$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Przezroczysta rogówka na powierzchni oka pozwala światłu dostać się do siatkówki i zapewnia większość mocy refrakcyjnej oka. Najbardziej zewnętrzna warstwa, warstwowy nabłonek rogówki, jest stale regenerowany przez komórki macierzyste nabłonka rąbka (LESC). LESC znajdują się w warstwie podstawnej nisz rąbka na skrzyżowaniu korneo-twardówkowym1,2. LSC nie mają specyficznych i unikalnych markerów, więc ich identyfikacja wymaga bardziej szczegółowej analizy zestawu domniemanych markerów. Nabłonkowy czynnik transkrypcyjny p63, a zwłaszcza N-końcowo skrócony transkrypt izoformy alfa p63 (ΔNp63α), został zaproponowany jako odpowiedni dodatni marker LESC 3,4. Asymetryczny podział LESC pozwala im na samoodnawianie się, ale także na wytwarzanie potomstwa, które migruje dośrodkowo i do przodu. W miarę jak komórki zbliżają się do powierzchni rogówki, stopniowo tracą swoją łodygę i ostatecznie różnicują się w powierzchowne komórki płaskonabłonkowe, które są stale tracone z powierzchni rogówki.
Uszkodzenie którejkolwiek z warstw rogówki może prowadzić do poważnego zaburzenia widzenia, a wady rogówki są jedną z głównych przyczyn utraty wzroku na całym świecie. W niedoborze rąbków komórek macierzystych (LSCD) rąbek jest niszczony przez chorobę lub uraz, co prowadzi do spojówki i zmętnienia powierzchni rogówki, a następnie utraty wzroku5,6. Terapia zastępcza komórek z wykorzystaniem autologicznych lub allogenicznych przeszczepów rąbka ramiennego oferuje strategię leczenia dla pacjentów z LSCD4,7,8,9. Jednak pobieranie przeszczepów autologicznych niesie ze sobą ryzyko powikłań dla zdrowego oka, a tkanki dawcy jest niewystarczająca. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), w szczególności ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), mogą służyć jako nieograniczone źródło klinicznie istotnych typów komórek, w tym komórek nabłonka rogówki. W związku z tym LESC (HPSC-LESCs) pochodzące z hPSC stanowią atrakcyjne nowe źródło komórek w terapii wymiany komórek oka.
Tradycyjnie, zarówno metody hodowli niezróżnicowanych hPSC, jak i ich protokoły różnicowania do LESCs opierały się na użyciu niezdefiniowanych komórek żywiących, surowic zwierzęcych, kondycjonowanych pożywek lub błon owodniowych10,11,12,13,14,15. Ostatnio wysiłki na rzecz bezpieczniejszych produktów terapii komórkowej skłoniły do poszukiwania bardziej ustandaryzowanych i wolnych od ksenotypów protokołów hodowli i różnicowania. W rezultacie, kilka zdefiniowanych i wolnych od ksenotypów metod długotrwałej hodowli niezróżnicowanych hPSC jest obecnie dostępnych na rynku16,17,18. Jako kontinuum, niedawno wprowadzono protokoły ukierunkowanego różnicowania, które opierają się na sygnałach molekularnych, aby kierować hPSC do losu nabłonka rogówki19,20,21,22,23. Jednak wiele z tych protokołów wykorzystywało albo niezdefiniowane, oparte na karmie, hPSC jako materiał wyjściowy, albo złożone, ksenogeniczne koktajle czynników wzrostu w celu różnicowania.
Celem tego protokołu jest zapewnienie solidnej, zoptymalizowanej, wolnej od kseno- i karmy metody hodowli hPSC, a następnie różnicowanie jej na rogówkowe LESC. Jednowarstwowa hodowla pluripotencjalnych hPSC na matrycy lamininy-521 (LN-521) w zdefiniowanej, wolnej od albumin pożywce hPSC (w szczególności Essential 8 Flex) umożliwia szybkie wytwarzanie jednorodnego materiału wyjściowego do różnicowania. Następnie prosta, dwuetapowa strategia różnicowania kieruje hPSC w kierunku powierzchniowego losu ektodermalnego w zawiesinie, a następnie różnicowania adherentnego do LESC. Populacja komórek, w której > 65% wyraża ΔNp63α, uzyskuje się w ciągu 24 dni. Protokół bezksenologiczny i bezzasilający został przetestowany na kilku liniach hPSC (zarówno hESC, jak i hiPSC), bez konieczności optymalizacji specyficznej dla linii komórkowej. Opisane tutaj protokoły konserwacji bez weekendów, pasażu, kriokonserwacji i fenotypowania hPSC-LESC umożliwiają produkcję dużych partii wysokiej jakości LESC do celów klinicznych lub badawczych.