Artykuł metodologiczny

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58274

⸱

29 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1BioTime, Inc

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Streszczenie

Epigenetyka rozwoju siatkówki to dobrze zbadana dziedzina badań, która obiecuje przynieść nowy poziom zrozumienia mechanizmów różnych chorób zwyrodnieniowych siatkówki u ludzi i wskazać nowe podejścia do leczenia. Architektura jądrowa siatkówki myszy jest zorganizowana w dwa różne wzory: konwencjonalny i odwrócony. Konwencjonalny wzór jest uniwersalny, w którym heterochromatyna jest zlokalizowana na obrzeżach jądra, podczas gdy aktywna euchromatyna znajduje się we wnętrzu jądra. W przeciwieństwie do tego, odwrócony wzór jądrowy jest unikalny dla jąder komórek fotoreceptora dorosłego pręcika, w których heterochromatyna lokalizuje się w centrum jądrowym, a euchromatyna znajduje się na obrzeżach jądra. Metylację DNA obserwuje się głównie w chromocentrach. Metylacja DNA jest dynamiczną kowalencyjną modyfikacją reszt cytozyny (5-metylocytozyny, 5 mC) dinukleotydów CpG, które są wzbogacone w regiony promotorowe wielu genów. Trzy metylotransferazy DNA (DNMT1, DNMT3A i DNMT3B) uczestniczą w metylacji DNA podczas rozwoju. Wykrywanie 5mC za pomocą technik immunohistochemicznych jest bardzo trudne, co przyczynia się do zmienności wyników, ponieważ wszystkie zasady DNA, w tym zasady zmodyfikowane 5mC, są ukryte w dwuniciowej helisie DNA. Jednak szczegółowe określenie rozkładu 5mC podczas opracowywania jest bardzo pouczające. W tym miejscu opisujemy powtarzalną technikę niezawodnego immunohistochemicznego wykrywania 5mC i innego epigenetycznego markera DNA 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), który kolokalizuje się z "otwartą", transkrypcyjnie aktywną chromatyną w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Wprowadzenie

Epigenetyczna regulacja rozwoju i postmitotycznej homeostazy siatkówki myszy to ekscytujący obszar badań, który obiecuje przynieść nowe zrozumienie biologicznych mechanizmów kontrolujących retinogenezę i determinację losu komórki, funkcji metabolicznych specyficznych dla typu komórki, a także patologii komórek, śmierci i regeneracji komórek1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Chromatyna ulega dynamicznym zmianom w rozwoju, a także w odpowiedzi na zmienne sygnały zewnętrzne, niezależnie od tego, czy jest to stres, metabolizm czy bodźce śmierci komórki6,14,15,16,17,18. W jądrach myszy chromatyna dzieli się na aktywną euchromatynę i nieaktywną heterochromatynę6,19,20. W jądrze interfazowym euchromatyna znajduje się w wewnętrznym obszarze jądra, podczas gdy heterochromatyna wyściela obwód jądra i jąderko. Ten wzór nazywa się konwencjonalnym i jest wysoce konserwatywny u eukariontów. Natomiast jądra pręcików u zwierząt prowadzących nocny tryb życia, takich jak myszy i szczury, mają odwrócony wzór, w którym jądro jest zajęte przez heterochromatynę w środku otoczoną euchromatyną, tworząc najbardziej zewnętrzną powłokę6,18,20. W momencie narodzin jądra pręcików mają konwencjonalną architekturę jądrową. Inwersja jąder pręcików zachodzi podczas rozwoju poprzez przebudowę konwencjonalnej architektury jądrowej. Podczas tego procesu obwodowa heterochromatyna oddziela się od peryferii jądra, a chromocentra łączą się ze sobą, tworząc pojedyncze chromocentrum w środku jądra6,18.

Metylacja genomowego DNA uczestniczy w kontrolowaniu lokalnej konformacji chromatyny21. Metylacja DNA zachodzi w pozycji 5' reszt cytozyny dinukleotydów CpG, które są wzbogacone w region promotorowy wielu genów w genomach myszy22,23,24,25,26, a także w regionach międzygenowych i intronowych, które przenoszą elementy regulatorowe27. Metylacja wysp CpG w promotorach proksymalnych21,24 i sekwencje CpG w wzmacniaczach genów27,28 jest ważny w regulacji dynamicznego stanu dwuwartościowej chromatyny, zawierającej wiele genów rozwojowych/czynników transkrypcyjnych odgrywających ważną rolę w rozwoju, raku i starzeniu się29,30,31,32,33,34. Trzy metylotransferazy DNA (DNMT) uczestniczą w metylacji DNA podczas rozwoju myszy35. Wszystkie trzy DNMT ulegają ekspresji podczas rozwoju siatkówki myszy36, a specyficzne dla siatkówki zmiany w genach Dnmt wpływają na rozwój siatkówki2,7. Hydroksymetylocytozyna (5hmC) jest produktem utleniającym demetylacji 5-metylocytozyny (5mC). Trzy enzymy translokacji Ten-Eleven (TET) uczestniczą w demetylacji 5mC37,38,39. Modyfikacja hydroksymetylo-C jest wzbogacona w promotory, ciała genów i międzygenowe sekwencje genomowe w bogatych w geny i aktywnie transkrybowanych regionach27,40.

Istnieje wiele opisanych podejść do określania zmieniających się wzorców metylacji DNA w komórkach41,42,43,44,45,46, niektóre z nich umożliwiają ilościowe określenie globalnych zmian metylacji DNA, podczas gdy inne koncentrują się na precyzyjnych zmianach w regionach bogatych w CpG w obrębie promotory i wzmacniacze. Podano również metody wykrywania i oznaczania ilościowego 5hmC47, w tym metodą immunohistochemii13. Techniki immunohistochemiczne, które umożliwiają solidne monitorowanie zmian 5mC i 5hmC w jądrach rozwijających się i postmitotycznych komórek, są bardzo pouczające dla określenia dynamiki chromatyny in situ w odpowiedzi na zewnętrzne lub wewnętrzne zmiany wpływające na komórki4,13,48,49. Podejście to jest jednak podatne na niedocenianie zmian metylacji i hydroksymetylacji DNA ze względu na trudności techniczne, związane z wykrywaniem modyfikacji cytozyny w preparatach histologicznych. Dzieje się tak, ponieważ niepolarne zasady DNA, w tym cytozyna modyfikowana 5mC i 5hmC, są ukryte w środku dwuniciowego DNA helix50 i wymagają demaskowania. Jest to szczególnie trudne w przypadku zamrożonych preparatów histologicznych, które mogą szybko stracić informacyjną organizację pierwotnej tkanki po zastosowaniu surowego traktowania.

Siatkówka myszy jest doskonałym modelem do analizy wpływu metylacji DNA na rozwój neuronów i homeostazę postmitotyczną. Istnieje tylko 6 typów neuronów (fotoreceptory pręcikowe i czopkowe, komórki amakrynowe, dwubiegunowe, poziome i zwojowe), jeden typ komórek glejowych (glej Mullera) i jeden typ komórek neuroepitelialnych (nabłonek barwnikowy siatkówki)51. Stwierdzono, że typy komórek siatkówki mają wyraźne wzorce metylacji DNA18,19, który ostatnio był badany w rozdzielczości jednozasadowej1,5,9,12. Niedawno informowaliśmy o zastosowaniu immunohistochemii do wyznaczania wzorca dystrybucji 5mC w jądrach komórek siatkówki i zmian w jądrach siatkówki dorosłej myszy, gdzie wszystkie trzy metylotransferazy DNA zostały usunięte przez celowanie warunkowe7. W porównaniu z wieloma doniesieniami, w których obecność metylacji DNA w komórkach siatkówki mogła być postrzegana jedynie jako pozytywny lub negatywny sygnał w komórkach hipermetylowanych poddawanych apoptozie, nasze podejście umożliwiło wykrycie specyficznego ułożenia chromatyny w jądrach komórek siatkówki, co my i kilka grup zgłaszaliśmy i omawialiśmy wcześniej5,6,7,18,19,36,52. W tym miejscu szczegółowo opisujemy immunohistochemiczną (IHC) technikę wykrywania 5mC i 5hmC w zamrożonych odcinkach histologicznych utrwalonych paraformaldehydem, a także demonstrujemy dane, które udało nam się odtworzyć z naszego oryginalnego raportu7.

Protokół

Wszystkie procedury na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Dziecięcego w Oakland Research Institute i przestrzegały oświadczenia Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącego wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Przygotowanie tkanek do barwienia immunologicznego

  1. Eutanazja myszy C57 BL / 6J w dniu embrionalnym (E) 16, dniu po urodzeniu (P) 0, P15 i P90 za pomocą dwutlenku węgla (CO2), a następnie dekapitacji (myszy E16 i P0).
  2. Natychmiast wyłuszczyć oczy myszy przekłute igłą 29G1/2 po grzbietowej stronie oka. Inkubować przez 5 minut (min) w 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (1x PBS) o pH 8,0 w temperaturze pokojowej.
  3. Aby wykonać muszle oczne z P0, P15 i P90, wypreparuj rogówkę i soczewkę cienkimi nożyczkami okulistycznymi, podczas gdy oczy są w 4% PFA.
    UWAGA: Pomiń ten krok w przypadku oczu E16, ponieważ oczy są za małe.
  4. Zamocuj muszle oczne (P0, P15 i P90) i całe oczy (E16) w 4% PFA na 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj muszki oczne i całe oczy dwukrotnie w 1 ml 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Cryoprotect kubki oczne i całe oczy w 1xPBS, pH 8,0 zawierającym 10% sacharozy przez 1 godzinę. Przechowywać w 20% sacharozy w 1x PBS przez 1 godzinę, a następnie nasycić 30% sacharozy w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Następnego dnia zanurzyć muszle oczne i całe oczy w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (500 μl) w krioformach, zamrozić błyskawicznie w kąpieli suchego lodu i etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Usunąć formy z osadzonymi muszlami ocznymi i całymi oczami z temperatury -80 °C i pozostawić do zrównoważenia do -20 °C przez 1 godzinę przed kriosekcją.
  8. Przeciąć przekroje poprzeczne siatkówki (o grubości 12 μm) równolegle do osi skroniowo-nosowej przez głowę nerwu wzrokowego za pomocą kriostatu w temperaturze -20 °C.
  9. Zamontuj skrawki siatkówki na szkiełkach mikroskopowych53 i przechowuj w temperaturze -80 °C.

2. Barwienie immunologiczne przeciwciałami 5-mC i 5-hmC

  1. Oceń odcinki siatkówki zamontowane na szkiełkach za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Hydrofobowy długopis barierowy zmniejsza objętość przeciwciała potrzebnego do zabarwienia tkanki.
  2. Przemyć odcinki siatkówki jednorazowo 200 μl 1x PBS przez 10 min.
  3. Przepuszczalność skrawków siatkówki za pomocą 200 μl 0,1% Triton X-100 w 1x PBS (PBS-T) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Denaturować skrawki siatkówki przez 30 minut za pomocą 200 μL świeżo przygotowanego 2 N kwasu solnego (HCl) w 1x PBS w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Konieczne jest staranne miareczkowanie leczenia HCl, aby zoptymalizować sygnał 5mC.
  5. Zawsze uwzględniaj kontrpróby biologiczne (3-4), optymalizując sygnał 5mC54.
    UWAGA: Przeprowadziliśmy pobieranie antygenu w 4 punktach czasowych (15 min, 30 minut, 1 h i 2 h) i stwierdziliśmy, że 30-minutowa inkubacja jest optymalna dla sygnału 5mC. Dłuższa inkubacja z HCl degraduje strukturę jąder, prowadząc do niemożności zlokalizowania sygnału 5mC do jądra.
  6. Po denaturacji zneutralizować skrawki siatkówki, dodając 100 μL 0,1 M Tris-HCl (pH 8,3) na skrawki siatkówki przez 10 min.
  7. Inkubować skrawki w 500 μl roztworu blokującego (5% przedimmunologicznej normalnej surowicy koziej w 0,1% Triton X-100 w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.
  8. Po zablokowaniu dodać przeciwciała anty-5mC; anty-5hmC rozcieńczone w stosunku 1:500 w roztworze blokującym do odcinków siatkówki.
  9. Skrawki siatkówki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnościowej.
  10. Następnego dnia przemyć skrawki siatkówki 3 razy (za każdym razem 10-15 min) 0,1% PBS-T, a następnie inkubować w roztworze blokującym z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (kozia anty-królicza i kozia anty-mysia IgG, rozcieńczona; 1:1000), zawierającą roztwór DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) (1 μg/ml) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w roztworze blokującym.
    UWAGA: Unikać wysuszania skrawków podczas wszystkich etapów immunodetekcji.
  11. Umyj szkiełka trzykrotnie 1 ml 0,1% PBS-T.
  12. Po ostatnim umyciu zamontuj sekcje z wodnym medium montażowym pod szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij bezbarwnym lakierem do paznokci.

3. Immunohistochemia konfokalna

  1. Ustaw sekcje tak, aby strona nabłonka barwnikowego siatkówki była zawsze skierowana w jedną stronę (np. do góry), aby uzyskać spójność.
  2. Wykonaj przechwytywanie obrazu wybarwionych immunologicznie skrawków siatkówki przy 63-krotnym powiększeniu (powiększenie soczewki obiektywu) z 2-krotnym lub 3-krotnym zoomem.
  3. Generuj wiele sekcji optycznych każdego wybranego obrazu (stosy z) we wszystkich 3 kanałach (czerwonym, zielonym i niebieskim, RGB) w kroku 0,35 μm.
    UWAGA: Końcowe powiększenie próbki uwidocznionej z 10-20X (powiększenie soczewki obiektywu) wyniesie odpowiednio 63X w połączeniu z (zwykle używaną) soczewką okularową 10X.
    Wizualizacja skompresowanego stosu optycznego w celu zlokalizowania sygnału 5mC i 5hmC

Wyniki

Aby określić rozmieszczenie 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) podczas rozwoju siatkówki oraz w siatkówce pomitotycznej, przeprowadzono immunohistochemiczne barwienie przekrojów siatkówki myszy C57BL/6J z dni E16, P0, P15 i P90 przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5mC i 5hmC.

W dniu E16 barwienie 5mC było intensywne w chromocentrach jąder komórkowych, podczas gdy w pozostałej części jąder komórkowych obserwowano słabe barwienie (Rycina 1a). Barwienie 5hmC ograniczało się do jąder komórkowych i nie występowało w chromocentrach (Rycina 1b).

W siatkówce P0 sygnał 5mC był zlokalizowany w chromocentry jądra komórkowego oraz na obwodzie jądra (Rysunek 2a, strzałka i grot strzałki). Zaobserwowano również słabe barwienie 5mC pomiędzy chromocentry jąder komórkowych. Sygnał 5hmC był wyraźnie obecny w jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentry (Rysunek 2b). Stwierdzono, że więcej jąder wykazuje barwienie na 5mC i 5hmC w wewnętrznej warstwie neuroblastów (INBL) (Rysunek 2c, linia przerywana)

W siatkówce P15 stwierdzono silne barwienie 5mC i 5hmC w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL), wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) oraz warstwie komórek zwojowych (GCL) (Rycina 3). W ONL (fotoreceptory pręcikowe) sygnał 5mC występował w chromocentrach jąder komórkowych oraz na obwodzie jądra (Ryciny 3a-3c, 3g). Sygnał 5hmC stwierdzono w całych jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentrów (Ryciny 3d-3f). Transmisyjna mikroskopia elektronowa przeprowadzona na siatkówce P15 wykazuje rozmieszczenie domen heterochromatycznych w jądrach komórek pręcikowych podobne do tego, które stwierdzono przy użyciu sygnału przeciwciała przeciwko 5mC (Rycina 3h oraz 3i).

Barwienie 5mC w INL i GCL było silne w chromocentrach jąder komórkowych, a słabe barwienie zaobserwowano również w całych jądrach komórkowych (Ryciny 3j-3l i 3r-3t). W przeciwieństwie do 5mC, sygnał 5hmC lokalizował się w całych jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentrów w INL i GCL (Ryciny 3m-3o i 3u-3w). Zaobserwowano silny sygnał 5hmC na obrzeżach jąder komórkowych w GCL.

W dojrzałych fotoreceptorach pręcikowych sygnał 5mC ograniczał się do chromocentrum i peryferii jąder komórkowych (Rysunki 4a-4c), podczas gdy sygnał 5hmc był ograniczony do peryferii jądra (Rysunki 4d-4f).

Immunofluorescencja barwienia 5mC i 5hmC; analiza metylacji DNA; obraz mikroskopowy.
Rysunek 1. Lokalizacja 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w siatkówce myszy w 16. dniu embrionalnym.
Immunobarwienie siatkówki myszy C57BL/6J przeciwciałami przeciwko 5mC (czerwony, a) oraz 5hmC (zielony, b). W dniu E16 sygnał 5mC jest bardzo silny w chromocentrach jąder komórkowych, a także występuje w całych jądrach komórkowych na znacznie niższym poziomie. Barwienie 5hmC było ograniczone wyłącznie do jąder komórkowych. Panel c przedstawia nałożony obraz 5mC i 5hmC. Jądra są wybarwione DAPI (niebieski, c). Wstawki przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazach. Pasek skali: 5 µm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Immunofluorescencja komórek siatkówki wykazująca metylację 5mC, 5hmC, barwienie DAPI, wyniki mikroskopowe.
Rycina 2. Barwienie immunohistochemiczne 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w siatkówce myszy w 0. dniu po urodzeniu.
Immunoznakowanie siatkówki myszy C57BL/6J przeciwciałami przeciwko 5mC (czerwony, a) i 5hmC (zielony, b). W siatkówce P0 5mC i 5hmC występują zarówno w zewnętrznej warstwie neuroblastów (ONBL), jak i w wewnętrznej warstwie neuroblastów (INBL). a) Sygnał 5mC jest intensywny w chromocentrach (strzałka) i na obwodzie jąder komórkowych (głowica strzałki). Słabe barwienie 5mC obserwuje się również pomiędzy chromocentrami jąder komórkowych. b) Barwienie 5hmC ogranicza się do jądra komórkowego, a silny sygnał obserwuje się w INBL (linia przerywana na panelu c). Panel c przedstawia obraz po nałożeniu sygnałów 5mC i 5hmC. Jądra zostały wybarwione przeciwbarwnikiem DAPI (niebieski, c). Wstawki przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazach. Pasek skali: 5 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna: rozkład 5mC i 5hmC w warstwach siatkówki; ONL, INL, GCL; barwienie DAPI.
Rycina 3. Rozkład 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylowej cytozyny w siatkówce myszy w 15. dniu po urodzeniu.
Immunobarwienie siatkówki myszy C57BL/6J przeciwciałami anty-5mC oraz 5hmC (a-g, j-y). W zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL) (fotoreceptory pręcikowe) sygnał 5mC (czerwony, a) zazwyczaj pokrywa się z chromocentrami jąder komórkowych (grot strzałki, b), a także lokalizuje się na obwodzie jądra (strzałka, b). Panel b (czerwony) i c (szary) przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazie a. Sygnał 5hmC (zielony, d) ogranicza się do całych jąder komórkowych z wyjątkiem chromocentrów. Panel e (zielony) i f (szary) przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazie d. Panel g przedstawia obraz po nałożeniu sygnałów 5mC i 5hmC. Jądra przeciwbarwiono DAPI. Panele h i i to obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego jąder fotoreceptorów w 15. dobie po urodzeniu, ukazujące rozmieszczenie domen heterochromatyny. Czarny grot strzałki w panelu h wskazuje pojedyncze jądro fotoreceptora pręcikowego, powiększone w panelu i. Czerwone groty strzałek w panelu i wskazują domeny heterochromatyny wewnątrz jądra fotoreceptora pręcikowego, natomiast czerwone strzałki wskazują heterochromatynę na obwodzie jądra. W jądrach komórkowych warstwy wewnętrznej jądrowej (INL) (j-q) oraz warstwy komórek zwojowych (GCL) (r-y) sygnał 5mC (czerwony) lokalizuje się w chromocentrach obecnych na obwodzie, a słabe barwienie wykryto również w pozostałej części jąder komórkowych. Panel k (czerwony) i l (szary) przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazie j. Barwienie 5hmC (zielone) w jądrach komórkowych INL i GCL ogranicza się do całego jądra komórkowego. Zwróć uwagę na silne barwienie 5hmC na obwodzie jąder komórek GCL. Panel p i x przedstawiają obrazy po nałożeniu sygnałów 5mC i 5hmC, natomiast panel q i y przedstawiają powiększenie obszarów oznaczonych gwiazdką odpowiednio na obrazach p i x. Jądra przeciwbarwiono DAPI. Pasek skali: 5 µm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej ukazujące czopki w zewnętrznej warstwie jądrowej, z zaznaczeniem charakterystycznych markerów.
Rysunek 4. Rozkład 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylozytozyny w jądrach fotoreceptorów pręcikowych siatkówki myszy C57BL/6J w 90. dniu po urodzeniu.
Barwienie 5mC (czerwone, a) jest wyraźnie widoczne w chromocentrum jąder komórkowych, a także słabo widoczne na obwodzie jądra. Panele b (czerwony) i c (szary) przedstawiają powiększenie obszaru zaznaczonego gwiazdką na obrazie a. Barwienie 5hmC (zielone, d) ogranicza się wyłącznie do obwodu jądra. Panele e (zielony) i f (szary) przedstawiają powiększenie obszaru zaznaczonego gwiazdką na obrazie d. Panel g przedstawia obraz po nałożeniu sygnałów 5mC i 5hmC, natomiast panel h jest powiększeniem obszaru zaznaczonego gwiazdką na obrazie g. Jądra zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). Pasek skali: 5 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.

Dyskusja

Metylacja i hydroksymetylacja DNA są dynamicznymi i odwracalnymi modyfikacjami DNA, które modulują różnorodny zakres mechanizmów biologicznych w komórkach rozwijających się, jak i postmitotycznych. W tym miejscu opisujemy powtarzalną technikę wykrywania modyfikacji DNA 5mC i 5hmC in situ za pomocą techniki immunohistochemicznej (przy użyciu przeciwciał anty-5mC i anty-5hmC) w zamrożonych odcinkach siatkówki myszy utrwalonych paraformaldehydem oraz podajemy wytyczne dotyczące poprawy i standaryzacji wyników, zwłaszcza podczas porównywania kilku różnych próbek. Wcześniej użyliśmy tej metody do nakreślenia zmian 5mC w siatkówce myszy z celowaniem specyficznym dla siatkówki genów metylotransferazy DNA Dnmt1, Dnmt3a i Dnmt3b i zgłosiliśmy (oczekiwane) wyczerpanie znaczników 5mC w ich siatkówkach7.

Krytycznym krokiem w wykrywaniu immunohistochemicznym w 5 mC jest optymalizacja leczenia wycinków histologicznych HCl: oczekuje się, że mniej niż 15-minutowa obróbka wstępna nie przyniesie powtarzalnych wyników, podczas gdy nadmierne leczenie HCl niszczy architekturę jądrową. Najlepszy wynik uzyskaliśmy po 30 minutowej inkubacji z HCl. Zalecamy, aby zawsze używać świeżo rozcieńczonego HCl i świeżo przygotowanego 4% roztworu PFA do denaturacji DNA i utrwalenia tkanki siatkówki.

Aby rozwiązać problemy z wynikami, zalecamy dołączenie trzech do czterech powtórzeń biologicznych przy jednoczesnej optymalizacji sygnału 5mC. Podczas gdy każdy pojedynczy zestaw barwienia immunohistochemicznego może generować nieco inne wyniki (mniej lub bardziej jasne obszary heterochromatyczne), co jest oczekiwane w metodzie immunohistochemicznej, oczekuje się, że rozkład jądrowy 5mC i 5hmC w poszczególnych zestawach sekcji będzie bardzo powtarzalny, o ile przestrzegany jest protokół.

Technika ta ma również ograniczenia, ponieważ konsekwentnie obserwowaliśmy zmienność rozkładu 5mC w jądrach komórek fotoreceptorowych w tej samej sekcji. Odkryliśmy, że niektóre jądra wykazywały silny sygnał 5mC, podczas gdy sąsiednie jądra komórkowe nie wykazywały sygnału 5mC. Wynika to z ograniczenia w demaskowaniu antygenu 5mC przez leczenie HCl w zamrożonych skrawkach.

Znaczenie tej techniki umożliwia lokalizację 5 mC bez obróbki DNazą i proteinazą K, co prowadzi do lepszego zachowania chromocentrów. Oczekuje się, że technika ta będzie działać niezawodnie na wszystkich skrawkach wszystkich tkanek zwierzęcych kręgowców, zawierających ślady 5mC, 5hmC i przetwarzanych z podobnym podejściem, nie tylko siatkówki myszy, tak długo, jak długo przestrzegany będzie protokół.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem SBIR (1R44EY027654-01A1).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Supplies
29G1/2 ULTRA-FINEBD Biosciences329461
Nożyczki okulistyczneFine Science tools, Inc. 15000-03
Długopis PAPRPICORP.com195505
Microslide Superfrost plusVWR48311-703
odczynnik
paraformaldehydMikroskop elektronowy Science15710
1x PBSCorning21-031-CV
SacharozaSigmaS9378
Tissue-Tek Optyczny środek tnący (OCT)VWR4583
Triton X 100SigmaT9284
6 N HClVWR analityczny BDH7204-1
Tris-HCl pH 8,3TeknovaT1083
Surowica koziaJackson Immunoresearch005-000-121
5mCGenway Biotech GWB-BD5190
5hmCAktywny motyw39791
LaminB1AbcamAb16048
Cy2 AffiniPure Koza Ant-Królik IgGJackson Immunoresearch111-225-1444
Cy3 AffiniPure Kozia Mrówka IgGJackson Immunoresearch115-585-166
DAPIThermo Fisher ScientificD1306
Prolong Gold Antifade mediumThermo Fisher ScientificP36930
Equipment
MICRM HM 550Thermo Fisher Scientific388114
Mikroskop konfokalnyZeiss

Bibliografia

  1. Merbs, S. L., et al. Cell-specific DNA methylation patterns of retina-specific genes. PLoS One. 7 (3), e32602(2012).
  2. Nasonkin, I. O., et al. Conditional knockdown of DNA methyltransferase 1 reveals a key role of retinal pigment epithelium integrity in photoreceptor outer segment morphogenesis. Development. 140 (6), 1330-1341 (2013).
  3. Rhee, K. D., Yu, J., Zhao, C. Y., Fan, G., Yang, X. J. Dnmt1-dependent DNA methylation is essential for photoreceptor terminal differentiation and retinal neuron survival. Cell Death & Disease. 3, e427(2012).
  4. Wahlin, K. J., et al. Epigenetics and cell death: DNA hypermethylation in programmed retinal cell death. PLoS One. 8 (11), e79140(2013).
  5. Aldiri, I., et al. The Dynamic Epigenetic Landscape of the Retina During Development, Reprogramming, and Tumorigenesis. Neuron. 94 (3), 550-568 (2017).
  6. Eberhart, A., et al. Epigenetics of eu- and heterochromatin in inverted and conventional nuclei from mouse retina. Chromosome Research. 21 (5), 535-554 (2013).
  7. Singh, R. K., et al. Dnmt3a and Dnmt3b cooperate in photoreceptor and outer plexiform layer development in the mammalian retina. Experimental Eye Research. 159, 132-146 (2017).
  8. Farinelli, P., et al. DNA methylation and differential gene regulation in photoreceptor cell death. Cell Death & Disease. 5, e1558(2014).
  9. Mo, A., et al. Epigenomic landscapes of retinal rods and cones. Elife. 5, e11613(2016).
  10. Popova, E. Y., Barnstable, C. J., Zhang, S. S. Cell type-specific epigenetic signatures accompany late stages of mouse retina development. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 3-8 (2014).
  11. Kim, J. W., et al. NRL-Regulated Transcriptome Dynamics of Developing Rod Photoreceptors. Cell Reports. 17 (9), 2460-2473 (2016).
  12. Wang, L., et al. Retinal Cell Type DNA Methylation and Histone Modifications Predict Reprogramming Efficiency and Retinogenesis in 3D Organoid Cultures. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
  13. Perera, A., et al. TET3 is recruited by REST for context-specific hydroxymethylation and induction of gene expression. Cell Reports. 11 (2), 283-294 (2015).
  14. Mimura, I., et al. Dynamic change of chromatin conformation in response to hypoxia enhances the expression of GLUT3 (SLC2A3) by cooperative interaction of hypoxia-inducible factor 1 and KDM3A. Molecular and Cellular Biology. 32 (15), 3018-3032 (2012).
  15. Nair, N., Shoaib, M., Sorensen, C. S. Chromatin Dynamics in Genome Stability: Roles in Suppressing Endogenous DNA Damage and Facilitating DNA Repair. Int J Mol Sci. 18 (7), (2017).
  16. Mekhail, K., Moazed, D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (5), 317-328 (2010).
  17. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (4), 243-254 (2009).
  18. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  19. Solovei, I., et al. LBR and lamin A/C sequentially tether peripheral heterochromatin and inversely regulate differentiation. Cell. 152 (3), 584-598 (2013).
  20. Solovei, I., Thanisch, K., Feodorova, Y. How to rule the nucleus: divide et impera. Current Opinion in Cell Biology. 40, 47-59 (2016).
  21. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, Suppl . 245-254 (2003).
  22. Cross, S. H., Charlton, J. A., Nan, X., Bird, A. P. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nature Genetics. 6 (3), 236-244 (1994).
  23. Antequera, F., Bird, A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11995-11999 (1993).
  24. Antequera, F., Boyes, J., Bird, A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell. 62 (3), 503-514 (1990).
  25. Fouse, S. D., et al. Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with. Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell. 2 (2), 160-169 (2008).
  26. Elango, N., Yi, S. V. DNA methylation and structural and functional bimodality of vertebrate promoters. Molecular Biology and Evolution. 25 (8), 1602-1608 (2008).
  27. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905(2013).
  28. Colwell, M., et al. Evolutionary conservation of DNA methylation in CpG sites within ultraconserved noncoding elements. Epigenetics. 13 (1), 49-60 (2018).
  29. Lee, S. M., et al. Intragenic CpG islands play important roles in bivalent chromatin assembly of developmental genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1885-E1894 (2017).
  30. Charlet, J., et al. Bivalent Regions of Cytosine Methylation and H3K27 Acetylation Suggest an Active Role for DNA Methylation at Enhancers. Molecular Cell. 62 (3), 422-431 (2016).
  31. Bernhart, S. H., et al. Changes of bivalent chromatin coincide with increased expression of developmental genes in cancer. Scientific Reports. 6, 37393(2016).
  32. Curry, E., et al. Genes Predisposed to DNA Hypermethylation during Acquired Resistance to Chemotherapy Are Identified in Ovarian Tumors by Bivalent Chromatin Domains at Initial Diagnosis. Cancer Research. 78 (6), 1383-1391 (2018).
  33. Rakyan, V. K., et al. Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains. Genome Research. 20 (4), 434-439 (2010).
  34. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature Reviews Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
  35. Chen, T., Li, E. Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases. Current Topics in Developmental Biology. 60, 55-89 (2004).
  36. Nasonkin, I. O., et al. Distinct nuclear localization patterns of DNA methyltransferases in developing and mature mammalian retina. The Journal of Comparative Neurology. 519 (10), 1914-1930 (2011).
  37. Scourzic, L., Mouly, E., Bernard, O. A. TET proteins and the control of cytosine demethylation in cancer. Genome Medicine. 7 (1), 9(2015).
  38. Gong, Z., Zhu, J. K. Active DNA demethylation by oxidation and repair. Cell Research. 21 (12), 1649-1651 (2011).
  39. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  40. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  41. Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature Reviews Genetics. 9 (6), 465-476 (2008).
  42. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method. Biology (Basel). 5 (1), (2016).
  43. Lisanti, S., et al. Comparison of methods for quantification of global DNA methylation in human cells and tissues). PLoS One. 8 (11), e79044(2013).
  44. Armstrong, K. M., et al. Global DNA methylation measurement by HPLC using low amounts of DNA. Biotechnology Journal. 6 (1), 113-117 (2011).
  45. consortium, B. Quantitative comparison of DNA methylation assays for biomarker development and clinical applications. Nature Biotechnology. 34 (7), 726-737 (2016).
  46. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  47. Song, C. X., He, C. The hunt for 5-hydroxymethylcytosine: the sixth base. Epigenomics. 3 (5), 521-523 (2011).
  48. Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  49. Santos, F., Dean, W. Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Methods in Molecular Biology. 325, 129-137 (2006).
  50. Watson, J. D., Crick, F. H. The structure of DNA. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 123-131 (1953).
  51. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  52. Kizilyaprak, C., Spehner, D., Devys, D., Schultz, P. In vivo chromatin organization of mouse rod photoreceptors correlates with histone modifications. PLoS One. 5 (6), e11039(2010).
  53. Singh, R. K., Kolandaivelu, S., Ramamurthy, V. Early alteration of retinal neurons in Aipl1-/- animals. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3081-3092 (2014).
  54. Eberhart, A., Kimura, H., Leonhardt, H., Joffe, B., Solovei, I. Reliable detection of epigenetic histone marks and nuclear proteins in tissue cryosections. Chromosome Research. 20 (7), 849-858 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie 5 metylocytozynywykrywanie 5 hydroksymetylocytozynybarwienie immunohistochemiczneanaliza siatk wki myszymikroskopia konfokalnadenaturacja kwasem solnymfiksacja paraformaldehydemtechnika kriosekcjonowanialokalizacja chromocentr wwzorce architektury j drowej
Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.