Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58270

⸱

4 grudnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Hematology, Oncology and Immunology, University of Tübingen, 2Dept. of Endocrinology, Diabetology, Clinical Pathology and Metabolism, University of Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Streszczenie

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) charakteryzuje się ekspansją złośliwych klonów komórek B i stanowi najczęstszą białaczkę w krajach zachodnich. Większość pacjentów z PBL wykazuje powolny przebieg choroby, a także anergiczny fenotyp komórek białaczkowych, odnoszący się do receptora komórek B niereagującego na stymulację zewnętrzną. Niedawno wykazaliśmy, że czynnik transkrypcyjny NFAT2 jest kluczowym regulatorem anergii w PBL. Głównym wyzwaniem w analizie roli czynnika transkrypcyjnego w różnych chorobach jest identyfikacja jego specyficznych genów docelowych. Ma to ogromne znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów patogenetycznych i potencjalnych interwencji terapeutycznych. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest klasyczną techniką demonstrowania interakcji białko-DNA i dlatego może być stosowana do identyfikacji bezpośrednich genów docelowych czynników transkrypcyjnych w komórkach ssaków. W tym przypadku ChIP wykorzystano do identyfikacji LCK jako bezpośredniego genu docelowego NFAT2 w ludzkich komórkach CLL. DNA i związane z nim białka są sieciowane za pomocą formaldehydu, a następnie ścinane przez sonikację na fragmenty DNA o długości około 200-500 par zasad (bp). Usieciowane fragmenty DNA związane z NFAT2 są następnie selektywnie immunoprecypitowane z resztek komórkowych przy użyciu przeciwciała αNFAT2. Po oczyszczeniu powiązane fragmenty DNA są wykrywane za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Sekwencje DNA z wyraźnym wzbogaceniem reprezentują regiony genomu, które są celem NFAT2 in vivo. Odpowiednie ścinanie DNA i dobór wymaganego przeciwciała są szczególnie istotne dla skutecznego zastosowania tej metody. Protokół ten jest idealny do wykazania bezpośrednich interakcji NFAT2 z genami docelowymi. Jego głównym ograniczeniem jest trudność w zastosowaniu ChIP w testach na dużą skalę analizujących docelowe geny wielu czynników transkrypcyjnych w nienaruszonych organizmach.

Wprowadzenie

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) reprezentuje najczęstszą białaczkę u dorosłych w krajach zachodnich, wykazując wyraźną akumulację CD19, CD23 i CD5 wyrażających dojrzałe limfocyty B1. U większości pacjentów przebieg choroby przebiega powoli, co nie wymaga specjalnego leczenia przez wiele lat. W przeciwieństwie do tego, niektórzy pacjenci wykazują szybki postęp wymagający natychmiastowych interwencji terapeutycznych z chemioterapią immunologiczną lub innymi terapiami celowanymi2,3. Czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T (NFAT) to rodzina czynników transkrypcyjnych kontrolujących różne procesy rozwojowe i aktywacyjne w wielu typach komórek4,5,6. Niedawno wykazaliśmy nadekspresję i konstytucjonalną aktywację NFAT2 w komórkach PBL od pacjentów z powolną chorobą7. Tutaj reguluje stan braku reakcji na stymulację receptora limfocytów B zwany anergy7. Aby wykazać, że NFAT2 wiąże się z promotorem białkowej kinazy tyrozynowej (LCK) specyficznej dla limfocytów i reguluje ekspresję LCK w ludzkich komórkach CLL, opracowano i zastosowano specyficzny test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP).

ChIP to jedna z kilku technik do badania roli czynników transkrypcyjnych w ekspresji genów8. Ekspresja genów jest ściśle koordynowana w bardzo złożony sposób przez kilka regulatorów, w których czynniki transkrypcyjne odgrywają niezastąpioną rolę w tym procesie9,10,11,12. Czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję genów w kontekście przestrzennym i czasowym zostały zidentyfikowane u wielu gatunków (np. dla rozwoju i różnicowania)13,14,15,16,17,18. Błędy w skomplikowanych mechanizmach kontrolnych związanych z czynnikami transkrypcyjnymi mogą prowadzić do różnych procesów patologicznych, w tym raka19,20. W związku z tym identyfikacja czynników transkrypcyjnych i ich odpowiednich celów może zaoferować nowe ścieżki terapeutyczne21,22. Aby zbadać tę intrygującą dziedzinę, dostępnych jest kilka metod, takich jak ChIP, test przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA), różne testy ściągania DNA i testy reporterowe8,11,12,23,24.

Aby wykazać, że pewien czynnik transkrypcyjny oddziałuje z określonymi regionami genomu in vivo, ChIP jest idealną techniką25. W tym celu DNA i związane z nim białka w żywych komórkach są sieciowane za pomocą promieniowania UV lub formaldehydu (usieciowane ChIP, XChIP). Ten krok jest pomijany, aby uzyskać lepszy odzysk DNA i białka w tak zwanym natywnym ChIP (NChIP)26. Kompleksy DNA-białko są następnie ścinane przez sonikację na fragmenty około 200-500 par zasad (bp) i immunoprecypitowane z resztek komórkowych przy użyciu specyficznego przeciwciała przeciwko interesującemu czynnikowi transkrypcyjnemu. Powiązane fragmenty DNA są następnie oczyszczane i charakteryzowane za pomocą PCR, klonowania molekularnego i sekwencjonowania. Alternatywne techniki wykorzystują mikromacierze (ChIP-on-Chip) lub sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-Seq) do analizy immunoprecypitowanego DNA.

ChIP został po raz pierwszy wprowadzony przez Gilmoura i Lisa w 1984 roku, kiedy używali światła UV do kowalencyjnego sieciowania DNA i wiązania białek w żywych bakteriach27. Po lizie komórek i immunoprecypitacji bakteryjnej polimerazy RNA, specyficzne sondy znanych genów wykorzystano do mapowania dystrybucji i gęstości polimerazy RNA in vivo. Metoda ta została następnie wykorzystana przez tych samych badaczy do analizy rozkładu eukariotycznej polimerazy RNA II na genach białka szoku cieplnego w Drosophila28. Test XChIP został dodatkowo udoskonalony przez Varshavsky'ego i współpracowników, którzy jako pierwsi wykorzystali sieciowanie formaldehydu do zbadania związku histonu H4 z genami białka szoku cieplnego29,30. Podejście NChIP, które niesie ze sobą zaletę w postaci lepszej odzysku DNA i białka dzięki naturalnie nienaruszonym epitopom, a tym samym większej swoistości przeciwciał, zostało po raz pierwszy opisane przez Hebbesa i współpracowników w 198831.

Zaletą ChIP w porównaniu z innymi technikami analizy interakcji DNA-białko jest to, że rzeczywista interakcja czynnika transkrypcyjnego może być badana in vivo i nie stosuje się żadnych sond ani sztucznych warunków tworzonych przez lub żele8,11,12. Dzięki połączeniu ChIP z sekwencjonowaniem nowej generacji, można jednocześnie identyfikować wiele celów.

Głównymi ograniczeniami tej techniki jest jej ograniczone zastosowanie do testów na dużą skalę w nienaruszonych organizmach25. Analiza zróżnicowanych wzorców ekspresji genów może być również trudna przy użyciu technik ChIP, jeśli odpowiednie białka ulegają ekspresji tylko na niskich poziomach lub w wąskich oknach czasowych. Innym potencjalnie ograniczającym czynnikiem jest dostępność odpowiedniego przeciwciała odpowiedniego dla ChIP11.

Przedstawiony tutaj protokół ChIP może być wykorzystany do identyfikacji in vivo docelowych genów czynnika transkrypcyjnego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). W szczególności celem było zidentyfikowanie nowych genów docelowych NFAT2 w PBL. ChIP został wybrany ze względu na jego potencjał do bezpośredniego wykazania wiązania NFAT2 z regionami promotorowymi różnych genów docelowych w naturalnych warunkach w ludzkich komórkach pacjentów z PBL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na materiale ludzkim zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu w Tybindze i uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów, którzy dostarczyli próbki do tego badania.

1. Izolacja i stymulacja komórek Jurkata

UWAGA: Aby zoptymalizować protokół, użyj linii komórkowej Jurkat, która jest znana z ekspresji wysokiego poziomu NFAT2. Wszystkie kroki są wykonywane pod okapem z przepływem laminarnym.

  1. Przygotuj 50 ml RPMI 1640 uzupełnionego 10% FCS i 1% penicyliny/streptomycyny, podgrzewając go do 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Hodować komórki Jurkata przez 1-2 dni w kolbie hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w 20 ml RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS i 1% penicyliny/streptomycyny do gęstości około 2 x 106 komórek/ml (komórki liczy się za pomocą barwienia błękitem trypanowym i komory Neubauera pod mikroskopem) i zbiera je przez odwirowywanie przez 5 minut przy 200 x g.
  3. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w 10 ml RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS i 1% penicyliny/streptomycyny. Następnie policz komórki za pomocą konwencjonalnego barwienia błękitem trypanowym i komory Neubauera pod mikroskopem.
  4. Odwirować komórki z etapu 1.3 przez 5 minut przy 200 x g i usunąć supernatant przez aspirację. Następnie ponownie zawiesić komórki o gęstości 2 x 107 komórek/ml w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS i 1% penicyliny/streptomycyny i przenieść 1 ml do nowej konwencjonalnej probówki o pojemności 5 ml przez pipetowanie.
  5. Stymuluj komórki, dodając 12-mirystynian 13-octanu (PMA) i 1 μM jonomycyny. Następnie inkubować komórki przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy otwartej pokrywie probówki (w celu uniknięcia zanieczyszczenia można użyć folii uszczelniającej przepuszczającej powietrze).

2. Izolacja i stymulacja pierwotnych komórek PBL od pacjentów

UWAGA: Próbki pacjentów zostały pobrane i stymulowane zgodnie z wcześniejszym opisem7. Wszystkie kroki są wykonywane pod okapem z przepływem laminarnym.

  1. Przygotuj sprzęt niezbędny do pobrania krwi od pacjentów i przeprowadzenia separacji w gradinie gęstości: igły 21-G, opaska uciskowa, strzykawki do pobierania krwi NH 4-heparyny (np. S-monovettes), 1x PBS i podłoże o gradinie gęstości (gęstość 1,077 g / ml).
  2. Po wkłuciu żyły należy pobrać krew od pacjentów z PBL (ok. 40 ml krwi na pacjenta) do strzykawek. Następnie przenieś krew do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Umyć strzykawkę 10 ml PBS i umieścić zawiesinę PBS krwi w probówkach o pojemności 50 ml (dostosować liczbę probówek do objętości krwi).
  3. Przygotować 15 ml pożywki o gradiencie gęstości w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie ostrożnie nałożyć 35 ml zawiesiny PBS we krwi na podłoże o gradiencie gęstości. W tym celu należy trzymać probówkę pod płaskim kątem i powoli pipetować zawiesinę PBS krwi do dolnej ścianki probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Ponieważ w stożkowej probówce o pojemności 50 ml gromadzi się więcej zawiesiny PBS we krwi, należy zwiększyć kąt probówki do kąta prostego. Powtórzyć ten krok w zależności od objętości zawiesiny PBS we krwi.
  4. Przeprowadzić wirowanie przy 560 x g przez 20 minut (bez hamulca), a następnie wyekstrahować jednojądrzastą fazę komórkową, która zawiera jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC). W tym celu należy zebrać białą interfazę separacji w gradimencie gęstości za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i przenieść ją do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Napełnić zawiesinę komórkową do 50 ml PBS i odwirować przez 5 minut przy 360 x g. Usunąć supernatant przez aspirację. Powtórz ten krok z wirowaniem przez 5 minut przy 275 x g. Następnie połącz komórki jednego pacjenta w 5-10 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  6. Policz komórki zgodnie z opisem w 1.3.
    UWAGA: Zależy to od proporcji komórek CLL w izolowanych PBMC, czy komórki mogą być użyte bezpośrednio do tej procedury, czy też należy przeprowadzić izolację komórek B, np. poprzez magnetyczne sortowanie komórek (MACS). Izolacja limfocytów B jest zalecana, ale można ją pominąć, jeśli odsetek komórek PBL przekracza 95% wszystkich limfocytów (oznaczonych za pomocą cytometrii przepływowej). Krew pacjentów z PBL jest utrwalana i poddawana lizie zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie przeprowadza się barwienie przeciwciałami CD19-FITC i CD5-PE zgodnie z instrukcjami producenta, a komórki analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej. Jeden przykładowy pacjent jest pokazany w Rycina 1, w której odsetek komórek CLL wynosi 89,03%. W związku z tym u tego pacjenta należy wykonać izolację limfocytów B. Odsetek fizjologicznych limfocytów B jest znikomy (3,72% w przykładzie).
  7. Przemyć komórki 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) RPMI 1640 uzupełnionego 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny, 100 mM aminokwasów endogennych, 1 mM pirogronianu sodu i 50 mM β-merkaptoetanolu przez 5 minut przy 200 x g i usunąć supernatant przez aspirację.
  8. Dostosuj komórki do 2 x 107 komórek/ml w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny, 100 mM aminokwasów endogennych, 1 mM pirogronianu sodu i 50 mM β-merkaptoetanolu (37 °C) i napełnij 1 ml zawiesiny komórek do probówki o pojemności 5 ml.
    UWAGA: ẞ-merkaptoetanol jest stosowany w celu przeciwdziałania stresowi oksydacyjnemu.
  9. Stymuluj komórki, dodając 32,4 nM PMA i 1 μM jonomycynę. Następnie inkubować komórki przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy otwartej pokrywie probówki (w celu uniknięcia zanieczyszczenia można użyć folii uszczelniającej przepuszczającej powietrze).
    UWAGA: Aby zmniejszyć poziom stresu, komórki mogą być odpoczywane przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze przed 16 godzinną stymulacją.

3. Utrwalanie, liza komórek i ścinanie chromatyny

UWAGA: Próbki pacjentów i komórki Jurkat są utrwalane i poddawane lizie za pomocą dostępnego na rynku zestawu ChIP zgodnie z instrukcjami producenta z modyfikacjami opisanymi wcześniej7. Mocowanie odbywa się pod okapem z przepływem laminarnym.

  1. Przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml z 1 ml 37% formaldehydu, probówkę o pojemności 1,5 ml z 1 ml 1,25 M glicyny, probówkę o pojemności 5 ml z 4 ml 1x PBS i pudełko z lodem do utrwalenia komórek.
  2. Po stymulacji komórek przez odpowiedni czas inkubacji w kroku 1.5 lub 2.9, należy obracać probówki o pojemności 5 ml przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS w probówkach o pojemności 5 ml.
  3. Dodaj 340 μM formaldehydu (13,5 μl 37% formaldehydu) do komórek. Po krótkim wymieszaniu, ostrożnie pipetując w górę i w dół, inkubować zawiesinę przez 2,5 minuty (komórki Jurkata) lub 5 minut (próbka pacjenta) w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W przypadku komórek pierwotnych potrzebny jest wydłużony czas utrwalania, aby zapewnić optymalne ścinanie.
  4. Dodać 125 mM glicyny (57 μl z 1,25 M glicyny), aby zatrzymać utrwalanie i inkubować przez kolejne 5 minut. Natychmiast po tym umieścić komórki na lodzie i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant przez aspirację.
  5. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml lodowatego PBS o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i za każdym razem usunąć supernatant przez aspirację.
    UWAGA: Po utrwaleniu protokół może zostać wstrzymany. Stałe ogniwa należy przechowywać w temperaturze -80 °C. W celu zbadania, czy epitop przeciwciała przeznaczonego do użycia w poniższym protokole nie jest zamaskowany przez utrwalenie, dodatkowe próbki można wykorzystać do analizy za pomocą elektroforezy żelowej SDS-PAGE i Western blot. Czynności te wykonuje się przy użyciu 100 μg białka zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie przeciwciała αNFAT2 stosuje się w rozcieńczeniu 1:1000, a przeciwciało GAPDH w rozcieńczeniu 1:10000. Przykładowy obraz utrwalonych próbek z komórek Jurkata z odpowiednimi i nieodpowiednimi przeciwciałami pokazano w Rysunek 2.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml dostępnego w handlu buforu do lizy 1, pipetując w górę iw dół. Następnie umieść próbki na lodzie na wytrząsarce i inkubuj je przez 10 minut, wytrząsając.
    UWAGA: Przed lizą komórki można rozdrobnić na 10 s w ciekłym azocie. Jest to przydatne w przypadku komórek Jurkata, ale należy tego unikać w pierwotnych próbkach pacjentów. W celu rozpadu umieść probówki o pojemności 5 ml na 5 s w 5-10 ml ciekłego azotu w specjalnym pojemniku. Nosić okulary ochronne i odpowiednie rękawice ochronne.
  7. Następnie odwirować probówki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
  8. Homogenizować komórki w 5 ml dostępnego w handlu buforu do lizy 2, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować przez 10 minut na lodzie, wytrząsając. Następnie odwirować probówki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl (komórki Jurkat) lub 140 μl (próbki pacjenta) buforu ścinającego 1 zawierającego 1x inhibitor proteazy (odpowiednio 5 μl lub 1,4 μl) i inkubować mieszaninę przez 10 minut na lodzie.
  10. W przypadku ścinania chromatyny przenieść 140 μl zawiesiny komórek z kroku 3.9 do probówek sonikatora (unikać wytwarzania pęcherzyków powietrza i powtórzyć ten krok, jeśli jest to konieczne ze względu na objętość próbki). Umieścić probówki w zogniskowanym ultrasonografie w temperaturze 7 °C i ścinać przez 10 minut (linia komórkowa) lub 7,5 minuty (próbki pacjenta) ze średnią mocą padającą 9,375 W, aby uzyskać fragmenty DNA o wartości 200-500 pz.
  11. Na koniec odwirować w temperaturze 15700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w małej wirówce i zebrać supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  12. Aby sprawdzić odpowiednie rozmiary fragmentów, przeanalizuj 20 μl ściętej chromatyny za pomocą elektroforezy żelowej w 1,5% żelu agarozowym TBE. Przykładowy obraz ściętej chromatyny z komórek Jurkata dobrej i złej jakości jest pokazany w Rysunek 3. W tym momencie protokół może zostać potencjalnie wstrzymany. Chromatyna ścięta powinna być przechowywana w temperaturze -80 °C.

4. Immunoprecypitacja chromatyny

UWAGA: Immunoprecypitacja chromatyny została przeprowadzona za pomocą dostępnego na rynku zestawu ChIP zgodnie z instrukcjami producenta z modyfikacjami7.

  1. Obliczyć liczbę immunoprecypitacji (70 μl (komórki Jurkata) lub 15 μl (próbki pacjenta) ściętej chromatyny plus jedno przeciwciało) i przygotować 20 μl kulek pokrytych białkiem A na wytrącenie w probówce o pojemności 1,5 ml. Przemyć kulki w 40 μl 1x buforu ChIP 1 na wytrącenie, pipetując w górę i w dół, pozostawić kulki w stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant przez pipetowanie. Wykonaj ten krok w sumie cztery razy. Na koniec ponownie zawieś koraliki w oryginalnym woluminie za pomocą 1x bufora ChIP 1.
  2. Do samej immunoprecypitacji należy użyć 10 μg przeciwciała αNFAT2 (7A6) do wychwycenia NFAT2 wraz z jego związanymi sekwencjami docelowymi. Użyj 2,5 μg króliczego przeciwciała IgG (DA1E) jako kontroli IgG. Przygotować reakcje w świeżych probówkach o pojemności 1,5 ml, jak wskazano w tabeli 1.
    UWAGA: Ważne jest, aby użyć przeciwciała monoklonalnego o wysokim powinowactwie, którego epitop nie jest maskowany podczas fiksacji dla tego protokołu. Przeciwciała poliklonalne wprowadzają dodatkowy poziom zmienności, co znacznie utrudnia właściwą interpretację otrzymanych wyników.
  3. Inkubować mieszaninę z etapu 4.2 przez noc w temperaturze 4 °C na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
  4. Następnego dnia wirować probówki przez 5 s przy 7 000 x g w małej wirówce, inkubować je w stojaku magnetycznym przez 1 minutę i usunąć supernatant przez aspirację. Umyj koraliki raz każdym z myjących 1, 2, 3 i 4 po kolei.
  5. W tym celu należy ponownie zawiesić kulki w 350 μl buforu do przemywania i inkubować je przez 5 minut w temperaturze 4 °C na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
  6. Następnie wirować probówki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce. Następnie umieść je na 1 minutę w stojaku magnetycznym, usuń supernatant i dodaj kolejny bufor do płukania.
  7. Po ostatnim etapie płukania usunąć supernatant za pomocą pipetowania, zebrać kulki w 100 μl buforu elucyjnego 1 i inkubować je przez 30 minut na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
  8. Krótko zakręć probówkami (5 s przy 7000 x g w małej wirówce) i umieść je w stojaku magnetycznym na 1 minutę.
  9. Następnie przenieść supernatant przez pipetowanie do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 4 μl buforu elucyjnego 2.
  10. Aby utworzyć kontrolę wejściową, zmieszaj 1 μl ściętej chromatyny z 99 μl buforu elucyjnego 1 i 4 μl buforu elucyjnego 2 (w tej konfiguracji na pacjenta przypadają trzy probówki: jedna kontrolna wejściowa, jedna kontrolna IgG i jedna próbka αNFAT2).
  11. Próbki inkubować przez 4 godziny w temperaturze 65 °C i prędkości obrotowej 1300 obr./min w wytrząsarce probówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 μl 100% izopropanolu, wirować i wirować próbki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce.
  12. Ponownie zawiesić dostępne kulki magnetyczne poprzez dokładne wirowanie, dodać 10 μl kulek do każdej próbki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
  13. Po inkubacji wirować probówki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce i umieścić je na 1 minutę w stojaku magnetycznym. Usunąć supernatant przez aspirację.
  14. Zawiesić kulki w 100 μl buforu do przemywania 1. Odwróć probówki do wymieszania i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min.
  15. Wirować probówki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce, umieścić je na 1 minutę w stojaku magnetycznym i usunąć supernatant przez pipetowanie. Powtórz kroki 4.13-4.14 z buforem płuczącym 2.
  16. Następnie usunąć bufor płuczący przez aspirację, ponownie zawiesić kulki w 55 μl buforu elucyjnego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej na obracającym się kole z prędkością 6 obr./min w celu wymycia wytrąconego DNA. Na koniec wirować probówki przez 5 s przy 7000 x g w małej wirówce, umieścić je na 1 minutę w stojaku magnetycznym i przenieść supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać potencjalnie wstrzymany. Wyluzowany DNA należy następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.

5. Wykrywanie docelowych genów NFAT w komórkach CLL.

  1. Przeprowadzić reakcję qRT-PCR dwa razy dla każdej próbki, jak wskazano w tabeli 2.
    UWAGA: W celu wykrycia genów docelowych przeprowadza się ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) przy użyciu dostępnej na rynku mieszanki qRT-PCR z instrumentem do PCR w czasie rzeczywistym.
  2. Do reakcji należy używać białych 96-dołkowych płytek reakcyjnych i instrumentu RT-PCR. Warunki cyklu są następujące: 95 °C przez 30 s, [95 °C przez 5 s, 60 °C przez 30 s] x 40 cykli.
    UWAGA: Do obliczenia względnego wzbogacenia stosuje się seryjne rozcieńczenie wsadu (nierozcieńczone lub rozcieńczone w stosunku 1:10, 1:100 i 1:1000 w wodzie wolnej od nukleaz). W komórkach Jurkata IL-2 stosowano jako kontrolę pozytywną32. CD40L, dobrze znany cel NFAT2 w komórkach B, został użyty jako kontrola pozytywna w komórkach CLL, a LCK jako przykład dla nowego docelowego genu NFAT2 w CLL33,34. Startery dla CD40L, regionu IL-2 i promotora LCK są opisane w tabeli konkretnych odczynników i sprzętu.

6. Normalizacja i analiza danych

UWAGA: Względne wzbogacenie dla regionów promotora zainteresowania (IL-2, CD40L lub LCK) jest obliczane przy użyciu kontroli IgG do normalizacji.

  1. Najpierw określ wartości Ct (cykl progowy) dla wejściowego rozcieńczenia szeregowego, IL-2, CD40L i regionu promotora LCK za pomocą oprogramowania ewaluacyjnego na podstawie danych qRT-PCR.
  2. Zdefiniować krzywą wzorcową dla stężeń poprzez szeregowe rozcieńczanie wsadu. Za pomocą tej krzywej wzorcowej należy obliczyć stężenie IL-2, CD40L i regionu promotora LCK dla każdego duplikatu każdej próbki.
  3. Następnie oblicz średnią duplikatów. Następnie ustaw próbkę immunoprecypitacji IgG jako odniesienie. Zdefiniuj względne wzbogacenie dla tej próbki jako 1,0 i porównaj drugą próbkę (z immunoprecypitacji NFAT2) z tym odniesieniem.
  4. Na koniec należy obliczyć względne wzbogacenie, dzieląc stężenie próbek przez stężenie odniesienia IgG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia przykładową analizę cytometryczną CLL pacjenta, wykonaną po barwieniu przeciwciałami CD19-FITC i CD5-PE. Rysunek 1a pokazuje bramkowanie limfocytów, które stanowią większość komórek we krwi pacjentów z CLL. Rysunek 1b przedstawia odsetek komórek CLL CD19+/CD5+ , które w tym przykładzie stanowią 89,03% limfocytów. Odsetek limfocytów B CD19+/CD5

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytycznymi etapami przeprowadzenia udanego testu ChIP są wybór odpowiedniego przeciwciała i optymalizacja procesu ścinania chromatyny25. Wybór przeciwciała αNFAT2 okazał się szczególnie trudny podczas opracowywania tego protokołu. Chociaż na rynku dostępnych jest kilka przeciwciał αNFAT2, a większość z nich działa dobrze w western blotting i innych zastosowaniach, klon 7A6 był jedynym przeciwciałem, które można było z powodzeniem zastosować w ChIP7. Nawet rzekomo identyczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant DFG MU 3340/1-1 oraz grant Deutsche Krebshilfe 111134 (oba przyznane M.R.M.). Dziękujemy Elke Malenke za doskonałą pomoc techniczną).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 X PBSSigma AldrichD8537
1,5 mL wytrząsarka do probówek Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
10X Bolt Środek redukujący próbkiThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Bufor do bieganiaThermo ScientificB0002
37 % Formaldehyd p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Bufor do próbekThermo ScientificB0007
Przeciwciało anty-NFAT2Alexis1008505klon 7A6
Przeciwciało anty-NFAT2Sygnalizacja komórkowa8032SKlon D15F1
Przeciwciało anty-NFAT2 klasy ChIPAbcamab2796Clone 7A6
duża wirówkaEppendorf5804RMoże być zastąpiony podobnymi instrumentami
Mysz CD19-FITC Anti-humanBD Biosciences555412Clone HIB19
Mysz CD5-PE Anti-human CD5BD Biosciences555353Clone UCHT2
Gradient gęstości medium Biocoll (Gęstość 1,077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1,5 mLeppendorf22431021
FBS superiorMerckS0615
BD BiosciencesFACSCaliburMożna zastąpić podobnymi instrumentami
proteazy i fosfatazy Halt (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Żelowe urządzenie transferoweThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Stacks transferowe, nitroceluloza, rozmiar regularnyThermo Scientific
iDeal Zestaw ChIp-seq do histonówDiagenodaC01010059
jonomycyna sól wapniowaSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Osioł anty-króliczy IgG (H + L), 0,5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Kozia anty-mysia IgG (H + L), 0,1 mgLI-COR Biosciences925-32210
System obrazowania w podczerwieni LI-COR OdysseyLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, białyRoche4729692001Może być zastąpiony innymi płytkami w różnych instrumentach do PCR w czasie rzeczywistym
Roztwór lizujący OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 Woda klasy AFACovaris520101
M220 Zogniskowany ultrasonografCovaris500295
Stojak magnetyczny, DynaMag-15 MagnesThermo Scientific12301DMoże być zastąpiony podobnymi instrumentami
MEM Roztwór aminokwasów endogennych 100XThermo Scientific11140050
Mikroskop Axiovert 25Zeiss451200Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mmCovaris520045
Neubauer ulepszona komora liczącaKarl Hecht GmbH &                       Co KG40442012Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
NH4 Heparin MonovetteSarstedt02.1064
Woda bez nukleazPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15-dołkowyThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Bufor blokujący (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicylina/Streptomycyna 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L promotor region forwardSigma Aldrich5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'
Podkład CD40L promotor region odwróconySigma Aldrich5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'
Podkład IL-2 promotor regionuforward Sigma Aldrich5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3'
Podkład IL-2 region promotora odwróconySigma Aldrich5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'
Podkład LCK region promotor forwardSigma Aldrich5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3'
Podkład LCK region promotora odwróconySigma Aldrich5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'
Rabbit mAb IgG XP IsotypeControl Cell Signaling# 3900SClone DA1E
Instrument do PCR w czasie rzeczywistymRocheLightCycler 480Może być zastąpiony podobnymi instrumentami
Mieszalniki rolkowePhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SuplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Wstępnie barwione białko StandardThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Można zastąpić podobnymi instrumentami
mała WirówkaThermo ScientificHeraeus Fresco 17Może być zastąpiona podobnymi instrumentami
Pirogronian soduThermo Scientific11360070
ß-MerkaptoetanolThermo Scientific21985023
Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS-10X)Sygnalizacja komórkowa#12498
Roztwór błękitu trypanowegoSigma Aldrich93595-50ML
Cytometr przepływowy Koktajl inhibitorów IB23001

Bibliografia

  1. Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
  2. Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
  3. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
  4. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
  5. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
  6. Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
  7. Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755(2017).
  8. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
  9. Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
  10. Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
  11. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  12. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  13. Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
  14. Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
  15. Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
  16. Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
  17. Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
  18. Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
  19. Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
  20. Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
  21. Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
  22. Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
  23. Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , Wiley & sons. (1994).
  24. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  25. Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
  26. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  27. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  28. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  29. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  30. Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
  31. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
  32. Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
  33. Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
  34. Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
  35. Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130(2017).
  36. Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724(2017).
  37. Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
  38. Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
  39. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  40. Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
  41. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  42. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  43. Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza czynników transkrypcyjnychinterakcje białko-DNAilościowa PCR w czasie rzeczywistymścinanie sonikacyjneprzeciwciało anty-NFAT2detekcja genu LCKutrwalanie formaldehydem
Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.