Method Article

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste nabłonka rąbka rogówki (LESC) są odpowiedzialne za ciągłe odnawianie nabłonka rogówki, a tym samym za utrzymanie homeostazy rogówki i przejrzystości wizualnej. LESC pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowią obiecujące źródło komórek w terapii wymiany komórek rogówki. Nieokreślone, ksenogeniczne warunki hodowli i różnicowania powodują różnice w wynikach badań i utrudniają kliniczne zastosowanie środków terapeutycznych pochodzących z hPSC. Protokół ten zapewnia powtarzalną i wydajną metodę różnicowania hPSC-LESC w warunkach wolnych od komórek kseno- i zasilających. Po pierwsze, jednowarstwowa hodowla niezróżnicowanego hPSC na rekombinowanej lamininie-521 (LN-521) i zdefiniowanej pożywce hPSC służy jako podstawa do solidnej produkcji wysokiej jakości materiału wyjściowego do różnicowania. Po drugie, szybka i prosta metoda różnicowania hPSC-LESC pozwala na uzyskanie populacji LESC w ciągu zaledwie 24 dni. Metoda ta obejmuje czterodniową indukcję ektodermalną powierzchni w zawiesinie z małymi cząsteczkami, a następnie fazę hodowli adherentnej na matrycy kombinacji LN-521 / kolagen IV w określonym podłożu różnicującym nabłonek rogówki. Krioprzechowywanie i rozszerzone różnicowanie dodatkowo oczyszcza populację komórek i umożliwia przechowywanie komórek w dużych ilościach w celu wykorzystania ich do produktów terapii komórkowej. Uzyskane w ten sposób wysokiej jakości hPSC-LESCs stanowią potencjalną nową strategię leczenia rekonstrukcji powierzchni rogówki w leczeniu niedoboru rąbkowych komórek macierzystych (LSCD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przezroczysta rogówka na powierzchni oka pozwala światłu dostać się do siatkówki i zapewnia większość mocy refrakcyjnej oka. Najbardziej zewnętrzna warstwa, warstwowy nabłonek rogówki, jest stale regenerowany przez komórki macierzyste nabłonka rąbka (LESC). LESC znajdują się w warstwie podstawnej nisz rąbka na skrzyżowaniu korneo-twardówkowym1,2. LSC nie mają specyficznych i unikalnych markerów, więc ich identyfikacja wymaga bardziej szczegółowej analizy zestawu domniemanych markerów. Nabłonkowy czynnik transkrypcyjny p63, a zwłaszcza N-końcowo skrócony transkrypt izoformy alfa p63 (ΔNp63α), został zaproponowany jako odpowiedni dodatni marker LESC 3,4. Asymetryczny podział LESC pozwala im na samoodnawianie się, ale także na wytwarzanie potomstwa, które migruje dośrodkowo i do przodu. W miarę jak komórki zbliżają się do powierzchni rogówki, stopniowo tracą swoją łodygę i ostatecznie różnicują się w powierzchowne komórki płaskonabłonkowe, które są stale tracone z powierzchni rogówki.

Uszkodzenie którejkolwiek z warstw rogówki może prowadzić do poważnego zaburzenia widzenia, a wady rogówki są jedną z głównych przyczyn utraty wzroku na całym świecie. W niedoborze rąbków komórek macierzystych (LSCD) rąbek jest niszczony przez chorobę lub uraz, co prowadzi do spojówki i zmętnienia powierzchni rogówki, a następnie utraty wzroku5,6. Terapia zastępcza komórek z wykorzystaniem autologicznych lub allogenicznych przeszczepów rąbka ramiennego oferuje strategię leczenia dla pacjentów z LSCD4,7,8,9. Jednak pobieranie przeszczepów autologicznych niesie ze sobą ryzyko powikłań dla zdrowego oka, a tkanki dawcy jest niewystarczająca. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), w szczególności ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), mogą służyć jako nieograniczone źródło klinicznie istotnych typów komórek, w tym komórek nabłonka rogówki. W związku z tym LESC (HPSC-LESCs) pochodzące z hPSC stanowią atrakcyjne nowe źródło komórek w terapii wymiany komórek oka.

Tradycyjnie, zarówno metody hodowli niezróżnicowanych hPSC, jak i ich protokoły różnicowania do LESCs opierały się na użyciu niezdefiniowanych komórek żywiących, surowic zwierzęcych, kondycjonowanych pożywek lub błon owodniowych10,11,12,13,14,15. Ostatnio wysiłki na rzecz bezpieczniejszych produktów terapii komórkowej skłoniły do poszukiwania bardziej ustandaryzowanych i wolnych od ksenotypów protokołów hodowli i różnicowania. W rezultacie, kilka zdefiniowanych i wolnych od ksenotypów metod długotrwałej hodowli niezróżnicowanych hPSC jest obecnie dostępnych na rynku16,17,18. Jako kontinuum, niedawno wprowadzono protokoły ukierunkowanego różnicowania, które opierają się na sygnałach molekularnych, aby kierować hPSC do losu nabłonka rogówki19,20,21,22,23. Jednak wiele z tych protokołów wykorzystywało albo niezdefiniowane, oparte na karmie, hPSC jako materiał wyjściowy, albo złożone, ksenogeniczne koktajle czynników wzrostu w celu różnicowania.

Celem tego protokołu jest zapewnienie solidnej, zoptymalizowanej, wolnej od kseno- i karmy metody hodowli hPSC, a następnie różnicowanie jej na rogówkowe LESC. Jednowarstwowa hodowla pluripotencjalnych hPSC na matrycy lamininy-521 (LN-521) w zdefiniowanej, wolnej od albumin pożywce hPSC (w szczególności Essential 8 Flex) umożliwia szybkie wytwarzanie jednorodnego materiału wyjściowego do różnicowania. Następnie prosta, dwuetapowa strategia różnicowania kieruje hPSC w kierunku powierzchniowego losu ektodermalnego w zawiesinie, a następnie różnicowania adherentnego do LESC. Populacja komórek, w której > 65% wyraża ΔNp63α, uzyskuje się w ciągu 24 dni. Protokół bezksenologiczny i bezzasilający został przetestowany na kilku liniach hPSC (zarówno hESC, jak i hiPSC), bez konieczności optymalizacji specyficznej dla linii komórkowej. Opisane tutaj protokoły konserwacji bez weekendów, pasażu, kriokonserwacji i fenotypowania hPSC-LESC umożliwiają produkcję dużych partii wysokiej jakości LESC do celów klinicznych lub badawczych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uniwersytet w Tampere posiada zgodę Krajowego Urzędu ds. Medycznych Spraw Prawnych Finlandii (Dnro 1426/32/300/05) na prowadzenie badań nad ludzkimi embrionami. Instytut posiada również wspierające oświadczenia Komisji Etycznej Okręgu Szpitalnego Pirkanmaa dotyczące wyprowadzania, hodowli i różnicowania linii hESC (Skottman/R05116) oraz wykorzystania linii hiPSC w badaniach okulistycznych (Skottman/R14023). Do tego badania nie wyprowadzono żadnych nowych linii komórkowych.

UWAGA: Opisany protokół opiera się na specyficznym, dostępnym na rynku pożywce do różnicowania hPSC i nabłonka rogówki. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby uzyskać informacje o producencie/dostawcy i numery katalogowe.

1. Ustanowienie hodowli hPSC wolnej od kseno- i karmowego

  1. Preparaty
    1. Pokryj płytki 24-dołkowe ludzką rekombinowaną lamininą-521 (LN-521). Do pierwszego przejścia bez zasilania (FF) należy użyć LN-521 w stężeniu 1,09 μg/cm2 i w stężeniu 0,55 μg/cm2 dla kolejnych pasaży. Sugerowane stężenia LN-521 służą jako punkt wyjścia do udanej hodowli FF, ale można je obniżyć.
      1. Fiolkę LN-521 rozmrażać powoli w temperaturze 4 °C zgodnie z instrukcją producenta.
        UWAGA: Odpowiednio obsługiwany roztwór LN-521 może być przechowywany w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy po rozmrożeniu.
      2. Aby przygotować roztwór powlekający, rozcieńczyć odpowiednią ilość roztworu podstawowego LN-521 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco zawierającą Ca2+ i Mg2+ do całkowitej objętości 300 μl na studzienkę.
      3. Odpipetować roztwór powlekający do studzienek, uszczelnić płytkę studzienkową parafilmem i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Powlekane płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
        (Opcjonalnie): Alternatywnie, w celu uzyskania protokołu szybkiego powlekania, inkubować płytki dołkowe z roztworem powlekającym przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Przygotować pożywkę hodowlaną hPSC (w szczególności Essential 8 Flex), uzupełniając podłoże podstawowe dostarczonym suplementem, zgodnie z instrukcją producenta. Dodać 50 j/ml penicyliny-streptomycyny. Należy pamiętać, że preparat jest wrażliwy na światło i wysokie temperatury. Rozmrozić suplement i ogrzać podłoże w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem. Uzupełnioną pożywkę hPSC należy zużyć w ciągu dwóch tygodni od daty suplementacji.
  2. Przenoszenie hPSC do hodowli FF na LN-521
    1. Podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury rzeczywistej w okapie z przepływem laminarnym.
    2. Pasaż hPSC ze standardowego systemu hodowli na nioskach żywiących (np. inaktywowany ludzki napletek (hFF) lub mysie fibroblasty zarodkowe) lub inne systemy hodowli FF przy użyciu standardowej metodologii. Na przykład kolonie hPSC hodowane na komórkach zasilających hFF można rozciąć na małe kawałki za pomocą skalpela, a następnie oderwać je za pomocą końcówki igły. Ludzkie PSC hodowane przy użyciu systemów hodowli FF mogą być przenoszone metodą pasażowania klastrowego z wcześniejszą obróbką enzymatyczną lub bez niej.
    3. Usuń roztwór powlekający LN-521 z 24 dołków i dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża hPSC na dołek.
      UWAGA: Nie pozwól, aby studzienki wyschły, ponieważ LN-521 dezaktywuje się po wysuszeniu.
    4. Przenieś kawałki kolonii/klastry komórek do 24-dołkowych pożywki powlekanej LN-521 w pożywce hPSC za pomocą pipety. Przenieś 20–30 kawałków kolonii na studnię, unikając przepełnienia studni.
    5. Zastąp pożywkę 1 ml pożywki hPSC następnego dnia po przeniesieniu, a następnie co drugi dzień. Kultury są gotowe do pasażowania 3–4 dni później, gdy hPSC wyrosły na kolonie o gładkiej, niezróżnicowanej morfologii. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Rysunek 1B (pierwszy obraz). W przypadku pierwszego przejścia FF kolonie nie powinny być dopuszczone do wzrostu do w pełni zlewającej się monowarstwy, ale kultury powinny być pasażowane, gdy kolonie osiągną przybliżoną wielkość 1 mm.
  3. Pasażowanie i utrzymanie hodowli FF hPSC
    1. Podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury rzeczywistej w okapie z przepływem laminarnym.
    2. Począwszy od drugiego pasażu FF, należy przejść przez hPSC FF, gdy kultura osiągnie 80-100% konfluencji. Przejście FF hPSC do nowych 24-dołkowych płytek pokrytych LN-521 przy użyciu pasażowania pojedynczych komórek dwa razy w tygodniu (w poniedziałki i czwartki) w celu utrzymania wysokiej jakości kultur o niezróżnicowanej morfologii i osiągnięcia schematu karmienia bez weekendów. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z 18,24,25.
      1. Przepłukać FF hPSC dwukrotnie 1 ml 1x DPBS bez Ca2+ i Mg2+.
      2. Odłączyć FF hPSC za pomocą trypsyny-EDTA wolnej od ksenotypów (w szczególności enzymu TrypLE Select Enzyme) przez inkubację 500 μl na studzienkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Aby uzyskać optymalny czas inkubacji, pozwól komórkom zaokrąglić się, ale nie odłączać. Zwykle trwa to 3 minuty w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (nie przekraczać 5 minut).
      3. Usuń trypsynę-EDTA wolną od ksenotypów i natychmiast dodaj 500 μl na studzienkę zdefiniowanego inhibitora trypsyny.
      4. Odłącz hPSC FF poprzez ostrożne, ale dokładne pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Przenieść zawiesinę FF hPSC przez sitko do komórek 40 μm do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej wstępnie podgrzane podłoże hPSC.
      5. Przemyć studzienki 1 ml pożywki hPSC i dodać pożywkę myjącą do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
      6. Odwirować zawiesinę jednokomórkową przez 5 minut przy 300 x g, odessać osad komórkowy i ponownie zawiesić w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hPSC.
      7. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      8. Usunąć roztwór powlekający LN-521 (0,55 μg/cm2) z 24 dołków i dodać pożywkę hPSC, jak w 1.2.3.
      9. Płytka FF hPSC na 0,55 μg/cm2 LN-521 powlekana 24-dołkowa o gęstości komórek 40 000 – 50 000 komórek/cm2.
      10. Zastąp pożywkę świeżą pożywką hPSC następnego dnia po pasażu, a następnie co drugi dzień z wyjątkiem niedziel.
    3. Komórki są gotowe do wykorzystania do różnicowania 3-4 dni po pasażowaniu, gdy kultura osiągnie zbieżność >85%. Aby zapewnić wysoką jakość hPSC, zapoznaj się z metodami charakterystyki opisanymi szczegółowo w poprzednich pracach18,24,25. Zaleca się hodowlę hPSC tylko do poziomu pasażu 15 w systemie FF przy użyciu pasażowania pojedynczych komórek, aby uniknąć zmian kariotypowych. Jako materiał wyjściowy do różnicowania należy używać wyłącznie wysokiej jakości, niezróżnicowanych hPSC.

2. Ukierunkowane różnicowanie i kriokonserwacja LESCs pochodzących z hPSC

  1. Preparaty
    1. Przygotuj podstawową pożywkę indukcyjną wolną od ksenotypów (podstawowa pożywka indukcyjna): Uzupełnij zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco (konkretnie KnockOut DMEM) 15% zamiennikiem surowicy wolnej od ksenotypów (w szczególności CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM L-glutaminy, 0,1 mM 2-merkaptoetanolu, 1% aminokwasów endogennych i 50 U/ml penicyliny-streptomycyny. Zużyć podstawową pożywkę indukcyjną w ciągu dwóch tygodni.
    2. Przygotować pożywkę do indukcji rogówki w hodowli zawiesiny.
      1. Dzień 1: Uzupełnij podstawową pożywkę indukcyjną o 5 μM blebbistatynę.
      2. Dzień 2: Uzupełnij podstawową pożywkę indukcyjną 10 μM SB-505124 i 50 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
      3. Dzień 3-4: Uzupełnij podstawową pożywkę indukcyjną białkiem morfogenetycznym 4 (BMP-4) o stężeniu 25 ng/mL.
    3. Przygotować pożywkę do różnicowania nabłonka rogówki (pożywkę różnicującą, w szczególności CnT-30) do hodowli adherentnej: Dodać suplementy do podłoża podstawowego zgodnie z instrukcjami producenta i dodać 50 U/ml penicyliny-streptomycyny.
      UWAGA: Preparat pożywki różnicującej jest wrażliwy na światło. Uzupełnioną pożywkę różnicującą należy zużyć w ciągu 6 tygodni od daty suplementacji.
    4. Pokryj 100 mm szalki do hodowli tkankowych w celu adherentnego różnicowania (patrz krok 2.3) mieszaniną 5 μg/cm2 ludzkiego kolagenu łożyskowego typu IV (col IV) i 0,5 μg/cm2 LN-521 rozcieńczonych w 1x DPBS zawierającym Ca2+ i Mg2+, w całkowitej objętości powłoki 5 ml na szalkę. Przygotować i przechowywać powłoki z col IV i LN-521 zgodnie z opisem w 1.1.1.3.
  2. Krok I: Indukcja rogówki w hodowli zawiesinowej
    1. Podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury rzeczywistej w okapie z przepływem laminarnym.
    2. Odłączyć hPSC FF od zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą trypsyny-EDTA wolnej od ksenocytów, zgodnie z instrukcjami w krokach 1.3.2.1–1.3.2.6. Policz komórki i rozprowadź 2-3x106 komórek w 6-dołkowej studzience o niskim przyłączeniu, w całkowitej objętości 3 ml podstawowej pożywki indukcyjnej uzupełnionej 5 μM blibistatyną w celu wywołania tworzenia EB przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (dzień 1).
    3. Następnego dnia (dzień 2) usunąć pożywkę i zastąpić ją 3 ml podstawowej pożywki indukcyjnej uzupełnionej 10 μM SB-505124 i 50 ng/ml bFGF.
    4. W ciągu następnych dwóch dni (dni 3-4) usuń pożywkę i zastąp ją 3 ml podstawowej pożywki indukcyjnej uzupełnionej 25 ng / ml BMP-4.
  3. Krok II: Różnicowanie rogówki w kulturze przylegającej
    1. Podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury rzeczywistej w okapie z przepływem laminarnym.
    2. W 5 dniu połóż EB na 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych pokrytych 5 μg/cm2 col IV i 0,5 μg/cm2 LN-521.
      1. Usunąć roztwór powlekający z 100 mm szalek do hodowli tkankowych i dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej na każde naczynie.
        UWAGA: Nie pozwól, aby naczynia wyschły, ponieważ LN-521 dezaktywuje się po wysuszeniu.
      2. Przenieść EB z jednej płytki 6-dołkowej do dwóch lub trzech 100-milimetrowych szalek do hodowli tkankowych (około 50 EB nacm2) przez pipetowanie. Rozprowadź EB równomiernie, delikatnie potrząsając.
    3. Utrzymuj komórki w przylegającej kulturze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zastępując pożywkę 10 ml świeżej pożywki różnicującej trzy razy w tygodniu (w poniedziałek, środę i piątek) przez następne 2,5–3 tygodnie. Regularnie sprawdzaj komórki pod kątem pojawienia się prawidłowej morfologii nabłonka za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
  4. Krok III: LESC pochodzące z kriobankowości hPSC
    1. Podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury regulowanej w okapie z przepływem laminarnym, z wyjątkiem podłoża do krioprezerwacji, które powinno być wstępnie schłodzone.
    2. Odłączyć LESC pochodzące z hPSC za pomocą trypsyny-EDTA wolnej od ksenozyny i policzyć komórki, zgodnie z instrukcjami dla hPSC FF w krokach 1.3.2.1–1.3.2.6, ale przy użyciu pożywki różnicującej.
      UWAGA: W przypadku LESC pochodzących z hPSC optymalny czas inkubacji z trypsyną-EDTA wolną od ksenotypów jest dłuższy (około 5 minut). Użyj 3 ml wolnego od ksenotypów trypsyny-EDTA i zdefiniowanego inhibitora trypsyny na 100 mm szalka.
    3. Po zliczeniu komórek powtórzyć wirowanie przez 5 minut przy 300 x g, odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy we wstępnie schłodzonym, wolnym od ksenotypów pożywce do kriokonserwacji hPSC. Odpipetować zawiesinę pojedynczej komórki do krioprobówek tak, aby każda krioprobówka zawierała 0,5 do 1 x 106 komórek w 1 ml pożywki do kriokonserwacji.
    4. Umieścić probówki w pojemniku do zamrażania i natychmiast (w ciągu 5 minut) przenieść do temperatury -80 °C na noc.
    5. Następnego dnia przenieś probówki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  5. Krok IV: Rozmrażanie kriokonserwowanych hPSC-LESCs
    1. Przed rozmrożeniem pokryj naczynia/płytki dołkowe 5 μg/cm2 col IV i 0,5 μg/cm2 LN-521.
    2. Podgrzej wszystkie potrzebne materiały i odczynniki do temperatury rzeczywistej w okapie z przepływem laminarnym.
    3. Usunąć roztwór powlekający z naczyń/studzienek i dodać odpowiednią ilość wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego.
      UWAGA: Nie pozwól, aby naczynia wyschły, ponieważ LN-521 dezaktywuje się po wysuszeniu.
    4. Szybko rozmrozić komórki w temperaturze pokojowej i natychmiast przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej.
    5. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 300 x g, aspirować i ponownie zawiesić osad w pożywce różnicującej w celu usunięcia pożywki do krioprezerwacji.
    6. Umieść komórki na szalkach/studzienkach pokrytych 5 μg/cm2 col IV i 0,5 μg/cm2 LN-521, w pożywce różnicowej o gęstości 40 000 – 50 000 komórek/cm2. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , wymieniając pożywkę różnicującą trzy razy w tygodniu.

3. Fenotypowanie LESC pochodzących z hPSC

  1. Jakościowa analiza immunofluorescencyjna
    1. W celu immunofluorescencji pokryj 24- lub 12-dołkowe studzienki płytkowe 5 μg/cm2 col IV i 0,5 μg/cm2 LN-521 i płytkuj/rozmrażaj hPSC-LESCs w pożywce różnicowej o gęstości 40 000–50 000 komórek/cm2.
    2. Gdy kultury osiągną zbieżność, utrwal komórki 4% paraformaldehydem (PFA): Umyj studzienki dwukrotnie 1x DPBS bez Ca2+ i Mg2+ i inkubuj 15-20 minut z 4% PFA w temperaturze pokojowej. Następnie umyj dwukrotnie 1x DPBS, aby usunąć wszelkie pozostałości PFA. Stosować 0,5-1 ml roztworów na dołek.
      UWAGA: Stałe komórki mogą być przechowywane w 1x DPBS w temperaturze 4 °C do tygodnia przed barwieniem.
      Uwaga: PFA jest toksyczny i. Z PFA należy obchodzić się pod wyciągiem i nosić odzież ochronną, okulary ochronne i rękawice.
    3. Odessać 1x DPBS i przepuszczalnie błony komórkowe poprzez inkubację przez 10-15 minut z 0,1% Triton X-100 w 1x DPBS.
    4. Odessać 0,1% Triton X-100 i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał przez inkubację przez 1 godzinę z 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 1x DPBS w RT. Przygotować rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych w 0,5% BSA w 1x DPBS.
      UWAGA: Patrz Tabela 1 dla zalecanych przeciwciał pierwszorzędowych.
    5. Odessać 3% BSA i inkubować z odpowiednio rozcieńczonym przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.
    6. Myć studzienki 3x przez 5 min za pomocą 1x DPBS. Przygotować drugorzędowe rozcieńczenia przeciwciał w 0,5% BSA w 1x DPBS.
      UWAGA: Patrz Tabela 1 dla zalecanych przeciwciał drugorzędowych.
    7. Odessać 1x DPBS i inkubować z odpowiednim, odpowiednio rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Od tego momentu należy chronić próbki przed światłem, aby zapobiec blaknięciu barwników fluorescencyjnych.
    8. Przemyć studzienki 3x przez 5 minut za pomocą 1x DPBS, a na koniec przeciwbarwić jądra 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) i zamontować za pomocą fluorescencyjnych pożywki montażowej. DAPI może być używany oddzielnie zgodnie z instrukcją producenta lub dołączony do nośnika montażowego. Umieścić okrągłe szkiełka nakrywkowe (o średnicy 19 mm i 13 mm odpowiednio dla płytek 12- i 24-dołkowych) w każdym dołku. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi suszenia i przechowywania zamontowanych próbek.
    9. Zobrazuj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  2. Ilościowa analiza immunofluorescencyjna
    1. Przygotuj próbki cytospinowe LESC pochodzących z hPSC na szkłach obiektowych.
      1. Odłączyć LESC pochodzące z hPSC za pomocą trypsyny-EDTA wolnej od ksenozyny i policzyć komórki, zgodnie z instrukcją w kroku 2.4.2.
      2. Po zliczeniu dodać wstępnie schłodzony 1x DPBS i wirować przez 5 minut przy 300 x g. Dostosuj objętość próbki i stężenie komórek zgodnie z instrukcjami producenta dla danej cytowirówki, np. 50 000 – 100 000 komórek w objętości próbki 150 μL.
      3. Odwiruj komórki do okularów obiektowych za pomocą cytowirówki, np. 5 min przy 28 x g i natychmiast utrwal na 15-20 minut z 4% PFA w 1x DPBS przy RT. Zalecany czas i prędkość wirowania można znaleźć w instrukcji obsługi danego cytowirownika.
    2. Przejdź do barwienia próbek cytospinowych zgodnie z opisem w krokach 3.1.3–3.1.8 Użyj pisaka blokującego ciecz, aby otoczyć próbki hydrofobowym okręgiem i przeprowadzić barwienie w kropelce w celu ekonomicznej praktyki. Mycie może być wykonywane w pojemnikach z uchwytami na szkiełka, w celu zapewnienia skutecznego usunięcia nadmiaru przeciwciał i zminimalizowanego barwienia tła. Wybarwić jądra przeciwstawne za pomocą DAPI i zamocować barwione próbki za pomocą fluorescencyjnych pożywek montażowych, przykrywając szkiełkami nakrywkowymi. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi suszenia i przechowywania zamontowanych próbek.
    3. Uchwyć 5–10 obrazów na próbkę z losowo wybranych lokalizacji, korzystając np. z 10-krotnym powiększeniem mikroskopu fluorescencyjnego.
    4. Oszacuj odsetek komórek wybarwionych dodatnio w stosunku do całkowitej liczby komórek (DAPI dodatnich), np. za pomocą narzędzi do przetwarzania i analizy obrazów ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Najlepiej przeanalizować >500 komórek na próbkę.
      1. Otwórz obraz do analizy w oprogramowaniu ImageJ. Zduplikuj obraz i przefiltruj z domyślnym rozmyciem gaussowskim, aby usunąć szum.
      2. Utwórz próg. Dostosuj wartości progowe do optymalnego doboru dodatnio wybarwionych jąder komórkowych i zastosuj. Zduplikowany obraz jest teraz konwertowany na widok binarny.
      3. Przetwarzaj obraz binarny za pomocą narzędzi do przetwarzania binarnego "Wypełnij" i "Zlewnia", które automatycznie oddzielą połączone obszary reprezentujące pojedyncze jądra.
      4. Użyj narzędzia "Analizuj cząstki", aby automatycznie wyświetlić listę regionów zainteresowań (ROI) w oknie menedżera ROI, które otworzy się po zastosowaniu polecenia. Zamknij obraz binarny.
      5. Wizualizuj ROI na oryginalnym obrazie, wybierając opcję "Pokaż wszystko" w Menedżerze ROI. Potwierdź poprawny wybór barwionych jąder komórkowych, a w razie potrzeby ręcznie usuń i dodaj poszczególne selekcje.
  3. Analiza cytometrii przepływowej
    1. Aby potwierdzić poziomy ekspresji p63α, wybarwić komórki do cytometrii przepływowej.
      1. Odłączyć LESC pochodzące z hPSC za pomocą trypsyny-EDTA wolnej od ksenozyny i policzyć komórki, zgodnie z instrukcją w kroku 2.4.2.
      2. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml wstępnie schłodzonego 1x DPBS i odwirować przez 5 minut przy 300 x g. Utrwalić i przepuścić za pomocą gotowego do użycia roztworu do utrwalania/przepuszczalności przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Następnie dwukrotnie przemyć komórki 1 ml wstępnie schłodzonego 1x przepuszczalnego buforu do płukania.
        UWAGA: Od tego kroku utrzymuj ogniwa w temperaturze 4 °C lub na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
      3. UWAGA: Roztwór utrwalający/przepuszczalny zawiera 4,2% formaldehydu. Z niebezpiecznym roztworem należy obchodzić się pod wyciągiem i nosić odzież ochronną, okulary ochronne i rękawice.
      4. Podzielić próbki na probówki polipropylenowe o pojemności 5 ml. Każda próbka powinna zawierać 100 000–200 000 komórek, a objętość próbki należy dostosować do około 100 μl 1x buforu do płukania.
      5. Dodać 2 μl sprzężonego z fluorochromem przeciwciała FACS p63-α (zalecane przeciwciało, patrz Tabela wyposażenia i materiałów) do probówek z próbkami. Pozostawić jedną próbkę niezabarwioną, aby służyła jako kontrola ujemna. Próbki należy wirować i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
      6. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml wstępnie schłodzonego buforu do płukania 1x, a na koniec ponownie zawiesić granulki za pomocą 300 μl buforu. Przechowuj probówki na lodzie, chroniąc przed światłem.
    2. Analizować próbki za pomocą cytometru przepływowego. Niebarwioną próbkę kontroli ujemnej należy użyć do bramkowania właściwej populacji komórek i do wykluczenia fluorescencyjnego sygnału tła. Przeanalizuj co najmniej 10 000 komórek wybarwionych p63-α. W celu szczegółowego wdrożenia technicznego należy zapoznać się z instrukcją obsługi danego cytometru przepływowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od hPSC do hPSC-LESC

Cały proces od wywołania różnicowania FF hPSC do krioprzechowywania hPSC-LESC trwa około 3,5 tygodnia. Schematyczny przegląd metody różnicowania z zaznaczonymi jej kluczowymi krokami znajduje się w Rysunek 1A. Rysunek 1B pokazuje typowe morfologie populacji komórek w różnych fazach protokołu. Przedstawione dane uzyskano za pomocą linii Regea08/017 hESC...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczekiwanym rezultatem tego protokołu jest pomyślne i solidne generowanie LESCs z jednokomórkowej zawiesiny FF hPSC w ciągu około 3,5 tygodnia. Ponieważ nabłonek rogówki rozwija się z ektodermy powierzchniowej29, pierwszym krokiem protokołu jest skierowanie hPSC w kierunku tej linii. Krótka 24-godzinna indukcja z antagonistą transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β) SB-505124 i bFGF są wykorzystywane do indukcji różnicowania ektodermalnego, a następnie 48-godzinna mezodermalna wskazówka BMP-4...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie było wspierane przez Akademię Fińską (grant numer 297886), program części zamiennych dla ludzi firmy Tekes, Fińską Agencję Finansowania Technologii i Innowacji, Fińską Fundację Banku Oczu i Tkanek oraz Fińską Fundację Kultury. Autorzy dziękują technikom laboratorium biomedycznego Outi Melin, Hannie Pekkanen, Emmie Vikstedt i Outi Heikkilä za doskonałą pomoc techniczną i wkład w hodowlę komórkową. Profesor Katriina Aalto-Setälä została uznana za autorkę zastosowanej linii hiPSC oraz placówki BioMediTech Imaging Core za dostarczenie sprzętu do obrazowania fluorescencyjnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiał/Odczynnik
1x DPBS zawierający Ca2+ i Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS bez Ca2+ i Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm naczynie do hodowli komórkowychCorning CellBIND#3296Format naczynia hodowlanego dla adherentnego hPSC-LESC różnicowanie
Płytka 12-dołkowaCorning CellBIND#3336Format naczynia hodowlanego dla próbek IF
Płytka 24-dołkowaCorning CellBIND#3337Forma naczynia hodowlanego dla próbek IF
2-merkaptoetanolGibco#31350-010
Płytka 6-dołkowa, nasadka Ultra-LowCorning Costar#3471Format naczynia hodowlanego do indukcji w zawiesinie kultura
Alexa Fluor 488 anty-mysie IgThermoFisher Scientific#A-21202Przeciwciało drugorzędowe dla IF
Alexa Fluor 488 anty-królik IgThermoFisher Scientific#A-21206Przeciwciało drugorzędowe dla IF
Alexa Fluor 568 anty-kozie IgThermoFisher Scientific#A-11057Przeciwciało drugorzędowe dla IF
Alexa Fluor 568 anty-mysie IgThermoFisher Scientific#A-10037Przeciwciało drugorzędowe dla IF
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, człowiek)PeproTech Inc.#AF-100-18BNiezwierzęcy rekombinowany ludzki FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Roztwór do utrwalania/przepuszczalnościBD Biosciences#554722Roztwór do utrwalania i przepuszczalności do cytometrii przepływowej
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Bufor płuczący do cytometrii przepływowej
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Białko morfogenetyczne kości 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A Albumina
surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Przeciwciało cytokeratyny 12Santa Cruz Biotechnology#SC-17099Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko
cytokeratynie 14IF R& D Systems#MAB3164Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko przeciwciału IF
Cytokeratin 15ThermoFisher Scientific#MS-1068-PPrzeciwciało pierwszorzędowe dla IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Pożywka hodowlana do adherentnego różnicowania hPSC-LESC
Kolagen typu IV (ludzki)Sigma-Aldrich#C5533Ludzki kolagen łożyskowy typu IV
CoolCell LX Pojemnik do zamrażaniaSigma-Aldrich#BCS-405
Probówki CryoPureSarsted#72.3801,6 ml krioprobówka do kriokonserwacji hPSC-LESC
Zdefiniowany inhibitor trypsynyGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminin 521Biolamina#Ln521Ludzka rekombinowana laminina 521
Δ Np63&alfa; przeciwciałoBioCare Medical#4892Przeciwciało pierwszorzędowe dla
przeciwciała IF OCT3/4R& D Systems#AF1759Pierwszorzędowe przeciwciało dla IF
p63 i alfaTechnologia sygnalizacji komórkowej#ACI3066APierwszorzędowe przeciwciało dla IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (koniugat PE)Technologia sygnalizacji komórkowej56687p63-α Przeciwciało sprzężone z PE do cytometrii przepływowej
Przeciwciało PAX6Sigma-Aldrich#HPA030775Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko
penicylinie IF / streptomycynieLonza# 17-602E
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich# 158127Utrwalacz komórek do IF
ProLong Gold Antifade Mountant z DAPIThermo Fisher Scientific#P36931Mocowanie DAPI do twardych mocowanie do
zestawu do kriokonserwacji IF PSCThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM aminokwasy endogenneGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Środek permeabilizacyjny do IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200Uchwyt DAPI do montażu płynnego do IF
strong>NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin IITharmac
Cytometr przepływowy, np. BD Accuri C6BD Biosciences
Mikroskop fluorescencyjny, np. Olympus IX 51Olympus
#<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286(2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles