Artykuł metodologiczny

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

DOI:

10.3791/58268

⸱

19 września 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Binarne systemy transkrypcyjne to potężne narzędzia genetyczne szeroko stosowane do wizualizacji i manipulowania losem komórek oraz ekspresją genów w określonych grupach komórek lub tkanek w organizmach modelowych. Systemy te zawierają dwa składniki jako oddzielne linie transgeniczne. Linia sterująca wyraża aktywator transkrypcji pod kontrolą specyficznych tkankowo promotorów / wzmacniaczy, a linia reporterowa / efektorowa zawiera gen docelowy umieszczony poniżej miejsca wiązania aktywatora transkrypcji. Zwierzęta, w których znajdują się oba składniki, indukują specyficzną tkankowo transaktywację docelowej ekspresji genu. Precyzyjna czasoprzestrzenna ekspresja genu w docelowych tkankach ma kluczowe znaczenie dla bezstronnej interpretacji aktywności komórki/genu. W związku z tym niezbędne jest opracowanie metody generowania wyłącznych linii sterujących specyficznych dla komórek/tkanek. W tym miejscu przedstawiamy metodę generowania wysoce specyficznego tkankowo ukierunkowanego systemu ekspresji poprzez zastosowanie techniki edycji genomu opartej na "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated" (CRISPR/Cas). W tej metodzie endonukleaza Cas9 jest kierowana przez dwa chimeryczne przewodnikowe RNA (gRNA) do określonych miejsc w pierwszym egzonie kodującym genu w genomie Drosophila w celu wytworzenia pęknięć dwuniciowych (DSB). Następnie, wykorzystując egzogenny plazmid dawcy zawierający sekwencję transaktywatora, autonomiczna maszyneria naprawcza komórki umożliwia naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) DSB, co skutkuje precyzyjną delecją i zastąpieniem eksonu sekwencją transaktywatora. Wbity transaktywator ulega ekspresji wyłącznie w komórkach, w których funkcjonalne są cis-regulatorowe elementy zastąpionego genu. Przedstawiony tutaj szczegółowy protokół krok po kroku do generowania binarnego sterownika transkrypcyjnego ulegającego ekspresji w komórkach nabłonkowych/neuronalnych Drosophila fgf / bezgałęziowych może być przyjęty do dowolnej ekspresji specyficznej dla genu lub tkanki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetyczny zestaw narzędzi do ukierunkowanej ekspresji genów został dobrze rozwinięty u Drosophila, co czyni go jednym z najlepszych systemów modelowych do badania funkcji genów zaangażowanych w różnorodne procesy komórkowe. Binarne systemy ekspresji, takie jak drożdże Gal4/UAS (sekwencja aktywacji upstream), zostały po raz pierwszy przyjęte do wychwytywania specyficznych tkankowo wzmacniaczy i nieprawidłowej ekspresji genów w modelu genetycznym Drosophila1 (Rysunek 1). System ten umożliwił opracowanie wielu technik, takich jak czasoprzestrzenna regulacja nadekspresji genów, błędna ekspresja, nokaut w wybranych grupach komórek, a także ablacja komórek, znakowanie komórek, śledzenie na żywo procesów komórkowych i molekularnych w zarodkach i tkankach, śledzenie linii i analizy mozaiki podczas rozwoju. Wiele binarnych systemów transkrypcji, takich jak bakteryjny system operacyjny LexA/LexA (Ryc. 1) i system Q Neurospora, to potężne narzędzia genetyczne, które są obecnie szeroko stosowane u Drosophila, oprócz oryginalnego systemu Gal4/UAS do ukierunkowanej ekspresji genów1,2,3.

Tutaj prezentujemy metodę generowania wysoce niezawodnego systemu ekspresji binarnej specyficznego dla tkanki za pomocą techniki edycji genomu. Ostatnie postępy w technologii edycji genomu CRISPR/Cas9 umożliwiły bezprecedensowe możliwości dokonywania ukierunkowanych zmian w genomie w szerokim zakresie organizmów. W porównaniu z innymi dostępnymi technikami edycji genomu, system CRISPR/Cas9 jest niedrogi, wydajny i niezawodny. Technologia ta wykorzystuje składniki bakteryjnego adaptacyjnego układu odpornościowego: endonukleazę Cas9 Streptococcus pyogenes, która tworzy pęknięcie dwuniciowe (DSB), oraz chimeryczny przewodnik RNA (gRNA), który kieruje Cas9 do określonego miejsca genomu dla docelowego DSB4. Komórki zawierają maszynerię do naprawy DSB przy użyciu różnych ścieżek. Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) prowadzi do małych insercji lub delecji w celu zakłócenia funkcji genu, podczas gdy naprawa ukierunkowana na homologię (HDR) wprowadza zdefiniowane ukierunkowane/pożądane genomowe wejście/nokaut poprzez użycie egzogennego dawcy HDR jako szablonu. Strategia zastępowania oparta na HDR może być skutecznie wykorzystana do wygenerowania wysoce niezawodnego specyficznego tkankowo systemu ekspresji binarnej, który może przezwyciężyć wszystkie ograniczenia tradycyjnych metod pułapek wzmacniających. Opisujemy krok po kroku procedurę wykorzystania naprawy HDR opartej na CRISPR / Cas9 w generowaniu binarnej linii sterownika transkrypcji, która ulega ekspresji pod kontrolą endogennej regulacji transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej genu Drosophila. W tym protokole demonstrujemy generowanie linii sterującej specyficznej dla genu bezgałęziowego (bnl) kodującego białko z rodziny FGF, które reguluje rozgałęzioną morfogenezę nabłonka tchawicy dróg oddechowych5. W tym przykładzie pierwszy kodujący egzon genu bnl został zastąpiony sekwencją bakteryjnej sekwencji transaktywatora LexA bez zmiany jakichkolwiek endogennych sekwencji cis-regulatorowych genu bln. Pokazujemy, że strategia wygenerowała linię napędową bnl-LexA, która czasoprzestrzennie kontroluje ekspresję genu reporterowego umieszczonego poniżej LexAoperator (LexAop lub LexO) wyłącznie w komórkach nabłonkowych / mezenchymalnych / neuronalnych wykazujących ekspresję bnl.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i konstruowanie wektora ekspresji gRNA

  1. Aby precyzyjnie zastąpić długi zdefiniowany region eksonu, należy użyć podejścia z podwójnym gRNA6, w którym każdy gRNA może specyficznie celować w dwa końce wybranego regionu zainteresowania. Aby uzyskać dokładną, specyficzną dla genu czasoprzestrzenną ekspresję sterownika, wybierz dwa miejsca docelowe gRNA w pierwszym egzonie kodującym genu.
  2. W przypadku Drosophila melanogaster wybierz miejsca docelowe gRNA za pomocą narzędzia flyCRISPR Optimal Target Finder (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Można również korzystać z innych dostępnych narzędzi do projektowania CRISPR, w tym narzędzia Optimized CRISPR Design (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) i E-CRISP (www.e-crisp.org/E-CRISP).
    UWAGA: Poniższe protokoły projektowania i klonowania gRNA zostały zaadoptowane z metod opisanych wcześniej6,7.
    1. Skopiuj rzeczywistą sekwencję do pola znajdującego się w narzędziu online. Wybierz najnowszą wersję adnotacji genomu Drosophila melanogaster, "r_6", z menu rozwijanego "Wybierz genom". W polu "Wybierz długość prowadnicy (nt)" wprowadź"20. Wybierz, aby znaleźć "Wszystkie cele CRISPR" i kliknij "Znajdź cele CRISPR".
    2. Oceń wszystkie kandydujące cele gRNA, ustawiając "Maksimum" dla "Rygorystyczności" i "Tylko NGG" dla "PAM". Spróbuj wybrać miejsca gRNA bez żadnych potencjalnych niedocelowych lub minimalnej możliwej liczby niedocelowych. Użyj narzędzia internetowego opisanego w Doench et al. 2014 8, aby wybrać gRNA z potencjalnym "dobrym" wynikiem aktywności.
    3. Jednocześnie upewnij się, że nie ma polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w celach gRNA w genomie macierzystej linii muchowej wybranej do wstrzyknięcia (np. nos-Cas9 na chromosomie X, BL# 54591). Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w Gratz et al. 20157, aby wyodrębnić genomowe DNA z macierzystej linii muchy. PCR amplifikuje w przybliżeniu regiony 500-1,000 nt za pomocą starterów, które otaczają sekwencję zainteresowania i polimerazy DNA o wysokiej wierności; zweryfikuj sekwencyjnie produkty amplifikowane metodą PCR.
  3. Aby wygenerować tandemowy wektor ekspresji gRNA, postępuj zgodnie z niezależnym od ligacji protokołem klonowania6, aby wprowadzić dwie sekwencje protospacer do wektora ekspresji RNA pCFD4. Należy zauważyć, że obecnie dostępny jest ulepszony wektor ekspresji multi-gRNA (pCFD5), w którym oba sgRNA są wyrażane z silnych promotorów U6:39 (https://www.crisprflydesign.org). Użyj metody składania DNA, aby sklonować gRNA do wektora pCFD4.
    1. Zaprojektuj i uporządkuj startery do przodu i do tyłu do wprowadzenia dwóch sekwencji protospacerowych do wektora ekspresji RNA pCFD4 (tabela 1A). Jak wcześniej opisano6, starter forward zawiera pierwszą sekwencję protospacer otoczoną regionami odpowiadającymi promotorowi U6-1 i rdzeniowi gRNA w pCFD4; odwrócony starter zawiera odwrotną sekwencję dopełniacza drugiego protospacera otoczoną regionami odpowiadającymi rdzeniowi gRNA i promotorowi U6-3 w pCDF4.
    2. Zawiesić startery do 100 μM za pomocą wody podwójnie destylowanej wolnej od DNaz i RNaz (ddH2O). Wykonaj 10 μM podkład o stężeniu roboczym. Użyj plazmidu pCFD4 jako matrycy i ustaw reakcję PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności i zalecanych ustawień dla reakcji PCR6.
    3. Aby sklonować amplifikowany produkt do pCFD4, należy przetrawić plazmid pCFD4 z enzymem BbsI, przeprowadzając następującą reakcję: 2–5 μg plazmidu pCFD4, 5 μl 10x buforu do wytrawiania, 1 μl enzymu BbsI i ddH2O, aby doprowadzić końcową objętość do 50 μL. Wymieszaj zawartość reakcji, delikatnie stukając w probówkę i zbierając wszystkie rozproszone kropelki ze ścianki probówki do dno przez krótkie obrócenie. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    4. Uruchom produkt PCR z kroku 2, a produkt strawiony z kroku 3 na 1% żelu agarozowym. Wykonuj elektroforezę przez wystarczająco dużo czasu, aby całkowicie oddzielić prążki DNA. Wytnij pasma DNA o odpowiedniej wielkości pod oświetlaczem UV przed oczyszczeniem oczekiwanych produktów za pomocą kolumny elucyjnej żelu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Iloczyn PCR powinien mieć wartość 600 pz, a zlinearyzowany plazmid pCFD4 powinien mieć wartość ~6,4 kb 6.
    5. Ustawić reakcję składania DNA w probówce do PCR, zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów).
    6. Przekształć 2 μl produktu zespołu w kompetentne bakterie (DH5α lub podobne szczepy z ΔrecA1, ΔendA1), ułożyć na płytce agarowej z ampicyliną (100 μg/ml) zawierającą LB (LB/Amp) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Należy pamiętać, że mieszanka złożeniowa DNA może być toksyczna dla niektórych szczepów bakterii, ale rozcieńczenie mieszanki montażowej może zmniejszyć toksyczność.
    7. Wybierz 3-4 kolonie odporne na ampicylinę z płytki inkubowanej przez noc, zaszczep kolonię w 3 ml LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny i hoduj zaszczepione bakterie w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez noc. Ekstrahuj plazmid z bakterii hodowanych przez noc za pomocą zestawu mini-przygotowania plazmidu zgodnie z instrukcją producenta (patrz tabela materiałów).
    8. Sekwencjonuj plazmidy za pomocą uniwersalnego startera T3, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem prawidłowych klonów zawierających tandemową insercję gRNA. Utwórz zapas glicerolu bakterii przekształconych za pomocą zweryfikowanego sekwencyjnie pCFD4-gRNA w 20% glicerolu i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Projektowanie i budowa dawcy HDR

  1. W celu genomowego knock-in sekwencji Gal4 lub LexA należy zaprojektować dwuniciowy donor HDR zawierający sekwencję transaktywatora otoczoną dwoma ramionami homologicznymi.
    1. Użyj >1,5 kb lewego i prawego ramienia homologicznego otaczającego miejsce (miejsca) celowania gRNA. Rozszerzone ramiona homologiczne zwiększają wydajność HDR podczas procesu naprawy 10.
    2. PCR amplifikuje ramiona homologii z genomowego DNA (gDNA) wyekstrahowanego z macierzystej linii muchowej wybranej do wstrzyknięcia (np. nos-Cas9 (na chromosomie X), BL# 54591). Użyj enzymu polimerazy Taq-DNA o gorącym starcie, odpowiedniego do długiego wydłużania PCR (patrz tabela materiałów). Weryfikacja sekwencji.
  2. Aby uniknąć przekierowania gRNA do zmodyfikowanego locus, zaprojektuj zastępczego dawcę w taki sposób, aby miejsca rozpoznawania gRNA zostały zakłócone przez wprowadzoną sekwencję egzogenną.
    UWAGA: aby uniknąć zmiany przypuszczalnych elementów cis-regulatorowych, zawsze wybieraj miejsca rozpoznawania gRNA w regionie egzonu kodującego.
  3. Aby wygenerować kasetę zastępczą, zaplanuj strategię składania DNA, aby połączyć ze sobą cztery segmenty: ramiona homologii 5' i 3', środkową egzogenną sekwencję DNA transaktywatora i zlinearyzowany szkielet wektora klonowania (np. pUC19 lub inne powszechnie używane wektory klonujące). Postępując zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi składania DNA (patrz Tabela materiałów), zaprojektuj odpowiednie startery do amplifikacji PCR i montażu każdego segmentu. Zawiesić podkłady do 100 μM za pomocą ddH2O. Wykonać 10 μM podkład o stężeniu roboczym. Używaj polimerazy o wysokiej wierności do wszystkich reakcji PCR. Postępuj zgodnie z następującym protokołem:
    1. PCR amplifikuje kasetę ekspresji Gal4 lub LexA z dostępnego wektora (np. nls-LexA: p65; idealne plazmidy ekspresji Gal4 / LexA / QF2 można znaleźć i uzyskać z powszechnych zasobów, takich jak Addgen) przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1B.
      1. Aby zachować wszystkie oryginalne regulacje transkrypcyjne i potranskrypcyjne zastąpionego eksonu dotyczące ekspresji sekwencji DNA transaktywatora, zaprojektuj kasetę w taki sposób, aby edytowany allel genomowy wyrażał chimeryczne mRNA transaktywatora i genu. Zachowaj koniec 5' i 3' docelowego eksonu, aby zachować wszelki sygnał splicingu.
      2. Włącz sekwencję peptydu samorozszczepiającego T2A między resztkowym eksonem kodującym 5' a sekwencją transaktywatora, aby zapobiec translacji do białka chimerycznego. Dodaj kodon stop translacji po egzogennej sekwencji transaktywatora (Rysunek 5).
    2. PCR amplifikuje ramiona homologii z genomowego DNA (gDNA) wyekstrahowanego z rodzicielskiej linii muchowej wybranej do wstrzyknięcia (np. nos-Cas9 (na chromosomie X), BL# 54591) przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1B. Używaj polimerazy o wysokiej wierności do wszystkich reakcji PCR przy użyciu systemów w następujący sposób: 5 μl 5x buforu reakcyjnego, 0,5 μl 10 mM dNTP, 1,25 μl 10 μM startera do przodu, 1,25 μl 10 μM startera odwrotnego, 0,5 μl matrycy DNA, 0,25 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności, 16,25 μL ddH2O.
    3. Użyj linearyzowanego wektora klonowania, takiego jak pUC19. Obecnie dostępnych jest wiele wektorów dawcy. Zobacz pełną listę na następującej stronie internetowej: http://flycrispr.molbio.wisc.edu.
    4. Uruchom produkty PCR na 1% żelu agarozowym. Wykonuj elektroforezę przez wystarczająco dużo czasu, aby zapewnić wyraźne oddzielenie pożądanego pasma od niepożądanych pasm niespecyficznych (jeśli występują). Żelem oczyść oczekiwane fragmenty DNA. Zmierzyć stężenie każdego oczyszczonego fragmentu DNA za pomocą spektrofotometru.
    5. Ustaw reakcję składania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszać zlinearyzowany wektor klonowania i fragmenty docelowe z etapu 3 i kroku 4 w następującej reakcji: 1 μl liniowego wektora klonowania (50 ng/μL), 2–3-krotny nadmiar każdego fragmentu docelowego, 10 μL 2x mieszanina główna zespołu DNA, doprowadzić końcową objętość reakcji do 20 μl za pomocą ddH2O. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.
    6. Przekształć 2 μl produktu montażowego w kompetentne bakterie, płytka na płytkach agarowych LB/Amp zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Dodaj również X-Gal + IPTG na płytce, aby uzyskać niebieskie/białe ekranowanie.
    7. Wybierz 3-4 białe kolonie z płytki inkubowanej przez noc, zaszczep kolonię w 3 ml LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny i hoduj w temperaturze 37 °C przez noc w shakerze. Ekstrahuj plazmid z bakterii hodowanych przez noc za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów).
    8. Przebadaj dodatnią kolonię za pomocą PCR lub trawienia restrykcyjnego.
    9. Sekwencja zweryfikuj region dawcy HDR końcowego plazmidu. Zachowaj zapas bakterii przekształcony za pomocą odpowiednich klonów w 20% glicerolu w temperaturze -80 °C do przyszłej inokulacji.

3. Wstrzykiwanie zarodków, genetyka much i badania przesiewowe w celu edycji genomu

  1. Przygotuj wektor ekspresyjny gRNA wolny od endotoksyn o wysokiej czystości, a także plazmid dawcy HDR za pomocą zestawu maxiprep plazmidu (patrz Tabela materiałów).
  2. Jednoczesne wstrzyknięcie plazmidu ekspresji gRNA (100 ng / μL) i dawcy zastępczego (500 ng / μL) do linii zarodkowej zarodków nos-Cas9 6. Uwaga: korzystamy z komercyjnej usługi iniekcji, ale ta procedura może być również wykonana w laboratorium.
  3. Genetyka much i badania przesiewowe (Rysunek 2 i Rysunek 3):
    1. Kiedy wstrzyknięte zarodki rozwiną się w dorosłe osobniki, skrzyżuj każdą pojedynczą muchę G0 z muchami równoważącymi. Należy wybrać odpowiedni równoważnik dla chromosomu zawierającego docelowy allel.
    2. Znieczulij potomstwo F1 z każdej krzyżówki G0 na podkładce CO2 i losowo wybierz 10-20 samców pod mikroskopem stereoskopowym. Skrzyżuj je pojedynczo z samicami balansera, jak pokazano na Rysunek 3.
    3. Kiedy wykluwają się larwy F2, wybierz pojedynczego ojca F1 z każdej krzyżówki i wyekstrahuj gDNA za pomocą protokołu przygotowania genomowego DNA pojedynczej muchy:
      1. Przygotuj bufor do ekstrakcji gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować 20 mg/ml roztworu podstawowego proteinazy K i przechowywać w zamrażarce.
      2. Umieść każdą muchę w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i oznacz probówkę. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez noc.
      3. Przygotować świeżą objętość roboczą buforu do ekstrakcji gDNA zawierającego 200 μg/ml końcowego stężenia proteinazy K.
        Uwaga: Na tym etapie nie używaj starego bufora.
      4. Zgniataj każdą muchę przez 10–15 s za pomocą końcówki pipety zawierającej 50 μl buforu do zgniatania bez dozowania płynu. Wlej pozostały bufor do probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20–30 minut.
      5. Umieścić probówki w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C na 1-2 minuty, aby dezaktywować proteinazę K.
      6. Wiruj przez 5 minut przy 10 000 x g. Przechowywać preparat w temperaturze 4 °C do dalszej analizy PCR.
  4. Użyj tej samej metody do przygotowania gDNA z muchy nos-Cas9, która służy jako kontrola negatywna. Wykonaj trzyetapowe badania przesiewowe oparte na PCR, aby zidentyfikować prawidłowy HDR "kończy się" (Rysunek 2, Rysunek 5) przy użyciu gDNA każdego samca F1 jako szablonu5. Użyj 1 μl preparatu DNA w następującym systemie reakcyjnym PCR: 10 μl 2x PCR Master Mix z barwnikiem, 1 μl każdego startera (10 μM), 1 μl matrycy DNA i 7 μl ddH2O.
  5. Jak pokazano na Rysunek 5A, wykonaj PCR przy użyciu starterów fwd1 i rev1, aby sprawdzić, czy doszło do insercji lub wymiany; wykonaj PCR przy użyciu starterów fwd2 i rev2, aby zweryfikować wstawienie lub zamianę z regionu 3'; wykonaj PCR przy użyciu starterów M13F i rev3, aby sprawdzić "ends-in" HDR (Tabela 1C).
  6. Utrzymuj linki muchowe z potwierdzonym HDR na końcu i ustal zrównoważone zapasy od generacji F2. Krzyżowanie z balanserem leci ponownie, aby usunąć wszelkie niezamierzone mutacje na innych chromosomach.
  7. Przygotuj wysokiej jakości gDNA z uznanych zapasów do amplifikacji długiego PCR (>800–1,000 nt) za pomocą polimerazy Taq o wysokiej wierności i w pełni zweryfikuj amplikony uzyskane ze zmodyfikowanych regionów genomu. Alternatywnie, użyj surowego ekstraktu gDNA, jak opisano wcześniej, aby amplifikować krótsze (<800 nt), nakładające się na siebie produkty PCR w celu walidacji sekwencjonowania edytowanego genomu. Użyj następującego protokołu, aby przygotować dobrej jakości genomowe DNA Drosophila:
    1. Umieść około 25 dorosłych much w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i zamrażaj w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Dodać 250 μl roztworu A (pH 9,0, Tris HCl 0,1 M, EDTA 0,1 M, SDS 1%).
    3. Homogenizować muchy za pomocą tłuczków homogenizujących w probówkach do mikrowirówek i umieścić probówkę na lodzie.
    4. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut.
    5. Dodać 35 μl KOAc (5 M), wstrząsnąć i dobrze wymieszać, ale nie wirować.
    6. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
    7. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 15 minut.
    8. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml ostrożnie przenieść tylko klarowny supernatant do nowej probówki, pozostawiając osad lub interfazę.
    9. Dodać 150 μl izopropanolu do supernatantu. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.
    10. Wirować z prędkością 10 000 x g przez 5 minut.
    11. Ostrożnie usunąć supernatant i pozostawić osad w probówce.
    12. Przemyć granulki 1 ml 70% EtOH.
    13. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 5 minut.
    14. Usunąć supernatant. Suszyć pelety na powietrzu przez 15 do 20 minut. Nie przesuszaj granulek.
    15. Rozpuścić osad w 100 μl ddH2O.
    16. Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności odpowiedniej dla długich amplikonów (>800 pz), aby amplifikować cały edytowany region. Najlepiej wziąć dwa startery na zewnątrz włożonej kasety, aby wzmocnić region genomu. Żel oczyść produkt PCR i, jak opisano wcześniej, zweryfikuj produkt sekwencyjnie za pomocą wielu nakładających się starterów.
  8. Zweryfikuj prawidłowe wzorce ekspresji czasoprzestrzennej z wypreparowanych tkanek/zarodków zmodyfikowanych linii much:
    1. Wykonaj RT-PCR z całkowitego RNA, aby zweryfikować ekspresję hybrydowego produktu mRNA (Tabela 1D).
    2. Przeprowadzić hybrydyzację in situ produktu mRNA będącego przedmiotem zainteresowania w tkankach larwalnych/zarodku, aby potwierdzić ekspresję.
    3. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem dokładnych specyficznych dla tkanki wzorców ekspresji czasoprzestrzennej wśród zweryfikowanych sekwencyjnie linii końcowych, skrzyżuj każdą z edytowanych linii uzyskanych dla binarnego sterownika ekspresji z linią LexO-GFP lub LexO-RFP (dla sterownika LexA) (dostępną w centrach magazynowych Bloomington) i obserwuj ekspresję genu reporterowego sterowanego przez LexA lub Gal4 w tkankach zarodka, larwy i dorosłego pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania docelowego systemu raportowania wyrażeń binarnych specyficznego dla komórek wyrażających btl5. Elementy cis-regulatorowe (CRE), które kontrolują złożoną czasoprzestrzenną ekspresję btl, nie są scharakteryzowane. Dlatego, aby osiągnąć ekspresję czasoprzestrzenną pod kontrolą endogennej sekwencji regulatorowej bln, zaprojektowano tylko pierwszy kodujący ekson bln

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjnie, pułapki wzmacniające Drosophila były generowane dwiema różnymi metodami. Jednym ze sposobów jest losowa insercja sekwencji sterownika (np. Gal4) do genomu poprzez transpozycję (np. transpozycję elementu P)1 . Alternatywnie, sekwencje sterujące można umieścić pod kontrolą transkrypcyjną domniemanego regionu wzmacniacza / promotora w konstrukcie plazmidowym, który następnie zostałby zintegrowany z ektopowym miejscem genomu 3,11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. F. Portowi, Dr. K. O'Connor-Gilesowi i Dr. S. Fengowi za dyskusje na temat strategii CRISPR; Dr. T.B. Kornbergowi i Bloomington Stock Center za odczynniki; Podstawowe urządzenie do obrazowania UMD; oraz finansowanie z NIH: R00HL114867 i R35GM124878 do SR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218klonowanie
LB-AgarBD DifcoBD  244520klonowanie
Tris-HClSigma AldrichT3253Biologia molekularna
EDTASigma AldrichE1161Biologia molekularna
NaClSigma AldrichS7653Biologia molekularna
UltraPure Woda wolna od DNaz / RNazThermoFisher Scientific10977-023Biologia molekularna
10% SDSSigma Aldrich71736Biologia molekularna
KOAcFisher-ScientificP1190Biologia molekularna
EtOHFisher-Scientific04-355-451Biologia molekularna
GeneJET MiniprepThermoFisherScientific K0503
Miniprep PureLink HiPure Plasmid Maxipep ZestawyThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539SResrogacyjne
starteryenzymatyczne IDT-DNAPCR
pCFD4Kornberg LabMatryca i wektor DNA dla gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-wysoka wierność TaqNEBNEB #M0491PCR
Gibson Assembly Master MixNEBNEB #E2611Składanie DNA
pBPnlsLexA:p65UwAddgeneMatryca DNA do amplifikacji LexA
Proteinaza KThermoFisher Scientific25530049Molecular Biology
2x PCR PreMix, z barwnikiem (czerwony)SydlabMB067-EQ2RBiologia molekularna
Zestaw do elucji żeluZymo Research (Genesee Scientific)11-300Odczynnik
TRI do biologii molekularnejSigma-AldrichBiologia molekularna
Zestawy do oczyszczania RNA z bezpośrednim zolemZymo Research (Genesee Scientific)11-330Biologia molekularna
OneTaq Jednoetapowy zestaw RT-PCRNEBE5315SBiologia molekularna
lexO-CherryCAAXKornberg LabFly line
UAS-CD8: GFPLaboratorium KornbergaLinia muchowa
btl-Gal4Kornberg labFly line
MKRS/TB6BKornberg labFly line
Mikroskop konfokalny SP5XLeicaImaging Wzór ekspresji
CO2 stacjaGenesee Scientific59-122WCUpchanie muchy
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZ-61pchanie muchy
Tłuczki homogenizujące do mikroprobówekFisher-Scientific03-421-217do izolacji genomowego DNA
NanoDropThermoFisher ScientificND-1000Kwantyfikacja DNA
spektrofotometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
  3. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  4. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
  6. Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  7. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), 31.2.1-20 (2015).
  8. Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  9. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  10. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), Bethesda, Md. 657-664 (2013).
  11. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Lin, C. -C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
  13. Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CRISPR Cas9binarny system transkrypcyjnyekspresja tkankowo swoistaedycja genomu Drosophilanaprawa ukierunkowana homologiprojektowanie gRNAknock in transaktywatorazast powanie egzon wregulacja czasoprzestrzennasystem GAL4 LexA

Powiązane artykuły