Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania dyskretnych klastrów tlenu metali, polioksometalanów (POM), na granicy pojedynczej cząsteczki za pomocą biologicznej platformy elektronicznej opartej na nanoporach. Metoda ta stanowi komplementarne podejście do tradycyjnych narzędzi chemii analitycznej stosowanych w badaniu tych cząsteczek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka fizyczna pojedynczych nanocząstek metalicznych w wysokiej rozdzielczości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poszczególne cząsteczki mogą być wykrywane i charakteryzowane poprzez pomiar stopnia, w jakim redukują prąd jonowy przepływający przez pojedynczy por w skali nanometrowej. Sygnał jest charakterystyczny dla właściwości fizykochemicznych cząsteczki i jej interakcji z porami. Pokazujemy, że nanopory utworzone przez egzotoksynę białka bakteryjnego Staphylococcus aureus alpha hemolysin (αHL) mogą wykrywać polioksometalany (POM, anionowe klastry tlenu metali) na granicy pojedynczej cząsteczki. Ponadto jednocześnie mierzy się wielokrotne produkty degradacji kwasu 12-fosfatungstycznego POM (PTA,H3PW12O40) w roztworze. Czułość pojedynczej cząsteczki metody nanoporowej pozwala na scharakteryzowanie POM przy znacznie niższych stężeniach niż wymagane do spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Technika ta może posłużyć jako nowe narzędzie dla chemików do badania właściwości molekularnych polioksometalanów lub innych klastrów metalicznych, aby lepiej zrozumieć procesy syntezy POM i być może poprawić ich wydajność. Hipotetycznie za pomocą tej metody można by zbadać położenie danego atomu, czyli rotację fragmentu w cząsteczce, a także stopień utlenienia metalu. Ponadto ta nowa technika ma tę zaletę, że umożliwia monitorowanie cząsteczek w roztworze w czasie rzeczywistym.
Wprowadzenie
Wykrywanie analitów biomolekularnych na poziomie pojedynczej cząsteczki może odbywać się za pomocą nanoporów i pomiaru modulacji prądu jonowego. Zazwyczaj nanopory dzielą się na dwie kategorie w zależności od ich wytwarzania: biologiczne (samoorganizujące się z białka lub origami DNA)1,2,3, lub półprzewodnikowe (np. wyprodukowane za pomocą narzędzi do przetwarzania półprzewodników)4,5. Podczas gdy nanopory w stanie stałym sugerowano jako potencjalnie bardziej wytrzymałe fizycznie i mogą być stosowane w szerok....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Poniższy protokół jest specyficzny dla systemu Nanopatch DC firmy Electronic BioSciences (EBS). Można go jednak łatwo dostosować do innych aparatów elektrofizjologicznych używanych do pomiaru prądu przez płaskie dwuwarstwowe błony lipidowe (standardowa komora membranowa dwuwarstwowa lipidowa, geometria rurki U, ciągnięte mikrokapilary itp.). Identyfikacja materiałów handlowych i ich źródeł ma na celu opisanie wyników doświadczalnych. W żadnym wypadku identyfikacja ta nie oznacza rekomendacji Narodowego Instytutu Standaryzacji i Technologii ani nie oznacza, że materiały są najlepsze z dostępnych.
1. Przygotowan....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W ciągu ostatnich dwóch dekad pory w białkach błonowych o rozmiarach nanometrycznych okazały się wszechstronnymi czujnikami pojedynczych cząsteczek. Pomiary oparte na nanoporach są stosunkowo proste w wykonaniu. Dwie komory wypełnione roztworem elektrolitu są oddzielone nanoporem osadzonym w elektrycznie izolującej membranie lipidowej. Potencjał elektrostatyczny w obrębie nanoporu jest generowany przez wzmacniacz patch-clamp lub zewnętrzne źródło zasilania. poprzez Elektrody Ag/A.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na swój ładunek anionowy, POM prawdopodobnie wiążą się z organicznymi kationami przeciwstawnymi poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Dlatego ważne jest, aby zidentyfikować właściwe warunki roztworu i odpowiednie środowisko elektrolitów (zwłaszcza kationy w roztworze), aby uniknąć skomplikowanego tworzenia się POM. Szczególną ostrożność należy zachować przy wyborze bufora. Na przykład szybkość wychwytywania POM z roztworami buforowanymi tris(hydroksymetylo)aminometanem i kwasem cytrynowym jest znacznie niższ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej na stypendium podoktorskie (dla J.E.) oraz grant od NIH NHGRI (dla J.J.K.). Dziękujemy za pomoc profesorom Jingyue Ju i Sergeyowi Kalachikovowi (Columbia University) za dostarczenie heptamerycznego αHL oraz za inspirujące dyskusje z profesorem Josephem Reinerem (Virginia Commonwealth University).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore Filtr | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Dekan, ReagentPlus, ≥ 99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| &alfa; HL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Drut Ag Elektroda | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag / AgCl | In Vivo Metryczny | E202 | |
| System wzmacniacza o wysokiej impedancji | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| kapilary kwarcowe niestandardowe | |||
| ogniwo | |||
| Przetwarzanie i analiza danych MOZAIKA | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Hydrat kwasu fosfatungstycznego | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodu fosforan jednozasadowy | jednowodny Sigma-Aldrich | 71507 |
Bibliografia
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
