Reometria siłowo-zaciskowa do charakteryzowania hydrożeli na bazie białek

Summary

Nowa technika reometrii siłowo-zaciskowej jest używana do badania właściwości mechanicznych próbek hydrożelu na bazie białek o małej objętości, połączonych między silnikiem cewki drgającej a czujnikiem siły. Analogowy układ proporcjonalno-całkująco-pochodny (PID) pozwala na "zaciśnięcie" doświadczanej siły do pożądanego protokołu.

Abstract

Tutaj opisujemy metodę reometrii siłowo-zaciskowej, aby scharakteryzować właściwości biomechaniczne hydrożeli na bazie białek. Metoda ta wykorzystuje analogowy układ proporcjonalno-całkująco-pochodnej (PID) do zastosowania protokołów kontrolowanej siły na cylindrycznych próbkach hydrożelu na bazie białek, które są uwiązane między liniowym silnikiem cewki drgającej a przetwornikiem siły. Podczas pracy system PID dostosowuje wydłużenie próbki hydrożelu zgodnie z predefiniowanym protokołem siły, minimalizując różnicę między siłami zmierzonymi i zadanymi siłami. To unikalne podejście do hydrożeli na bazie białek umożliwia wiązanie próbek hydrożelowych o bardzo małej objętości (< 5 μl) o różnych stężeniach białka. W przypadku protokołów rampy siłowej, w których przyłożone naprężenie wzrasta i maleje liniowo w czasie, system umożliwia badanie zachowań elastyczności i histerezy związanych z (nie)fałdowaniem białek oraz pomiar standardowych parametrów sprężystości i lepkosprężystości. Przy stałej sile, gdzie impuls siły ma kształt schodkowy, odpowiedź sprężysta, ze względu na zmianę siły, jest oddzielona od odpowiedzi lepkosprężystej, która pochodzi z rozwijania i ponownego fałdowania domeny białkowej. Ze względu na małą objętość próbki i wszechstronność w stosowaniu różnych zaburzeń mechanicznych, reometria siłowo-zaciskowa jest zoptymalizowana do badania mechanicznej odpowiedzi białek pod wpływem siły przy użyciu podejścia masowego.

Introduction

Oprócz unikalnych właściwości fizycznych, hydrożele na bazie białek mają nadzieję zrewolucjonizować spektroskopię sił, umożliwiając pomiar kilku miliardów cząsteczek za jednym razem, umożliwiając w ten sposób badanie białek w zatłoczonych środowiskach, podobnych do tych spotykanych w skórze i innych tkankach. Domeny białkowe pozostają pofałdowane wewnątrz hydrożeli, co pozwala na badanie ich biomechanicznej odpowiedzi na siłę, partnerów wiążących i warunki chemiczne. Dodatkowo, odpowiedź biomechaniczna domen białkowych wewnątrz hydrożeli przypomina odpowiedź obserwowaną w technikach spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek. Na przykład chemiczne denaturanty i utleniacze zmniejszają stabilność stanu złożonego, zarówno na poziomie domeny pojedynczego białka^1,2,3, jak i na poziomie makroskopowym4^,5,6,7. Podobnie, osmolity zwiększają stabilność pojedynczych białek^8,9, co prowadzi do zmniejszenia odpowiedzi lepkosprężystej hydrożeli, dla tych samych warunków siły^7,10.

Zaimplementowano kilka podejść do syntezy hydrożeli na bazie białek, za pomocą interakcji fizycznych^11,12 lub kowalencyjnego sieciowania^4,13. Reakcje kowalencyjne pozwalają na stałe miejsca sieciowania, a te hydrożele mogą odzyskać stan początkowy po usunięciu zaburzeń mechanicznych lub chemicznych. Skuteczne podejście do kowalencyjnego sieciowania opiera się na tworzeniu kowalencyjnych wiązań węgiel-węgiel między odsłoniętymi aminokwasami tyrozynowymi przy użyciu nadsiarczanu amonu (APS) jako utleniacza i soli rutenu (II) jako inicjatora (Rysunek 1)¹⁴. Po wystawieniu na działanie białego światła roztwór skoncentrowanych białek można przekształcić w hydrożel. Kontrolując, kiedy rozpoczyna się reakcja, mieszanina białkowo-APS może być wstrzykiwana do dowolnej formy odlewniczej, takiej jak probówki z politetrafluoroetylenu (PFTE) (Rysunek 1B i 1C), co pozwala na użycie bardzo małej objętości roztworu¹⁵. Co więcej, zastosowanie światła białego do wywołania reakcji sieciowania powoduje ograniczone wybielanie białek fluorescencyjnych i pozwala na formułowanie hydrożeli kompozytowych z markerami fluorescencyjnymi (Rysunek 1). Inne metody tworzenia hydrożelu oparte na białkach wykorzystują sieciowanie oparte na interakcji kowalencyjnej SpyTag-SpyCatcher¹⁶, sieciowanie aminowe za pomocą aldehydu glutarowego¹³, lub interakcje biotyna-streptawidyna¹⁷.

Dynamiczna analiza mechaniczna (DMA) jest obecnie techniką szeroko stosowaną do badania hydrożeli na bazie polimerów^13,18. Chociaż DMA może stosować protokoły stałej siły do biomateriałów, wymaga modułów Younga powyżej 10 kPa i dużych objętości próbek powyżej 200 μL¹⁹. Ze względu na te ograniczenia, hydrożele białkowe są na ogół zbyt miękkie, aby można je było badać za pomocą tej techniki. Ponieważ zmodyfikowane poliproteiny są trudniejsze do syntezy niż polimery, ponieważ wymagają żywego systemu do produkcji, tak duże objętości są w najlepszym razie nieefektywne^4,15. Co więcej, większość tkanek biologicznych jest bardziej miękka niż 10 kPa. Opracowano kilka podejść do próbek biologicznych, zwłaszcza w badaniu elastyczności mięśni^20,21. Techniki te mogą również działać w trybie sprzężenia zwrotnego w celu przyłożenia stałej siły, ale są zoptymalizowane dla próbek o małych średnicach (w zakresie mikronów) narażonych na działanie siły przez bardzo krótki czas (zwykle krótszy niż 1 s).

Hydrożele na bazie białek zostały pomyślnie przebadane za pomocą zmodyfikowanych technik reometrycznych. Na przykład odlanie hydrożelu w kształcie pierścienia pozwala na użycie reometrii ekstensywnej do pomiaru zmiany doświadczanej siły w funkcji extension^4,22. Inne podejścia do badania właściwości reologicznych hydrożeli na bazie białek wykorzystują kontrolowaną reometrię naprężeń ścinających. Techniki te pozwalają również osiągnąć małą objętość próbki i tolerują miękkie materiały. Jednak metody te nie są w stanie naśladować sił ciągnących, które powodują rozwijanie się białka in vivo, a moduł Younga jest obliczany na podstawie złożonych teorii, które wymagają różnych założeń i poprawek²³.

Niedawno opisaliśmy nowe podejście, które wykorzystuje małą ilość białek, polimeryzowanych wewnątrz probówek o średnicy < 1 mm. Naszą pierwszą implementacją tej techniki było działanie w trybie zacisku długotrwałego, w którym żel był rozciągany zgodnie z pożądanym protokołem¹⁵. W tej metodzie białka doświadczają ciągłych zmian zarówno w rozciągliwości, jak i sile, podczas gdy domeny się rozwijają, co sprawia, że interpretacja danych jest uciążliwa. Niedawno opisaliśmy nową technikę reometrii siłowo-zaciskowej, w której pętla sprzężenia zwrotnego może wystawić hydrożele białkowe o małej objętości na działanie predefiniowanego protokołu siły⁷ (Rysunek 2). Analogowy system PID porównuje siłę zmierzoną przez czujnik siły z wartością zadaną wysłaną z komputera i dostosowuje przedłużenie żelu poprzez przesuwanie cewki drgającej, aby zminimalizować różnicę między dwoma wejściami. To "zaciśnięcie" siły pozwala teraz na nowe rodzaje eksperymentów w celu zmierzenia biomechaniki hydrożeli białkowych.

W trybie narastania siły, hydrożel białkowy na uwięzi doświadcza stałego wzrostu i spadku siły w czasie. PID kompensuje wszelkie odkształcenia lepkosprężyste poprzez zmianę wydłużenia w sposób nieliniowy, w zależności od rodzaju preparatu białkowego i hydrożelowego. Główną zaletą rampy siły jest to, że umożliwia ona kwantyfikację standardowych parametrów, takich jak moduł Younga i rozpraszanie energii, w wyniku rozwijania i ponownego fałdowania domen białkowych.

W trybie stałej siły, przyłożona siła zmienia się w sposób krokowy. W tym trybie żel rozciąga się i kurczy elastycznie, gdy siła jest odpowiednio zwiększana lub zmniejszana, po czym następuje odkształcenie zależne od czasu. To odkształcenie lepkosprężyste, mające miejsce, gdy żel doświadcza stałej siły, jest bezpośrednio związane z rozwijaniem/ponownym fałdowaniem domeny. W uproszczony sposób to rozszerzenie może być postrzegane jako ekwiwalent kilku miliardów śladów pojedynczych cząsteczek uśrednionych razem i zmierzonych jednocześnie. Protokoły stałej siły mogą być stosowane do badania pełzania i relaksacji hydrożeli białkowych w funkcji siły i czasu. W funkcji siły, dla hydrożeli białkowych na bazie BSA, wykazaliśmy niedawno, że istnieje liniowa zależność między elastycznym i lepkosprężystym przedłużeniem i odrzutem przy zastosowanym odkształceniu⁷.

Tutaj szczegółowo opisujemy działanie reometru z zaciskiem siłowym przy użyciu żeli kompozytowych wykonanych z mieszaniny białka L (8 domen²⁴, przedstawionego jako L₈) i konstruktu białkowego L-eGFP (L-eGFP), który sprawia, że cały hydrożel jest fluorescencyjny i łatwy do zademonstrowania.

Protocol

1. Przygotowanie roztworu odczynników

1. Przygotować wyjściowy roztwór białkowy, rozpuszczając/rozcieńczając białko będące przedmiotem zainteresowania do pożądanego stężenia, używając buforu Tris [20 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu i 150 mM NaCl, pH 7,4].
   UWAGA: Najmniejsze stężenie białka, dla którego sieciowanie prowadzi do hydrożeli, zależy od użytego białka i zwykle wynosi > 1 mM.
2. Przygotować zapasy roztworów roztworów nadsiarczanu amonu (APS) (1 M) i chlorku tris(bipirydyny)rutenu(II) ([Ru(bpy)₃]²⁺) (6,67 mM) przez rozpuszczenie proszków APS i [Ru(bpy)₃]²⁺ w buforze Tris.

2. Synteza hydrożelu na bazie białek

1. Umieścić igłę 23 G na strzykawce o pojemności 1 ml za pomocą wciśniętego tłoka.
2. Wytnij rurkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy 10 cm (o średnicy wewnętrznej 0.022 cala i średnicy zewnętrznej 0.044 cala) za pomocą żyletki. Przymocować igłę i strzykawkę do jednego końca rurki PTFE.
3. Włożyć drugi koniec rurki do roztworu silanu i napełnić rurkę, cofając tłok strzykawki. Pozostaw tubkę na ~30 min.
4. Usuń roztwór silanu i osusz rurkę sprężonym powietrzem.
   UWAGA: Upewnij się, że cały roztwór silanu jest wysuszony i że w probówce nie pozostały żadne pozostałości.
5. Zmieszać roztwór białka z APS i [Ru(bpy)3]²⁺ w probówce o pojemności 1,5 ml przy stałym stosunku objętości [np. 15:1:1 lub 15:0,5:0,5 (v:v:v)].
6. Wirować roztwór fotoaktywny, aż całkowicie się wymiesza.
7. Odwirować mieszaninę z maksymalną prędkością (np. 14 000 x g), aby usunąć wszelkie pęcherzyki z roztworu.
8. Włożyć otwarty koniec rurki z PTFE poddanej działaniu środka do mieszaniny fotoaktywnej i wciągnąć roztwór do probówki, cofając tłok strzykawki.
9. Umieść załadowaną rurkę w odległości ~10 cm od lampy rtęciowej o mocy 100 W, aby zapobiec jej nagrzewaniu się i trzymaj ją tam do 30 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 1B).
   UWAGA: W niektórych przypadkach czas ekspozycji na światło może wynosić nawet 30 s. W przypadku żeli fluorescencyjnych stosuje się tu krótsze czasy żelowania, aby ograniczyć fotowybielanie.
10. Wyjmij rurkę z igły i odetnij krawędzie rurki w pobliżu końców hydrożelu żyletką.
11. Użyj igły 24 G, aby wytłaczać hydrożel do roztworu Tris (Rysunek 1C).
    UWAGA: igły są używane, aby uniknąć jakichkolwiek nacięć lub uszkodzeń próbki hydrożelu.
12. Sprawdź wzrokowo żele pod kątem wszelkich wad, które mogą powstać podczas wytłaczania lub z powodu pęcherzyków powietrza, a żele z wadami należy wyrzucić.

3. Nasadka hydrożelowa na bazie białka i konfiguracja reometru siłowo-zaciskowego

1. Uruchom program sterujący przyrządem. Włącz silnik cewki drgającej. Ustaw pozycję cewki na wartość zbliżającą się do końca zakresu (np. 7.5 mm).
   UWAGA: Zaleca się, aby pozycja cewki drgającej zbliżała się do końca maksymalnego zakresu ruchu, aby zmaksymalizować możliwe wydłużenie hydrożelu.
2. Przesuń haki w kierunku z i ustaw je na zgięciu w kierunku x (który jest współrzędną ciągnięcia; patrz Rysunek 2B). Zapisz wartości mikrometrycznych dla kierunku x.
3. Przeciąć 2 sterylne szwy na pasma o równej długości (2 - 3 cm; patrz Rysunek 3A i B).
4. Zawiąż luźny podwójny węzeł od góry do każdego z pasm i umieść 2 pętle na haczyku podłączonym do czujnika siły (Rysunek 3C i 3D).
5. Napełnij komorę doświadczalną buforem Tris i przenieś próbkę hydrożelu do wypełnionej komory za pomocą pęsety medycznej.
6. Umieść cewkę drgającą i haki czujnika siły blisko powierzchni roztworu i wyrównaj haki we wszystkich kierunkach za pomocą manipulatorów pozycjonujących x/y/z.
7. Za pomocą pęsety medycznej zawieś obie strony próbki hydrożelu białkowego na haczykach połączonych z cewką drgającą i czujnikiem siły (Rysunek 3C).
8. Zaciśnij 1 pętlę szwów wokół próbki hydrożelu na haku cewki drgającej, przytrzymując oba końce pętli szwów pęsetą medyczną i ciągnąc je jednocześnie (Rysunek 3D).
9. Powtórz krok 3.8 dla pętli podłączonej do czujnika siły (Rysunek 3D).
   UWAGA: Unikaj ekstremalnego zaciskania szwów, aby zapobiec uszkodzeniom strukturalnym i poprzecznemu przecięciu próbki hydrożelu.
10. Zaciśnij pętle szwów na zgięciach każdego haczyka, aby zapobiec poślizgowi; użyj tych zagięć jako punktów odniesienia, aby znaleźć zerową separację między haczykami w kroku 3.2. Odetnij nadmiar szwów za pomocą nożyczek medycznych (Rysunek 3D).
11. Przesuń dołączony hydrożel za pomocą manipulatorów z wzdłuż osi z w kierunku komory doświadczalnej, aby zanurzyć hydrożel w roztworze eksperymentalnym.
12. Wyrównaj próbkę hydrożelu w y-z za pomocą manipulatorów tak, aby żel nie był pod żadnym naprężeniem.
13. Wyzeruj czujnik siły i oddziel dwa haczyki za pomocą stopni x-mikrometrycznych, aż żel zacznie odczuwać siłę. Gdy tak się stanie, lekko przekręć mikrometryczną w kierunku x.
14. Zapisz położenie obu manipulatorów dla silnika cewki drgającej i czujnika i wykorzystaj różnicę między tymi wartościami a wartościami zmierzonymi w kroku 3.2, aby obliczyć dokładną odległość między hakami mocującymi na początku eksperymentu.
15. Ustaw zakres krzywej luzu na ~1,5 - 2 mm i zmierz luz żelowy (Rysunek 4A).
    UWAGA: Dla każdego pomiaru luzu drgawkowego staraj się, aby początek reżimu luzu był bliski początkowej pozycji cewki drgającej, co pozwala na uzyskanie optymalnej liczby punktów danych, aby dopasować się do 2 reżimów (Rysunek 4A). Długość żelu można określić z rozdzielczością mikronów, wykorzystując separację między hakami i przecięcie między 2 reżimami na krzywej zapasu czasu (patrz również krok 5.1). Ponieważ czujnik siły może dryfować w czasie z powodu zmian warunków doświadczalnych, część krzywej luzu, w której żel nie jest pod wpływem siły, informuje o tym możliwym dryfie. Program sterujący przyrządem automatycznie kompensuje tę różnicę podczas wysyłania polecenia wartości zadanej do pętli PID (Rysunek 4A wstawka).

4. Charakterystyka hydrożelu opartego na białkach przy użyciu pomiarów kontrolowanej rampy siły i stałej siły

1. Eksperymenty z rampą siłową
   1. Aby wykonać cykl narastania siły poprzez zwiększenie siły przy żądanej szybkości obciążenia (np. 0,01 mN/s), wprowadź siły początkowe i końcowe oraz czas trwania protokołu jako odwrócone "V". Następnie przytrzymaj żel na poziomie 0 mN (lub małej siły) przez > 200 s, aby umożliwić ponowne złożenie domen białkowych i odzyskanie elastyczności żelu.
   2. Zapisz ślad.
2. Eksperymenty ze stałą siłą
   1. Wykonaj protokół stałej siły, przykładając małą siłę (np. 0,1 mN) przez 30 s, a następnie zwiększ siłę do stałej siły (np. 1 mN) przez określony czas (np. 120 s), a następnie schładzając siłę z powrotem do tej samej niskiej wartości (np. 0,1 mN) przez > 300 s, aby umożliwić ponowne złożenie domen białkowych i odzyskanie elastyczności żelu.
   2. Po pierwszym impulsie dostosuj ustawienia PID, aby zmaksymalizować czas odpowiedzi pętli sprzężenia zwrotnego (patrz Rysunek 2D).
      UWAGA: W przypadku sztywnych żeli i niewielkich zmian siły czas reakcji pętli jest ograniczony przez elektronikę czujnika siły i czas reakcji cewki i może wynosić nawet 5^{ms 7}. W przypadku bardziej miękkich żeli i dużych zmian siły, czas reakcji jest podyktowany elastycznością hydrożeli (Rysunek 2D).
   3. Zapisz ślad.

5. Analiza danych

1. Wykorzystując zmierzoną odległość między hakami i obliczoną pozycję cewki, gdy żel zacznie odczuwać siłę (Δx w Figura 4A wkładka), oblicz długość żelu L, korzystając z równania:
   L = L₀ + ∆x
   W tym przypadku L₀ jest odległością między hakami, mierzoną od położenia mikrometrycznych przed eksperymentem (krok 3.14).
   UWAGA: W przypadku żeli o niskich stężeniach białka, które nie powodują pełnego usieciowania, zmierzona długość zmieni się ze śladu na ślad. Ponadto, przez długi czas, białka wewnątrz hydrożeli mogą doświadczać efektów starzenia²⁵, co powoduje ogólne wydłużenie żelu.
2. Znormalizuj zmierzone wydłużenie do długości żelu, aby uzyskać odkształcenie.
3. Znormalizuj zmierzoną siłę do powierzchni poprzecznej, używając wewnętrznej średnicy rurki używanej do polimeryzacji.

Results

Rysunek 1A pokazuje schemat reakcji fotoaktywnej użytej do syntezy hydrożelu L-EGP/L₈. Rysunek 1B pokazuje mieszaninę hydrożelu w rurce PTFE przed i po fotoaktywacji. Rysunek 1C przedstawia ekstrudowany hydrożel L-eGFP-L₈ w roztworze Tris. Próbka hydrożelu nie posiada wad strukturalnych, takich jak karbowania. Hydrożele z wyraźnie widocznymi uszkodzeniami należy wyrzucić.

Discussion

W tym artykule opisujemy technikę reometrii siłowo-zaciskowej w celu zbadania odpowiedzi biomechanicznej hydrożeli na bazie białek o małej objętości. Dodatkowo dostarczany jest protokół do syntezy jednolitej cylindrycznej próbki hydrożelu białkowego o małej objętości. Przedstawiono również protokół, który opisuje, w jaki sposób wiązać różne rodzaje hydrożeli na bazie białek o różnej elastyczności, nie powodując żadnych odkształceń mechanicznych ani uszkodzeń próbek hydrożelu na bazie białka lub ślizgania się żelu na hacz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przetwornik siły SI-KG4A	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A
Albumina surowicy bydlęcej	Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Nadsiarczan amonu	Sigma-Aldrich	248614-100G
Chlorek tris(bipirydyny)rutenu(II)	Sigma-Aldrich	544981-1G
EKSPRESOWE MATERIAŁY MEDYCZNE  6-0 NYLON SZEW 12/PK	Fisher Scientific	NC0395626
Tylko strzykawka 1 ml, końcówka Luer-Lok	BD	309628
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
, 0,022 "ID x 0,042" OD, 100 stóp / rolka	Cole-Parmer	EW-06417-21
Igła podskórna, 23 Gauge	Profesjonaliści w zakresie zaopatrzenia medycznego	305194
Końcówki dozujące Jensen Global JG24-1.5X Red IT - 24 gauge	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Lampa rtęciowa o krótkim łuku	ALB	USH-103D USHIO
Pęseta
Nożyczki
Olympus
Kod komputerowy i projekt CAD części niestandardowych mogą być udostępnione na życzenie odpowiedniemu autorowi.