Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Summary

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Abstract

Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w homeostazie energetycznej i termoregulacji. Składa się z różnych typów adipocytów, a także prekursorów adipocytów, komórek odpornościowych, fibroblastów, naczyń krwionośnych i wypustek nerwowych. Chociaż kontrola molekularna specyfikacji typu komórki i sposobu interakcji tych komórek jest coraz bardziej nakreślona, bardziej kompleksowe zrozumienie tych komórek rezydujących w tłuszczu można osiągnąć, wizualizując ich rozmieszczenie i architekturę w całej tkance. Istniejące podejścia immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne do analizy histologii tkanki tłuszczowej opierają się na cienkich skrawkach zatopionych w parafinie. Jednak cienkie skrawki wychwytują tylko niewielką część tkanki; W rezultacie wnioski mogą być stronnicze w zależności od tego, jaka część tkanki jest analizowana. Dlatego opracowaliśmy technikę oczyszczania tkanki tłuszczowej, Adipo-Clear, aby umożliwić kompleksową trójwymiarową wizualizację wzorców molekularnych i komórkowych w całych tkankach tłuszczowych. Adipo-Clear został zaadaptowany z iDISCO/iDISCO+, ze specyficznymi modyfikacjami wprowadzonymi w celu całkowitego usunięcia lipidów zmagazynowanych w tkance przy jednoczesnym zachowaniu natywnej morfologii tkanki. W połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną z użyciem arkuszy świetlnych demonstrujemy tutaj zastosowanie metody Adipo-Clear do uzyskania wysokorozdzielczych obrazów wolumetrycznych całej tkanki tłuszczowej.

Introduction

Do niedawna tkanka tłuszczowa była postrzegana jako amorficzny zbiór komórek tłuszczowych. W ciągu ostatnich kilku dekad nasze zrozumienie stało się bardziej wyrafinowane, a tłuszcz jest obecnie uznawany za złożony narząd zawierający różne typy adipocytów, a także prekursory adipocytów, komórki odpornościowe, fibroblasty, naczynia krwionośne i projekcje nerwowe. Interakcje między tymi komórkami rezydującymi w tkance tłuszczowej mają wyraźny wpływ na tkankę tłuszczową oraz fizjologię i patofizjologię organizmu¹. Chociaż nowe badania ujawniły ważne mechanizmy molekularne leżące u podstaw niektórych interakcji, bardziej wszechstronne zrozumienie wymaga wiarygodnego profilowania strukturalnego całej tkanki w trzech wymiarach (3D).

Nasza obecna wiedza na temat morfologii tkanki tłuszczowej opiera się głównie na analizie histologicznej cienkich odcinków (5 μm) ze stosunkowo dużym powiększeniem obrazowania (ponad 10X)^2,3. Takie podejście ma jednak kilka istotnych ograniczeń. Po pierwsze, skomplikowane struktury nitkowate, takie jak nerwy współczulne i układ krążenia, o których wiadomo, że odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej^4,5,6,7, są trudne do oceny za pomocą cienkich przekrojów. Po drugie, ze względu na pozornie amorficzny kształt i brak reprezentatywnych jednostek strukturalnych, na których można by się skupić, trudno jest docenić struktury tkanki tłuszczowej wyłącznie na podstawie barwienia przekrojowego. Po trzecie, tkanka tłuszczowa ma bardzo wysoką zawartość lipidów, co stwarza wyzwania w uzyskaniu spójnych odcinków seryjnych, które są odpowiednie do rekonstrukcji anatomicznej 3D, konwencjonalnej metody stosowanej do badania morfologii całego mózgu⁸. Biorąc pod uwagę te czynniki, istnieje ogromne zapotrzebowanie na kompleksowe podejście, które może zapewnić wizualizację 3D całego magazynu tłuszczu przy jednoczesnym osiągnięciu rozdzielczości komórkowej.

3D wolumetryczne obrazowanie całego narządu jest trudne ze względu na zasłaniające efekty rozpraszania światła. Głównym źródłem rozpraszania światła w tkankach biologicznych są granice faz lipidowo-wodnych. Chociaż wysiłki mające na celu wyeliminowanie rozproszenia poprzez usunięcie lipidów trwają od ponad wieku, w ostatnim czasie pojawiło się wiele innowacji⁹. Jedną z takich nowo opracowanych metod oczyszczania tkanek jest obrazowanie 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem z wykorzystaniem znakowania immunologicznego (iDISCO/iDISCO+)^10,11. Jednak tkanka tłuszczowa stanowi szczególne wyzwanie ze względu na wysoki poziom lipidów, dlatego wymagane są dodatkowe modyfikacje protokołu iDISCO/iDISCO+, aby w pełni wydobyć lipidy, jednocześnie chroniąc tkankę przed zapadnięciem się. Opracowany przez nas zmodyfikowany protokół, obecnie nazywany Adipo-Clear, wykorzystuje delipidację tkanki tłuszczowej na bazie metanolu/dichlorometanu w celu uzyskania optymalnej przezroczystości odpowiedniej dla obrazowania wolumetrycznego o wysokiej rozdzielczości¹². Ponieważ etap delipidacji w dużej mierze wygasza endogenne białka fluorescencyjne, takie jak GFP i RFP, wizualizacja takich białek musi być osiągnięta przez znakowanie immunologiczne. Ogólnie rzecz biorąc, ten prosty i solidny protokół można zastosować do badania organizacji na poziomie tkankowym komórek rezydujących w tkance tłuszczowej, śledzenia linii komórek progenitorowych adipocytów i morfogenezy tkanki tłuszczowej podczas rozwoju.

Protocol

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Rockefellera.

1. Przygotowanie tkanek

1. Wykonaj standardową perfuzję dosercową z ~20 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze 4 °C, aż krew zostanie całkowicie usunięta z tkanki.
2. Zmienić perfuzat na ~20 ml roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS) w temperaturze 4 °C, aż szyja i ogon znacznie się usztywnią.
   UWAGA: PFA jest toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Roztwory należy sporządzać wewnątrz dygestoria.
3. Ostrożnie przeanalizuj interesujące Cię poduszeczki tłuszczowe, aby usunąć całą poduszeczkę tłuszczową, nie uszkadzając jej. Używaj kleszczy z końcami, aby uniknąć szczypania lub ściskania tkanki. Unikaj zanieczyszczania wypreparowanej tkanki jakimkolwiek futrem.
4. Po utrwaleniu tkanki w 4% PFA w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Dla każdej poduszeczki tłuszczowej po utrwaleniu ~10 ml roztworu utrwalającego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
5. Umyj chusteczkę 3 razy (po 1 godzinie) 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT).
6. Przechowywać tkankę przez krótki okres (do 2 tygodni) w 1x PBS w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. W przypadku długotrwałego przechowywania (np. 1-2 lata) należy zmienić bufor na 1x PBS z 0,05% azydkiem sodu (jako środek konserwujący).
   UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny po spożyciu doustnym lub wchłonięciu przez skórę. Stężone roztwory azydku sodu (o stężeniu 5% lub większym) należy przenosić pod wyciągiem.

2. Delipidacja i przepuszczalność

Czas: 1-2 dni

1. Przygotować gradient metanolu 20%, 40%, 60% i 80% z buforem B1n (tabela 1) (v/v), np. dla buforu 20% metanolu/B1n wymieszać 20 ml metanolu i 80 ml buforu B1n. Przechowywać wszystkie w temperaturze 4 °C. Kryształy glicyny wytrącają się z 60% i 80% metanolu/B1n z powodu nasycenia. Unikaj usuwania kryształów; Roztwór płynny należy stosować do następujących rodzajów prania.
   UWAGA: Metanol jest lotny, drażniący i łatwopalny. Unikać kontaktu ze skórą lub oczami.
2. Delikatnie usuń włosy z próbki pod mikroskopem preparacyjnym. Wszelkie włosy, kłaczki lub zanieczyszczenia przyczepione do próbki spowodują cienie podczas obrazowania. Przenieść oczyszczoną próbkę do nowej probówki.
3. Wszystkie poniższe czynności należy wykonać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że wskazano inaczej. W przypadku małych próbek (np. tylnych podskórnych/okołogonadalnych poduszek tłuszczowych od młodych chudych myszy) należy użyć probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml z 1,6 ml roztworu. W przypadku dużych próbek lub próbek o wysokiej zawartości lipidów (np. poduszek tłuszczowych od otyłych myszy) należy użyć probówek o pojemności 5 ml z 4 ml roztworu.
   1. Umieścić probówki zawierające próbki poziomo na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na ~ 100 obr./min. Upewnij się, że próbki mogą swobodnie poruszać się wewnątrz probówki.
4. Odwodnić próbkę w stopniowanej serii 20%, 40%, 60%, 80% i 100% buforu metanol/B1n przez wskazany czas (tabela 2). Zminimalizuj ilość przenoszonego roztworu.
5. Odlipidować próbkę 100% dichlorometanem (DCM) (3 razy), przy czym czas inkubacji jest wskazany w tabeli 2. Próbka powinna opaść na dno rurki pod koniec drugiego i trzeciego płukania DCM. Jeśli nie, należy wydłużyć czas inkubacji, aby zapewnić pełną delipidację (np. wydłużyć z 30 minut do 1-2 godzin).
   UWAGA: DCM należy obchodzić się z dygestoriami. Do inkubacji należy używać szklanych pojemników do przechowywania i probówek do mikrowirówek wykonanych z polipropylenu. Probówki do mikrowirówek nie powinny być używane do długotrwałego przechowywania DCM. Szalki Petriego i pipety serologiczne wykonane z polistyrenu nie są kompatybilne z DCM. DCM jest bardzo niestabilny. Szybko przenieść próbkę do świeżego roztworu, aby zapobiec wysuszeniu.
6. Przemyć dwukrotnie 100% metanolem przez wskazany czas (Tabela 2).
7. Opcjonalnie: Jeśli próbka nie jest dobrze perfundowana, kolor hemoglobiny z pozostałych czerwonych krwinek może powodować silną autofluorescencję. Wybielać 5% H₂O₂ w metanolu (1 objętość 30% H₂O₂ do 5 objętości metanolu) przez noc w temperaturze 4 °C.
8. Ponownie uwodnić próbkę w odwróconej serii metanol/B1n: 80%, 60%, 40%, 20% metanolu/B1n i 100% buforu B1n (2 razy) przez wskazany czas (tabela 2).
9. Przemywać próbkę buforem PTxwH (tabela 1) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
10. Zdelipidowaną próbkę należy przechowywać w buforze PTxwH w temperaturze 4°C (do 1 roku) lub natychmiast przejść do etapu barwienia immunologicznego.

3. Barwienie immunologiczne całego wierzchowca

Czas: 8-10 dni

Uwaga: Wszystkie poniższe kroki powinny być wykonane w RT, chyba że zaznaczono inaczej, z potrząsaniem i ochroną przed światłem. W przypadku małych próbek należy użyć probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml z 1,6 ml roztworu. W przypadku dużych próbek należy użyć probówek o pojemności 5 ml z 4 ml roztworu. Zaleca się, aby najpierw zwalidować przeciwciała na małych fragmentach tkanki lub skrawkach tkanek poddanych działaniu metanolu.

1. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze PTxwH do zalecanego stężenia. Odwirować rozcieńczony roztwór przeciwciała o stężeniu ~20 000 x g przez 10 minut, aby zapobiec wprowadzaniu osadów lub agregacji przeciwciał.
2. Zdelipidowaną próbkę inkubować z pierwszorzędowym roztworem przeciwciał przez wskazany czas (Tabela 2).
3. Przemyć próbkę buforem PTxwH w serii etapów inkubacji: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h i przez noc.
4. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze PTxwH do zalecanego stężenia. Odwirować rozcieńczony roztwór przeciwciała o sile ~20 000 x g przez 10 minut, aby zapobiec wprowadzaniu osadów lub agregacji przeciwciał.
   Uwaga: Aby uniknąć wysokiego tła spowodowanego autofluorescencją tkanek, zaleca się przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforami, które emitują światło w obszarach czerwonych i dalekiej czerwieni. W zależności od liczby linii laserowych dostępnych w mikroskopie, w jednej próbce można jednocześnie zobrazować do 3-4 znaczników.
5. Inkubować próbkę z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez wskazany czas (tabela 2).
6. Przemyć próbkę buforem PTxwH w serii etapów inkubacji: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h i przez noc.
7. Opcjonalnie: W przypadku typów tkanek, które są delikatne, utrwal wybarwioną tkankę za pomocą 4% PFA w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C, aby zachować morfologię tkanki.
   Uwaga: Ten krok może zwiększyć tło obrazowania. Nie jest konieczne wykonywanie tego kroku w przypadku tkanki tłuszczowej.
8. Przemyć próbkę 1x PBS w serii etapów inkubacji: 5 min, 10 min i 30 min.
9. Delikatnie usuń kłaczki z próbki pod mikroskopem preparacyjnym.

4. Oczyszczanie tkanek

Czas: 1-2 dni

1. Opcjonalnie: Osadź próbkę w agarozie, aby ułatwić montaż próbki do mikroskopii arkuszowej.
   Uwaga: Ten krok jest zdecydowanie zalecany w przypadku tkanki tłuszczowej w celu ustabilizowania jej kształtu podczas obrazowania.
   1. Przygotować roztwór do zatapiania z 1% agarozą w 1x PBS (w/v). Schłodzić roztwór do zatapiania do temperatury ~ 40 °C, aby uniknąć wystawienia próbki na działanie nadmiernego ciepła.
   2. Oczyszczoną próbkę umieścić w formie (np. na szalce Petriego lub łódce wagowej) i ułożyć ją w żądanej pozycji. Unikaj przenoszenia płynów. Delikatnie wylać roztwór do zatapiania na próbkę. Unikaj pęcherzyków powietrza.
   3. Pozwól, aby agaroza całkowicie zastygła w temperaturze pokojowej. Wyciąć blok zawierający próbkę.
      Uwaga: Wszystkie poniższe etapy, w tym inkubację przez noc, należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej, z potrząsaniem i ochroną przed światłem. W przypadku małych próbek należy użyć probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml z 1,6 ml roztworu. W przypadku dużych próbek należy użyć probówek o pojemności 5 ml z 4 ml roztworu.
2. Odwodnić próbkę w gradiencie metanolu za pomocą_H2O: 25%, 50%, 75% i 100% (3 razy) przez wskazany czas (Tabela 2).
   Uwaga: Próbkę można pozostawić na noc na etapie 100% metanolu.
3. Inkubować próbkę w 100% DCM przez 1 godzinę z wytrząsaniem (3 razy). Próbka powinna opaść na dno rurki pod koniec każdego prania DCM. Jeśli nie, wydłuż czas inkubacji, aby zapewnić całkowite usunięcie metanolu. Próbkę można pozostawić na noc na etapie 100% DCM.
4. Inkubować próbkę w eterze dibenzylowym (DBE) przez noc z łagodnym wstrząsaniem, aby uzyskać dopasowanie współczynnika załamania światła.
   Uwaga: Próbka ostatecznie stanie się przezroczysta w świetle widzialnym.
   UWAGA: DBE jest niebezpieczny. Unikać kontaktu ze skórą. Obsługuj go pod wyciągiem w dwuwarstwowych rękawicach. Wyrzuć rękawice, gdy tylko zostaną zanieczyszczone DBE. Do inkubacji należy używać szklanych pojemników i probówek do mikrowirówek (polipropylenowych). Probówki do mikrowirówek nie powinny być używane do długotrwałego przechowywania DBE. Szalki Petriego i pipety serologiczne wykonane z polistyrenu nie są kompatybilne z DBE. Wyczyść wszelkie rozlane płyny 100% etanolem.
5. Inkubować próbkę ze świeżym DBE, lekko wstrząsając przez 2 godziny. Przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej w ciemności lub przejść bezpośrednio do obrazowania.
   Uwaga: Zaleca się, aby próbki zostały zobrazowane w ciągu miesiąca. Chociaż niektóre fluorofory są bardziej stabilne niż inne, nie zaleca się długotrwałego przechowywania próbek na tym etapie.

5. Mikroskopia

1. Obrazowanie za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi, który jest kompatybilny z DBE.
   Uwaga: Tylko obiektywy, które są zatwierdzone do obrazowania na bazie rozpuszczalników organicznych i dopasowane do współczynnika załamania światła DBE, mogą być używane jako obiektywy zanurzające w obrazowaniu zanurzonym w DBE.
   1. Zamontuj próbkę zatopioną w agarozie na uchwycie, który może zapobiegać ruchowi podczas obrazowania. Zanurzyć próbkę w komorze wypełnionej DBE.
   2. Zbierz stos z pokrywający całą próbkę (np. powiększenie 1-2X), aby uzyskać rozkład/strukturę markera w całej tkance.
   3. Przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu (np. powiększenie 4-12X), aby przybliżyć obszary zainteresowania i zobrazować szczegółowe struktury.
      Uwaga: Kolagen jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do powstania macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki tłuszczowej, która otacza wszystkie komórki tłuszczowe¹³. Kolagen ma typowe spektrum emisyjne w zakresie od 400 nm do 550 nm¹⁴. Obrazowanie próbki za pomocą linii lasera 488 (zielona) i zebranie wyemitowanego światła w zakresie długości fali, który leży w widmie emisyjnym kolagenu (np. 525-550 nm) dostarczy sygnał autofluorescencji tkanki, który, jak wcześniej wykazano, wyznacza kontur komórki tłuszczowej i ogólną architekturę tkanki¹².
2. Obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu dwufotonowego.
   1. Umieść próbkę zatopioną w agarozie w szkiełku komorowym ze szklanym dnem, nie dotykając żadnych plastikowych części (lub innej komory obrazowania zgodnej z DBE, która może być uszczelniona). Upewnij się, że DBE nie wycieka.
   2. Wybierz obiektywy o większych odległościach roboczych, aby uzyskać głębszą penetrację.
      Uwaga: Obrazowanie powinno być wykonywane za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub dwufotonowego przez szklane dno szkiełka komory. Należy unikać bezpośredniego kontaktu próbki z obiektywami zanurzeniowymi, które nie są zalecane w przypadku obrazowania opartego na DBE.

Results

Przygotowane całe poduszeczki tłuszczowe Adipo-Clear można zobrazować w 3D, aby przeanalizować, jak morfologia tkanek i interakcje komórkowe są zaburzone w stanach szczupłych i otyłych. Metodę tę można łatwo zastosować do analizy ogólnej struktury tkanki tłuszczowej poprzez zbieranie sygnału autofluorescencji tkankowej w kanale zielonym. Wcześniej wykazaliśmy, że sygnał autofluorescencji w tkance tłuszczowej korzystnie nakłada się na barwienie perylipidynowe, powszechnie używany marker do...

Discussion

Adipo-Clear to prosta i solidna metoda oczyszczania tkanki tłuszczowej, którą można łatwo wykonać w zwykłym laboratorium. W porównaniu z innymi metodami oczyszczania na bazie rozpuszczalników, takimi jak iDISCO/iDISCO+10,11,12, Adipo-Clear jest szczególnie zoptymalizowany do oczyszczania tkanki tłuszczowej i innych tkanek o wysokiej zawartości tłuszczu. Etap delipidacji całkowicie usuwa lipidy z tkanki tłuszczowej, a tym samym u...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Metanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparyna	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichlorometan	Sigma Aldrich	270991
Nadtlenek wodoru 30%	Fisher Scientific	325-100
Eter benzylowy	Sigma Aldrich	108014
Agaroza	Invitrogen	16500500
Azydek sodu	Sigma Aldrich	71289-5G
Glicyna	Fisher Scientific	BP381-1
Królik poliklonalna hydroksylaza anty-tyrozynowa	Millipore	AB152	1:200 rozcieńczenie
Koza poliklonalna anty-CD31 / PECAM-1	R& D Systems	AF3628	Końcowe stężenie 2 &mikro; g / ml
Szczurzy monoklonalny anty-CD68, klon FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Końcowe stężenie 2 &mikro; g/mL
Donkey anty-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Końcowe stężenie 5-10 &mikro; g/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Końcowe stężenie 5-10 &mikro; g/mL
Osioł anty-szczurzy IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Końcowe stężenie 5-10 &mikro; g/mL
Komora obrazowania	ibidi	80287
Mikroskop z arkuszem świetlnym	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Oprogramowanie do obrazowania	LaVision BioTec	Imspector Oprogramowanie
do wizualizacji mikroskopii	Bitplane	Imaris