Artykuł metodologiczny

Aparatura do pobierania mikrokolumn tkankowych

DOI:

10.3791/58289

⸱

25 października 2018

 ,  ,  , 
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Dermatology, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół produkcji igieł do pobierania igieł, które mogą być używane do pobierania tkanki skórnej o pełnej grubości bez powodowania bliznowacenia miejsca dawczego. Igły można łączyć z prostym systemem zbierania, aby uzyskać zbiory na dużą skalę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje proces produkcji aparatu laboratoryjnego, wykonanego z gotowych komponentów, który może być używany do zbierania mikrokolumn tkanki skórnej o pełnej grubości. Niewielki rozmiar mikrokolumn pozwala na szybkie gojenie się miejsc dawczych bez powodowania bliznowacenia w miejscu dawczym, podczas gdy pobieranie tkanki o pełnej grubości umożliwia włączenie wszystkich komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników tkanki skórnej, w tym tych związanych z głębszymi obszarami skóry właściwej i strukturami skóry przydatków, które nie zostały jeszcze pomyślnie odtworzone przy użyciu konwencjonalnych technik inżynierii tkankowej. Mikrokolumny mogą być stosowane bezpośrednio w ranach skóry w celu przyspieszenia gojenia lub mogą być wykorzystywane jako autologiczne źródło komórek/tkanek dla innych podejść inżynierii tkankowej. Igły do pobierania są wytwarzane poprzez modyfikację standardowych igieł podskórnych i mogą być używane samodzielnie do pobierania niewielkich ilości tkanek lub w połączeniu z prostym systemem pobierania opartym na ssaniu (również wykonanym z powszechnie dostępnych materiałów laboratoryjnych) do zbioru na dużą skalę, aby ułatwić badania na dużych modelach zwierzęcych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologiczny przeszczep skóry jest podstawą leczenia ran, ale jest ograniczony przez niedobór i zachorowalność miejsca dawczego, co doprowadziło do wspólnych wysiłków w ostatnich dziesięcioleciach w celu opracowania nowych opcji terapeutycznych, które zastąpiłyby konwencjonalne przeszczepy skóry1,2. Niedawno opracowaliśmy alternatywną metodę pobierania skóry, aby wykorzystać korzyści płynące z przeszczepu skóry o pełnej grubości, jednocześnie minimalizując zachorowalność w miejscu dawczym. Zbierając skórę o pełnej grubości w postaci małych (~0,5 mm średnicy) "mikrokolumn", miejsca dawcze są w stanie zagoić się szybko i bez blizn w normalnych warunkach (potencjalne wyjątki znajdują się w sekcji dyskusji poniżej)3. Mikrokolumny mogą być stosowane bezpośrednio w łożyskach ran, aby przyspieszyć zamykanie ran, zmniejszyć skurcze3 i przywrócić różnorodny zakres typów komórek naskórka i skóry właściwej oraz funkcjonalnych struktur przydatków4, z których wiele nie jest dostępnych w konwencjonalnym przeszczepie skóry o podzielonej grubości lub obecnych bioinżynieryjnych substytutach skóry5. Zdolność mikrokolumn do wspomagania gojenia i ich miejsc dawczych do gojenia się bez blizn została niezależnie potwierdzona przez inne grupy badawcze6,7.

Wcześniej opracowaliśmy laboratoryjny system zbierania, aby umożliwić zbieranie mikrokolumn na dużą skalę8; jednak ten system składa się z wielu niestandardowych komponentów, które nie są powszechnie dostępne. W tym miejscu szczegółowo opisujemy proces produkcji igieł do zbioru, a także proste systemy zbierania, wykonane w większości z gotowych komponentów, które można wykorzystać do uzyskania dużych zbiorów. Aparatura opisana w tym manuskrypcie nadaje się do badań in vitro i pracy na zwierzętach, ale nie do stosowania u ludzi. Urządzenie kliniczne z zezwoleniem FDA do stosowania tej techniki u ludzi jest dostępne na rynku, ale nie będzie tutaj szczegółowo omawiane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace z udziałem żywych zwierząt i próbek tkanek zwierzęcych zostały zatwierdzone przez Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Produkcja igieł do zbioru

  1. Ustawienie etapu produkcji
    1. Przymocuj żeńskie złącze luer lock do słupka i zamontuj słupek na stoliku obrotowym tak, aby luer lock znajdował się na środku stolika (Rysunek 1A).
    2. Ustaw ten pierwszy stopień obrotu pionowo i zamontuj go prostopadle do drugiego, poziomego stopnia obrotu (Rysunek 1B).
    3. Zamontuj stolik obrotu poziomego na dwuosiowym stoliku translacyjnym (Rysunek 1B).
    4. Przymocuj kombinację do stabilnej powierzchni, takiej jak optyczna płytka stykowa.
    5. Oddzielnie zamontuj narzędzie obrotowe na tej samej płytce stykowej, tak aby narzędzie było umieszczone równolegle do płytki stykowej i w przybliżeniu na tej samej wysokości, co złącze luer lock na etapie kombinacji obrotu/translacji (Rysunek 1C).
    6. Zamontuj dwie tarcze do cięcia koncentrycznie na narzędziu obrotowym (mniejsza diamentowa tarcza do cięcia o mniejszej ziarnistości na większej ściernicy do cięcia kamienia) (Rysunek 1D).
      UWAGA: Różnica około 9 mm między średnicami obu kół jest na ogół wystarczająca.
    7. Umieść górne źródło światła z regulowanym ramieniem nad narzędziem obrotowym, tak aby światło było skierowane na koła tnące.
    8. Aby poprawić wizualizację, umieść mikroskop preparacyjny nad stanowiskiem produkcyjnym tak, aby okular był skupiony na tarczach tnących (Rysunek 1C).
      UWAGA: Alternatywnie użytkownicy mogą nosić okulary powiększające.
  2. Zmiana kształtu końcówki igły
    1. Nosić okulary ochronne i maskę chirurgiczną, aby zapobiec przedostawaniu się drobnych cząstek metalu do oczu lub dróg oddechowych.
    2. Wybierz igły podskórne o odpowiednim rozmiarze, w oparciu o wymagania eksperymentalne.
    3. Zaznacz zamierzoną długość na każdej igle do zbioru.
      UWAGA: Do zbioru ze skóry świni zazwyczaj wystarczają igły o średnicy 8 mm; Chociaż długość może się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych (np. Grubość docelowej tkanki skórnej, rozmiar rozstawu igieł). Ogólnie rzecz biorąc, igła o rozmiarze 19 dobrze sprawdza się w przypadku skóry świń.
    4. Opuść igłę prostopadle do narzędzia obrotowego przy włączonym zasilaniu, używając krawędzi zewnętrznej tarczy tnącej do odcięcia nadmiaru długości igły, w miejscu zaznaczonym w kroku 1.2.3.
    5. Podłącz skróconą, igłę do żeńskiego złącza luer lock na etapie produkcji.
    6. Wyreguluj obrót w poziomie stage tak, aby igła znajdowała się pod kątem 12° równolegle do tarcz tnących na narzędziu obrotowym (zmiana kąta wpłynie na siłę wymaganą do wkłucia igły).
    7. Włącz lampę górną i dostosuj jej położenie, obserwując igłę w powiększeniu, aż światło odbije się od linii środkowej (wzdłuż) igły.
    8. Włącz narzędzie obrotowe, a następnie użyj etapu translacji, aby przesunąć igłę w kierunku wewnętrznej (diamentowej) tarczy tnącej (Rysunek 2A).
    9. Powoli dociskaj igłę do tarczy tnącej, aż tarcza tnąca osiągnie mniej więcej linię środkową igły (jak widać po odbiciu światła górnego wzdłuż linii środkowej).
    10. Powoli przesuwaj wyciętą powierzchnię igły z wewnętrznej tarczy diamentowej na zewnętrzną tarczę kamienną, aby wykończyć powierzchnię wyciętej igły drobniejszym polerowaniem (Rysunek 2B).
    11. Wycofaj igłę z tarczy tnącej.
    12. Korzystając z pionowego stolika obrotu, obróć igłę o 180°.
    13. Powtórz kroki 1.2.9-1.2.10, aby zmienić kształt drugiej strony igły.
      UWAGA: Igła powinna teraz mieć dwie końcówki tnące o mniej więcej równej długości (Rysunek 2C i 2D).
    14. Usunąć igłę ze etapu produkcji.
    15. Oczyść wewnętrzny otwór metalowym drutem, który jest nieco mniejszy niż wewnętrzna średnica igły.
    16. Za pomocą ostrego drewnianego patyczka (np. odłamując koniec małego drewnianego patyczka na aplikatorze z bawełnianą końcówką), usuń wszelkie zadziory, które mogą być nadal przyczepione do krawędzi nowo uformowanej igły.
      UWAGA: Igły do zbioru można w razie potrzeby polerować elektrolitycznie i sterylizować w autoklawie.

2. Pobieranie tkanek skórnych

  1. Użyj igieł do zbierania, aby pobrać mikrokolumny skóry z tkanek ex vivo lub żywych zwierząt.
  2. W przypadku cienkiej tkanki skórnej ex vivo (zwłaszcza z próbek, w których brakuje podskórnego tłuszczu lub został on odcięty), należy przytrzymać tkankę docelową nad otworem probówki wirówkowej o pojemności 50 ml lub ułożyć dwa kawałki tkanki jeden na drugim, aby uniknąć uszkodzenia końcówek igieł poprzez uderzanie nimi o twarde powierzchnie.
    UWAGA: W przypadku zbioru in vivo od żywych zwierząt zaleca się miejscowe podawanie lidokainy i epinefryny we wstrzyknięciu śródskórnym w celu złagodzenia analgezji i zmniejszenia krwawienia.
  3. Zmontuj urządzenie do zbioru zgodnie z potrzebną ilością mikrokolumn, jak opisano poniżej.
  4. Opcja niskiej-średniej głośności:
    1. Aby zebrać małe lub średnie ilości mikrokolumn, wystarczy napełnić standardową strzykawkę (strzykawki o pojemności 10-20 ml zwykle dobrze działają) zwykłą solą fizjologiczną i podłączyć ją do igły do zbierania.
    2. Całkowicie wbić igłę do pobrania w skórę dawcy, a następnie ją schować.
    3. Nacisnąć na tłok strzykawki, aby przepłukać sól fizjologiczną przez igłę do zbioru i usunąć mikrokolumnę, która utknęła w otworze igły.
    4. Aby przyspieszyć proces zbioru, powtórz krok 2.4.2 od 3 do 5 razy przed usunięciem mikrokolumn w kroku 2.4.3.
      UWAGA: Zwykle wygodnie jest wyrzucić mikrokolumny do standardowego sitka komórkowego, aby ułatwić późniejsze zbieranie mikrokolumn.
    5. Jeśli igły zostaną zatkane, zwiększ nacisk na tłok, aby usunąć zablokowaną tkankę i usunąć zatkanie. Jeśli samo zwiększenie ciśnienia jest niewystarczające, włóż metalowy drut przez otwór końcówki igły, aby usunąć zatkanie w otworze igły.
    6. Mikrokolumny należy przechowywać zanurzone w soli fizjologicznej lub pożywce do czasu użycia, aby zapobiec wysuszeniu .
      UWAGA: Przy doświadczonym operatorze opisana powyżej metoda może być stosowana do zbierania mikrokolumn z szybkością około 1 mikrokolumny na sekundę.
  5. Opcja dużej głośności:
    1. Stwórz proste urządzenie wspomagane ssaniem, które można skonstruować tak, aby ułatwić zbieranie dużych ilości mikrokolumn.
      UWAGA: Urządzenie składa się z igły do zbierania, strzykawki o pojemności 20 ml z dyszą typu luer lock, adaptera ssącego zwykle używanego do liposukcji (Rysunek 3A) oraz sterylnego kanistra ssącego.
    2. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 20 ml.
    3. Podłączyć strzykawkę do adaptera ssącego.
    4. Zakończ składanie, podłączając igłę do pobierania do strzykawki (Rysunek 3B).
    5. Użyj kawałka sterylnego przewodu ssącego, aby podłączyć adapter ssący do sterylnego kanistra ssącego. Upewnij się, że urządzenie do zbioru jest podłączone do wejścia kanistra, które umożliwia niezakłócony przepływ płynu do kanistra (co może wymagać podłączenia do portu kanistra, który jest oznaczony jako odpływ, a nie dopływ).
    6. Podłącz urządzenie do źródła podciśnienia.
      UWAGA: Wymagany nacisk zależy od średnicy i długości igły, jak opisano wcześniej8. Dla aparatury opisanej w tym manuskrypcie system ssący spotykany w typowych salach operacyjnych jest na ogół wystarczający.
    7. Podłączyć igłę do pobierania próbek do strzykawki.
    8. Zbierz mikrokolumny, wkładając igłę do pobierania w skórę.
      UWAGA: Mikrokolumny zostaną wciągnięte do strzykawki przez odsysanie, a następnie przepłukane do kanistra ssącego.
    9. Podczas procedury zbioru należy okresowo zanurzać igłę do zbioru w pojemniku ze sterylną solą fizjologiczną, aby przepłukać system.
      UWAGA: To płukanie solą fizjologiczną ułatwia transport mikrokolumny i zapewnia jej nawodnienie. Alternatywnie, adapter luer MFF można podłączyć do zamka luer strzykawki, a za pomocą rurki połączeniowej również do wiszącego worka kroplowego z solą fizjologiczną.
    10. Trzymaj pod ręką metalowy drut lub igłę o mniejszej średnicy, która jest nieco mniejsza niż wewnętrzna średnica igły do zbioru. Jeśli igła zostanie zatkana, można ją usunąć, wkładając metalowy drut do otworu igły.
    11. Gdy w kanistrze zgromadzi się żądana ilość mikrokolumn, odłącz urządzenie od ssania, a następnie wylej zawartość kanistra ssącego przez filtr, aby zebrać mikrokolumny.
  6. Po pobraniu należy nałożyć miejscową maść z antybiotykiem na miejsca dawcze.
    UWAGA: Dodatkowe opatrunki na ogół nie są wymagane w miejscach dawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Igły do pobierania powinny być w stanie zebrać mikrokolumny tkanki skórnej o pełnej grubości z około 80-90% skutecznością, a każda mikrokolumna powinna zawierać naskórek, skórę właściwą i trochę podskórnej tkanki tłuszczowej (Rysunek 4). Jeśli wskaźnik powodzenia pobierania jest niski lub jeśli wprowadzenie igły do tkanki staje się trudne, prawdopodobnie potrzebna jest nowa igła. Jeśli wskaźnik sukcesu zbioru jest stale niski, nawet w przypadku nowych igieł, oznacza to...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj metody mają na celu umożliwienie pobierania mikrokolumn tkankowych w ilościach wystarczających do badań in vivo na dużych zwierzętach, przy użyciu narzędzi wykonanych z dostępnych na rynku materiałów laboratoryjnych. Przyrząd ten był wcześniej używany do pobierania tkanek z wyciętej skóry ludzkiej 4,9, jak również żywejskóry świń3. Opisane parametry szczególne to te, które uznano za najbardziej odpowiednie do stosowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są współtwórcami patentów związanych z technologią opisaną w tym artykule, z których otrzymali dochody z licencji i opłat licencyjnych za pośrednictwem swojej instytucji, Massachusetts General Hospital. J. Tam jest również konsultantem firmy Medline Industries, Inc., która posiada licencję komercyjną na tę technologię.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Armię, Marynarkę Wojenną, NIH, Siły Powietrzne, VA i Sprawy Zdrowia, aby wesprzeć wysiłki AFIRM II, pod numerem nagrody W81XWH-13-2-0054. U.S. Army Medical Research Acquisition Activity, 820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014 jest biurem przyznającym i zarządzającym akwizycją. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tarcza diamentowaDremel545
Igła podskórna (19G)Fisher Scientific14-840-98Można użyć innych rozmiarów igieł, w zależności od potrzeb eksperymentalnych
Kamienne kołoDremel540
(20 ml z blokadą typu luer)Fisher Scientific22-124-967
Adapter ssącyTulip MedicalPA20BDOpcjonalnie, do zbioru dużych ilości
Kanister ssącyFisher Scientific19-898-212Opcjonalnie, do zbioru dużych ilości. Sterylizuj przed użyciem.
Rurka ssącaMedlineDYND50216HOpcjonalnie, do zbioru dużych ilości
Strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
  2. Singh, M., et al. Challenging the Conventional Therapy: Emerging Skin Graft Techniques for Wound Healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4), 524-530 (2015).
  3. Tam, J., et al. Fractional Skin Harvesting: Autologous Skin Grafting without Donor-site Morbidity. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 1 (6), 47(2013).
  4. Tam, J., et al. Reconstitution of full-thickness skin by microcolumn grafting. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (10), 2796-2805 (2017).
  5. Huang, C., et al. Regeneration of hair and other skin appendages: A microenvironment-centric view. Wound Repair and Regeneration. 24 (5), 759-766 (2016).
  6. Fernandes, J. R., et al. Micro-mechanical fractional skin rejuvenation. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 216-223 (2013).
  7. Rettinger, C. L., Fletcher, J. L., Carlsson, A. H., Chan, R. K. Accelerated epithelialization and improved wound healing metrics in porcine full-thickness wounds transplanted with full-thickness skin micrografts. Wound Repair and Regeneration. 25 (5), 816-827 (2017).
  8. Franco, W., et al. Fractional skin harvesting: device operational principles and deployment evaluation. Journal of Medical Devices. 8 (4), 041005(2014).
  9. Rasmussen, C. A., et al. Chimeric autologous/allogeneic constructs for skin regeneration. Military Medicine. 179, 8 Suppl 71-78 (2014).
  10. Ter Horst, B., Chouhan, G., Moiemen, N. S., Grover, L. M. Advances in keratinocyte delivery in burn wound care. Advanced Drug Delivery Reviews. 123, 18-32 (2018).
  11. Wong, V. W., Levi, B., Rajadas, J., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Stem cell niches for skin regeneration. International Journal of Biomaterials. 2012, 926059(2012).
  12. Manstein, D., Herron, G. S., Sink, R. K., Tanner, H., Anderson, R. R. Fractional photothermolysis: a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury. Lasers in Surgery and Medicine. 34 (5), 426-438 (2004).
  13. Iriarte, C., Awosika, O., Rengifo-Pardo, M., Ehrlich, A. Review of applications of microneedling in dermatology. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 10, 289-298 (2017).
  14. Anderson, R. R., et al. Laser treatment of traumatic scars with an emphasis on ablative fractional laser resurfacing: consensus report. Journal of the American Medical Association Dermatology. 150 (2), 187-193 (2014).
  15. Hogan, S., Velez, M. W., Ibrahim, O. Microneedling: a new approach for treating textural abnormalities and scars. Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery. 36 (4), 155-163 (2017).
  16. Manuskiatti, W., Fitzpatrick, R. E., Goldman, M. P. Long-term effectiveness and side effects of carbon dioxide laser resurfacing for photoaged facial skin. Journal of the American Academy of Dermatology. 40 (3), 401-411 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pobieranie tkankowych mikrokolumnregeneracja tkanki sk rnejmodyfikacja ig y hipodermicznejsystem pobierania oparty na ssaniupobieranie sk ry pe nej grubo cigojenie ran w mikrokolumnachautologiczne przeszczepy tkanekzmiana kszta tu ko c wki ig yp ukanie steryln sol fizjologicznwytwarzanie aparatury laboratoryjnej

Powiązane artykuły