Artykuł metodologiczny

Metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia

DOI:

10.3791/58288

⸱

5 września 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Science, Nanchang University, 2Queen Mary School, Medical Department, Nanchang University, 3School of Life Science, Nanchang University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół mający na celu poprawę podziału parafiny. Metoda ta łączy cięcie i pływanie za pomocą prostej studzienki termostatycznej, aby uniknąć procesu przenoszenia wymaganego przez metodę konwencjonalną. W rezultacie znacznie poprawiła się wydajność i liczba nienaruszonych skrawków parafiny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cięcie tkanki zatopionej w parafinie jest szeroko stosowane w histologii i patologii. Jest to jednak żmudne. Aby udoskonalić tę metodę, kilka firm komercyjnych opracowało złożone systemy przenoszenia przekrojów wykorzystujące płynną wodę. Aby uprościć tę technologię, stworzyliśmy prostą metodę przy użyciu domowego sprzętu, który łączy cięcie i pływanie w prostej komorze termostatycznej; Dzięki temu sekcje automatycznie wchodzą do łaźni wodnej na powierzchni wody. Hipokamp z mózgów dorosłych myszy, nerek dorosłych myszy, embrionalnych mózgów myszy i oczu dorosłych danio pręgowanego przecięto przy użyciu zarówno konwencjonalnego przekroju parafinowego, jak i przedstawionej metody dla porównania. Analiza statystyczna pokazuje, że nasza ulepszona metoda pozwoliła zaoszczędzić czas i pozwoliła uzyskać wyższą jakość sekcji. Ponadto cięcie parafinowe całej próbki w krótkim czasie jest łatwe dla młodszych operatorów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie morfologiczne jest ważne w badaniach biologicznych. Chociaż nowa technologia pozwoliła naukowcom obserwować swoje cele bezpośrednio z całej tkanki lub organizmu1,2,3, cięcie próbki na cienkie sekcje, a następnie barwienie, pozostaje podstawową metodą nie tylko morfologii tkanki, ale także białka ukierunkowanego bezpośrednio w tkance. W mikroskopii świetlnej wykorzystuje się trzy typy przekrojów: parafinowy, mrożony i półcienki. Chociaż kriosekcja jest powszechna w celu ochrony antygenowości tkanek, a przygotowanie próbki jest proste, morfologia zatrzymanej tkanki jest słaba i nieodpowiednia do cienkiego cięcia4,5. Cięcie parafiny jest najczęściej stosowaną metodą wykazywania dobrze zachowanej morfologii. Ponieważ próbki są całkowicie odwodnione i zatopione w wosku, bloki parafiny mogą być przechowywane w nieskończoność. Ponadto w wyniku cięcia parafiny powstają cienkie odcinki, które poprawiają dostęp sondy biologicznej w dalszych eksperymentach i zmniejszają nakładanie się warstwy komórkowej w kierunku Z.

Jednak konwencjonalne cięcie parafiny jest żmudne i wymaga umiejętności operatora. Skrawki parafiny ulegają utrwalaniu, odwadnianiu, zatapianiu, cięciu i unoszeniu się. Co ważne, przenoszenie taśm sekcyjnych z uchwytu noża do kąpieli wodnej jest konieczne, ale trudne dla młodszych operatorów. Szczególnie w suchym powietrzu wstęgi sekcji skręcają się z powodu elektryczności statycznej i są trudne do rozłożenia na powierzchni ciepłej wody. Aby poprawić jakość przekroju, zaleca się zwilżenie odsłoniętej powierzchni tkanki między przejściami ostrza mikrotomu, chłodzenie bloków wosku poprzez zanurzenie ich w lodowatej wodzie lub podniesienie wilgotności za pomocą nawilżacza w pobliżu mikrotomu6,7. Nowsze metody poprawy przekroju parafiny obejmują hybrydowe zatapianie parafiny, kriosekcję8 oraz komercyjny system transferu sekcji assistance9. Chociaż metody te częściowo poprawiają szybkość i jakość cięcia parafiny, sprawiają, że cięcie jest znacznie bardziej kłopotliwe, a komercyjne systemy przenoszenia sekcji są drogie.

W tym protokole pokazujemy, jak krok po kroku tworzyć proste, tanie i elastyczne urządzenia, które można podłączyć do uchwytu ostrza obrotowego mikrotomu. To urządzenie składa się z kanału sekcyjnego, łaźni wodnej i grzałki z przełącznikiem wykrywania temperatury. Po przecięciu dziesiątki sekcji wpływają do kanału kształtownika i wchodzą bezpośrednio do łaźni wodnej, rozkładając się w ten sposób automatycznie. Poprawia to wydajność cięcia parafiny i sprawia, że technologia ta jest wygodniejsza. Stosując tę metodę, więcej wycinków hipokampa dorosłej myszy, wycinków nerki dorosłej myszy, embrionalnych 15,5-dniowych (E15,5) odcinków mózgu myszy i wycinków oczu dorosłego danio pręgowanego zebrano w krótszym czasie i pozostało ono bardziej nienaruszone morfologicznie. Metoda ta może być również stosowana do innych próbek tkanek, które wymagają przyspieszonego cięcia parafiny przy jednoczesnym uniknięciu utraty rozróżnienia sekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Nanchang.

1. Złóż sprzęt i podłącz mikrotom

  1. Zaprojektuj parametr zgodnie z wymaganiami (Uzupełniające Rysunek 1).
  2. Prześlij parametr do lokalnej fabryki w celu wyprodukowania tablic akrylowych.
  3. Złóż wszystkie części po kolei: Użyj chloroformu, aby połączyć 7 komercyjnych płyt akrylowych w zbiornik z kanałem sekcyjnym i kąpielą wodną ( Rysunek 1).
    UWAGA: Chloroform wytwarza substancje toksyczne, gdy styka się ze światłem i tlenem. Zamontuj urządzenie w dygestorium.
  4. Zamontuj rurowy elektryczny element grzejny przez otwór w płycie akrylowej #1 (Rysunek 2A, grot strzałki).
  5. Aby zainstalować regulator temperatury, utwórz mały otwór na akrylowej płycie #2 za pomocą wiertarki elektrycznej i zainstaluj czujnik temperatury (Rysunek 2A, strzałka). Zainstaluj termostat cyfrowy na zbiorniku (Rysunek 2A).
    UWAGA: Czujnik temperatury powinien znajdować się nie dalej niż 1 cm pod powierzchnią wody.
  6. Aby zapewnić dostęp do zasilania, wyreguluj napięcie poniżej 24 V przed włączeniem urządzenia.
  7. Wyjmij tackę na odpady sekcyjne z mikrotomu.
  8. Połącz kanał sekcji z uchwytem ostrza mikrotomu za pomocą neutralnego uszczelniacza silikonowego ( Rysunek 2B).
    UWAGA: Nie rozmazuj żadnego neutralnego uszczelniacza silikonowego nad górną częścią ostrza, aby stare ostrze można było łatwo wymienić.
  9. Suszyć przez noc, aby chloroform i neutralny uszczelniacz silikonowy miały czas na zastygnięcie.
  10. Zamontuj ostrze w uchwycie ostrza. Wlej wodę do łaźni wodnej (Rysunek 2C). Powierzchnia wody powinna dotykać górnej części ostrza (Rysunek 2D, grot strzałki).

2. Sekcja parafiny

UWAGA: Zanieczyszczenia często gromadzą się na górnych lub dolnych krawędziach bloku wosku i na powierzchni wody. Te zanieczyszczenia powinny być regularnie usuwane.

  1. Wykonaj konwencjonalne cięcie parafiny10.
    1. Zaciśnij próbkę zatopioną w parafinie na obrotowym mikrotomie i umieść ostrze w uchwycie ostrza.
    2. Obróć pokrętło i podziel próbkę na sekcje.
    3. Przenieść wstęgę z cząstkami parafiny do łaźni wodnej o temperaturze 38,5 °C.
    4. Po rozłożeniu podnieś skrawki na szkiełko mikroskopowe z powierzchni wody.
    5. Szkiełka suszyć przez noc w piekarniku w temperaturze 42 °C.
  2. Ulepszone cięcie parafiny (Rysunek 3)
    1. Włącz sprzęt.
    2. Otwórz grzałkę z przełącznikiem wykrywania temperatury i ustaw docelową temperaturę w zakresie od 38,0 °C do 40,0 °C na 1 godzinę z wyprzedzeniem, aby podgrzać wodę.
    3. Zmodyfikuj blok parafiny uzyskany przez zatapianie parafiny, a następnie umieść blok parafiny na zacisku kasety mikrotomu i zablokuj go.
      UWAGA: Górne i dolne granice bloku parafinowego należy zmodyfikować poziomo, aby wstęga sekcji nie tworzyła łuku i nie mogła przepływać przez kanał wąskich sekcji.
    4. Szybko zbliż się do próbki, wycinając grubsze fragmenty.
    5. Dostosuj do odpowiedniej grubości przekroju (10 μm dla mózgów dorosłych myszy, nerek dorosłych myszy i zarodków mózgów myszy, 4 μm dla oczu danio pręgowanego). Obróć pokrętło, a sekcje automatycznie wejdą do kanału sekcji i wanny.
    6. Dziel próbkę powolnym i równomiernym ruchem cięcia (Rysunek 3A).
      UWAGA: Grubość pierwszej sekcji zostanie zmieniona po zatrzymaniu pokrętła na kilka minut. Ostrza jednorazowe należy wymienić, gdy sekcje mają kolejne zadrapania.
    7. Wprowadź sekcje do komory kąpieli, aby unosiły się w linii (Rysunek 3B, 3C).
      UWAGA: Jeśli część głowicy przylega do ścianki komory, użyj prowadnicy szczotki, aby utrzymać ją w ruchu.
    8. Przyklej skrawki do szkiełek mikroskopowych. Po całkowitym rozłożeniu sekcji w łaźni wodnej oddziel kilka sekcji pęsetą. Następnie podnieś je z kąpieli wodnej na szkiełka mikroskopowe (Rysunek 3D).
      UWAGA: Sekcje należy zbierać z tylnej części kąpieli wodnej, ponieważ te w kanale sekcji i przedniej części kąpieli wodnej nie będą jeszcze w pełni rozłożone.
    9. Wysuszyć szkiełka, umieszczając je na noc w piekarniku o temperaturze 42 °C. Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony.
  3. Użyj barwienia Hematoxylin-Eozyny (HE) w celu oceny ulepszonej metody8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulepszona metoda zwiększyła liczbę nienaruszonych skrawków parafiny. Przetestowaliśmy tę nową metodę na tkance hipokampa dorosłej myszy, nerkach dorosłych myszy, embrionalnych mózgach myszy i oczach zebry. Do zbiornika dodawano wodę, a temperatura wody utrzymywała się w zakresie od 38,0 °C do 40,0 °C. Po seryjnym przygotowaniu próbek tkanek zostały one pokrojone i porównane z konwencjonalnym cięciem. Nowa metoda pozwoliła uniknąć utraty sekcji i zwiększyła odsetek nienaruszonych skrawków ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby poprawić morfologię przekroju parafiny i rozwiązać problem marnowania czasu podczas konwencjonalnego cięcia parafiny, stworzyliśmy ulepszoną metodę cięcia parafiny, która łączy cięcie i rozwijanie. Ta ulepszona metoda opiera się na prostym sprzęcie, który składa się z kanału sekcyjnego, łaźni wodnej i grzałki z przełącznikiem wykrywania temperatury. Taśma sekcji wchodzi do łaźni wodnej przez kanał sekcji i rozwija się automatycznie podczas cięcia. Dlatego metoda ta poprawia jakość i wydajność cięcia parafiny, co zost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy posiadają patent na to urządzenie i deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31400936, 31460260) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Jiangxi w Chinach (20171BAB215020). Dziękujemy również wspólnemu programowi Uniwersytetu Nanchang i Uniwersytetu Królowej Marii w Londynie za wsparcie tych prac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
InkubatorBoekel Scientific133000-2
Etanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Pokrywka64-17-5
Ksylen Sinopharm Chemical Reagent Co., pokrywka1330-20-7
ParaplastLeica39601006
Podgrzewany moduł zatapiania parafinyLeica
TrichlorometanSinopharm Chemical Reagent Co., Pokrywka67-66-3
Regulator temperatury (12 V 120 W)MingsuoXH-W3002
Mikrotom obrotowy Leica
Neutralny uszczelniaczsilikonowy Połącz kanał wodny z uchwytem noża do mikrotomów
Transformator napięciaDearllS-250-12
Ostrze jednorazoweAccu-Edge4689
HematoxylinBaso Diagnostics Inc.BA-4025
Eozyna Baso Diagnostyka Inc.BA-4025
Microslide Sail Marka7105
Neutralny balsamSinopharm Chemical Reagent Co., Pokrywka10004160
Szkiełko nakrywkowe Citoglas10212424C
MikroskopCarl Zeiss
Kwas solnyXilong Chemical7647-01-0
Kąpiel wodna do sekcji parafinowychLeica
HistoCore Arcadia C - Zimna płytaLeica
odstraszający parafinę Thermo Scientific9990420
Komercyjna płyta akrylowa Leica Rurowy elektryczny element grzejny (12 V 200 W) spray

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  2. Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
  3. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
  4. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
  5. Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
  6. Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
  7. Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
  8. Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).
  9. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).
  10. Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).
  11. Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
  12. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).
  13. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).
  14. Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
  15. Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Paraffin SectioningTissue SectioningCutting Floating MethodWater Bath SectioningMicrotome SectioningSection Transfer SystemThermostatic ChamberSection Quality AnalysisHematoxylin Eosin StainingWhole Specimen Sectioning

Powiązane artykuły