Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58265

⸱

28 sierpnia 2018

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę oceny aktywności proteolitycznej proteazy o niskiej aktywności i pojedynczej rotacji w kontekście komórkowym. W szczególności metoda ta jest stosowana do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9, kluczowego czynnika napędzającego metabolizm lipidów, którego aktywność proteolityczna jest wymagana do jego ostatecznej funkcji hipercholesterolemicznej.

Streszczenie

Konwertaza proproteinowa subtylizyna/keksyna typu 9 (PCSK9) to proteaza jednoobrotowa, która reguluje poziom lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w surowicy, a w konsekwencji choroby sercowo-naczyniowe. Chociaż proteoliza PCSK9 jest wymagana do uzyskania pełnego efektu hipercholesterolemii, ocena jego funkcji proteolitycznej jest trudna: wiadomo tylko, że PCSK9 sam się rozszczepia, przechodzi tylko jeden obrót, a po proteolizie zachowuje swój substrat w miejscu aktywnym jako autoinhibitor. Przedstawione tutaj metody opisują test, który pozwala przezwyciężyć te wyzwania. Test koncentruje się na proteolizie międzycząsteczkowej w kontekście komórkowym i łączy udane rozszczepienie z wydzielaną aktywnością lucyferazy, którą można łatwo odczytać w kondycjonowanym pożywce. Poprzez sekwencyjne etapy mutagenezy, transfekcji przejściowej i odczytu lucyferazy, test może badać proteolizę PCSK9 w warunkach zaburzeń genetycznych lub molekularnych w sposób wysokoprzepustowy. System ten doskonale nadaje się zarówno do biochemicznej oceny klinicznie odkrytych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu typu missense (SNP), jak i do badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów proteolizy PCSK9.

Wprowadzenie

PCSK9 jest ukierunkowany na degradację receptora LDL (LDL-R), podnosząc poziom cholesterolu LDL (LDL-C) i prowadząc do miażdżycowej choroby serca1,2. Terapie ukierunkowane na PCSK9 zdecydowanie obniżają poziom LDL-C i poprawiają wyniki sercowo-naczyniowe u pacjentów, nawet jeśli są dodane do agresywnej terapii obniżającej stężenie lipidów za pomocą statyn3,4. Obecnie zatwierdzone terapie ograniczają się jednak do podejść opartych na przeciwciałach i cierpią z powodu braku opłacalności5,6. Aby rozwiązać ten problem, potrzebne są mniej kosztowne alternatywy terapeutyczne, sposób na identyfikację pacjentów, którzy mogą uzyskać większe korzyści, lub jedno i drugie.

Podejścia małocząsteczkowe mogą być ukierunkowane na wewnątrzkomórkowy PCSK9, zapewnić lepszą drogę podania i obniżyć koszty, co czyni je "Świętym Graalem" w tej dziedzinie7. Jednak PCSK9 okazał się trudny do leczenia za pomocą małych cząsteczek. Z punktu widzenia proteazy, celowanie w funkcję proteolityczną PCSK9 jest atrakcyjną strategią, ponieważ autoproteoliza jest etapem ograniczającym szybkość dojrzewania PCSK9 8 i jest wymagana dla maksymalnego wpływu na LDL-R9. Do tej pory jednak strategia ta nie odniosła sukcesu, prawdopodobnie ze względu na unikalną biochemię PCSK9: PCSK9 rozszczepia tylko siebie10, przeprowadzając reakcję pojedynczego obrotu, a po samorozszczepieniu prodomena PCSK9 pozostaje związana w miejscu aktywnym jako autoinhibitor11, uniemożliwiając odczyt jakiejkolwiek dalszej aktywności proteazy.

Ten artykuł przedstawia metodę oceny funkcji proteolitycznej PCSK9 w sposób wysokoprzepustowy8. Dzięki mutagenezie ukierunkowanej na miejsce badacze mogą wykorzystać ten test do zbadania wpływu kodowania SNP znalezionych w klinice, aby ocenić ich wpływ na proteolizę, etap ograniczający szybkość dojrzewania PCSK9. Ponadto metoda ta będzie przydatna w projektowaniu wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu identyfikacji modulatorów proteolizy PCSK9, które zgodnie z przewidywaniami ostatecznie zakłócą prezentację PCSK9 w stosunku do LDL-R (i modulują efekt hipercholesterolemiczny PCSK9). Wreszcie, protokół ten można dostosować do innych proteaz o wewnętrznie niskiej aktywności, pod warunkiem, że i) można znaleźć określoną parę substrat-proteaza oraz ii) można ustalić odpowiednią wewnątrzkomórkową kotwicę dla substratu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mutageneza celowana wektora proteazy

  1. Zaprojektować i zamówić syntetyczne oligonukleotydy w celu wprowadzenia pożądanej mutacji, korzystając z modyfikacji standardowych protokołów mutogenezy ukierunkowanej12. Standardowe odsolone primery (bez dodatkowej puryfikacji) są w pełni wystarczające.
    Uwaga: Ogólne podejście do projektowania primerów polega na stworzeniu primerów częściowo nakładających się, jak wskazano w Tabeli 1, przy użyciu kalkulatora temperatury topnienia (Tm) specyficznego dla używanej polimerazy.
  2. Przygotować mieszaniny do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla mutogenezy ukierunkowanej w warunkach chłodzenia (na lodzie), zgodnie z Tabelą 2.
  3. Przeprowadzić cykle PCR zgodnie z Tabelą 3.
  4. Naniesć 2 - 5 µL z każdej reakcji PCR na 1% żel agarozowy i zwizualizować produkty, aby potwierdzić pomyślną amplifikację.
    Uwaga: Poprawny PCR wykaże pojedynczy, wyraźny prążek DNA o rozmiarze zbliżonym do markera matrycy (~7.8 kB).
  5. Dodać 0.5 µL (na 25-µL reakcję) enzymu DpnI i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  6. Przetransformować 2 µL mieszaniny reakcyjnej do chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli.
    Uwaga: Zastosowanie szybko rosnącego szczepu E. coli skróci czas inkubacji, jednak każdy szczep klonujący będzie odpowiedni.
  7. Wysiać transformanty na agar Luria-Bertani (LB) zawierający 50 - 100 µg/mL karbenicyliny. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  8. Wybrać 2 - 4 kolonie i wyhodować je w kulturze małej skali (2 - 5 mL podłoża LB z 50 - 100 µg/mL karbenicyliny). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przy 220 rpm do momentu zmętnienia.
  9. Wyizolować plazmidowe DNA z komórek, używając zestawu do puryfikacji DNA plazmidowego (i.e., „miniprep”) zgodnie z instrukcją producenta. Oznaczyć stężenie elutowanego DNA za pomocą spektrofotometru mikropojemnościowego.
  10. Przeprowadzić szczegółowe sekwencjonowanie DNA plazmidowego w usłudze sekwencjonowania metodą Sangera (np. w jednostce core lub komercyjnym laboratorium). Przygotować próbki DNA zgodnie ze specyfikacją usługodawcy. Primery, które zostały pomyślnie zastosowane w poprzednich reakcjach sekwencjonowania, wymieniono w Tabeli 4.
    Uwaga: Ze względu na amplifikację całego plazmidu metodą PCR, zaleca się sekwencjonowanie całego regionu kodującego PCSK9 dla każdego mutanta.

2. Wysokoprzepustowy test proteolizy oparty na lucyferazie

  1. Wysiew komórek (dzień 0)
    1. Do eksperymentów należy użyć komórek HEK293T o niskim numerze pasażu, hodowanych w podłożu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Wszystkie prace z komórkami należy prowadzić w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aż do momentu przeprowadzenia pomiaru aktywności lucyferazy. Należy oszacować liczbę potrzebnych studzienek i płytek do eksperymentu, przyjmując, że transfekcje będą wykonywane w trzech powtórzeniach dla każdego badanego warunku.
    2. Odseparuj komórki HEK293T z kolby macierzystej, traktując je minimalną objętością 0,05% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), aby pokryć komórki. Zneutralizuj trypsynę-EDTA, dodając 2 objętości pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS, a następnie przenieś komórki do sterylnej probówki. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (wykorzystując barwienie błęknitem trypanu). Odwiruj probówkę przy 500 x g przez 5 min w celu regeneracji komórek.
    3. Odssać pożywkę zawierającą trypsynę i resuspenderować komórki w pożywce hodowlanej do stężenia 2 x 105 komórek/ml. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 µL komórek do każdej studniki białej płytki 96-dołkowej (z nieprzezroczystym dnem), co daje końcowe stężenie wysiewu 2 x 104 komórek/dołek.
      Uwaga: W przypadku pierwszych eksperymentów pomocne może być dodatkowe wysianie komórek na analogiczną płytkę 96-dołkową z przezroczystym dnem, aby monitorować wzrost i adhezję komórek w trakcie protokołu oraz ułatwić późniejsze rozwiązywanie problemów.
    4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 24 h.
    5. Przygotuj płytkę matczyną z plazmidami w formacie 96 dołków. Rozcieńcz każdy plazmid w buforze elucyjnym (Tris-HCl, pH 8,5) do stężenia 50 ng/µL w pojedynczej studzience płytki 96-dołkowej.
      1. Przygotuj po 4 dołki dla plazmidu kontroli pozytywnej (WT)8, plazmid kontroli negatywnej (S386A)8oraz bufor bez plazmidu (do transfekcji pozornych). Jeśli planowane są traktowanie lekami lub inne zabiegi komórkowe, należy przygotować płytkę główną z plazmidem kontroli pozytywnej (WT) w każdej studzience, a także po 4 studzenczkach z plazmidem kontroli negatywnej (S386A) oraz buforem bez plazmidu.
  2. Transfekcja (dzień 1)
    1. Przygotować mieszaninę do transfekcji w formacie płytki 96-dołkowej, wykorzystując głębokie płytki 96-dołkowe. Transfekcje przeprowadzić w trzech powtórzeniach, dbając o przygotowanie wystarczającej ilości odczynników, aby uwzględnić straty podczas pipetowania i przenoszenia cieczy.
      Uwaga: Poniższe obliczenia pozwalają na przygotowanie ilości odczynnika wystarczającej do przeprowadzenia analizy na jednej płytce 96-dołkowej w trzech powtórzeniach (szacunek ostrożny dla 420 dołków).
      1. Przygotować mieszaninę główną (master mix) z rozcieńczonego odczynnika do transfekcji lipidowej, dodając 50.4 µL odczynnika do 2050 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Przygotować mieszaninę główną (master mix) odczynnika do prekompleksacji DNA, dodając 33.6 µL odczynnika do 1730 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy.
      2. Przy użyciu pipety wielokanałowej odmierzyć 16.8 µL rozcieńczonej mieszaniny odczynników do prekompleksacji DNA do każdego dołka płytki głębokodołkowej.
      3. Przy użyciu pipety wielokanałowej nanieść alikwoty 3.2 µL (160 ng) każdego plazmidu z płytki matczynej do każdego dołka płytki głębokodobojowej.
      4. Przy użyciu pipety wielokanałowej odnieść alikwoty 20 µL przenieś rozcieńczoną mieszaninę odczynnika do transfekcji lipidowej do każdej studzienki płytki i wymieszaj zawartość każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryj płytki i pozostaw je w temperaturze pokojowej (RT) na 10–15 min w celu utworzenia kompleksów lipid-DNA.
        Uwaga: Po transfekcji końcowy skład każdego dołka będzie następujący: 40 ng DNA, 0.12 µL odczynnika do transfekcji i 0.08 µL odczynnika do prekompleksacji DNA, a zawartość każdej dołki będzie 10 µL w całkowitej objętości (pożywka z obniżoną zawartością surowicy).
    2. Ostrożnie wymień pożywkę w komórkach 293T w płytkach 96-dołkowych za pomocą pipety wielokanałowej, dbając o to, aby nie uszkodzić komórek. Odessaną pożywkę zastąp 95 µL pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS.
      Uwaga: Jest to odpowiedni moment na potraktowanie komórek wybranym lekiem.
    3. Dodaj 10 µL mieszaniny transfekcyjnej do każdej odpowiedniej studzienki poprzez pipetkę wielokanałową. Delikatnie zamieszaj płytkę, aby wymieszać zawartość dołków. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 przez 24 h.
      Uwaga: końcowa objętość w dołkach wynosi 105 µL, aby uwzględnić parowanie w ciągu 24 h.
  3. Analiza (dzień 2)
    1. Przygotuj roztwór zapasowy dla odczynników coelenterazyny: 3 M askorbinian sodu [rozpuszczony w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), przygotowany na świeżo], 5 M NaCl, 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA; rozpuszczonej w PBS, przygotowanej na świeżo) oraz 2 mM coelenterazyny (rozpuszczonej w zakwaszonym metanolu zawierającym 200 µL (3 N HCl na każde 10 mL).
      Uwaga: 2 mM celenterazyny można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze -80 °C or w ciemności.
    2. Przygotować 2x odczynniki koelenterazyny do odczytu lucyferazy, osobny odczynnik dla komórek i osobny dla pożywki, zgodnie z Tabela 5Wymieszać wszystkie odczynniki z wyjątkiem coelenterazyny, a następnie przefiltrować mieszaninę przez filtr 0,22-µm przefiltrować przez filtr strzykawkowy, a następnie dodać celenterazynę. Przechowywać odczynniki w ciemności do momentu ich dodania do płytek.
      Uwaga: Ze względu na ubytek roztworu podczas filtracji należy przygotować taką ilość odczynnika, aby uwzględnić straty wynikające zarówno z filtracji, jak i z przelewów. Tabela 5 przedstawia końcową stężenie odczynników 2x (a także ilość roztworu zapasowego niezbędną do odczytu jednej płytki 96-dołkowej z jednym odczynnikiem).
    3. Wyjmij komórki z inkubatora 24 h po transfekcji. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 50 µL medium warunkującego z każdej studzienki do nowej, białej (nieprzezroczystej) płytki 96-dołkowej.
      1. Oznakuj płytki, wskazując, czy zawierają one pożywkę, czy komórki. Jeśli przeprowadzono transfekcję w więcej niż jednej płytce 96-dołkowej, oznakuj płytki w taki sposób, aby każda płytka z pożywką była przypisana do odpowiadającej jej płytki z komórkami.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 µL dodaj 2x nie litycznego odczynnika coelenterazyny do płytki zawierającej wyłącznie medium kondycjonowane. Delikatnie kołysz lub wstrząsaj płytką w ciemności przez 5–10 min w temperaturze pokojowej.
    5. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 µL dodaj 2x litycznego odczynnika celenterazyny do płytki zawierającej komórki. Delikatnie kołysz lub wstrząsaj płytką w ciemności przez 5–10 min w temperaturze pokojowej.
    6. Po inkubacji zmierz luminescencję płytki zawierającej wyłącznie pożywkę za pomocą czytnika płytek. Następnie, za pomocą tego samego czytnika, zmierz luminescencję płytki zawierającej komórki.
    7. Wyrzuć płytki i zapisz pliki do analizy danych.

3. Analiza danych

  1. Przeprowadź wstępną analizę danych przy użyciu oprogramowania arkuszowego. Utwórz arkusz zawierający wyniki z płytek z komórkami oraz płytek z medium.
  2. Ręcznie sprawdź dane z płytek z komórkami, aby zidentyfikować studzienki o niskiej wydajności transfekcji. Studzienki, w których odczyt stanowi < 5% - 10% odczytu dla plazmidu kontrolnego negatywnego (S386A), należy uznać za słabo transfekowane, co czyni interpretację tych danych wątpliwą.
  3. Oblicz średnią luminescencję tła dla każdej płytki na podstawie studzienek z transfekcją pozorną (mock). Odejmij tło każdej płytki od wartości uzyskanych na tej płytce.
    Uwaga: Wartość ta może być pomijalna w zależności od użytego czytnika płytek.
  4. Przetwórz dane, obliczając proporcję aktywności lucyferazy w medium w stosunku do całkowitej aktywności lucyferazy dla każdej studzienki. Ponieważ płytka z komórkami zawiera zarówno medium warunkujące, jak i komórki, a płytka zawierająca tylko medium zawiera taką samą ilość medium warunkującego jak płytka z komórkami, należy zastosować poniższe równanie:
    figure-protocol-1
    Gdzie RLU = względne jednostki luminescencji, odczyt z czytnika płytek po odjęciu tła.
  5. Oblicz średnią ilość wydzielonej lucyferazy dla studzienek kontroli pozytywnej (WT) oraz kontroli negatywnej (S386A).
  6. Oceń ogólną jakość eksperymentu, obliczając współczynnik Z (Z-factor)13:
    figure-protocol-2
    Uwaga: Wartości aktywne pochodzą z kontroli pozytywnej (WT), a wartości nieaktywne ze studzienek kontroli negatywnej (S386A). Wartości zbliżone do 1 wskazują na wyższą jakość eksperymentu. W przypadku wartości poniżej 0 należy rozważyć powtórzenie eksperymentu lub optymalizację procedury.
  7. Przenieś dane z programu arkuszowego do oprogramowania do naukowej analizy danych.
  8. Znormalizuj aktywność wydzielonej lucyferazy do średnich wartości kontroli pozytywnej (WT) i kontroli negatywnej (S386A), przyjmując wartość 1 dla kontroli pozytywnej i 0 dla kontroli negatywnej.
  9. Oczyść dane z wartości odstających, stosując metodę regresji i usuwania wartości odstających (ROUT), ustawiając maksymalny wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) na 1%.
  10. Oceń istotność statystyczną różnic, porównując dane dla każdego wariantu mutanta (lub mutanta) do średniej aktywności WT (znormalizowanej do wartości 1). Wykonaj wielokrotne nieparzyste testy t, korygując wyniki dla wielokrotnych porównań metodą Holma-Sidaka przy α = 0.05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wysokoprzepustowy test proteolizy opiera się na pokonaniu trzech głównych wyzwań. Po pierwsze, aby zniwelować naturalnie niską wydajność proteazy PCSK9 działającej w cyklu pojedynczego obrotu, zastosowano proteazę PCSK9 pozbawioną hamującej prodomeny, w której sekwencja cięcia na końcu prodomeny jest połączona z lucyferazą zdolną do sekrecji14. Po drugie, aby zaspokoić potrzebę fałdowania proteazy w kompleksie z jej hamującą prodomeną, dwa polipeptydy są koekspresj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane powyżej procedury eksperymentalne przedstawiają metodę przezwyciężenia wewnętrznie niskiej aktywności proteazy jednoobrotowej PCSK9 i solidnej oceny jej funkcji proteolitycznej. Kluczowa koncepcja testu opiera się na przekształceniu zdarzenia pojedynczego obrotu w enzymatycznie amplifikowany odczyt. Do mocnych stron testu należą stosunkowo krótkie ramy czasowe i łatwość użycia reportera lucyferazy, a także jego skalowalność do podejść o wysokiej przepustowości. Ponadto test ocenia proteolizę w jej natywnym, komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują hojnemu wsparciu finansowemu od NHLBI/NIH (K08 HL124068 i LRP HMOT1243), NCATS/NIH poprzez UCSF Clinical and Translational Science Institute Catalyst Program (UL1 TR000004), Senatu Akademickiego UCSF, Fundacji Hellmana, Gilead Sciences Research Scholar Award, Pfizer ASPIRE Cardiovascular Award (wszystkie dla Johna S. Chorby) i Instytutu Medycznego Howarda Hughesa (dla Adri M. Galvana i Kevana M. Shokata).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki PCRUSA Scientific1402-2900do PCR
Q5 Gorący startNew England BiolabsM0493Lpolimerazy DNA o wysokiej wierności
NewEngland BiolabsN0447LdNTP (do PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WTAutorzynie dotyczyDostępne od autorów
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386AAutorzyn/aDostępne od autorów
Agarose LEGold BiotechnologyA-201-100Do żeli DNA
E-Gel Imager System z podstawą niebieskiego światłaThermoFisher Scientific4466612Do obrazowania żeli DNA
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisher ScientificS33102Do żeli DNA
Tris BaseThermoFisher ScientificBP152-1Do żelu DNA Bufor do biegania
Lodowaty kwas octowyThermoFisher ScientificA38-500Do żelu DNA Bufor do biegania
Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowegoMillipore Sigma3690EDTA, do żelu DNA Bufor
do biegania 1 kb Drabinka DNAGold BiotechnologyD010
DpnINew England BiolabsR0176SEnzym restrykcyjny
LB Płytki agarowe ze 100 &mikro; g/mL karbenicylinaTeknovaL1010Płytki LB-Carb
One Shot Mach1 T Odporny na fagi Chemicznie kompetentny E. coliThermoFisherScientificC862003Chemicznie kompetentne komórki
LB Broth, MillerThermoFisher ScientificBP1426-2LB
CarbenicillinGold BiotechnologyC-103-5Selektywny antybiotyk
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit IOmega BioTekD6942-02Oczyszczanie DNA Miniprep
Kit Spektrofotomer NanoDrop 2000 SpektrofotometrThermoFisher ScientificND-2000C
Komórki 293T Amerykańskakolekcja kultur tkankowych (ATCC)CRL-3216HEK Komórki 293T
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronianThermoFisher Scientific11995065DMEM, komórka ssaków Media
Surowica bydlęcapłodu Axenia BiologixF001FBS
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific25300062Trypsyna, do dysocjacji komórek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)ThermoFisher Scientific10010023PBS
Countess Automatyczny licznik komórekThermoFisher ScientificC10227Automatyczne zliczanie komórek
Szkiełka do komory do liczenia komórek ThermoFisherScientificC10228Szkiełka do liczenia komórek
CELLSTAR Płytki do hodowli tkankowych, białe, z białym dnem, z pokrywkąGrenier Bio-One655083Biała, 96-dołkowa płytka z białym dnem
TempPlate 96-dołkowa płytka do PCR bez listwy, naturalnaUSA Scientific1402-959696-dołkowa płytka do głównej płytki plazmidowej
Nunc 2,0 ml DeepWell PłytkiThermoFisher Scientific 27874396-dołkowa płytka głębinowa
Lipofectamina 3000ThermoFisher ScientificL3000008Odczynnik do transfekcji lipidów, odczynnik Lf3K
P3000ThermoFisher ScientificL3000008odczynnik do wstępnego kompleksowania DNA, wyposażony w Lf3K
OptiMEM I Zredukowane podłoże surowicyThermoFisher Scientific31985062Zredukowane podłoże surowicy do transfekcji
(+)-L-askorbinian soduMillipore SigmaA4034Askorbinian sodu
Chlorek soduMillipore SigmaS9888NaCl
Albumina, surowica bydlęca, frakcja V, niska zawartość metali ciężkichMillipore Sigma12659
BSA Metanol (HPLC)ThermoFisher ScientificA4524MeOH
Kwas solnyVWRJT9535-2Skoncentrowany HCl
CoelenterazineGold BiotechnologyCZ2.5z substratem lucyferazy
, sterylnyThermoFisher Scientific09-720-3Filtr sterylny, PVDF, 0,22 i mikro;
Pipeta wielofunkcyjna Pipet-Lite L12-200XLS+wielokanałowaRainin 17013810 Pipeta
wielokanałowa Pipet-Lite Pipeta wielokanałowa L12-20XLS+Pipeta wielokanałowa Rainin 17013808 Pipeta
wielofunkcyjna Pipet-Lite L12-10XLS+Pipeta wielokanałowa Rainin17013807
Zbiornik na odczynnikiCorning4870Korytko na odczynniki
Probówki wirówkowe, 15 mlThermoFisher Scientific05-539-12Probówki 15 ml
, 50 mlCorning430829probówki 50 ml
Czytnik mikropłytek SparkCzytnik płytekTecanN/A
ExcelMicrosoft 2016 dla komputerów MacOprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych
PrismGraphPadSoftware v7Oprogramowanie do analizy danych naukowych
Mieszanina roztworów deoxynukleotydów Filtr strzykawkowy Pipeta Probówki wirówkowe

Bibliografia

  1. Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
  2. Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
  3. Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
  4. Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
  5. Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
  6. Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
  7. Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
  8. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
  9. Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
  10. Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
  11. Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
  12. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  13. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
  16. Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
  17. Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
  18. Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Proteoliza PCSK9wysokoprzepustowe przesiewaniekom rki HEK293transfekcja przej ciowaodczyn celenterazynowypo ywka warunkuj casekwencja ci ciaanaliza SNPma ocz steczkowe inhibitory

Powiązane artykuły