Artykuł metodologiczny

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

DOI:

10.3791/58298

⸱

23 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulacja epigenetyczna odgrywa kluczową rolę w ekspresji genów. Od czasu odkrycia modyfikacji histonów w latach 60. XX wieku, ich funkcje fizjologiczne i patologiczne są szeroko badane. Rzeczywiście, pojawienie się głębokiego sekwencjonowania nowej generacji i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) za pomocą specyficznych przeciwciał modyfikujących histony zrewolucjonizowało nasze spojrzenie na regulację epigenetyczną w całym genomie. I odwrotnie, tkanki zazwyczaj składają się z różnych typów komórek, a ich złożona mieszanina stanowi wyzwanie analityczne w badaniu epigenomu w określonym typie komórki. Aby zająć się stanem chromatyny specyficznym dla typu komórki w sposób obejmujący cały genom, niedawno opracowaliśmy sekwencjonowanie immunoprecypitacyjne chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), które opiera się na selektywnym oczyszczaniu chromatyny przez znakowane białka histonowe rdzenia z typów komórek będących przedmiotem zainteresowania, a następnie ChIP-Seq. Celem tego protokołu jest wprowadzenie najlepszych praktyk tChIP-Seq. Technika ta zapewnia wszechstronne narzędzie do badania epigenomu specyficznego dla tkanek w różnych modyfikacjach histonów i organizmach modelowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki zwierząt składają się z różnych typów komórek. Regulacja genów w każdej komórce określa typ komórki. Modyfikacje chromatyny - metylacja DNA i modyfikacja histonów - leżą u podstaw specyficzności ekspresji genów dla typu komórki. W związku z tym pomiar regulacji epigenetycznej w każdym typie komórki był pożądany, ale było to wyzwanie techniczne.

Aby zbadać epigenetykę w określonym typie komórki, niedawno opracowano tandemowe sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny (tChIP-Seq) (Rysunek 1)1. W tChIP znakowane epitopami rdzeń histonowy H2B ulega ekspresji z promotora specyficznego dla typu komórki. Ta cecha pozwala na wyizolowanie chromatyny z komórek będących przedmiotem zainteresowania, chociaż materiał zaczyna się od mieszaniny różnych typów komórek. Po ChIP-Seq - oczyszczaniu chromatyny za pomocą zmodyfikowanego znacznika histonowego i głębokim sekwencjonowaniu wyizolowanego DNA nowej generacji - możemy monitorować status epigenetyczny docelowego typu komórki w sposób obejmujący cały genom.

Korzystając z tej techniki, niedawno badaliśmy specyficzną dla neuronów trimetylację białka histonu H3 przy znacznikach lizyny 4 (H3K4me3). W tym badaniu opracowaliśmy mysz typu knock-in, w której białko H2B znakowane C-końcowo FLAG ulegało ekspresji po rekombinacji za pośrednictwem Cre (Rosa26CAG floxed-pA H2B-FLAG). Krzyżując się z myszą posiadającą gen Cre-retikulum endoplazmatycznego (ER) pod kontrolą promotora CamK2a, uzyskana linia myszy indukowała H2B-FLAG w aktywnych neuronach po wstrzyknięciu tamoksyfenu (Camk2a H2B-FLAG)1. Zaczynając od mózgu ustalonej linii myszy, przeprowadziliśmy tChIP-Seq z przeciwciałem anty-H3K4me3. Ponieważ znaczniki H3K4me3 często odpowiadają regionom promotorowym, możemy odkryć setki mRNA specyficznie wyrażanych w neuronach1.

Tutaj opisujemy typową metodę tChIP-Seq, która obejmuje etapy od sekcji tkanek do budowy biblioteki (Rysunek 1). Ostatecznym celem tego protokołu jest podzielenie się naszymi najlepszymi praktykami dotyczącymi wydajności tChIP-Seq i przyszłego zastosowania tej metody do innych typów komórek i modyfikacji histonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody opisane tutaj zostały zatwierdzone przez dział bezpieczeństwa RIKEN (H27-EP071) i przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. Sekcja tkanek

  1. Rozetnij interesujące Cię tkanki na małe kawałki (około <3 mm2) za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych.
    Uwaga: Większe fragmenty tkanek potrzebują więcej czasu na zamrożenie, a mniejsze fragmenty przenoszą większe objętości buforu, co może mieć wpływ na wyniki.
  2. Dodaj wypreparowane fragmenty tkanek do czystego pojemnika wypełnionego ciekłym azotem i zbierz je do probówek o pojemności 2 ml (1 sztuka na probówkę) wypełnionych ciekłym azotem.
    Uwaga: Do tego kroku zalecane są rurki z powierzchnią hydrofilową.
  3. Umieścić probówki w temperaturze -80 °C na > 5 minut z otwartą nakrętką, aby odparować pozostały ciekły azot.
    Uwaga: Po zamknięciu nakrętki fragmenty tkanek można przechowywać w temperaturze -80 °C przez miesiąc przed użyciem.

2. Utrwalenie komórek

Uwaga: Do tego kroku użyliśmy poręcznego młynka kriogenicznego. Można zastosować alternatywną aparaturę.

  1. Umieść probówki o niskiej zawartości białka o niskiej zawartości białka o niskim stopniu wiązania zawierające próbki tkanek na metalowym stojaku na lód schłodzonym w ciekłym azocie.
  2. Umieść metalową kulę w probówce o pojemności 1,5 ml i schłodź ciekłym azotem. Umieść go na metalowym stojaku na lód.
  3. Otwórz probówkę o pojemności 2 ml i umieść w niej schłodzoną metalową kulkę. Zamknij nakrętkę, umieść probówki o pojemności 2 ml w uchwycie probówki poręcznego młynka kriogenicznego i natychmiast zanurz zmontowany uchwyt probówki w ciekłym azocie na 1 minutę.
  4. Włóż uchwyt zamrożonej probówki do zewnętrznej kasety poręcznego młynka kriogenicznego i energicznie potrząsaj 60 razy przez 30 s.
  5. Zdemontować uchwyt probówki, wyjąć metalową kulkę i umieścić probówkę o pojemności 2 ml w chłodziarce do pobierania próbek wstępnie schłodzonej w temperaturze -20 °C.
  6. Umieścić schładzalnik próbki w temperaturze -20 °C na 15 minut, aby zapobiec zamarznięciu utrwalacza w następnym etapie.
  7. Przynieś chłodziarkę do próbek na stół, otwórz pokrywę probówki i natychmiast wlej do niej 900 μl 1% formaldehydu. Po kilkukrotnym pipetowaniu przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 2 ml zawierającej 900 μl 1% formaldehydu i utrwalać na 10 minut, delikatnie obracając, w inkubatorze ustawionym na temperaturę 23 °C.
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i szkodliwy.
  8. Aby zatrzymać reakcję utrwalania, dodać 100 μl 2,5 M glicyny do każdej probówki i odwirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  9. Dodać 1 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwa razy (w sumie 3 prania).
    Uwaga: Utrwalone próbki można błyskawicznie zamrażać ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  10. Dodać 500 μl buforu do lizy 1 (50 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (pH 8,0), 10% m/v glicerolu, 0,5% m/v NP-40, 0,25% w/v Triton X-100 i 0,1x koktajlu inhibitora proteazy) do osadu, odpipetować kilkakrotnie i obracać przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Lysis Buffer 1 należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem.
  11. Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  12. Dodaj 1 ml buforu do lizy 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA i 0,1x koktajl inhibitorów proteazy) do osadu, wiruj i obracaj przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Lysis Buffer 2 należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem.
  13. Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  14. Dodać 800 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) z 1x koktajlem inhibitorów proteazy do osadu i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie.
  15. Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  16. Dodaj 500 μl buforu RIPA z 1x koktajlem inhibitorów proteazy.
  17. Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  18. Dodaj 1 ml buforu RIPA z 1x koktajlem inhibitorów proteazy. Natychmiast przejdź do następnego kroku.

3. Ścinanie chromatyny

  1. Przenieś lizat do probówki sonikatora, a następnie umieść probówkę na ultrasonografie.
  2. Ścinać chromatynę z następującymi ustawieniami: temperatura: 4 °C; szczytowa moc padająca: 175 W; współczynnik wypełnienia: 10%; cykle/seria: 200; i czas: 2,400 s.
  3. Przenieść próbkę do probówki o niskiej zawartości białka o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C.
  4. Zebrać supernatant do nowej probówki białkowej o niskim stopniu wiązania.
    Uwaga: Próbka może być błyskawicznie zamrażana w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80 °C.

4. Kontrola jakości DNA (odwrotne sieciowanie)

  1. Wymieszać 20 μl lizatu i 180 μl buforu elucyjnego ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0) i 1% w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS)) w probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C w termocyklerze przez 6 godzin przy otwartej pokrywie termocyklera. Pokrywę termocyklera należy trzymać otwartą, aby uniknąć nadmiernej denaturacji.
    Uwaga: Bufor elucyjny ChIP należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej przed użyciem. Ta inkubacja może zostać przedłużona do nocy.
  2. Dodać 1 μl 10 mg/ml RNazy A, odwirować i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. Dodać 6,5 μl 15 mg/ml proteinazy K, odwirować i inkubować w temperaturze 55 °C przez 60 minut.
  4. Przenieś reakcję do probówki o niskim poziomie wiązania DNA, dodaj 4 μl glikogenu 5 mg/ml i odwiruj. Następnie dodać 200 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) i wirować przez 5 minut w temperaturze 18 000 x g.
  5. Przenieść supernatant do nowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA. Dodać 200 μl buforu Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) i 200 mM NaCl) do pozostałego roztworu fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego i wirować przez 5 minut przy 18 000 x g w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant i wymieszać z pierwszym supernatantem.
  6. Dodać 900 μl lodowatego etanolu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: Inkubację tę można przedłużyć do 4-6 godzin.
  7. Wirować przez 30 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C.
  8. Odrzucić supernatant. Dodać 1 ml lodowatego 75% etanolu do granulatu i wirować przez 30 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Powtórz ten krok (w sumie dwa prania).
  9. Supernatant należy dokładnie wyrzucić i suszyć na powietrzu przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  10. Dodać 50 μl buforu Tris-EDTA (TE) i rozpuścić DNA, inkubując je w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub w temperaturze 4 °C przez noc. Unikaj wirowania i pipetowania. Zachowaj to DNA jako "dane wejściowe" i użyj go do przygotowania biblioteki, jeśli to konieczne.
  11. Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela Materiałów) i sprawdź rozkład wielkości za pomocą maszyny do elektroforezy mikroprzepływowej (patrz reprezentatywne dane pokazane w Rysunek 2A). Do tego testu użyj 10 ng lub mniej DNA.
    Uwaga: Fragmenty 100–500 par zasad (bp) powinny stanowić 50% lub więcej DNA.

5. Oczyszczanie powinowactwa przez przeciwciało anty-FLAG

Uwaga: Dla neuronów tChIP-Seq, tkanki mózgowe od 8 myszy są zazwyczaj używane do jednej próbki tChIP-Seq do przygotowania 2 ng oczyszczonego DNA przez tandemowe oczyszczanie immunologiczne (patrz Krok 7.1). W naszych rękach 0,1 ng DNA nadal zapewniało wysokiej jakości biblioteki DNA dla ChIP-Seq (Kadota, niepublikowane). Tak więc, w teorii, pojedyncza mysz może wystarczyć do wykonania neuronu tChIP-Seq. Wymagana ilość powinna być zoptymalizowana pod kątem interesującego typu tkanki i komórki. Do kontroli negatywnej eksperymentu z oczyszczaniem imumuno, należy przygotować i użyć lizatu tkanki mózgowej od myszy bez ekspresji H2B-FLAG.

  1. Odpipetować 200 μl kulek magnetycznych sprzężonych z owczą immunoglobuliną przeciw mysim G (IgG) do probówki o niskim poziomie wiązania białka.
  2. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1 minutę, aż supernatant stanie się przezroczysty. Odrzuć supernatant, dodaj 1 ml lodowatego PBS i odwiruj. Powtórz ten krok (w sumie dwa prania).
  3. Dodać 20 μl 1 mg/ml przeciwciała anty-FLAG i obracać przez 5 godzin w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Ta inkubacja może zostać przedłużona do nocy.
  4. Umyj koraliki zgodnie z krokiem 5.2. Umieść koraliki w probówce o pojemności 15 ml.
  5. Ponownie zawiesić kulki w 1110 μl buforu RIPA, a następnie dodać 900 μl 10x odczynnika blokującego, 180 μl 50x roztworu Denhardta, 10 μl 100x koktajlu inhibitorów proteazy i 6,8 ml lizatu przygotowanego w Kroku 3. Podziel tę mieszaninę na 5 probówek o niskim poziomie wiązania białek. Obracać przez 6 godzin w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Ta inkubacja może zostać przedłużona do nocy.
  6. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1 minutę, aż supernatant stanie się przezroczysty. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml buforu RIPA i delikatnie wymieszać. Powtórz ten krok 5 razy (w sumie 6 prań). Połącz wszystkie kulki w jednej probówce o niskim poziomie wiązania białka.
  7. Dodać 200 μl buforu elucyjnego ChIP i obracać przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Należy sprawdzić jakość DNA zgodnie z opisem w kroku 4.11 (patrz reprezentatywne dane pokazane na rysunkach 2B i C). Natychmiast przejdź do następnego kroku.

6. Oczyszczanie powinowactwa za pomocą przeciwciała anty-H3K4me3 i odwrotne sieciowanie

Uwaga: Następujące Kroki przygotowania koralików (6.1–6.4) powinny być wykonane przed Krokiem 5.7.

  1. Odpipetować 40 μl kulek magnetycznych sprzężonych z anty-mysią IgG owiec do probówki o niskim poziomie wiązania 2 ml białka.
  2. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1 minutę, aż supernatant stanie się przezroczysty. Odrzuć supernatant, dodaj 1 ml lodowatego PBS i delikatnie wymieszaj. Powtórz ten krok (w sumie dwa prania).
  3. Dodać 4 μl 1 mg/ml przeciwciała anty-H3K4me3 i obracać przez 6 godzin w temperaturze 4 °C.
  4. Umyj koraliki zgodnie z krokiem 6.2. Umieść kulki w probówce o niskiej zawartości białka o niskiej zawartości białka.
  5. Ponownie zawiesić kulki w 1558 μl buforu RIPA, a następnie dodać 200 μl 10x odczynnika blokującego, 40 μl 50x roztworu Denhardta, 2 μl 100x koktajlu inhibitora proteazy i 200 μl eluatu przygotowanego w kroku 5.7. Obracać przez noc w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: SDS w buforze elucyjnym ChIP został rozcieńczony więcej niż 10 razy w tej inkubacji.
  6. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1 minutę, aż supernatant stanie się przezroczysty. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml buforu RIPA i delikatnie wymieszać. Powtórz ten krok 4 razy (w sumie 5 prań). Po ostatnim praniu przenieś kulki do probówki o niskim poziomie wiązania DNA i wyrzuć supernatant.
  7. Dodać 200 μl buforu elucyjnego ChIP i obracać przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś eluat do nowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA.
    Uwaga: Eluat można przechowywać w temperaturze -80 °C.
  8. Postępuj zgodnie z krokiem 4, aby usunąć sieciowanie DNA. Ponownie zawiesić oczyszczone DNA w 20 μl buforu TE.
  9. Sprawdź jakość DNA zgodnie z opisem w kroku 4.11 (patrz reprezentatywne dane pokazane w Rysunek 2D). (Opcjonalnie) Przeprowadź analizę wzbogacenia metodą ilościowego PCR, jak opisano wcześniej2. Należy zaobserwować dziesięciokrotne lub większe wzbogacenie.

7. Budowa biblioteki

  1. Dla każdego wejścia i próbki DNA ChIP należy obliczyć proporcję DNA w regionie 100–500 pz, korzystając z funkcji analizy rozmazu w oprogramowaniu do elektroforezy mikroprzepływowej. Oszacuj objętość próbki wymaganą do uzyskania 2 ng DNA o masie 100–500 pz. Użyj 20 ng DNA w zakresie 100–500 pz jako próbki "wejściowej".
  2. Pobrać pipetować próbki DNA do 8-paskowych probówek PCR i dodaćH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 μl. (Opcjonalnie) Jeśli objętość DNA przekracza 10 μl, należy proporcjonalnie zwiększyć skalę następującej reakcji naprawy końcowej i wyboru wielkości.
  3. Przygotować mieszankę wzorcową do naprawy końcowej (patrz tabela materiałów). Dodać 4 μl głównej mieszanki końcowej naprawy do DNA i inkubować przez 30 minut w temperaturze 20 °C.
  4. Dodać 36 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 i 0,6x objętość (30 μl) kulek magnetycznych do odwracalnego immobilizacji w fazie stałej (SPRI) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant stanie się przezroczysty.
  6. Przenieść supernatant do nowej probówki, dodać 1,2 razy większą objętość (60 μl) kulek magnetycznych SPRI i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant stanie się przezroczysty.
  8. Umyj koraliki dwukrotnie 200 μl 80% EtOH, trzymając rurkę nadal na magnesie.
  9. Krótko odwiruj probówkę, aby zebrać resztki EtOH na dnie i umieść je z powrotem na magnesie. Dokładnie usunąć resztki EtOH.
  10. Pozostaw pokrywkę probówki otwartą na 1-2 minuty, aby umożliwić odparowanie EtOH.
  11. Zamknij pokrywę i trzymaj probówkę na lodzie.
    Uwaga: Teraz uzyskałeś DNA o wybranej wielkości 100–500 pz na koralikach. Więcej szczegółów na temat wyboru podwójnego rozmiaru można znaleźć na stronie producenta (www.beckman.com).
  12. Przygotować mieszankę wzorcową A-tailing (patrz Tabela Materiałów).
  13. Zawiesić kulki (z etapu 7.10) w 10 μl mieszanki wzorcowej z ogonków A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C.
  14. Dodać 1,8 razy większą objętość (18 μl) roztworu glikolu polietylenowego (PEG)/NaCl i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Wykonaj kroki 7.7-7.11, aby oczyścić DNA.
  16. Przygotować mieszaninę buforową do podwiązywania (patrz tabela materiałów).
  17. Odpipetować 8 μl buforu do ligacji, wymieszać z kulkami (z kroku 7.14), dodać 1 μl adaptera 1 μM i ponownie zawiesić kulki. Użyj 1 μL adaptera 5 μM dla próbki wejściowej. Rozważ użycie różnych adapterów dla każdej próbki do multipleksowania.
  18. Dodać 1 μl ligazy DNA i inkubować przez 15 minut w temperaturze 20 °C.
  19. Dodać 1,0 razy więcej (10 μl) roztworu PEG/NaCl, ponownie zawiesić kulki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  20. Wykonaj kroki 7.7-7.10, aby oczyścić DNA.
  21. Odpipetować 25 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 do probówki i ponownie zawiesić kulki.
  22. Dodać 1,0x objętość (25 μl) roztworu PEG/NaCl i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  23. Wykonaj kroki 7.7-7.10, aby oczyścić DNA.
  24. Odpipetować 11 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 do probówki i ponownie zawiesić kulki.
  25. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant stanie się przezroczysty.
  26. Zebrać supernatant do nowej 8-paskowej probówki do PCR.
  27. Przygotuj główną mieszankę PCR w czasie rzeczywistym (szczegółowe informacje można znaleźć w Materiałach).
  28. Odpipetować 8,5 μl głównej mieszanki PCR w czasie rzeczywistym na 384-dołkowej ilościowej płytce PCR (qPCR) i dodać 1,5 μl zligowanego DNA z adapterem (od kroku 7.26).
  29. Odpipetować 10 μl każdego wzorca fluorescencyjnego w pustych studzienkach.
  30. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym z następującym programem: (98 °C przez 45 s) x 1 cykl, (98 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s) x 20 cykli i (72 °C przez 60 s) x 1 cykl.
  31. Określ liczbę cykli PCR potrzebnych do osiągnięcia intensywności fluorescencji wzorca fluorescencyjnego 2.
  32. Przygotować główną mieszankę PCR (patrz tabela materiałów).
  33. Odpipetować 11,5 μl wzorcowego wzorca PCR wymieszać z pozostałym DNA ligowanym adapterowo (z kroku 7.26) i przeprowadzić PCR zgodnie z krokiem 7.30 z cyklami PCR określonymi w kroku 7.31.
  34. Dodać 1,0x objętość (20 μl) roztworu PEG/NaCl i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  35. Wykonaj kroki 7.7-7.10, aby oczyścić DNA.
  36. Odpipetować 20 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 do probówki i ponownie zawiesić kulki.
  37. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant stanie się przezroczysty.
  38. Zebrać supernatant do nowej probówki o niskim poziomie wiązania 1,5 ml-DNA.
  39. Sprawdź jakość biblioteki zgodnie z opisem w kroku 4.11 (patrz reprezentatywne dane pokazane na rys. 2E i F). Należy użyć 1 μl próbki DNA z biblioteki. (Opcjonalnie) Przeprowadź analizę wzbogacenia za pomocą qPCR, jak opisano wcześniej 2. Należy zaobserwować dziesięciokrotne lub większe wzbogacenie.

8. Sekwencjonowanie

  1. Sekwencjonowanie bibliotek w sekwencerze nowej generacji (patrz reprezentatywne dane pokazane w Rysunek 3).
    Uwaga: Głębokość sekwencji wystarczająca do analizy danych będzie się różnić w zależności od wielkości genomu organizmu3. W przypadku człowieka i myszy zalecamy uzyskanie co najmniej 20-40 milionów odczytów single-end. W zależności od wydajności odczytów, multipleksowanie może być opłacalne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy sekcję tkanek, utrwalanie, lizę komórek, tandemowe oczyszczanie chromatyny i przygotowanie biblioteki DNA dla sekwenatorów nowej generacji. Podczas zabiegów można sprawdzić jakość DNA, która jest kluczem do udanego sekwencjonowania, w wielu krokach (Ryc. 2). Ponieważ pojedynczy nukleosom jest zwykle otoczony DNA o długości 147 pz 4, ścięte DNA nie powinno być krótsze niż ten rozmiar. Natychmiast po ultradźwiękach DNA wyizolowano ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem neuronów mózgu myszy, w których ekspresja H2B znakowanego FLAG jest indukowana przez wstrzyknięcie tamoksyfenu. Promotory używane do ekspresji H2B, wyjściowe materiały tkankowe i ilość tkanek są kluczowymi parametrami dla udanego tChIP-Seq. W związku z tym optymalizację tych czynników należy rozważyć dla każdego typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania.

Krytycznym krokiem wśród procedur stosowanych w tym protokole jest ścinanie DNA w celu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Iwasaki za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były częściowo wspierane przez Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (#26113005 dla S.N. i JP17H05679 dla S.I.); stypendium dla młodych naukowców (A) (JP17H04998 do S.I.) z Ministerstwa Edukacji, Nauki, Sportu i Kultury Japonii (MEXT); oraz Pionierskie Projekty "Ewolucja Komórkowa" i wszystkie projekty RIKEN "Choroba i Epigenom" od RIKEN (do S.N. i S.I.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka białkowa LoBind, 2 mlEppendorfNo  0030108132Do lizy komórek
Białkowa probówka LoBind, 1,5 mlEppendorfNo.  0030108116Do przygotowania ChIP i biblioteki
Probówka DNA LoBind, 1,5 mlEppendorfNo.  0030108051Do przygotowania ChIP i biblioteki
8-paskowa probówka do PCRBIO-BIK3247-00Do przygotowania ChIP i biblioteki
SK MillTOKKENSK-200Poręczny młynek kriogeniczny do wytwarzania proszku komórkowego do utrwalania
Metalowa kulaTOKKENSK-100-DLC10Akcesorium SK Mill
2 ml rurka ze stali nierdzewnejTOKKENTK-AM5-SUSOpcja dla ogniwa liza
2 ml uchwyt na probówkę ze stali nierdzewnejTOKKENSK-100-TLOpcja do lizy komórek
16% formaldehydu (w/v), bez metanoluPierce28906Do utrwalania komórek. Przygotuj 1% roztwór przed użyciem.
GlycineNacalai Tesque17109-35Przygotuj 2,5 M zapas
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Do mycia lizatu i oczyszczonego DNA
HEPESNacalai Tesque02443-05Do buforu do lizy 1. Przygotować 1 M, pH 7,5 bulionu.
5 M NaCl, klasa biologii molekularnejNacalai Tesque06900-14Do buforu do lizy 1, buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, klasa biologii molekularnejWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Do buforu do lizy 1, buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl
GlicerolWako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945Do buforu do lizy 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Do buforu do lizy 1
Triton X-100, klasa biologii molekularnejNacalai Tesque12967-32Do buforu do lizy 1
TrisNacalai Tesque35406-91Do buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl. Przygotować 1 M, wywar o pH 8,0.
0,1 M EGTA pH neutralneNacalai Tesque08947-35Do koktajlu inhibitorów proteazy Lysis Buffer 2
(100x)Nacalai Tesque25955-24Do blokowania degradacji białka
Bufor RIPAThermo Fisher Scientific89900Do lizy i mycia
komórek milliTUBE 1 mL AFA FiberCovaris520130Probówka Sonicator. Akcesorium do skoncentrowanego ultrasonografu
Skoncentrowany ultrasonografCovarisS220 lub E220Aby strawić DNA do odpowiedniej wielkości dla ChIP-Seq
UltraPure 10% SDSThermo Fisher Scientific15553-027Do buforu elucyjnego ChIP
RNaza ANacalai Tesque30141-14Do oczyszczania DNA z lizatu
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCRSigma-Aldrich3115887001Do oczyszczania DNA z lizatu
EtanolWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225Przygotować 70% roztwór
Monoklonalne przeciwciało anty-FLAG M2 wytwarzane u myszySigma-AldrichF1804W celu oczyszczenia chromatyny ulegającej ekspresji w komórkach będących przedmiotem zainteresowania
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgGThermo Fisher Scientific11201DMoże być stosowany do anty-FLAG IP i anty-H3K4me3 IP
Anty-tri-metylowy histon H3 (K4), mysie przeciwciało monoklonalneWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811Każde inne przeciwciało, które działa do analizy ChIP, będzie działać
10x Odczynnik blokującySigma-Aldrich11096176001Do blokowania podczas oczyszczania powinowactwa
Denhardt' s roztwórNacalai Tesque10727-74Do blokowania podczas oczyszczania powinowactwa
Glikogen (5 mg / ml)Thermo Fisher ScientificAM9510Do oczyszczania DNA z lizatu
Fluorometr Qubit 2.0Thermo Fisher ScientificQ32866Do oznaczania ilościowego izolowanego DNA
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851Do ilościowego oznaczania izolowanego DNA
Probówka 0,5 mlAxygen10011-830Do oznaczania ilościowego za pomocą Qubit
Fenol / chloroform / alkohol izoamylowy (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Do oczyszczania DNA z lizatu
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterA63881Koraliki magnetyczne SPRI do przygotowania biblioteki
Metalowy stojak na lódFunakoshiIR-1Aby utrzymać zamrożony
lizat komórkowyChłodziarka do próbekNew England BiolabsT7771SPomaga naprawiać komórki przy minimalnych uszkodzeniach
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BADo sprawdzania jakości izolowanych fragmentów DNA. Można użyć innego analizatora fragmentów.
Bioanalyzer 2100 Expert SoftwareAgilent TechnologiesG2946CAdostarczany z zestawem Bioanalyzer
DNA o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-4626Aby sprawdzić jakość wyizolowanych fragmentów DNA
Zestaw do przygotowania biblioteki KAPA LTPRoche07961898001Dostarczany z 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase i roztworem PEG/NaCl
NEXTflex DNA BarcodesBIOO ScientificNOVA-514101Adapter do przygotowania biblioteki. Dostarczany z adapterami kodów kreskowych DNA i mieszanką podkładów.
Zestaw do wzmacniania biblioteki w czasie rzeczywistym KAPA07959028001dostarczany z 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix i wzorcami fluorescencyjnymi
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602Do przygotowania biblioteki. Dodatkowo enzym ten może być wymagany w zestawie do amplifikacji biblioteki w czasie rzeczywistym KAPA
Buffer EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8,5 do elucji
DNA 386-dołkowa płytka qPCRThermo Fisher Scientific4309849Do PCR w czasie rzeczywistym
QuantStudio 7 Flex System do PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher Scientific4485701Do ilościowego oznaczania
optycznej folii samoprzylepnej DNA MicroAmpThermo Fisher Scientific4311971Do PCR w czasie rzeczywistym
MicroAmp Przezroczysta folia samoprzylepnaThermo Fisher Scientific4306311Do uszczelniania płyt
MieszankaPołącz 1,4 i mikro; L z 10x bufor naprawy końca KAPA, 1 i mikro; L mieszanki enzymów naprawy końców KAPA oraz 1,6 i mikro; L z H2O
A-taling master mixKombajn 1 i mikro; L bufora ogonowego KAPA A, 0,6 i mikro; L enzymu ogoniastego KAPA A oraz 8,4 i mikro; L H2O
buforowa do ligacjiPołącz 2 i mikro; L buforu ligacyjnego KAPA i 6 &mikro; L z H2O
Mistrzowska mieszankaPołącz 5 i mikro; L z 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0,35 i mikro; L mieszanki starterów PCR (10 &mikro; M każdy z przedniego startera AATGATACGGCGACCGAG i odwrotnego startera CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) oraz 3.15 µ L z H2O
PCR master mixPołącz 10 i mikro; L z 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0,9 i mikro; L PCR Primer Mix oraz 0,6 i mikro; L of H2O
Integrative Genomics ViewerBroad InstituteIGV_2.3.88Przeglądarka genomu do wizualizacji danych sekwencjonowania
Olginukleotyd DNA: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′Eurofins GenomicsStarter do amplifikacji regionu promotorowego
olginukleotydu GAPDH DNA: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins GenomicsStarter do amplifikacji regionu promotora GAPDH
SYBR Premix ExTaq TakaraRR420LDo ilościowego określenia DNA odpowiadającego regionowi promotora GADPH
Thermal Cycler DiceTakaraTP870Do ilościowego określenia DNA odpowiadającego regionowi promotora GADPH
Roche główna naprawy końcowej Mieszanka PCR w czasie rzeczywistym

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149(2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunoprecypitacja chromatynymodyfikacja histon wsekcja tkanekmielenie kriogenicznefiksacja formaldehydemsonikacja chromatynyoczyszczanie powinowactwem

Powiązane artykuły