Artykuł metodologiczny

Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej

DOI:

10.3791/58293

⸱

17 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Jake Gittlen Laboratories for Cancer Research, Penn State College of Medicine, 2Division of Experimental Pathology, Department of Pathology, Penn State College of Medicine, 3Medical Scientist Training Program, Penn State College of Medicine, 4Center for In Vivo Microscopy, Duke University Medical Center, 5KTM Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy protokoły i zaprojektowaliśmy niestandardowe urządzenie, aby umożliwić osadzanie próbek w skali milimetrowej. Przedstawiamy procedury przygotowania próbek z naciskiem na zatapianie w rurkach z żywicy akrylowej i poliimidu w celu uzyskania sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania próbek w celu zbadania architektury tkanek i morfologii komórek za pomocą mikro-CT.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez ponad sto lat, badanie histologiczne tkanek było złotym standardem w diagnostyce medycznej, ponieważ histologia pozwala zidentyfikować i scharakteryzować wszystkie typy komórek w każdej tkance. Nasze laboratorium aktywnie pracuje nad postępem technologicznym w rentgenowskiej mikrotomografii komputerowej (mikro-CT), która wniesie diagnostyczną moc histologii do badania pełnych objętości tkanek w rozdzielczości komórkowej (tj. Metoda rentgenowskiej tomografii komputerowej). W tym celu wprowadziliśmy ukierunkowane ulepszenia w procesie przygotowywania próbek. Jedną z kluczowych optymalizacji, na której skupia się niniejsza praca, jest prosta metoda sztywnego osadzania utrwalonych i barwionych próbek w skali milimetrowej. Wiele z opublikowanych metod immobilizacji próbek i korelacyjnego obrazowania mikro-CT polega na umieszczeniu próbek w parafinie, wosku, agarozie lub płynach, takich jak alkohol. Nasze podejście rozszerza tę pracę o niestandardowe procedury i projekt trójwymiarowego urządzenia do drukowania do osadzania próbek w żywicy akrylowej bezpośrednio w rurkach poliimidowych, które są stosunkowo przezroczyste dla promieni rentgenowskich. W niniejszym dokumencie opisano procedury przygotowania próbek dla próbek o średnicy od 0,5 do 10 mm, które byłyby odpowiednie dla całych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego lub innych próbek zwierząt i tkanek o podobnych wymiarach. Jako dowód słuszności koncepcji umieściliśmy okazy z Danio, Drosophila, Daphnia i embrionu myszy; Pokazano reprezentatywne obrazy z trójwymiarowych skanów dla trzech z tych próbek. Co ważne, nasza metodologia prowadzi do wielu korzyści, w tym sztywnego unieruchomienia, długoterminowego zachowania pracochłonnie wytworzonych zasobów oraz możliwości ponownego badania próbek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotypy to obserwowalne cechy organizmu, które reprezentują konsekwencje unikalnych interakcji między jego genetycznym tłem a środowiskiem. Cechy te mogą obejmować właściwości behawioralne, biochemiczne, morfologiczne, rozwojowe i/lub fizjologiczne. Co ważne, różnice w cechach między organizmami typu dzikiego a mutantami genetycznymi mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów i funkcji genów dotkniętych chorobą. Jeśli chodzi o morfologię, histopatologia jest złotym standardem w ocenie fenotypów na poziomie komórkowym, ale cierpi z powodu artefaktów mechanicznych i nie pozwala na dokładną ilościową analizę objętościową1. Nasze laboratorium jest zmotywowane do pokonywania barier w zastosowaniu mocy diagnostycznej histologii do pełnych objętości tkanek w rozdzielczości submikronowej.

Przegląd dostępnych technologii sugeruje, że obrazowanie za pomocą rentgenowskiej mikrotomografii komputerowej (micro-CT) może zapewnić idealne możliwości potrzebne do trójwymiarowej (3D) histologii całego zwierzęcia w skali milimetrowej. Micro-CT umożliwia nieniszczącą, izotropową wizualizację 3D oraz możliwość przeprowadzania ilościowej analizy architektury tkanek 1,2. W ostatnich latach obrazowanie 3D niebarwionego i barwionego metalem danio pręgowanego za pomocą mikro-CT zyskało coraz większą popularność i jest wykorzystywane do analizy wolumetrycznej kilku tkanek, w tym mięśni, zębów, kości i tkanki tłuszczowej3,4,5,6,7,8,9,10. Inne organizmy modelowe i próbki tkanek są również podatne na obrazowanie mikro-CT. Na przykład, wprowadzono potok do ilościowego określania gęstej mezoskalowej neuroanatomii mózgów myszy zobrazowanych za pomocą synchrotronowego mikro-CT11. Podobnie, wykazano, że protokół barwienia oparty na eozynie jest odpowiedni do obrazowania mikrotomografii komputerowej tkanek miękkich całych narządów myszy12. Analiza morfometryczna niebarwionych ludzkich kręgów L3 oraz wizualizacja srebrzystych płuc ludzkich za pomocą mikrotomografii komputerowej wykazały użyteczność tej technologii w przypadku próbek ludzkich13,14.

Aby urzeczywistnić wielką obietnicę mikro-CT do kompletnego morfologicznego fenotypowania nienaruszonych małych zwierząt i próbek tkanek, należy pokonać szereg przeszkód związanych z przepustowością, rozdzielczością, polem widzenia, kompleksowym barwieniem komórek i długoterminową ochroną. Chociaż każdy z tych aspektów jest niezwykle ważny, niniejszy manuskrypt skupia się na optymalizacji procedur osadzania, z dodatkowymi uwagami na temat utrwalania i barwienia próbki. Barwienie metalami ciężkimi jest przydatne, ponieważ nieodłączny kontrast między różnymi tkankami miękkimi w obrazach mikro-CT jest niski. Zbadano wpływ różnych barwników metalicznych, takich jak tetratlenek osmu, jod, kwas fosfowolframowy (PTA) i chrom gallocyjaninowy, w celu zwiększenia kontrastu w obrazowaniu mikro-CT15,16,17. Octan uranylu był również stosowany jako środek kontrastowy do obrazowania mikro-tomografii komputerowej kości i chrząstek18,19. PTA stosowany w naszym protokole prowadzi do konsekwentnego barwienia prawie wszystkich tkanek i komórek w całych próbkach danio pręgowanego, uzyskując obrazy, które są potencjalnie zgodne z badaniami histologicznymi na pełnych objętościach tkanki.

Podczas akwizycji obrazu mikro-CT, wykonywana jest projekcja dwuwymiarowa (2D), podczas której próbka jest obracana o ułamek stopnia i powtarzana, aż próbka zakończy obrót o 180° lub 360°, generując serię tysięcy projekcji 2D używanych do rekonstrukcji objętości 3D20. W tym procesie każde zaburzenie próbki spowoduje, że odpowiednie projekcje 2D nie będą wyrównane, co spowoduje słabą rekonstrukcję objętości 3D. Unieruchomienie próbki jest sposobem na rozwiązanie tego problemu, a niektóre obecne strategie obejmują zanurzenie próbki w alkoholu lub zatopienie w agarozie w rurkach polipropylenowych lub końcówkach do mikropipet3,5,15,16,21,22. Metody zanurzania w cieczach nie są idealne, ponieważ ruch próbki podczas akwizycji obrazu może wystąpić między zestawami obrazowania, co skutkuje przesuniętymi rekonstrukcjami objętości 3D23. Ponadto dobrze wiadomo, że stabilność fizyczna próbek tkanek przechowywanych w płynie jest niska w skalach czasowych od miesięcy do lat, w wyniku niestabilności chemicznej i ścierania powierzchni związanego z przemieszczaniem się punktów styku między próbką a ścianką pojemnika (osobiste obserwacje z nieruchomymi próbkami tkanek zwierzęcych i ludzkich).

Aby zmniejszyć możliwość przemieszczania się próbki podczas obrazowania, próbki mogą być osadzone w agarozie24,25,26, ale ta praktyka wiąże się z ryzykiem dyfuzji plamy do agarozy, zmniejszając tym samym kontrast obrazu26. Ponadto preparaty płynne lub agarozowe są podatne na uszkodzenia fizyczne i z czasem ulegają degradacji, co sprawia, że nie nadają się do długotrwałego przechowywania próbek. Doszliśmy do wniosku, że potencjalnie skuteczna i prosta metoda immobilizacji próbki może zostać zaadaptowana do tej stosowanej w próbkach mikroskopii elektronowej. Żywice polimeryzowane, takie jak EPON 812 (wycofana i zastąpiona przez EMbed 812) są powszechnie stosowane w celu zapewnienia twardości wymaganej do generowania ultracienkich przekrojów do mikroskopii elektronowej27,28. Rzeczywiście, kilka badań porównawczych między obrazowaniem rentgenowskim a mikroskopią elektronową wykazało, że próbki osadzone w żywicy można obrazować za pomocą mikroskopii rentgenowskiej29,30. Jednak niektóre ze standardowych praktyk mikroskopii elektronowej nie przekładają się bezpośrednio na obrazowanie mikro-CT. Na przykład obrazowanie mikro-tomografią komputerową próbek z kwadratowymi krawędziami żywicy typowych bloków żywicy i próbek wyciętych z tych bloków wiąże się z artefaktami dyfrakcji krawędzi, które mogą zakłócać obrazowanie. Wygładzanie krawędzi żywicy, choć możliwe, jest pracochłonne i czasochłonne.

Podczas gdy w mikroskopii elektronowej stosowane są różne rodzaje żywic do osadzania tworzyw sztucznych, wysokie tło związane z twardszymi żywicami, takimi jak Embed 812, skłoniło nas do przetestowania innych. Wybraliśmy LR White ze względu na jego niską lepkość, niski skurcz, niską skłonność do tworzenia się pęcherzyków podczas polimeryzacji oraz niższe tło. Aby stworzyć próbki bez krawędzi i zminimalizować ilość żywicy otaczającej próbkę, opracowaliśmy protokoły pobierania próbek w ciekłej żywicy do rurek poliimidowych przed polimeryzacją. Poliimid został wybrany ze względu na jego wysoką stabilność termiczną i wysoką przepuszczalność promieniowania rentgenowskiego, dzięki czemu wyjmowanie rurki nie jest konieczne do obrazowania. Na koniec zaprojektowaliśmy niestandardowy adapter do mikropipet do naszej techniki zatapiania próbek, aby niezawodnie utrzymać rurkę i zapobiec zanieczyszczeniu mikropipet. Adapter można wydrukować w 3D z pliku obrazu CAD. Podsumowując, celem przedstawionych tutaj metod przygotowania próbek jest uproszczenie osadzania małych próbek, uzyskanie zwiększonego kontrastu barwienia, sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania nienaruszonych próbek w skali milimetrowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na żywych zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Pensylwanii.

1. Dzień 1: Fiksacja

  1. Aby poprawić utrwalenie i zmniejszyć objętość treści jelitowej, młode ryby należy głodzić przez co najmniej 24 godziny w przypadku okazu 10 mm lub dłużej w przypadku większych okazów (np. 72 godziny w przypadku okazu 14 mm).
  2. Wstępnie schłodzić 10% neutralną buforowaną formalinę (NBF) i 2x Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) na lodzie do 4 °C.
  3. Podwój objętość wody dla ryb dzięki schłodzonemu 2x MS-222 do szybkiej i humanitarnej eutanazji.
  4. Odczekaj 30 s (larwy) do 60 s (młode osobniki), po tym jak ryby przestaną się poruszać.
  5. Zanurz rybę w schłodzonym 10% NBF na 10 minut.
  6. Umieść rybę w schłodzonym 10% roztworze NBF przez noc w płaskodennych pojemnikach w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wymagane są pojemniki z płaskim dnem, aby zminimalizować zginanie próbki. Objętość utrwalacza i roztworów we wszystkich kolejnych etapach powinna być co najmniej 20-krotnie większa od objętości próbki, chyba że określono inaczej. W przypadku 1-5 larw danio pręgowanego zalecana objętość roztworu wynosi co najmniej 1 ml. Niewystarczające utrwalenie skutkuje słabym utrwaleniem, a nadmiar objętości odczynnika nie wpływa negatywnie na wynik opisanej procedury. Aby całkowicie utrwalić większe ryby, rozetnij brzuch, zaczynając nieco przed porem odbytu. Używaj minimalnej penetracji nożyczek lub noża i stosuj delikatną siłę z dala od ryby podczas cięcia, aby zminimalizować uszkodzenia narządów wewnętrznych. Protokoły fiksacji zostały opisane przez innych31,32,33.

2. Dzień 2: Odwodnienie i barwienie

  1. Przepłukać utrwalone próbki 3 razy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4 przez 10 minut.
  2. Zanurz próbki w 35% alkoholu etylowym (EtOH) na 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.
    UWAGA: Do wszystkich delikatnych etapów mieszania należy użyć wytrząsarki stołowej i ustawić ją tak, aby uzyskać efekt mieszania, ostrożnie unikając uderzania i ocierania próbki o powierzchnie pojemnika.
  3. Zanurz próbki w 50% EtOH na 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  4. Rozpuść kwas fosfowolframowy (PTA) w proszku w wodzie, aby przygotować 1% m/v roztwór podstawowy.
  5. Rozcieńczyć 1% roztwór podstawowy PTA w stosunku 3:7 w 100% EtOH, aby uzyskać 0,3% roztwór barwiący PTA.
  6. Próbki należy barwić przez noc w 0,3% roztworze PTA w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

3. Dzień 3: Infiltracja

  1. Przygotować mieszaninę 100% EtOH i żywicy akrylowej LR White w proporcji 1:1 i odstawić na bok.
  2. Płukać 3 razy w 70% EtOH przez 10 min.
  3. Zanurz próbki w 90% EtOH na 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  4. Zanurz próbki w 95% EtOH na 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  5. Zanurz próbki dwukrotnie w 100% EtOH na 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  6. Zanurz próbki w mieszaninie żywicy akrylowej 1:1 EtOH i LR White na noc w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

4. Dzień 4: Osadzanie

  1. Zanurz próbki w 100% białej żywicy LR na 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  2. Zastąp żywicę w kroku 4.1 świeżą żywicą 100% LR White i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  3. Zmontuj urządzenie do osadzania (Rysunek 1).
  4. Wytnij rurki poliamidowe o odpowiedniej średnicy i długości.
    UWAGA: Zalecane są rurki o średnicy wewnętrznej co najmniej 0.1 mm większej niż średnica próbki. W przypadku typowych próbek do każdej próbki stosuje się standardową długość rurki wynoszącą 30 mm. W razie potrzeby wydłużone próbki można pomieścić za pomocą dłuższych rurek.
    1. Przymocuj mikropipetę P1000 do szerokiego końca adaptera do osadzania i włóż rurkę poliimidową do wąskiego końca (Rysunek 1C). Jeśli adapter osadzania nie jest dostępny, przejdź do kroku 4.3.3. W przeciwnym razie przejdź do kroku 4.4.
    2. Odetnij koniec końcówki mikropipety prosto w poprzek, tak aby rurka poliimidowa dobrze przylegała. Naciąć na 44 mm od szerokiego końca żółtej końcówki mikropipety o pojemności 200 μl w przypadku rurki 0,0403" i w odległości 59 mm od spodu niebieskiej końcówki o pojemności 1 ml w przypadku rurki 0,105". Przytnij w razie potrzeby.
    3. Przymocuj odciętą końcówkę mikropipety do mikropipety.
  5. Przenieś próbki do małej łodzi wagowej lub miski na roztwór w kształcie litery V i całkowicie zanurz próbki w 100% żywicy LR White.
  6. Za pomocą aparatu do zatapiania opisanego w kroku 4.3 skierować rurkę na szeroki koniec nieruchomej próbki (lub w kierunku głowy w przypadku próbek zwierzęcych) i powoli pipetować próbkę do rurki. Umieść próbkę na środku rurki i upewnij się, że rurka powyżej i poniżej próbki jest wypełniona żywicą.
    1. Odpipetować próbkę do rurki w taki sposób, aby próbka poruszała się w naturalnym kierunku do przodu.
      UWAGA: Powolne pipetowanie pozwala uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza i uszkodzeń próbek spowodowanych ścieraniem krawędzi rurki. Ruch do tyłu do rurki może łatwo uszkodzić kończyny (kończyny, skrzydła, płetwy itp.). Zaleca się, aby w aparacie do zatapiania nie doszło do przelania się żywicy, aby później powietrze nie dostało się do rurki podczas wyjmowania.
  7. Natychmiast uszczelnij otwarty koniec miękką glinką modelarską na bazie oleju.
    1. Spłaszcz glinę w arkusz o grubości 1 mm.
    2. Ustabilizuj rurkę między palcem wskazującym i środkowym.
    3. Powoli dociśnij glinę do końca rurki kciukiem.
    4. Usuń nadmiar gliny.
  8. Wyjąć urządzenie do osadzania z mikropipety.
  9. Wyciągnij rurkę, delikatnie obracając i uszczelnij drugi koniec gliną.
    1. Przyłóż palec do uszczelnionego końca, aby zapobiec wyrzuceniu gliny.
    2. Powoli wepchnij nieuszczelniony koniec rurki w glinę.
  10. Umieścić rurkę poziomo i polimeryzować żywicę przez 24 godziny w temperaturze 65 °C.
    UWAGA: Umieszczenie poziome pozwala uniknąć ruchu próbki podczas polimeryzacji. Jeśli niewielka ilość powietrza została uwięziona w kroku 4.8, koniec z pęcherzykiem powietrza może być lekko podniesiony, aby zapobiec przemieszczaniu się pęcherzyków powietrza w kierunku próbki. Co ważne, zbyt duże uniesienie podczas polimeryzacji może spowodować, że próbka opadnie w kierunku dolnego końca z powodu grawitacji. Prawidłowo osadzona próbka jest porównywana z próbką z pęcherzykiem powietrza, czego należy unikać, ponieważ załamanie światła od granicy faz powietrze/żywica może pogorszyć jakość obrazu (Rysunek 2).

5. Dzień 5: Kolekcja

  1. Pobrać próbki do pobrania obrazu pod koniec dnia 5.
    UWAGA: Usunięcie rurki poliimidowej jest możliwe, ale nie jest konieczne do obrazowania. Obrazowanie mikrotomografią komputerową w oparciu o synchrotron dla próbki danio pręgowanego wykonano na linii badawczej 2-BM w Advanced Photon Source (APS) w Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA). Dla danio pręgowanego barwionego PTA określono optymalny zakres energii promieniowania rentgenowskiego wynoszący 5-30 keV, a do obrazowania wykorzystano energię promieniowania rentgenowskiego wynoszącą 13,8 keV. Uzyskano 1501 projekcji przy natężeniu 13,8 keV w zakresie 180 stopni (1 projekcja co 0,12 stopnia) za pomocą kamery o wymiarach 2048 na 2048 pikseli. Dodatkowo uzyskano również dwa obrazy płaskiego pola (jeden na początku i jeden na końcu akwizycji) oraz jeden obraz ciemnego pola. Korekcje płaskiego i ciemnego pola, redukcja artefaktów pierścieniowych i rekonstrukcja obrazu zostały wykonane przy użyciu zestawu narzędzi TomoPy o otwartym kodzie źródłowym34. Próbki Daphnia i Drosophila barwione PTA zostały zobrazowane pod mikroskopem rentgenowskim12,35. Konkretne ustawienia mikro-CT są zależne od przedmiotu i jakości plamy. Na przykład próbka Drosophila została zeskanowana przy 40 kVp, 74 mA i 15 s z rozdzielczością wokseli 3,10 × 3,10 × 3,10μm3.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany powyżej szczegółowo opisuje procedurę przygotowania próbek dla całych larw danio pręgowanego i młodych osobników do obrazowania mikro-CT. Warto zauważyć, że metoda ta jest łatwo dostosowywana do innych typów próbek (np. Drosophila, Daphnia, Arabidopsis, narządy myszy). Czasy inkubacji na różnych etapach są odpowiednie dla larw danio pręgowanego i próbek o podobnej wielkości; Większe próbki mogą wymagać dłuższej inkubacji. Aby pomóc w etapach zatapiania próbki, zaprojektowaliśmy adapter, który podłącza się do mikropipety o pojemności 1 ml i można go dostosować do różnych rozmiarów rurek poliimidowych (Rysunek 1). Ten niestandardowy adapter został wydrukowany w 3D z pliku CAD, który jest powiązany z tym rękopisem i dostępny do pobrania z http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. Ponieważ nie wszyscy czytelnicy mogą mieć dostęp do drukarki 3D, montaż domowego urządzenia do zatapiania za pomocą końcówek do mikropipet jest opisany w protokole (Krok 4.3). Pomyślnie osadzona larwa danio pręgowanego jest pokazana w porównaniu z okazem z pęcherzykiem powietrza (Rysunek 2), co prawdopodobnie pogorszy jakość obrazu. Aby zademonstrować wszechstronność procedury osadzania, pokazujemy próbki z różnych organizmów modelowych (tj. Danio, Drosophila, Daphnia, zarodek myszy), które przeszły przez proces przygotowania próbki (Rysunek 3). Pokazano zrekonstruowane objętości 3D całych okazów Danio, Daphnia i Drosophila zobrazowanych za pomocą mikrotomografii komputerowej (Rysunek 4). Co ważne, jak wykazano na próbce Danio, próbki te mogą być przechowywane przez dłuższy czas i ponownie wykorzystywane do wielu sesji obrazowania (Ryc. 5).

figure-results-1
Rysunek 1. Aparatura do zatapiania. (A) Adapter został zaprojektowany w celu ułatwienia osadzania przy użyciu powszechnie stosowanych narzędzi laboratoryjnych. (B) Ilustracja przekroju poprzecznego adaptera. (C) Aparatura do zatapiania po włożeniu rurki poliimidowej w punkcie adaptera (a) i zamocowaniu mikropipety w punkcie adaptera (c). Segment adaptera (b) to komora przelewowa zaprojektowana tak, aby pomieścić nadmiar żywicy i chronić mikropipetę przed zanieczyszczeniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Pomyślnie osadzone próbki są pozbawione pęcherzyków powietrza. (A) Osadzona 3-dniowa larwa danio pręgowanego (dpf) bez pęcherzyków powietrza. (B) Osadzony danio pręgowany o natężeniu 3 dpf z pęcherzykiem powietrza. Powietrze uwięzione podczas procesu zatapiania może przemieszczać się w kierunku próbki, jeśli próbka nie zostanie umieszczona poziomo podczas polimeryzacji. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Za pomocą naszego protokołu można osadzić szeroką gamę próbek. (A) 7 dpf larwy danio pręgowanego. b) Dorosły osobnik Drosophila. (C) Dorosłe rozwielitki. (D) Zarodek myszy. Większe próbki, takie jak zarodek myszy, są uwzględniane przez kilka modyfikacji protokołu. Krótko mówiąc, rurka poliimidowa została wypełniona żywicą do 1/3 swojej długości i spolimeryzowana przed zasadzeniem. Utrwaloną i wybarwioną próbkę umieszczono na wierzchu wstępnie spolimeryzowanej żywicy. Rurka została następnie wypełniona niespolimeryzowaną żywicą, a następnie drugą polimeryzacją. Rurka poliimidowa została usunięta przed wykonaniem zdjęć, aby umożliwić lepszą wizualizację próbki na tym rysunku. Usunięcie rurki nie jest konieczne do pomyślnego uzyskania obrazu za pomocą mikrotomografii komputerowej. Podziałka liniowa: obrazy próbek, 5 mm; powiększone wypustka, 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Trójwymiarowe renderingi osadzonych próbek. (A) Zrekonstruowane larwy danio pręgowanego o 3 dpf w rozdzielczości 0,743 × 0,743 × 0,743 μm3 wokselach. (B) Zrekonstruowana rozwielitka (rozdzielczość 3 × 3 × 3 μm3 wokselach). (C) Zrekonstruowana dorosła Drosophila (rozdzielczość 3,1 × 3,1 × 3,1 μm3 wokselach). Przekroje cyfrowe mogą być generowane pod dowolnym kątem, jak pokazano w lewej kolumnie. Renderingi powierzchni są pokazane po prawej stronie, renderowane przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Zatapianie żywicy można zobaczyć na wszystkich skanach poza próbką (oznaczone symbolem *), ale nie zakłóca to samej próbki. Larwa danio pręgowanego została sfotografowana w Argonne National Laboratory w Zaawansowanym Źródle Fotonów, które jest oparte na synchrotronie. Okazy Daphnia lub Drosophila zostały zobrazowane za pomocą komercyjnego mikroskopu rentgenowskiego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Próbki osadzone w naszym protokole mogą być ponownie obrazowane za pomocą mikrotomografii komputerowej. Te same larwy danio pręgowanego o wartości 5 dpf zostały sfotografowane w (A) 2011 i (B) 2013, przedstawione jako projekcje średniej intensywności w widoku strzałkowym. Porównanie obrazów między skanami po przechowywaniu pokazuje zachowanie cech anatomicznych. (C) Przedstawiono zbliżenie mięśni z obu skanów, z segmentowanymi liniami wskazującymi odpowiednie regiony używane do generowania profilu intensywności (D). Profile intensywności znormalizowane do odpowiadających im średnich wzdłuż obu linii pokazują przestrzennie pasujące lokalne szczyty w obu skanach. (E) Średnie wartości intensywności dla wybranych regionów w A i B należących do tła (Bg, fioletowy), jąder neuronalnych (N, zielony), istoty białej (W, niebieski) i mięśni (M, pomarańczowy) podzielono przez średnią dla tła (biały) i wykorzystano do wygenerowania stosunku sygnału do szumu (SNR), który dobrze odpowiada między skanami. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół sztywnego unieruchomienia utrwalonych i barwionych próbek w skali milimetrowej (o średnicy od 0,5 do 2,5 mm) do obrazowania mikro-CT. Biorąc pod uwagę szybki postęp technologii mikro-CT w odniesieniu do rozdzielczości i szybkości, metoda trwałego przechowywania próbki z możliwością ponownego obrazowania jest wysoce pożądana. Tradycyjnie, gęsta żywica do zatapiania jest powszechnie stosowana w mikroskopii elektronowej w celu zapewnienia wsparcia strukturalnego do cięcia ultracienkich odcinków i zminimalizowania uszkodzeń próbki. Nasza metoda dostosowała jego zastosowanie do sztywnego unieruchomienia podczas obrazowania nieniszczącego. Aby zminimalizować artefakty obrazowania wynikające z obecności nadmiaru żywicy, zastosowaliśmy przezroczyste rurki poliimidowe rentgenowskie do tworzenia okrągłych próbek bez krawędzi i ograniczania objętości żywicy wokół próbki.

Optymalny wynik procedury zatapiania zależy od starannego wykonania kilku krytycznych kroków i zwrócenia uwagi na integralność próbki podczas całej procedury. Rzeczywiście, uszkodzenie próbki spowoduje pogorszenie końcowego obrazu, niezależnie od powodzenia wykonania obrazowania. Ponieważ schładzanie przyczynia się do zmniejszenia reakcji bólowych, a nieutrwalona tkanka ulega szybszej degradacji w wyższych temperaturach, używamy wstępnie schłodzonych odczynników. Duże próbki mogą wymagać cięcia, aby umożliwić wejście utrwalacza do wnętrza próbki, tak aby narządy wewnętrzne, takie jak wątroba, trzustka i jelita, były całkowicie unieruchomione. Nieutrwalone tkanki pogarszają się i tracą integralność strukturalną, niszcząc strukturę biologiczną. Kolejnym kluczowym krokiem jest utrzymanie próbki w jej naturalnym ustawieniu. Dlatego opowiadamy się za stosowaniem pojemników z płaskim dnem, których używamy podczas całego zabiegu i są szczególnie ważne podczas utrwalania. Należy unikać mocowania w rurkach polipropylenowych lub rurkach stożkowych, które zwykle mają dno w kształcie litery V, ponieważ mogą one powodować zginanie wydłużonych próbek, co zniekształca naturalną morfologię próbki. Ponadto, aby zminimalizować użycie żywicy, wewnętrzna średnica rurki poliimidowej jest tylko nieznacznie większa niż szerokość próbki. Gięcie próbki może również spowodować jej uszkodzenie w momencie jej wejścia do rurki. Zaleca się również przenoszenie próbki do rurki w naturalny sposób do przodu, aby uniknąć uszkodzenia kończyn. Prawidłowe odwodnienie to kolejny krytyczny krok. Osiąga się to poprzez małe przyrosty rosnących stężeń EtOH, aby powoli zastępować wodę EtOH, który jest bardziej mieszalny z żywicą. Duże wzrosty stężenia EtOH są związane z kurczeniem się tkanek i można je złagodzić poprzez dodatkowe przyrosty inkubacji EtOH, aby przejście było bardziej stopniowe. Na koniec, aby zminimalizować ruch próbki lub kieszeni powietrznych, jeśli takie występują, próbki umieszcza się poziomo podczas polimeryzacji żywicy (koniec dnia 4). Kieszenie powietrzne lub uszczelniacz obok próbki powodują artefakty optyczne przy obrazowaniu rentgenowskim związanym z dyfrakcją krawędzi, obniżając jakość obrazu.

Jeśli chodzi o możliwe modyfikacje protokołu, zamiast LR White acrylic i PTA można zastosować inne żywice osadzające i bejce metalowe. Embed812, żywica epoksydowa powszechnie stosowana w mikroskopii elektronowej, jest bardzo lepka, trudniejsza do przenoszenia, może powodować zniekształcenia próbek i wiąże się z wyższym tłem niż żywice metakrylanu akrylowego lub glikolowego. Podczas gdy JB4 Plus, metakrylan glikolu, jest mniej lepki niż EMbed812 i ma niższe tło, w pobliżu próbki często pojawiają się losowe tworzenie się kieszeni powietrznych. Jak wspomniano, kieszenie powietrzne pogarszają jakość obrazu i są szczególnie problematyczne w przypadku cennych próbek. Warto zauważyć, że Technovit 7100, kolejny metakrylan glikolu, zakłóca barwienie PTA, co skutkuje słabym kontrastem na końcowym obrazie. Dla porównania, akryl LR White ma lepkość podobną do wody, niskie tło i nie przeszkadza w barwieniu PTA. W naszych rękach skuteczność zatopienia w LR White bez uszkodzenia próbki i pęcherzyków powietrza wynosi ponad 95%. Z tych powodów zalecamy jego stosowanie jako żywicy do zatapiania w mikrotomografii komputerowej tkanek. Jeśli chodzi o barwienie, wyniki różnych barwień metali, takich jak tetratlenek osmu, jod i PTA w obrazowaniu mikro-CT, zostały porównane i omówione w innym miejscu 15,16,17 i wykraczają poza zakres tego manuskryptu.

Wielkość próby jest głównym ograniczeniem dla naszego obecnego protokołu. Ponieważ do przenoszenia próbek do rurki stosujemy ssanie, możliwość zobaczenia próbki ma kluczowe znaczenie dla orientacji i upewnienia się, że rzeczywiście znajduje się ona w rurce. W rezultacie, próbki submilimetrowe, takie jak niesporczaki (tj. niedźwiedzie wodne) są niezwykle trudne do osadzenia, ponieważ wymagają użycia mikroskopu do wizualizacji. Po zastosowaniu ssania mikroskopijne próbki łatwo gubią się z płaszczyzny ogniskowej i stają się trudne do ponownego odkrycia, co utrudnia określenie, czy przeszły zbyt daleko przez dołączony koniec rurki. Większe próbki, takie jak zarodki myszy (3 - 10 mm) mogą być osadzane z niewielkimi modyfikacjami protokołu osadzania (ryc. 4D). W szczególności rurki poliimidowe zostały wypełnione w 1/3 płynną żywicą, która została spolimeryzowana przed zatopieniem. Utrwaloną i barwioną próbkę umieszczono na wierzchu wstępnie spolimeryzowanej żywicy. Rurka została następnie całkowicie wypełniona niespolimeryzowaną żywicą, a następnie nastąpiła druga polimeryzacja.

Znaczenie naszego protokołu osadzania jest wielorakie. Sztywno unieruchomione próbki całych zwierząt lub tkanek są pożądane z następujących powodów: (1) tworzenie długoterminowych repozytoriów próbek, które są trudne do wygenerowania lub przygotowania; 2) ponowne pozyskanie danych; (3) umożliwienie obrazowania seryjnego przy użyciu wielu metod obrazowania; oraz (4) zapewnienie standardów kalibracji i rozwoju technologii. Próbki przygotowane za pomocą naszej procedury zatapiania są zamknięte w stałej żywicy, która jest odporna na uszkodzenia i dlatego może być łatwo przechowywana, być może w nieskończoność. Długotrwałe przechowywanie jest szczególnie przydatne w przypadku rzadkich lub pracochłonnie generowanych okazów, takich jak te związane z projektami fenomowymi. Ponadto, w przypadku utraty danych cyfrowych, dane mogą zostać wygenerowane z oryginalnej próbki. Możliwość ponownego obrazowania przez długi okres czasu potencjalnie pozwala na badanie tej samej próbki za pomocą bardziej zaawansowanych metod obrazowania w przyszłości. Ponieważ próbki są fizycznie stabilne między instancjami obrazowania, obrazy są pozyskiwane z tej samej próbki w tej samej orientacji, co ułatwia rejestrację między wcześniejszymi i późniejszymi zestawami danych. Na przykład obraz o niskiej rozdzielczości może umożliwiać segmentację tkanek tylko u larwy danio pręgowanego. Ta sama larwa może być później ponownie zobrazowana w wyższej rozdzielczości, co pozwoli na bardziej szczegółowe analizy obliczeniowe w rozdzielczości komórkowej. Ta zdolność do bezpośredniego porównywania zarejestrowanych skanów sugeruje, że próbki osadzone w żywicy mogą być potencjalnym standardem dla rozwoju technologii mikro-CT. Skutki wszelkich zmian w metodzie obrazowania można ocenić poprzez obrazowanie tej samej próbki, tak aby wszystkie zmienne na etapie przygotowania próbki były kontrolowane. Na koniec do kalibracji przyrządu można użyć próbki wzorcowej zatopionej w żywicy w celu sprawdzenia spójności obrazowania.

Nasza poprzednia praca badająca histologię zmutowanych i chorych ryb wykazała, że rozdzielczość komórkowa pozwala na wykrycie subtelnych nieprawidłowości w strukturze tkanki, które są pomijane w ogólnym badaniu przy użyciu mikroskopu preparacyjnego36 lub mikroskopu stereoskopowego o małej mocy. Chcemy rozszerzyć nasze analizy wysokorozdzielcze na próbki ludzkie. Larwy danio pręgowanego, które stanowią główny przedmiot naszych prac rozwojowych, są podobne do ludzkich biopsji igłowych pod względem kruchości, niejednorodności tkanek komórkowych i międzykomórkowych, wielkości (średnica 1-3 mm) i wydłużonego kształtu. Opierając się na naszym rozległym doświadczeniu z danio pręgowanym i innych pracach pokazujących, że mikrotomografia komputerowa z powodzeniem barwi i skanuje ludzkie tkanki, choć w niższej rozdzielczości37, oczekujemy, że nasze podejścia wniosą wartość dodaną do obrazowania i analizy biopsji igłowych. Oszacowaliśmy, że skompletowanie zestawu wystarczającego na jedno przygotowanie do 20 próbek tego samego schorzenia może być potencjalnie mniejsze niż 30 USD. Próbki przygotowane naszą metodą zatapiania są odporne na uszkodzenia fizyczne, a przez to łatwe w transporcie. Niski koszt i łatwość transportu sugerują możliwość pobierania próbek z całego świata, szczególnie z obszarów, w których obrazowanie w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikrotomografii komputerowej nie jest łatwo dostępne. Naszą wizją jest, aby pliki cyfrowe o wysokiej rozdzielczości z biopsji igłowych (od 0,1 do kilku terabajtów) umożliwiły stworzenie cyfrowego atlasu tkanek ludzkich, a jednocześnie pozwoliły naukowcom udoskonalić i ulepszyć obecne potoki analityczne w celu lokalizacji i ilościowej charakterystyki architektury komórkowej i tkankowej w pełnym kontekście 3D skanowanych tkanek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Rolandowi Myersowi za uprzejme dostarczenie oryginalnych protokołów TEM. Ponadto chcielibyśmy podziękować dr Johnowi Colbourne'owi za dostarczenie próbki Daphnia, dr Santhosh Girirajan za dostarczenie próbki Drosophila oraz dr Fadii Kamal za dostarczenie zarodka myszy. Badacze potwierdzają wsparcie finansowe ze strony NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), Jake Gittlen Laboratories for Cancer Research oraz z funduszy pilotażowych z PSU Huck Institutes of the Life Sciences i Institute for CyberScience.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X Neutralna buforowana formalinaFisher ScientificSF100-4
Kwas fosfotunstycznyVWRMK282402
Tricaine-S (MS-222)Western ChemicalMS-222
LR Mikroskopia elektronowa białaSciences14380
Rurki poliimidowe (ID 0,04")Nordson Medical141-0065Dokładne rurki poliimidowe opisane w manuskrypcie nie są już dostępne. Bliski mecz jest podany tutaj. Rurki o niestandardowej średnicy mogą być produkowane na życzenie.
Alkohol etylowy 200 ProofPharmco-Aaper111000200
Miękka plastelina modelarska na bazie olejuSculpeyS302 001
Mikropipeta P200GilsonF123601
Mikropipeta P1000Fiolki szklane GilsonF123502
VWR66015-042
Umywalka w kształcie litery VVWR89094-676
Łodzie wagoweVWR10803-148
200 μ L żółta końcówka do mikropipetFisher Scientific02-707-500
1 ml niebieska końcówka do mikropipetFisher Scientific02-681-163
Wytrząsarka stołowaThermolyneM71735
KameraFotometriaCoolSNAP HQ2 CCD
ZeissXradia 520 Versa
Mikroskop rentgenowski

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
  2. Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
  3. Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625(2015).
  4. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  5. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  6. Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731(2017).
  7. Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014(2017).
  8. J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
  9. Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73(2012).
  10. Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142(2015).
  11. Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  12. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  13. Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
  14. Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
  15. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11(2009).
  17. Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
  18. Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
  19. Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
  20. Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
  21. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61(2006).
  22. Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074(2016).
  23. Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011(2017).
  24. Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321(2013).
  25. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  26. Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
  27. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
  28. Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
  29. Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44(2013).
  30. Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
  31. Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
  32. Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
  33. Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
  34. Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
  35. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
  36. Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
  37. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074(2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ywica akrylowarurki polimidoweprzygotowanie pr bekhistologia 3Dobrazowanie ca ego organizmud ugoterminowa konserwacjatomografia histologiczna rentgenowska

Powiązane artykuły