Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Summary

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Abstract

Binarne systemy transkrypcyjne to potężne narzędzia genetyczne szeroko stosowane do wizualizacji i manipulowania losem komórek oraz ekspresją genów w określonych grupach komórek lub tkanek w organizmach modelowych. Systemy te zawierają dwa składniki jako oddzielne linie transgeniczne. Linia sterująca wyraża aktywator transkrypcji pod kontrolą specyficznych tkankowo promotorów / wzmacniaczy, a linia reporterowa / efektorowa zawiera gen docelowy umieszczony poniżej miejsca wiązania aktywatora transkrypcji. Zwierzęta, w których znajdują się oba składniki, indukują specyficzną tkankowo transaktywację docelowej ekspresji genu. Precyzyjna czasoprzestrzenna ekspresja genu w docelowych tkankach ma kluczowe znaczenie dla bezstronnej interpretacji aktywności komórki/genu. W związku z tym niezbędne jest opracowanie metody generowania wyłącznych linii sterujących specyficznych dla komórek/tkanek. W tym miejscu przedstawiamy metodę generowania wysoce specyficznego tkankowo ukierunkowanego systemu ekspresji poprzez zastosowanie techniki edycji genomu opartej na "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated" (CRISPR/Cas). W tej metodzie endonukleaza Cas9 jest kierowana przez dwa chimeryczne przewodnikowe RNA (gRNA) do określonych miejsc w pierwszym egzonie kodującym genu w genomie Drosophila w celu wytworzenia pęknięć dwuniciowych (DSB). Następnie, wykorzystując egzogenny plazmid dawcy zawierający sekwencję transaktywatora, autonomiczna maszyneria naprawcza komórki umożliwia naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) DSB, co skutkuje precyzyjną delecją i zastąpieniem eksonu sekwencją transaktywatora. Wbity transaktywator ulega ekspresji wyłącznie w komórkach, w których funkcjonalne są cis-regulatorowe elementy zastąpionego genu. Przedstawiony tutaj szczegółowy protokół krok po kroku do generowania binarnego sterownika transkrypcyjnego ulegającego ekspresji w komórkach nabłonkowych/neuronalnych Drosophila fgf / bezgałęziowych może być przyjęty do dowolnej ekspresji specyficznej dla genu lub tkanki.

Introduction

Genetyczny zestaw narzędzi do ukierunkowanej ekspresji genów został dobrze rozwinięty u Drosophila, co czyni go jednym z najlepszych systemów modelowych do badania funkcji genów zaangażowanych w różnorodne procesy komórkowe. Binarne systemy ekspresji, takie jak drożdże Gal4/UAS (sekwencja aktywacji upstream), zostały po raz pierwszy przyjęte do wychwytywania specyficznych tkankowo wzmacniaczy i nieprawidłowej ekspresji genów w modelu genetycznym Drosophila¹ (Rysunek 1). System ten umożliwił opracowanie wielu technik, takich jak czasoprzestrzenna regulacja nadekspresji genów, błędna ekspres....

Protocol

1. Projektowanie i konstruowanie wektora ekspresji gRNA

1. Aby precyzyjnie zastąpić długi zdefiniowany region eksonu, należy użyć podejścia z podwójnym gRNA⁶, w którym każdy gRNA może specyficznie celować w dwa końce wybranego regionu zainteresowania. Aby uzyskać dokładną, specyficzną dla genu czasoprzestrzenną ekspresję sterownika, wybierz dwa miejsca docelowe gRNA w pierwszym egzonie kodującym genu.
2. W przypadku Drosophila melanogaster wybierz miejsca docelowe gRNA za pomocą narzędzia flyCRISPR Optimal Target Finder (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Można również korzystać z innych dost....

Results

Ten protokół został z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania docelowego systemu raportowania wyrażeń binarnych specyficznego dla komórek wyrażających btl⁵. Elementy cis-regulatorowe (CRE), które kontrolują złożoną czasoprzestrzenną ekspresję btl, nie są scharakteryzowane. Dlatego, aby osiągnąć ekspresję czasoprzestrzenną pod kontrolą endogennej sekwencji regulatorowej bln, zaprojektowano tylko pierwszy kodujący ekson bln

Discussion

Tradycyjnie, pułapki wzmacniające Drosophila były generowane dwiema różnymi metodami. Jednym ze sposobów jest losowa insercja sekwencji sterownika (np. Gal4) do genomu poprzez transpozycję (np. transpozycję elementu P)¹ . Alternatywnie, sekwencje sterujące można umieścić pod kontrolą transkrypcyjną domniemanego regionu wzmacniacza / promotora w konstrukcie plazmidowym, który następnie zostałby zintegrowany z ektopowym miejscem genomu ^3,11

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	klonowanie
LB-Agar	BD Difco	BD  244520	klonowanie
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Biologia molekularna
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Biologia molekularna
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Biologia molekularna
UltraPure Woda wolna od DNaz / RNaz	ThermoFisher Scientific	10977-023	Biologia molekularna
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Biologia molekularna
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Biologia molekularna
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Biologia molekularna
GeneJET Miniprep	ThermoFisher	Scientific K0503
Miniprep PureLink HiPure Plasmid Maxipep Zestawy	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Resrogacyjne
startery	enzymatyczne IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		Matryca i wektor DNA dla gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-wysoka wierność Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	Składanie DNA
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		Matryca DNA do amplifikacji LexA
Proteinaza K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, z barwnikiem (czerwony)	Sydlab	MB067-EQ2R	Biologia molekularna
Zestaw do elucji żelu	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Odczynnik
	TRI do biologii molekularnejSigma-Aldrich		Biologia molekularna
Zestawy do oczyszczania RNA z bezpośrednim zolem	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Biologia molekularna
OneTaq Jednoetapowy zestaw RT-PCR	NEB	E5315S	Biologia molekularna
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8: GFP	Laboratorium Kornberga		Linia muchowa
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Mikroskop konfokalny SP5X	Leica		Imaging Wzór ekspresji
CO2 stacja	Genesee Scientific	59-122WCU	pchanie muchy
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZ-61	pchanie muchy
Tłuczki homogenizujące do mikroprobówek	Fisher-Scientific	03-421-217	do izolacji genomowego DNA
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-1000	Kwantyfikacja DNA