krok 4) można następnie przeprowadzić na wyekstrahowanych lizatach w różnych punktach czasowych, aby określić, czy knockdown koinfekujących transkryptów wirusa prowadzi do utraty ratunku VSV-LUC.
      2. W przypadku eksperymentów RNAi z udziałem RNAi transkryptów L. dispar, zastąp mieszaninę transfekcji kompletną pożywką wzrostową i pozwól na knockdown przez 24 godziny przed zakażeniem VSV-LUC (krok 4). Testy LUC (krok 4) można następnie przeprowadzić na wyekstrahowanych lizatach w różnych punktach czasowych, aby określić, czy knockdown transkryptów L. dispar sprzyja ratowaniu VSV-LUC.
      3. W przypadku eksperymentów obejmujących transfekcję wektorów ekspresji plazmidu eksprymujących kandydujące immunomodulatory, należy zastąpić odczynnik do transfekcji i pozwolić na ekspresję białka przez 24 godziny przed zakażeniem VSV-LUC (krok 4). Testy LUC (krok 4) można następnie przeprowadzić na wyekstrahowanych lizatach w różnych punktach czasowych w celu określenia, czy ekspresja potencjalnych białek immunomodulujących sprzyja ratowaniu VSV-LUC.
        UWAGA: Opisane tutaj warunki transfekcji przy użyciu 1 μg/studzienkę plazmidowego DNA skutkują skutecznością transfekcji na poziomie 40–60%13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako przykład zastosowania obrazowania żywych komórek do monitorowania ratowania replikacji VSV po koinfekcji VACV, komórki LD652 wysiano do naczynia z 8 komorami, a następnie poddano infekcji pozornej lub infekcji VSV-DsRed (MOI = 1) w obecności lub absence VACV-FL-GFP (MOI = 25). Ponieważ VSV-DsRed wykazuje ekspresję DsRed jako wolne białko i nie jest on połączony z białkami strukturalnymi VSV (Rycina 1A), jest on wykrywany dopiero po wniknięciu VSV i rozpo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy proste testy oparte na fluorescencji i luminescencji w celu wykrycia warunków, które ratują replikację VSV w restrykcyjnych hodowlach komórek lepidoptera. Nieudane zakażenie VSV w komórkach lepidoptera tworzy doskonały stosunek sygnału do szumu podczas oznaczania ekspresji genu VSV. Na przykład, sygnały LU wykryte w lizatach z pojedynczych infekcji VSV-LUC były ~1000 razy wyższe niż w pozorowanych lizatach, ale sygnały te zmieniły się tylko około dwukrotnie w ciągu 72-godzinnego przebiegu czasu. W przeci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

D.G. był wspierany przez fundusze z University of Texas Southwestern Medical Center's Endowed Scholars Program. Autorzy dziękują Michaelowi Whittowi (The University of Tennessee Health Science Center) i Seanowi Whelanowi (Harvard Medical School) za udostępnienie VSV-DsRed i VSV-LUC. Autorzy dziękują również Gary'emu Lukerowi (University of Michigan Medical School) za miły dar w postaci szczepu VACV-FL-GFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCELLTREAT229106
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCELLTREAT229124
10 cm szalki do hodowli tkankowychCorningC430167
Grace' s Medium dla owadówSigmaG8142
EX-CELL 420Sigma14420C
Płodowa surowica bydlęca - OptimaAtlanta BiologicalsS12450
Pożywka1:1 mieszanina Grace's Insect Medium i EX-Cell 420 Pożywka bez surowicy zawierająca również 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy i 10% płodowej surowicy bydlęcej
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100&czasy ;)SigmaA5955
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)SigmaD8662
Pożywka wolna od surowicy (SFM)Thermo Fisher10902096
Arabinozyd cytozynySigmaC1768
Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)Corning25950CQC
Bufor do lizy reporterowej 5xPromegaE3971
Odczynnik do oznaczania lucyferazyPromegaE1483
96-dołkowe mikropłytkiCorning3915
Mysie przeciwciało anty-FLAGWako014-22383
Królicze przeciwciało lucyferazy przeciwko świetlikomAbcamab21176
Mysie przeciwciało anty-aktynoweSigmaA2066
Mysz anty-VSV MN/AN/ADr. John Connor (Boston University)
Mysz anty-VACV I3LN/AN/ADr. David Evans (University of Alberta)
8-dołkowe naczynie komoroweLab-Tek II155409
Barwnik żywotności komórekThermo FisherC12881
Czytnik mikropłytek FLUOstarBMG LabtechFLUOstar
Mikroskop konfokalnyOlympusFV10i-LIV
Oprogramowanie do analizy obrazuOlympusv1.18cellSens
Oprogramowanie Eppendorf 5702 Wirówka wentylowana Eppendorf22628102
Odyssey Fc System obrazowania w podczerwieniLi-COR BiosciencesOdyssey Fc
LD652komórki N/AN/ADr. Basil Arif (Zasoby naturalne Kanada) Komórki
BSC-40Komórki ATCCCRL-2761
Komórki BHKKomórki ATCCCCL-10
HeLa KomórkiATCCCCL-2
Komórki BSC-1 ZestawATCCCCL-26
in vitro Zestaw do oczyszczaniaThermo FisherAM1626
PCRQiagenNumer katalogowy: 28104
wzrostowa do transkrypcji i oczyszczania

Bibliografia

  1. Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281(2012).
  2. Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
  3. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
  4. Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
  5. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  6. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
  7. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
  8. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
  9. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), Maywood, NJ. 962-967 (2011).
  10. Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
  11. Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
  12. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
  13. Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
  14. Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera,, J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
  15. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
  16. Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394(2009).
  17. Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
  18. Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
  19. Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
  20. Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
  21. Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
  22. Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
  23. Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  24. Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
  25. Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522(2014).
  26. Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
  27. Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190(2013).
  28. Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
  29. Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
  30. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  31. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  32. Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wirus stomatitis p cherzykowejkom rki owad w z rz du Lepidopteratesty luminescencyjnetesty fluorescencyjneprzesiew RNAiprzesiew edycji genomuinterakcje wirus gospodarz
Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.