Method Article

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste nabłonka rąbka rogówki (LESC) są odpowiedzialne za ciągłe odnawianie nabłonka rogówki, a tym samym za utrzymanie homeostazy rogówki i przejrzystości wizualnej. LESC pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowią obiecujące źródło komórek w terapii wymiany komórek rogówki. Nieokreślone, ksenogeniczne warunki hodowli i różnicowania powodują różnice w wynikach badań i utrudniają kliniczne zastosowanie środków terapeutycznych pochodzących z hPSC. Protokół ten zapewnia powtarzalną i wydajną metodę różnicowania hPSC-LESC w warunkach wolnych od komórek kseno- i zasilających. Po pierwsze, jednowarstwowa hodowla niezróżnicowanego hPSC na rekombinowanej lamininie-521 (LN-521) i zdefiniowanej pożywce hPSC służy jako podstawa do solidnej produkcji wysokiej jakości materiału wyjściowego do różnicowania. Po drugie, szybka i prosta metoda różnicowania hPSC-LESC pozwala na uzyskanie populacji LESC w ciągu zaledwie 24 dni. Metoda ta obejmuje czterodniową indukcję ektodermalną powierzchni w zawiesinie z małymi cząsteczkami, a następnie fazę hodowli adherentnej na matrycy kombinacji LN-521 / kolagen IV w określonym podłożu różnicującym nabłonek rogówki. Krioprzechowywanie i rozszerzone różnicowanie dodatkowo oczyszcza populację komórek i umożliwia przechowywanie komórek w dużych ilościach w celu wykorzystania ich do produktów terapii komórkowej. Uzyskane w ten sposób wysokiej jakości hPSC-LESCs stanowią potencjalną nową strategię leczenia rekonstrukcji powierzchni rogówki w leczeniu niedoboru rąbkowych komórek macierzystych (LSCD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przezroczysta rogówka na powierzchni oka pozwala światłu dostać się do siatkówki i zapewnia większość mocy refrakcyjnej oka. Najbardziej zewnętrzna warstwa, warstwowy nabłonek rogówki, jest stale regenerowany przez komórki macierzyste nabłonka rąbka (LESC). LESC znajdują się w warstwie podstawnej nisz rąbka na skrzyżowaniu korneo-twardówkowym1,2. LSC nie mają specyficznych i unikalnych markerów, więc ich identyfikacja wymaga bardziej szczegółowej analizy zestawu domniemanych markerów. Nabłonkowy czynnik transkrypcyjny p63, a zwłaszcza N-końcowo skrócony transkrypt izoformy alfa p63 (ΔNp63α), został zaproponowa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uniwersytet w Tampere posiada zgodę Krajowego Urzędu ds. Medycznych Spraw Prawnych Finlandii (Dnro 1426/32/300/05) na prowadzenie badań nad ludzkimi embrionami. Instytut posiada również wspierające oświadczenia Komisji Etycznej Okręgu Szpitalnego Pirkanmaa dotyczące wyprowadzania, hodowli i różnicowania linii hESC (Skottman/R05116) oraz wykorzystania linii hiPSC w badaniach okulistycznych (Skottman/R14023). Do tego badania nie wyprowadzono żadnych nowych linii komórkowych.

UWAGA: Opisany protokół opiera się na specyficznym, dostępnym na rynku pożywce do różnicowania hPSC i nabłonka rogówki. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od hPSC do hPSC-LESC

Cały proces od wywołania różnicowania FF hPSC do krioprzechowywania hPSC-LESC trwa około 3,5 tygodnia. Schematyczny przegląd metody różnicowania z zaznaczonymi jej kluczowymi krokami znajduje się w Rysunek 1A. Rysunek 1B pokazuje typowe morfologie populacji komórek w różnych fazach protokołu. Przedstawione dane uzyskano za pomocą linii Regea08/017 hESC.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczekiwanym rezultatem tego protokołu jest pomyślne i solidne generowanie LESCs z jednokomórkowej zawiesiny FF hPSC w ciągu około 3,5 tygodnia. Ponieważ nabłonek rogówki rozwija się z ektodermy powierzchniowej29, pierwszym krokiem protokołu jest skierowanie hPSC w kierunku tej linii. Krótka 24-godzinna indukcja z antagonistą transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β) SB-505124 i bFGF są wykorzystywane do indukcji różnicowania ektodermalnego, a następnie 48-godzinna mezodermalna wskazówka BMP-4.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie było wspierane przez Akademię Fińską (grant numer 297886), program części zamiennych dla ludzi firmy Tekes, Fińską Agencję Finansowania Technologii i Innowacji, Fińską Fundację Banku Oczu i Tkanek oraz Fińską Fundację Kultury. Autorzy dziękują technikom laboratorium biomedycznego Outi Melin, Hannie Pekkanen, Emmie Vikstedt i Outi Heikkilä za doskonałą pomoc techniczną i wkład w hodowlę komórkową. Profesor Katriina Aalto-Setälä została uznana za autorkę zastosowanej linii hiPSC oraz placówki BioMediTech Imaging Core za dostarczenie sprzętu do obrazowania fluorescencyjnego.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiał/Odczynnik
1x DPBS zawierający Ca2+ i Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS bez Ca2+ i Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm naczynie do hodowli komórkowychCorning CellBIND#3296Format naczynia hodowlanego dla adherentnego hPSC-LESC różnicowanie
Płytka 12-dołkowaCorning CellBIND#3336Format naczynia hodowlanego dla próbek IF
Płytka 24-dołkowaCorning CellBIND#3337Forma naczynia hodowlanego dla próbek IF
2-merkaptoetanolGibco#31350-010
Płytka 6-dołkowa, nasadka Ultra-LowCorning Costar#3471Format naczynia hodowlanego do indukcji w zawiesinie kultura
Alexa Fluor 488 anty-mysie IgThermoFisher Scientific#A-21202Przeciwciało drugorzędowe dla IF
Alexa Fluor 488 anty-królik IgThermoFisher Scientific#A-21206Przeciwciało drugorzędowe dla IF
Alexa Fluor 568 anty-kozie IgThermoFisher Scientific#A-11057Przeciwciało drugorzędowe dla IF
Alexa Fluor 568 anty-mysie IgThermoFisher Scientific#A-10037Przeciwciało drugorzędowe dla IF
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, człowiek)PeproTech Inc.#AF-100-18BNiezwierzęcy rekombinowany ludzki FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Roztwór do utrwalania/przepuszczalnościBD Biosciences#554722Roztwór do utrwalania i przepuszczalności do cytometrii przepływowej
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Bufor płuczący do cytometrii przepływowej
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Białko morfogenetyczne kości 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A Albumina
surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Przeciwciało cytokeratyny 12Santa Cruz Biotechnology#SC-17099Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko
cytokeratynie 14IF R& D Systems#MAB3164Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko przeciwciału IF
Cytokeratin 15ThermoFisher Scientific#MS-1068-PPrzeciwciało pierwszorzędowe dla IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Pożywka hodowlana do adherentnego różnicowania hPSC-LESC
Kolagen typu IV (ludzki)Sigma-Aldrich#C5533Ludzki kolagen łożyskowy typu IV
CoolCell LX Pojemnik do zamrażaniaSigma-Aldrich#BCS-405
Probówki CryoPureSarsted#72.3801,6 ml krioprobówka do kriokonserwacji hPSC-LESC
Zdefiniowany inhibitor trypsynyGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminin 521Biolamina#Ln521Ludzka rekombinowana laminina 521
Δ Np63&alfa; przeciwciałoBioCare Medical#4892Przeciwciało pierwszorzędowe dla
przeciwciała IF OCT3/4R& D Systems#AF1759Pierwszorzędowe przeciwciało dla IF
p63 i alfaTechnologia sygnalizacji komórkowej#ACI3066APierwszorzędowe przeciwciało dla IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (koniugat PE)Technologia sygnalizacji komórkowej56687p63-α Przeciwciało sprzężone z PE do cytometrii przepływowej
Przeciwciało PAX6Sigma-Aldrich#HPA030775Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko
penicylinie IF / streptomycynieLonza# 17-602E
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich# 158127Utrwalacz komórek do IF
ProLong Gold Antifade Mountant z DAPIThermo Fisher Scientific#P36931Mocowanie DAPI do twardych mocowanie do
zestawu do kriokonserwacji IF PSCThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM aminokwasy endogenneGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Środek permeabilizacyjny do IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200Uchwyt DAPI do montażu płynnego do IF
strong>NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin IITharmac
Cytometr przepływowy, np. BD Accuri C6BD Biosciences
Mikroskop fluorescencyjny, np. Olympus IX 51Olympus
#<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles