Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Podsumowanie

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są powszechnymi prekursorami zarówno plemników, jak i jaj. Ludzkie embrionalne PGC są określane z pluripotencjalnych komórek epiblastów poprzez interakcje cytokin. Tutaj opisujemy 13-dniowy protokół indukcji komórek ludzkich transkryptomalnie przypominających PGC na powierzchni ciał zarodkowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją.

Streszczenie

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są wspólnymi prekursorami wszystkich komórek linii rozrodczej. W embrionach myszy populacja założycielska ~ 40 PGC jest indukowana z pluripotencjalnych komórek epiblastów przez zaaranżowaną ekspozycję na cytokiny, w tym białko morfogenetyczne kości 4 (Bmp4). W embrionach ludzkich najwcześniejsze PGC zostały zidentyfikowane na ścianie śródskórnej woreczka żółtkowego pod koniec 3^{. tygodnia ciąży}, ale niewiele wiadomo na temat procesu specyfikacji PGC u ludzi i ich wczesnego rozwoju. Aby obejść techniczne i etyczne bariery związane z badaniem ludzkich embrionalnych PGC, niedawno stworzono modele hodowli komórek zastępczych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. W tym miejscu opisujemy 13-dniowy protokół solidnej produkcji ludzkich komórek podobnych do PGC (hPGCLC). Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) utrzymywane w stanie pierwotnej pluripotencji są inkubowane w naiwnym pożywce przeprogramowującej 4i przez 48 godzin, dysocjowane na pojedyncze komórki i pakowane w mikrostudzienkach. Długotrwałe utrzymywanie się hiPSC w pierwotnym stanie pluripotencji powoduje znaczne aberracje chromosomowe i należy tego unikać. hiPSC w mikrostudzienkach są utrzymywane przez dodatkowe 24 godziny w pożywce 4i w celu wytworzenia ciał zarodkowych (EB), które są następnie hodowane w naczyniach z tworzywa sztucznego o niskiej przyczepności w warunkach kołysania w pożywce indukcyjnej hPGCLC zawierającej wysokie stężenie rekombinowanego ludzkiego BMP4. EB są dalej hodowane przez okres do 8 dni w stanie kołyszącym, nieprzylegającym, aby uzyskać maksymalne plony hPGCLC. Za pomocą immunohistochemii hPGCLC są łatwo wykrywane jako komórki silnie eksprymujące OCT4 w prawie wszystkich EB wyłącznie na ich powierzchni. Gdy EB są enzymatycznie dysocjowane i poddawane wzbogacaniu FACS, hPGCLC można zbierać jako komórki CD38+ z wydajnością do 40-45%.

Wprowadzenie

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są wspólnymi prekursorami wszystkich komórek rozrodczych u obu płci. Większość naszej wiedzy na temat rozwoju PGC w zarodkach ssaków została uzyskana dzięki badaniom laboratoryjnym na myszach^1,2. W 6,0-6,5 dniu embrionalnym zarodków myszy w epiblastach znajduje się 6 lub podobna niewielka liczba prekursorów PGC, z których indukowana jest populacja założycielska ~40 PGC w sposób zależny od białek morfogenetycznych kości Bmp2 i Bmp4 wydzielanych z sąsiednich komórek. Najwcześniejsze ludzkie PGC zidentyfikowane do tej pory w zarodkach znajdowały się na endodermalnej ścianie woreczka żółtkowego mniej więcej pod koniec trzeciego tygodnia ciąży³. Ponieważ jest to to samo miejsce, w którym migrujące PGC są obserwowane w zarodkach myszy, jest prawdopodobne, że obserwowane ludzkie PGC znajdowały się na ścieżce migracji, ale nie populacja założycielska. Brakuje jednak badań śledzących wcześniejsze stadia PGC lub prekursorów PGC w ludzkich embrionach.

Dostęp do ludzkich embrionalnych PGC jest trudny zarówno ze względu na przeszkody techniczne, jak i etyczne. Aby pokonać te przeszkody, niedawno stworzono modele hodowli komórkowych podobnych do PGC z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Pluripotencja to komórkowa zdolność do różnicowania się w linię zarodkową i trzy embrionalne listki zarodkowe⁴. Podczas gdy ludzkie PSC utrzymywane w pożywce mTeSR1 (gotowa do użycia, dostępna na rynku pożywka opracowana do utrzymywania ludzkich PSC w stanie pierwotnej pluripotencji) na szalkach pokrytych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej mają pluripotencję w stanie pierwotnym⁴, w 2013 r. laboratorium Jacoba Hanny wykazało, że przygotowane komórki pluripotencji mogą zostać przekształcone w naiwny stan pluripotencji poprzez wystawienie na działanie naiwnego ludzkiego podłoża z komórek macierzystych (NHSM) zawierającego substancję chemiczną inhibitory kinaz białkowych ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC i p38 MAPK oraz czynniki wzrostu LIF, TGF, bFGF⁵. W 2015 r. grupa badawcza kierowana przez Hannę i Azima Surani dokonała pierwszej solidnej produkcji ludzkich komórek podobnych do PGC (hPGCLC) z PSCs⁶. Później kilka innych laboratoriów, w tym nasze, zgłosiło generowanie hPGCLC z PSC przy użyciu nieco innych protokołów^7,8,9^,10. Nasze badanie dostarczyło dowodów na to, że hPGCLC wygenerowane przy użyciu różnych protokołów (które są podsumowane w tabeli S1 naszego wcześniej opublikowanego badania¹⁰) są transkryptomicznie podobne do siebie¹⁰. Dostępne dowody potwierdzają podobieństwo ludzkich PGCLC do ludzkich embrionalnych PGC we wczesnym stadium przed globalnym wymaz7 i/lub migracją chemotaktyczną¹⁰.

Badania embrionalnych PGC myszy, mysich PGCLC i ludzkich PGCLC (ale z bardzo ograniczonym dostępem do ludzkich PGC) wykazały, że mechanizmy molekularne specyfikacji PGC różnią się znacznie między mysim a ludzkim 1^,6^{,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Na przykład Prdm14 odgrywa kluczową rolę w specyfikacji PGC u embrionów myszy, ale jego rola w specyfikacji PGC u ludzi wydaje się ograniczona^1,15. W przeciwieństwie do tego, indukcja SOX17 przez EOMESODERMIN jest niezbędna dla specyfikacji PGC^6,11,14, podczas gdy te czynniki transkrypcyjne wydają się zbędne dla specyfikacji PGC myszy¹⁵. Te wstępne osiągnięcia badań z wykorzystaniem hPGCLC silnie wspierają znaczenie tego modelu hodowli komórkowej jako substytutu ludzkich embrionalnych PGC.

Ostatnio opublikowane badania, obejmujące dogłębną ocenę sekwencjonowania analizy liczby kopii genomowego DNA w naszym laboratorium, wykazały, że długotrwałe utrzymywanie PSC w stanie naiwnej pluripotencji znacznie zwiększa ryzyko niestabilności chromosomalnej i anomalii strukturalnych. Zjawisko to zaobserwowano zarówno w przypadku PSC mouse¹⁸, jak i human¹⁹. Oryginalny protokół produkcji hPGCLC opisany przez Hanna/Surani został opracowany dla ludzkich PSC utrzymywanych w pożywce 4i o naiwnej pluripotencji przez co najmniej 2 tygodnie⁶. Aby zachować prawidłowy diploidalny kariotyp ludzkich PSC i PGCLC, opracowaliśmy zmodyfikowany protokół, w którym ludzkie PSC są wystawione na działanie pożywki 4i tylko przez 72 godziny¹⁰, który jest przedstawiony w tym artykule. Ludzkie komórki iPS (hiPSC) są utrzymywane w stanie pluripotencji pierwotnej. Bezpośrednio przed utworzeniem EB komórki są inkubowane w naiwnym pożywce przeprogramowującej 4i (zmodyfikowanej pożywce NHSM) przez 48 godzin. Komórki są następnie dysocjowane i pakowane w mikrodołki, tworząc EB przez dodatkowe 24 godziny w pożywce 4i. EB są utrzymywane w pożywce indukcyjnej hPGCLC zawierającej wysokie stężenie rekombinowanego ludzkiego BMP4 w warunkach kołysania dla hodowli bez przyłączenia przez okres do 8 dni, aby uzyskać maksymalną wydajność hPGCLC. Po 8-dniowej hodowli EB hPGCLC można wyizolować ze zdysocjowanych komórek EB za pomocą FACS jako komórki CD38 + z wydajnością do ~ 40% w sortowalnej zawiesinie pojedynczej komórki sortowanej przez FACS. Podczas gdy inne opublikowane metody^7,8,9, w tym oryginalny protokół przed naszymi modyfikacjami⁶, zazwyczaj generują hPGCLC w spontanicznie utworzonych agregatach komórkowych bez określonej lokalizacji, hPGCLC wytwarzane przez nasz protokół są obserwowane na powierzchni ciał embrionalnych (EB).

Protokół

1. Hodowla komórkowa hiPSC w stanie pierwotnej pluripotencji

1. Przygotowanie potraw pokrytych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej
   1. Rozmrażaj Matrigel (białko macierzy zewnątrzkomórkowej) na lodzie w lodówce lub chłodni przez noc (nie rozmrażaj w temperaturze pokojowej ani w ciepłej kąpieli wodnej). Podwielokrotność białka matrycowego (~200 μl; objętość podwielokrotności jest określana przez producenta dla każdej partii i wskazana na etykiecie fiolki) do sterylnych probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania lub probówek do kriokonserwacji komórek na lodzie. Ważne jest, aby białko macierzy zewnątrzkomórkowej było lodowate podczas dozowania, aby uniknąć zestalenia. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
   2. Aby pokryć plastikowe naczynia do hodowli komórkowych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej, rozcieńczyć jedną porcję 25 ml lodowatego DMEM / F12 i rozprowadzić na trzech 10-centymetrowych szalkach (~ 8 ml / naczynie). Inkubuj naczynia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Po pokryciu naczynia można uszczelnić za pomocą Parafilm i przechowywać w temperaturze pokojowej do jednego tygodnia.
   3. Odessać pożywkę z szalek bezpośrednio przed inokulacją przygotowanych hiPSC o pluripotencji. Nie jest konieczne mycie panierowanych naczyń solą fizjologiczną lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami bez wapnia/magnezu [PBS(-)].
2. Inicjacja hodowli hiPSC w stanie pierwotnej pluripotencji
   1. Dodać 2 μl 50 mM Y27632 [inhibitor kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK)] do 10 ml pożywki mTeSR1 w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Przygotuj dwie probówki 10 ml pożywki uzupełnionej inhibitorem ROCK, aby zainicjować hodowlę komórkową w jednym 10-centymetrowym naczyniu z 1 ml zamrożonego bulionu komórkowego. Tego samego dnia należy użyć pożywki z dodatkiem Y27632. Podgrzewaj pożywkę z dodatkiem Y27632 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 min.
      Uwaga: Ten protokół działa dobrze z hiPSC utrzymywanymi w mTeSR1. Gdy hiPSC są utrzymywane w innych pożywkach wspierających wzrost PSC u ludzi z różnym stopniem zapoczątkowanej lub naiwnej pluripotencji, wydajność hPGCLC może się znacznie różnić.
      Uwaga: Okres trwałości całego mTeSR1 wynosi 2 tygodnie w temperaturze 4 °C i 6 miesięcy w temperaturze -20 °C, ale ponowne zamrożenie powoduje słabą wydajność. Zamrażamy 40 ml porcji mTeSR1 w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
   2. Rozmrozić fiolkę z zamrożonym bulionem hiPSC o wysokiej pluripotencji (1,0 - 3,0 x 10⁶ komórek w 1 ml pożywki do kriokonserwacji) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast po zakończeniu rozmrażania przenieść całą zawartość fiolki do jednej probówki (10 ml) wstępnie podgrzanej pożywki z dodatkiem Y27632.
   3. Zawiesinę komórek odwirować w temperaturze pokojowej, 300 x g przez 8 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml wstępnie podgrzanego Y27632 uzupełnionego z drugiej probówki.
   4. Równomiernie rozprowadzić zawiesinę komórkową w 10-centymetrowym naczyniu pokrytym białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej. Umieścić naczynie w inkubatorze trójgazowym CO₂ (37 °C, 6.5% O₂, 5% CO_{2 ).} Utrzymuj hodowlę hiPSC pod niskim ciśnieniem tlenu.
   5. Zmieniaj medium (mTeSR1 bez Y27632) codziennie. Inhibitor ROCK (Y27632) ma kluczowe znaczenie dla przeżycia hiPSC natychmiast po dysocjacji do pojedynczych komórek. Gdy hiPSC przylegają do powierzchni pokrytej białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej jako równomiernie rozmieszczone małe agregaty z konfluencją >10% (która zwykle kończy się w ciągu 16 godzin po inokulacji), Y27632 jest zbędny. Zbyt wczesna zmiana pożywki po inokulacji zdysocjowanych hiPSC bez Y27632 może spowodować prawie całkowitą śmierć komórki.
3. Pasażowanie zagruntowanych hiPSC pluripotencji
   Uwaga: Pasaż zapoczątkował pluripotencję hiPSC, gdy kolonie zajmują ~ 80% efektywnego obszaru wzrostu. Prawidłowe procedury pasażowania i gęstości są ważne dla odtwarzalności eksperymentu. Zaobserwowaliśmy, że skuteczność indukcji hPGCLC nie różni się istotnie między hodowlami hiPSC 6 dni po rozpoczęciu z zamrożonego stada (obejmującego jedno lub dwa pasaże) lub jednego miesiąca (obejmującego >10 pasaży). Indukcję hPGCLC z powodzeniem przeprowadzono z hiPSC utrzymujących się przez ponad dwa miesiące, chociaż skuteczność nie została oceniona ilościowo.
   1. Weź 4 ml mieszaniny enzymów dysocjacji komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i równoważ do temperatury pokojowej przez 5 minut.
   2. Podgrzej 10 ml PBS(-) w 15-mililitrowej probówce wirówkowej przez >5 min w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
   3. Dodać 2 μl 50 mM Y27632 (inhibitor ROCK) do 10 ml pożywki mTeSR1 w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Przygotować dwie probówki 10 ml pożywki z dodatkiem inhibitora ROCK i zużyć tego samego dnia. Do innej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml pobrać 5 ml mTeSR1 bez dodawania Y27632. Podgrzewane podłoże +/- Y27632 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 min.
      Uwaga: Wszystkie podwielokrotności pożywki przygotowane w kroku 1.3.3 mogą zawierać Y27632.
   4. Odessać starą pożywkę z 10-centymetrowego naczynia i raz przepłukać komórki podgrzanym 10 ml PBS(-). Wyrzuć PBS(-) i dodaj 4 ml enzymu dysocjacyjnego do naczynia. Umieść naczynie w inkubatorze CO₂ (inkubator trójgazowy działa, ale nie jest to konieczne) na ~4 minuty, aż komórki oderwą się od dna. Delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
   5. Przenieś zawiesinę jednokomórkową hiPSC do wstępnie podgrzanej probówki zawierającej 5 ml pożywki bez Y27632 (całkowita objętość w probówce 15 ml wynosi około 9 ml). Zawiesina komórek wirówki w temperaturze pokojowej, 300 x g przez 8 min.
   6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej Y27632.
   7. Usuń agregaty komórkowe za pomocą sitka komórkowego 40 μm i określ gęstość komórek za pomocą licznika Coulter.
   8. Rozcieńczyć zawiesinę komórek wstępnie podgrzaną pożywką uzupełnioną Y27632, aby uzyskać 3,0 x 10⁶ komórek w 10 ml w celu zaszczepienia 10-centymetrowego naczynia pokrytego białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej. Umieścić zaszczepione naczynie w inkubatorze z trzema gazami CO₂ (37 °C, 6,5%_O2, 5% CO_{2 ).}
   9. Zmieniaj medium (mTeSR1 bez Y27632) codziennie.

2. Generowanie hPGCLC

Uwaga: Rozpocznij następujące kroki, gdy komórki hiPSC w 10 cm naczyniu (podłoże mTeSR1, pokryte białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej) osiągną ~80% konfluencji (około 10⁷ komórek).

1. Przygotowanie potraw pokrytych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej (Dzień 1)
   1. Rozmrozić jedną porcję białka macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie i rozcieńczyć w 25 ml lodowatego DMEM/F12.
   2. Dozować rozcieńczone białko macierzy zewnątrzkomórkowej do płytek 6-dołkowych (1 ml / dołek). Jedna porcja wystarcza do pokrycia 24 dołków (4 płytki). Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Nieużywane powlekane płytki można szczelnie zamykać i przechowywać w temperaturze pokojowej do jednego tygodnia.
   3. Odessać pożywkę z płytek bezpośrednio przed inokulacją przygotowanych hiPSC pluripotencji. Nie ma potrzeby mycia powlekanych naczyń pożywką lub PBS(-).
2. Inokulacja przygotowanych hiPSC pluripotencji na płytki pokryte białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej (Dzień 1)
   1. Weź 4 ml enzymu dysocjacji komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wyrównaj do temperatury pokojowej przez 5 minut.
   2. Podgrzej 10 ml PBS(-) w 15-mililitrowej probówce wirówkowej przez >5 min w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
   3. Dodać 7 μl 50 mM Y27632 (inhibitor ROCK) do 35 ml pożywki mTeSR1 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Użyj pożywki uzupełnionej Y27632 tego samego dnia. Przygotuj dwie probówki na łączną zawartość 70 ml pożywki uzupełnionej Y27632 i podgrzej pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut.
   4. Odessać starą pożywkę z 10-centymetrowego naczynia i raz przepłukać komórki podgrzanym 10 ml PBS(-). Wyrzuć PBS(-) i dodaj 4 ml enzymu dysocjacji komórek do naczynia. Umieść naczynie w inkubatorze CO₂ (inkubator trójgazowy działa, ale nie jest to konieczne) na ~4 minuty, aż komórki oderwą się od dna. Delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
   5. Przenieść zawiesinę jednokomórkową hiPSC do wstępnie podgrzanej probówki zawierającej 10 ml pożywki uzupełnionej Y27632. Zawiesina komórek wirówki w temperaturze pokojowej, 300 x g przez 8 min.
   6. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy z 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki uzupełnionej Y27632.
   7. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe (wielkość porów 40 μm) w celu usunięcia agregatów komórkowych i policzenia komórek za pomocą licznika Coredtera.
   8. Rozcieńczyć zawiesinę pojedynczych komórek hiPSC do 5,0 x 10⁶ komórek w 50 ml wstępnie podgrzanej pożywki uzupełnionej Y27632.
   9. Zaszczepić 2 ml zawiesiny komórek (2,0 x 10⁵ komórek) w każdym dołku powlekanych płytek 6-dołkowych (4 płytki, 24 dołki). Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w każdym dołku. Umieścić płytki do hodowli komórkowych w inkubatorze z trzema gazami CO₂ (37 °C, 6,5%_O2, 5% CO₂).
      Uwaga: Gęstość komórek inokulum i równomierne rozmieszczenie w każdej studzience ma kluczowe znaczenie. Ponieważ inokulacja hiPSC w 10-centymetrowych szalkach może powodować znacznie większą gęstość komórek niż w innych obszarach. Równomierne zagęszczenie komórek pojedynczych hiPSC można łatwiej osiągnąć za pomocą płytek 6-dołkowych.
   10. Zmienić pożywkę za pomocą 2 ml/basenik mTeSR1 (bez Y27632) po 24 godzinach od inokulacji.
3. Konwersja hiPSC w stanie pierwotnej pluripotencji do 4i-niezależnych (ERK-niezależnych) komórek pluripotencjalnych (dzień 3 i dzień 4)
   1. Przygotuj kompletną pożywkę 4i z naiwną pluripotencją w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w następujący sposób (dzień 3 i dzień 4): 50 ml pożywki podstawowej 4i, 5 μl 30 mM CHIR99021, 5 μl z 10 mM PD0325901, 5 μl z 20 mM BIRB796, 5 μl z 50 mM SP600125 i 5 μl 50 mM Y27632.
      Uwaga: Pożywkę podstawową 4i przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrażać w lodówce przez noc. Przygotować świeżą kompletną pożywkę 4i bezpośrednio przed użyciem. Unikaj wystawiania chemikaliów 4i (CHIR, PD, BIRB i SP) na silne światło. Nie przechowywać kompletnego podłoża 4i w temperaturze 4 °C ani nie zamrażać go przez noc lub dłużej.
   2. Ogrzewać 50 ml 4i complete medium w partii wody o temperaturze 37 °C przez 15 min. Zmienić pożywkę na wstępnie podgrzaną pożywkę 4i complete (2 ml / studzienkę) po 48 i 72 godzinach od inokulacji. Dokładny czas zmiany pożywki jest ważny dla osiągnięcia wysokiej wydajności hPGCLC i odtwarzalności eksperymentalnej.
      Uwaga: Gęstość hodowli 4i hiPSC jest wysoka w tym stanie i zlewa się po 48-72 godzinach od inokulacji, ale jest to normalne.
4. Tworzenie EB za pomocą płytek mikrodołkowych (dzień 5)
   1. Przygotuj 50 ml kompletnego podłoża 4i w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i podgrzej je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez ~15 minut przed użyciem.
   2. Podgrzej 35 ml DMEM/F12 w 50-mililitrowej probówce wirówkowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez ~15 minut przed użyciem.
   3. Przygotuj płytkę mikrodołkową
      1. Dodaj 5% (w/v) sterylizowanego filtrem detergentu Pluronic F-127 do 8 aktywnych dołków płytki mikrodołkowej (patrz Tabela materiałów; 0,5 ml/studzienkę).
      2. Odwirować płytkę mikrodołka w temperaturze pokojowej, 1 000 x g, przez 5 minut. Sprawdzić mikrostudzienki za pomocą mikroskopu odwróconego, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Pozostaw płytkę mikrostudzienki na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby pokryć mikrostudzienki detergentem.
      3. Wylać roztwór detergentu z dołków płytki mikrodołkowej przez pipetowanie i przepłukać studzienki wstępnie podgrzanym DMEM/F12 (2 ml/studzienkę).
      4. Odwirować płytkę mikrodołka w temperaturze pokojowej, 1 000 x g przez 5 min. Sprawdzić mikrostudzienki za pomocą mikroskopu odwróconego, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
         Uwaga: Gdy w mikrostudzienkach nadal obserwuje się pęcherzyki powietrza, sprawdź, czy arkusz mikrostudzienki jest nadal mocno przyklejony do dna studzienki.
      5. Wyrzucić DMEM/F12 z dołków płytki mikrodołkowej przez pipetowanie i przepłukać studzienki wstępnie podgrzanym DMEM/F12 (2 ml/studzienkę).
      6. Powtórz kroki 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Dodać 4i kompletną pożywkę do przepłukanych dołków płytki mikrodołkowej (1 ml/studzienkę). Pozostałą pożywkę 4i należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      8. Odwirować płytkę mikrodołka w temperaturze pokojowej, 1 000 x g przez 5 min. Sprawdzić mikrostudzienki za pomocą mikroskopu odwróconego, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
      9. Umieścić płytkę mikrodołkową w inkubatorze trójgazowym (37 °C, 6,5%_O2, 5% CO₂) do momentu zaszczepienia 4i hiPSC.
   4. Inokulacja iPSC 4i do płytki mikrodołkowej
      1. Weź 13 ml enzymu dysocjacji komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i równoważ do temperatury pokojowej przez 5 minut.
      2. Podgrzej 50 ml PBS(-) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml przez >5 minuty w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
      3. Odessać starą pożywkę z 24 dołków naiwnej hodowli komórkowej hiPSC i raz przepłukać komórki wstępnie podgrzanym 2 ml / studzienką PBS (-). Odrzuć PBS(-) i dodaj 0,5 ml / dołek enzymu dysocjacyjnego. Umieścić płytki do hodowli komórkowych w inkubatorze CO₂ (37 °C) na ~4 minuty, aż komórki oderwą się od dna. Delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
      4. Przenieść zawiesinę jednokomórkową hiPSC do wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki o pojemności 20 ml 4i. Zawiesina komórek wirówki w temperaturze pokojowej, 300 x g przez 8 min.
      5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża 4i.
      6. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe (wielkość porów 40 μm) w celu usunięcia agregatów komórkowych. Umyj sitko do komórek 3 razy 1 ml podgrzanego 4i kompletnego podłoża. Policz komórki za pomocą licznika redlic.
      7. Rozcieńczyć jednokomórkową zawiesinę naiwnych hiPSC 4i do 27,0-32,4 x 10⁶ komórek w 9 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki 4i. Zauważ, że kompletna pożywka 4i zawiera już Y27632.
      8. Pobrać płytkę mikrodołkową zawierającą 1 ml kompletnej pożywki 4i w 8 dołkach z inkubatora trójgazowego (2.4.3.9). Zaszczepić 1 ml 4i naiwnej zawiesiny hiPSC (3,0-3,6 x 10⁶ komórek/studzienkę) do każdej studzienki. Ta gęstość komórek ma kluczowe znaczenie. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w każdym dołku, delikatnie pipetując.
      9. Odwirować płytkę mikrodołkową w temperaturze pokojowej, 100 x g przez 3 min.
      10. Umieścić płytkę mikrostudzienkową w inkubatorze z trzema gazami CO₂ (37 °C, 6.5% O₂, 5% CO_{2 ).} Nie przeszkadzaj komórkom umieszczonym w mikrostudzienkach. Inkubuj komórki przez 24-30 godzin. Nocna inkubacja (~16 godzin) jest zwykle niewystarczająca do wytworzenia ciasnych EB.
5. Przeniesienie EB na niskie płyty mocujące w celu hodowli bujania (dzień 6)
   1. Przygotować kompletną pożywkę hPGCLC w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w następujący sposób (dzień 6 - dzień 13):
      20 ml pożywki podstawowej hPGCLC, 4 μl 500 mM 2-merkaptoetanolu, 50 μl 20 mg/ml kwasu L-askorbinowego, 4 μL 50 mM Y27632, 50 μL 100 μg/ml rekombinowanego ludzkiego BMP4, 4 μL 500 μg/ml ludzkiego SCF, 4 μL 250 μg/ml ludzkiego EGF, i 8 μl 250 μg/ml ludzkiego LIF.
      Uwaga: Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować świeżą kompletną pożywkę hPGCLC i unikać ekspozycji na światło. Nie przechowywać kompletnego podłoża hPGCLC w temperaturze 4 °C ani zamrożonego przez noc lub dłużej.
      Uwaga: Stężenie BMP4 jest bardzo wysokie. Optymalne stężenie BMP4 może się różnić w zależności od serii BMP4. Różnica między partiami BMP4 silnie wpływa na produkcję hPGCLC. W przypadku braku BMP4 w kompletnym pożywce hPGCLC, wydajność hPGCLC jest bardzo niska⁶. Znaczenie innych cytokin w kompletnym pożywce hPGCLC zostało opisane przez Hanna/Surani⁶.
      Uwaga: W tym protokole końcowe stężenie ludzkiego LIF w kompletnym pożywce hPGCLC wynosi 100 ng/mL^6,10. Końcowe stężenie LIF stosowane we wcześniej opublikowanych badaniach, w tym naszym, wynosiło 1 μg/ml. Gdy aktywność właściwa ludzkiego odczynnika LIF wynosi >10 000 jednostek/μg (ED₅₀ < 0,1 ng/ml), 100 ng/ml LIF jest wystarczające do wsparcia wytwarzania hPGCLC z EB.
   2. Przenoszenie EB
      1. Podgrzej 5 ml pożywki podstawowej hPGCLC i 20 ml kompletnej pożywki hPGCLC przez >5 minuty w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
      2. Ostrożnie umieść sitko do komórek do góry nogami na stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
      3. Odpipetuj bardzo delikatnie każdą studzienkę płytki mikrodołkowej, aby oddzielić EB od mikrostudzienek. Przefiltrować całą zawartość każdej studzienki przez sitko do komórek, aby usunąć komórki niewłączone do EB.
      4. Przemyć EB zatrzymane na sitku komórkowym 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża podstawowego hPGCLC. Delikatnie powtórz pranie 5 razy.
      5. Umyte EB są teraz zatrzymywane na membranie sitka, które znajduje się na stożkowej probówce o pojemności 50 ml do góry nogami. Umieść świeżą stożkową probówkę o pojemności 50 ml na sitku do komórek, tak aby sitko do komórek było normalnie umieszczone w nowej probówce. Następnie szybko odwróć sitko komórkowe za pomocą nowej probówki. Sitko komórkowe i rurka znajdują się teraz w normalnych pozycjach, a EB znajdują się poniżej membrany sitka komórkowego.
      6. Zebrać EB w stożkowej probówce, dodając 18 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hPGCLC znad membrany sitka komórkowego. W ten sposób pożywka przejdzie przez membranę i zbierze EB przyczepione po dolnej stronie membrany aż do dna probówki wirówkowej.
      7. Zawiesina płytkowa EB w studzienkach 6-dołkowej płytki o niskim stopniu przylegania (3 ml/dołek).
      8. Umieść płytkę o niskim mocowaniu na kołysce kołyszącej w inkubatorze trójgazowym (37 °C, 6.5% O₂, 5% CO_{2 ).} Ustaw prędkość kołysania na ~20 obrotów na minutę.
         Uwaga: Nie stosuj ruchu wirowego, ponieważ EB gromadzą się w środku studzienek i bezpiecznika. Ostrożnie dostosuj prędkość kołysania, aby EB nie agregowały się. Zbyt energiczne kołysanie spowoduje fizyczne uszkodzenie EBs.
         Uwaga: Niskie ciśnienie tlenu jest zdecydowanie zalecane w przypadku hodowli EB.
6. Wytwarzanie hPGCLC na powierzchni EB (Dzień 7 - Dzień 13)
7. Codziennie należy przygotowywać świeżo 20 ml kompletnego podłoża hPGCLC. Bez kołysania EB opadną na dno studni w ciągu ~1 minuty. Usuń starą pożywkę bez suszenia EB (~0,2 ml / dobrze może pozostać stare podłoże) i codziennie dodawaj świeże kompletne podłoże hPGCLC (3 ml / dołek).

3. Barwienie immunohistochemiczne EB (Dzień 10 – Dzień 13)

1. Osadzanie EB w blokach białkowych macierzy zewnątrzkomórkowej do barwienia immunologicznego utrwalonego formaldehydem i zatopionego w parafinie (FFPE)
   1. Aby zidentyfikować hPGCLC jako komórki OCT4⁺, należy zebrać EB w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskim poziomie wiązania. Pozwól EB opaść na dno lub krótko odwirować (2 sekundy) w temperaturze pokojowej i wyrzuć pożywkę. Opłucz EB lodowatym PBS(-).
   2. Usunąć PBS(-) i inkubować EB w 1 ml lodowatego 1% (w/v) azydku sodu w PBS(-) przez 5 minut na lodzie. Pozwól EB opaść na dno lub krótko odwirować (2 sekundy) w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przepłukać EB lodowatym PBS(-).
      Uwaga: Dodanie azydku sodu spowalnia degradację białek wewnątrzkomórkowych i transkryptów RNA.
   3. Rozmrozić 200 μl białka macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie i dodać do probówki mikrowirówki zawierającej EBs. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na ~10 minut, aż żel zastygnie.
   4. Dodaj 1 ml 4% formaldehydu do PBS(-) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, delikatnie kołysząc.
      Uwaga: Zarówno EB, jak i białko macierzy zewnątrzkomórkowej są utrwalane na tym etapie. Bez utrwalenia bloki żelu mogą ulegać rozkładowi podczas procesu odwadniania. Jeśli wstępnie ustalone EB są osadzone w bloku żelowym, EB są ponownie mocowane za pomocą bloku żelowego i mogą być nadmiernie utrwalone.
   5. Wyrzuć formaldehyd i spłucz EB raz lodowatym PBS (-). Dodaj 1 ml 70% etanolu. EB zatopione w żelu mogą być przechowywane w 70% etanolu w temperaturze 4 °C przez tydzień.
   6. Przetwarzaj EB osadzone w żelu za pomocą standardowego protokołu FFPE. Przygotuj szkiełka FFPE o grubości 5 μm. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc i przechowuj je w temperaturze pokojowej do momentu barwienia immunologicznego.
      Uwaga: Nasz rutynowy protokół FFPE jest następujący: 70% etanolu, dwie zmiany, każda po 1 godzinie; 80% etanolu, jedna zmiana, 1 godzina; 95% etanolu, jedna zmiana, 1 godzina; 100% etanol, trzy zmiany po 1,5 godziny każda; ksylen, trzy zmiany, po 1,5 godziny każda; wosk parafinowy (58-60 °C), dwie zmiany po 2 godziny każda. Odwodnione tkanki są umieszczane w blokach parafinowych i cięte na 3-10 μm (zwykle 5 μm).
   7. Do barwienia całkowicie wysuszyć szkiełka w piecu o temperaturze 56 °C przez co najmniej 30 minut. Odparafinować i uwodnić szkiełka za pomocą serii ksylenów i stopniowanych alkoholi. Następnie umyj szkiełka w wodzie z kranu przez 5 minut.
   8. Aby dezaktywować endogenne peroksydazy, należy inkubować uwodnione szkiełka z roztworem blokującym BLOXALL w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie myj szkiełka PBS przez 5 minut.
   9. Blokuj szkiełka z normalną surowicą końską (lub normalną surowicą przeciwciał drugorzędowych innych gatunków) w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   10. Inkubować szkiełka z pierwszorzędowym przeciwciałem kozim anty-OCT-3/4 rozcieńczonym 0,1% BSA w PBS(-) w temperaturze 4 °C przez noc (zoptymalizować warunki rozcieńczenia i inkubacji dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego). Następnie umyć szkiełka podstawowym preparatem PBS(-) trzy razy w temperaturze pokojowej po 5 minut każde.
   11. Inkubować szkiełka z przeciwciałem anty-kozim IgG (przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową wytwarzane przez konia; patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie umyć szkiełka podstawowym preparatem PBS(-) trzy razy w temperaturze pokojowej po 5 minut każde.
   12. Wymieszaj niezbędne ilości substratów barwiących DAB (patrz Tabela materiałów) bezpośrednio przed użyciem i inkubuj szkiełka w kompletnym roztworze do barwienia DAB w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Monitoruj barwienie DAB za pomocą odwróconego mikroskopu i zatrzymaj reakcję, gdy komórki OCT4⁺ zostaną uwidocznione poprzez szybkie płukanie szkiełek w płynącej wodzie z kranu.
   13. Odwodnić szkiełka za pomocą serii stopniowanego alkoholu i ksylenów. Preparaty są gotowe do przeprowadzenia mikrodysekcji laserowej. Przygotuj stałe preparaty FFPE za pomocą podłoża montażowego (patrz tabela materiałów) do obserwacji mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości.

4. Wzbogacanie FACS hPGCLC z EB (Dzień 10 – Dzień 13)

1. Przygotowanie mieszanki enzymatycznej zestawu do dysocjacji ciała zarodka
   1. Przygotuj Enzyme Mix 1, dodając 50 μl enzymu P do 1 900 μl buforu X i wiruj. Wstępnie rozgrzej enzym Mieszaj 1 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut.
   2. Przygotuj mieszankę enzymów 2, dodając 10 μl enzymu A do 20 μl buforu Y.
   3. Wymieszaj mieszaniny enzymów 1 i 2, aby przygotować kompletną mieszankę enzymów dysocjacyjnych EB.
2. Dysocjacja EB
   1. Zebrać EB z płytek o niskim mocowaniu i odwirować w temperaturze pokojowej w 15 ml probówce wirówkowej, 300 x g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić EB za pomocą 10 ml PBS (-). Ponownie odwirować.
   2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić EB za pomocą kompletnej mieszanki enzymów dysocjacyjnych EB (4.1.3). Zawiesinę EB inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-20 minut, aż do dysocjacji EB. Podczas inkubacji delikatnie pipetować EB co 3 - 5 minut, aby ułatwić dysocjację. Alternatywnie, użyj automatycznego dysocjatora z Programem Dysocjacji Ciała Zarodka.
   3. Dodaj lodowato zimne 8 ml PBS(-) do zdysocjowanej zawiesiny komórek EB. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 μm. Umyj sitko do komórek 1 ml lodowatego PBS (-) trzy razy.
   4. Policz komórki w przefiltrowanej zawiesinie komórek za pomocą licznika Coredtera.
   5. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 8 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy za pomocą lodowatego 10 ml PBS(-).
   6. Podziel zawiesinę komórek na dwie probówki, jedną do kontroli bez barwienia (~10⁵ komórek), a drugą do barwienia anty-CD38 (wszystkie pozostałe komórki).
   7. Odwirować dwie probówki w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 8 minut.
3. Barwienie anty-CD38 i wzbogacanie FACS hPGCLC
   1. Zawiesić osad komórkowy w celu kontroli bez plam za pomocą 200 μl lodowatego 3% (w/v) BSA i 1% (w/v) azydku sodu w PBS(-). Umieścić na lodzie do cytometrii przepływowej.
      Uwaga: Dodatek azydku sodu spowalnia internalizację CD38 z powierzchni komórki.
   2. Zawiesić osad komórkowy do barwienia anty-CD38 lodowato zimnym 3% (w/v) BSA i 1% (w/v) azydkiem sodu w PBS(-) do 1 x 10⁶ komórek na 100 μl.
   3. Dodać 10 μl na 1 x 10⁶ komórek przeciwciała anty-CD38 sprzężonego z APC klasy FACS. Przykryj rurkę folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut, delikatnie kołysząc.
   4. Dodać 5 ml lodowatego PBS(-) i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 8 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 5 ml lodowatego PBS(-). Powtórzyć mycie PBS(-) w sumie trzy razy.
   5. Zawiesić osad komórkowy z 500 μl lodowatego 3% (w/v) BSA i 1% (w/v) azydku sodu w PBS(-) do gęstości komórek odpowiedniej dla FACS.
   6. Wzbogać hPGCLC w komórki CD38 ⁺, które zazwyczaj tworzą wyraźnie wyróżniającą się populację komórek. Użyj kontroli bez barwienia, aby zapewnić identyfikację komórek CD38 ⁺. Typowa wydajność hPGCLC wynosi 1-5% wszystkich pojedynczych komórek badanych przez FACS od EB dnia 10 i 20-40% od EB dnia 13.

Wyniki

Płytka mikrodołkowa używana tutaj jest w formacie 24-dołkowym i ma 8 dołków zawierających arkusze mikrodołków, z których każdy obsługuje tworzenie do 1,200 EBs. Z około 24 milionów naiwnych komórek pluripotencji 4i, ta płytka mikrodołkowa zwykle generuje ~ 8 000 EB składających się z ~ 3 000 komórek na EB. Podczas nieprzylegającej hodowli EB z ciągłym kołysaniem, liczba nienaruszonych EB stopniowo zmniejsza się z powodu spontanicznego samorozkładu, a ~3,000 EB przeżywa do 13 dnia protokołu. Większość z tych ocalałych EB ma 50-200 hPGCLC na swojej powierzchni (oszacowane przez immunohistochemiczne wykrywanie komórek OCT4+ w szeregowych sekcjach EB; patrz Rysunek 8), co daje w sumie ~100 000 hPGCLC OCT4+. Enzymatyczne trawienie EB do pojedynczych komórek jest stosunkowo nieefektywnym procesem, zmniejszającym wydajność wzbogaconych w FACS hPGCLC CD38 + do 9 000 - 47 000 komórek. W naszych rękach średnio sześć niezależnych, ale następujących po sobie partii eksperymentów wynosiło od 14 038 ± 5 731 (średnia ± SEM). Ponieważ komórki EB CD38-ujemne wyrażają mRNA OCT4 (qPCR) lub białko (immunohistochemia) tylko bardzo słabo, jeśli nie całkowicie nieobecne, wszystkie komórki EB silnie eksprymujące białko OCT4 są praktycznie równoważne całej populacji cDL38 + hPGCLC.

Krytycznym parametrem tego protokołu jest gęstość komórek. Gdy 2,0 x 10⁵ ludzkich iPSC zostanie zaszczepionych w basenie pokrytym białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej (9,60 cm² obszar wzrostu na dołek) 2 ml pożywki z dodatkiem Y27632 (2.2.9), komórki osiągną około 20-30% konfluencji w 24 godziny po inokulacji (Rysunek 1). Po dodatkowej 24-godzinnej hodowli w pożywce mTeSR1 pod nieobecność Y7632, komórki agregują się i tworzą kolonie, zajmując ~30% obszaru wzrostu (Rysunek 2). Komórki są następnie hodowane w pożywce przeprogramowującej 4i (2.3.2). Po 24 godzinach hodowli w pożywce 4i komórki stają się zlewające (Ryc. 3). Dodatkowa 24-godzinna hodowla w pożywce 4i sprawia, że komórki są gęsto upakowane (Rysunek 4). Dokładny czas zmiany pożywki (co 24 godziny +/- 4 godziny) i gęstość komórek mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego tworzenia EB i hPGCLC.

Po 48-godzinnej hodowli w pożywce 4i, komórki są dysocjowane i inokulowane na płytce mikrodołkowej, która ma dołki o wielkości 400 μm (2.4). Chociaż ta dostępna na rynku płytka mikrodołkowa jest powlekana przez producenta w celu uzyskania powierzchni o niskiej przyczepności, zaleca się ponowne pokrycie jej detergentem (2.4.3) w celu zmniejszenia ryzyka niepożądanego przylegania komórek. Mikrostudzienki o wielkości 800 μm skutkowały zmniejszoną wydajnością hPGCLC, co sugeruje znaczenie wielkości EB dla prawidłowo ukierunkowanego różnicowania. Komórki zaszczepione w pożywce 4i utworzą EB w mikrodołkach po 24-30 godzinach, co można zaobserwować za pomocą standardowego mikroskopu z kontrastem z odwróconymi fazami (Ryc. 5). Okrągły kontur EB staje się wyraźnie widoczny po 24 godzinach inkubacji. Nie zaleca się zbierania EB wcześniej (np. 16 godzin po inokulacji), zanim ich okrągły kontur będzie wyraźnie widoczny, ponieważ takie EB są bardzo podatne na uszkodzenia mechaniczne i łatwo się demontują. Należy pamiętać, że znaczne ilości naiwnych hiPSC NIE są włączone do EB, co jest normalne. Te niewłączone komórki zostaną wypłukane przed rozpoczęciem bujanej hodowli EB na powierzchni o niskiej przyczepności (2.5.2). Należy również zauważyć, że w naszym protokole EB są tworzone w pożywce 4i nieleczonej pluripotencji - nie w pożywce hPGCLC. Wstępne tworzenie stałych EB w pożywce 4i przed wystawieniem na działanie pożywki hPGCLC jest ważne dla rozmieszczenia hPGCLC na powierzchni EB.

EBs utrzymywane w pożywce hPGCLC w warunkach kołyszącej, nieprzylegającej hodowli zachowają swój kulisty kształt bez agregacji lub fuzji (Rysunek 6 i Rysunek 7). Zbyt słabe warunki kołysania spowodują agregację i fuzję EB, ale zbyt trudne warunki zdemontują EB. Ludzkie PGCLC pojawiają się jako komórki eksprymujące OCT4 na powierzchni EB już po 5-dniowej hodowli w pożywce hPGCLC, a ich liczba wzrasta aż do 8-dniowej hodowli (Ryc. 8). Dalsza inkubacja EB może spowodować demontaż EB i utratę hPGCLC. Ludzkie PGCLC mogą być wzbogacone z enzymatycznie zdysocjowanych komórek EB po 5-8 dniach hodowli w pożywce hPGCLC przez FACS jako komórki CD38 + (Rysunek 9).

Rycina 1: Hodowla ludzkich komórek iPSC w pożywce z dodatkiem Y27632 24 godziny po inokulacji. Gęstość komórek wynosi około 20-30% zlewania się. W obecności inhibitora ROCK Y27632 komórki mają tendencję do dobrego rozprzestrzeniania się z długim, przypominającym kolce wydłużeniem. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Hodowla ludzkich komórek iPSC 48 godzin po inokulacji. Komórki agregują się, tworząc kolonie, zajmujące ~30% obszaru wzrostu. Podziałka liniowa = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Hodowla ludzkich komórek iPSC inkubowana w pożywce przeprogramowującej 4i przez 24 godziny. Komórki docierają do zbiegu. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Hodowla ludzkich komórek iPSC inkubowana w pożywce reprogramującej 4i przez 48 godzin. Zlewające się komórki są gęsto upakowane. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ludzkie EB iPSC powstały w mikrostudzienkach po 24-godzinnej inkubacji w pożywce reprogramującej 4i. Okrągły kontur EB staje się widoczny po 24-30 godzinach od inokulacji. Gdy kontur zostanie potwierdzony pod mikroskopem z kontrastem fazowym, EB są gotowe do przeniesienia do warunków hodowli kołyszącej. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Ludzkie EB iPSC inkubowane przez 24 godziny w pożywce hPGCLC. EB w dużej mierze zachowują swój kulisty kształt. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 7: Ludzkie EB iPSC inkubowane przez 192 godziny w pożywce hPGCLC. EB są powiększone w porównaniu z ich wyglądem w 24-godzinnej hodowli, ale nadal w dużej mierze zachowują kuliste kształty bez agregacji lub fuzji. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 8: Ludzkie PGCLC wykazujące ekspresję OCT4 są zlokalizowane na powierzchni EB hiPSC inkubowanych przez 192 godziny w pożywce hPGCLC. EB osadzono w białku macierzy zewnątrzkomórkowej i przetworzono w celu barwienia immunohistochemicznego szkiełka FFPE OCT4 (substrat DAB). Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 9: Ludzkie PGCLC są wzbogacane z enzymatycznie zdysocjowanych komórek EB przez FACS jako komórki CD38+. Po inkubacji w pożywce hPGCLC przez 5-8 dni, EB mogą zostać zdysocjowane przez trawienie enzymatyczne w celu przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki. hPGCLC mogą być wzbogacone jako komórki CD38 ⁺ przez FACS (czerwone kropki). Komórki EB, które nie wykazują ekspresji CD38 (niebieskie kropki), powinny być również pobierane jako kontrola ujemna. Bramki FACS komórek CD38-dodatnich i CD38-ujemnych powinny być oddzielone szerokim marginesem (zielone kropki), aby uniknąć zanieczyszczenia każdego typu komórek. Górny i dolny panel pokazują profile FACS odpowiednio bez lub z barwieniem przeciwciałami anty-CD38. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niezawodna produkcja hPGCLC przy użyciu opisanego tutaj protokołu została potwierdzona na trzech niezależnych klonach ludzkich iPSC z prawidłowym diploidalnym kariotypem¹⁰. Te klony iPSC pochodziły z tej samej ludzkiej hodowli komórek fibroblastów skóry skóry u noworodków¹⁰. Zostaną one dostarczone przez autorów tego artykułu badaczom na żądanie i na podstawie odpowiedniej umowy o transfer materiałów oraz ustaleń dotyczących wysyłki zamrożonych żywych komórek ludzkich. Obecnie nie wiadomo, czy normalny kariotyp jest wymagany do silnej produkcji hPGCLC przy użyciu naszego protokołu, czy tych zgłoszonych przez inne laboratoria.

Ostatnie badania wykazały, że produkcja hPGCLC z hiPSCs¹¹ lub ESCs¹⁴ przy użyciu protokołu opisanego przez grupę Saitou z Uniwersytetu w Kioto⁸ jest zależna od ekspresji EOMESODERMINY, czynnika transkrypcyjnego T-box wymaganego do indukcji SOX17. Wydaje się, że SOX17 funkcjonuje jako główna linia determinująca czynnik transkrypcyjny w różnicowaniu linii zarodkowej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych⁶. EOMESODERMIN jest kodowany przez gen EOMES , a nokaut CRISPR/Cas9 EOMES spowodował prawie całkowity brak indukcji SOX17 w warunku¹¹ wytwarzającym hPGCLC, a ekspresja innych genów przebiegała zgodnie z tym samym wzorcem komórek nokautujących SOX17. Nadekspresja EOMESODERMINY z indukowalnego wektora w komórkach nokautujących EOMES-null podczas hodowli indukcyjnej hPGCLC skutecznie uratowała solidną produkcję hPGCLC, a także indukcję genów linii zarodkowej, w tym SOX17. W przeciwieństwie do tego, indukowana nadekspresja SOX17 również uratowała solidną produkcję PGCLC, ale bez indukowania EOMES. Tak więc EOMESODERMIN jest krytycznym induktorem SOX17 i wydaje się, że jest to najważniejsza rola EOMESODERMIN w indukcji hPGCLC z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Nasz protokół indukuje SOX17 w^{hiPSCs 10}, ale jego zależność od indukcji EOMESODERMINE czeka na ustalenie.

Protokół ten przekształca ludzkie iPSC o pierwotnej pluripotencji utrzymywane w pożywce mTeSR1 w niezależną od ERK naiwną pluripotencję przez 96 godzin w pożywce 4i⁶, która jest zmodyfikowaną naiwną pożywką dla ludzkich komórek macierzystych (NHSM)⁵. Nasze próby wygenerowania hPGCLC, zaczynając od tych samych ludzkich klonów iPSC, ale utrzymywanych w innych dostępnych na rynku pożywkach hodowlanych iPSC dla ludzi przed hodowlą w pożywce przeprogramowującej 4i, skutkowały różnym stopniem niższych plonów hPGCLC. Chociaż to, czy długoterminowa adaptacja w innych pożywkach poprawia produkcję hPGCLC, czy nie, zostanie określone w przyszłych badaniach, obserwacja ta sugeruje, że dokładny stan primed pluripotencji ludzkich iPSC przed przeprogramowaniem 4i znacząco wpływa na tworzenie EB w pożywce 4i i różnicowanie EB w pożywce hPGCLC.

Produkcja hPGCLC z hiPSC zgodnie z naszym protokołem jest solidna i wysoce powtarzalna, częściowo dzięki zastosowaniu płytek mikrodołkowych, które umożliwiają wydajną produkcję dużej liczby EB (~8 000 EB na partię) o jednolitej wielkości (3 000 hiPSC na EB). Liczba EB łatwo wytworzonych w jednej partii eksperymentu przy użyciu naszego protokołu może być znacznie większa niż metod wykorzystujących zwykłe studzienki do hodowli komórkowych z dnem U. Produkcja dużej liczby EB o jednakowej wielkości, równomiernie naszpikowanych hPGCLC, może zapewnić wyjątkowe możliwości wysokoprzepustowych badań chemicznych w celu identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów o małej masie cząsteczkowej wpływających na specyfikację PGC lub ich cechy biologiczne, takie jak przeprogramowanie epigenetyczne. Takie EB mogą być również przydatne do oceny toksykologicznej dużej liczby substancji toksycznych dla komórek rozrodczych, w tym nie tylko zanieczyszczeń środowiska, ale także leków przepisanych klinicznie, takich jak chemioterapeutyki.

Do krytycznych czynników solidnej i powtarzalnej produkcji hPGCLC przy użyciu przedstawionego protokołu należą: (i) wykorzystanie zdrowych hiPSC utrzymywanych w mTeSR1 na białku macierzy zewnątrzkomórkowej, (ii) inokulacja dokładnej liczby komórek, jak określono i ścisłe przestrzeganie czasu zmiany pożywki i subhodowli, (iii) wybór dużej partii ludzkiego rekombinowanego BMP4, oraz (iv) zminimalizowanie fizycznych uszkodzeń EB podczas hodowli bujania. Z naszego doświadczenia wynika, że najlepsza partia odczynnika BMP4 działała przy stężeniu 100 ng/ml, podczas gdy inne partie odczynników BMP4 wymagały dawek 2X lub większych. Z drugiej strony, wydajność produkcji hPGCLC przy użyciu najlepszej partii BMP4 raczej zmniejszała się przy wyższych dawkach BMP4 (np . 200 ng/ml). Zalecamy przetestowanie kilku różnych partii rekombinowanych ludzkich odczynników BMP4 uzyskanych od wielu dostawców pod kątem ich skuteczności we wspieraniu wytwarzania hPGCLC i zabezpieczenia dużej ilości najlepszej partii.

Unikalną cechą naszego protokołu hPGCLC jest to, że hPGCLC są zlokalizowane na najbardziej zewnętrznej warstwie powierzchniowej EBs¹⁰ (rysunek 8), podczas gdy inne protokoły mogą generować hPGCLC w środku agregatów komórkowych ^6,8. Ciała embrionalne mają tendencję do tworzenia wielu odrębnych warstw, takich jak powierzchnia, powłoka zewnętrzna, powłoka wewnętrzna i rdzeń, a centralne regiony rdzenia są często nekrotyczne z powodu ograniczonego dopływu składników odżywczych, tlenu, a także czynników wzrostu sprzyjających przetrwaniu dostarczanych z pożywki hodowlanej przez dyfuzję²⁰. Lokalizacja hPGCLC na powierzchni EB bez możliwych ograniczeń ze względu na ograniczoną dyfuzję w kierunku centrum EB może być korzystna dla bezpośredniej, kontrolowanej w czasie i dawce ekspozycji hPGCLC na leki lub substancje toksyczne w badaniach farmakologicznych lub toksykologicznych.

Podczas gdy mysie PGCLC wykazują silną demetylację DNA w całym genomie, obejmującą przynajmniej częściowo imprinting regionów kontrolnych ^7,19,20, stopień globalnej demetylacji gDNA w hPGCLC wydaje się słabszy niż w mysich PGCLCS lub PGCs ^6,7. Profile transkryptomalne sugerują, że hPGCLC mogą przypominać wcześniejsze stadium embrionalnych PGC niż mysie PGCLC¹⁰. Doniesiono, że przedłużona hodowla EB w warunkach produkcji hPGCLC powodowała zwiększony stopień demetylacji gDNA⁷; jednak to, czy wydłużony okres hodowli hPGCLC w EB lub w izolowanych komórkach może osiągnąć bardziej zaawansowane etapy różnicowania linii zarodkowej, musi zostać określone w przyszłych badaniach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Primed pluripotencja hiPSC culture
Matrigel	Corning	354277	Aliquot Matrigel w objętości wskazanej przez producenta (około 200 μ L). Używaj zimnych rurek. Przechowywać w temperaturze -80 stopni; C
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21041-025	Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	Rozpuszcza się poprzez dodanie 5X Suplementu do podłoża podstawowego. Odtworzone podłoże może być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C przez do 4 tygodnie bez wpływu na wydajność hodowli komórkowych.
Y27632	Axon	1683	Rozcieńczyć 5 mg Y27632 (MW 320,26) z 312,2 μ L wody do przygotowania 50 mM roztworu podstawowego Y27632. Sterylizować przez filtrację (0,22 μ m). Podwielokrotność 20 μ L/tuba x 15 tubek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07930	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Accutase	Innowacyjne technologie komórkowe	AT104-500	Enzym dysocjacji komórek; podwielokrotność 40 ml / probówkę x 12 probówek i przechowywać w temperaturze -20 stopni C.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4i kultura hiPSC
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1286101
Zamiennik serum KnockOut	Thermo Fisher Scientific	10828028	Porcja 40 ml/probówkę x 12 probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Insulina z trzustki bydlęcej	Sigma-Aldrich	I1882-100MG	Dodaj 0,1 ml lodowatego kwasu octowego do 10 ml wody. Sterylizować przez filtrację (0,22 um). Rozcieńczyć 100 mg liofilizowanego proszku insuliny zimnym 10 ml zakwaszonej wody, aby uzyskać 10 mg/ml roztworu podstawowego. Porcja 650 μ L/tuba x 15 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
ludzki LIF	PeproTech	300-05	Repuszcza 250 μ g ludzki LIF z 250 μ L woda. Dodaj 750 μ L 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-) do 250 μ g/ml ludzkiego roztworu podstawowego LIF. Aktywność właściwa tego produktu wynosi >10 000 jednostek/μg. Porcja 40 ul/tuba x 25 probówek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
ludzki FGF2	R& D Systems	4114-TC	Rozpuść 1 mg ludzkiego FGF2 z 5 ml PBS(-) w celu uzyskania 200 μ g/ml ludzkiego roztworu podstawowego FGF2. Podwielokrotność 100 μ L/tuba x 50 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
ludzki TGF-β 1	PeproTech	100-21	Reconstitite 50 μ g z 50 μ L 10 mM kwasu cytrynowego (pH 3,0). Dodaj 150 μ L 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-) do 250 μ g/ml ludzkiego TGF-β 1 roztwór podstawowy. Podwielokrotność 4 μ L/tuba x 50 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
4i podłoże podstawowe			Wymieszaj następujące odczynniki, aby uzyskać podłoże podstawowe 4i. 500 ml KnockOut DMEM 100 ml zamiennika surowicy KnockOut 6 ml penicyliny-streptomycyny-glutaminy (100x) 6 ml roztworu aminokwasów endogennych MEM (100x) 650 &mikro; L 10 mg/ml Insulina z trzustki bydlęcej 40 &mikro; L z 250 i mikro; g/ml ludzkiego LIF 20 i mikro; l z 200 i mikro; g/ml FGF2 4 i mikro; l z 250 i mikro; g/ml ludzkiego TGF-β 1 Podwielokrotności 40 ml/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.
CHIR99021	Axon	1386	Rozpuść 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) z 1791 μ L DMSO do przygotowania 30 mM CHIR99021 roztworu podstawowego. Podwielokrotność 50 μ L/tuba x 35 tubek i przechowywać w temperaturze -20 & deg;C.
PD0325901	Axon	1408	Rekonuść 5 mg PD0325901 (MW 482.19) z 1037 μ L DMSO do przygotowania 10 mM PD0325901 roztworu podstawowego. Podwielokrotność 50 μ L/tuba x 20 probówek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
BIRB796	Axon	1358	Rozpuść 10 mg BIRB796 (MW 527.66) z 948 μ L DMSO do przygotowania 20 mM BIRB796 roztworu podstawowego. Podwielokrotność 50 μ L/tuba x 18 tubek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
SP600125	Tocris	1496	Rozpuść 10 mg SP600125 (MW220.23) z 908 μ L DMSO do przygotowania 50 mM SP600125 roztworu podstawowego. Podwielokrotność 50 μ L/tuba x 18 tubek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
AggreWell400	STEMCELL Technologies	27845	Płytka Microwell
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Rozpuść 5 g Pluronic F-127 w 100 ml wody, aby uzyskać 5% (w/v) roztwór podstawowy Pluronic F127. Sterylizować przez filtrację (0,22 um). Aliqout 50 ml / probówkę x 2 probówki i przechowywać w r.t.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
hPGCLC kultura
Glasgow' s MEM	Thermo Fisher Scientific	11710035
Pirogronian sodu (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Penicylina-Streptomycyna (100x)	Corning	30-002-CI
hPGCLC podłoże podstawowe			Wymieszaj następujące odczynniki, aby uzyskać podłoże podstawowe hPGCLC. 500 ml Glasgow" s MEM 75 ml zamiennika surowicy KnockOut 6 ml roztworu aminokwasów endogennych MEM (100x) 6 ml 100 mM pirogronianu sodu 6 ml penicyliny-streptomycyny (x100) Porcje 40 ml/probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Rozcieńczony 350 μ L 2-merkaptoetanol (14,3 M) w 9,65 ml PBS (-) do otrzymania 500 mM roztworu podstawowego 2-merkaptoetanolu. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4544	Rozpuść 400 mg kwasu L-askorbinowego w 20 ml wody, aby uzyskać 20 mg/ml roztworu podstawowego kwasu L-askorbinowego. Sterylizować przez filtrację (0,22 um). Podwielokrotność 500 μ L/tuba x 40 tubek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Rekombinowany ludzki BMP4	R& Systemy D	314-BP	Rozpuszczają 1 mg rekombinowanego ludzkiego BMP4 z 10 ml 4 mM HCl w ilości 100 & mu; g/ml rekombinowanego ludzkiego roztworu podstawowego BMP4. Podwielokrotność 250 μ L/tuba x 40 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
Ludzki SCF	PeproTech	300-07	Repuszcza 250 μ g ludzki SCF z 500 μ L 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-) do wytworzenia 500 μ g/ml ludzkiego roztworu podstawowego SCF. Podwielokrotność 35 μ L/tuba x 14 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
Ludzki EGF	PeproTech	AF-100-15	Rozpuść 1 mg ludzkiego EGF w 1 ml 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-), aby uzyskać 1 mg / ml ludzkiego roztworu podstawowego EGF. Aliqot 100 μ L/rura x 10 rurek. Rozcieńczyć 100 μ L 1 mg/ml ludzkiego roztworu podstawowego EGF o stężeniu 300 μ L 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-) do 250 μ g/ml roztworu podstawowego humanEGF. Podwielokrotność 20 μ L/rura x 20 rurek. Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
Sitko do komórek	Corning	352340	Wielkość porów = 40 μm.
Rurka stożkowa polipropylenowa 50 ml	Corning	352070
Niska płyta mocująca	Corning	3471
Vari-Mix Platform Rocker	Thermofisher	M79735Q
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Barwienie immunohistochemiczne
BLOXALL Roztwór blokujący	VECTOR	SP-6000
Normal Surowica końska Odczynnik ImmPRESS Anty-Kozioł IgG	VECTOR	MP-7405
OCT-3/4 Przeciwciało	Santa Cruz	SC-8629
ImmPACT WEKTOR DAB		SK-4105
Permount	Thermofisher	SP15-100	Średni montażowy
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Izolujący hPGCLC
Zestaw do dysocjacji ciała zarodkowego	Miltenyi Biotec	130-096-348
Przeciwciało anty-CD38 sprzężone z APC	abcam	ab134399