TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Summary

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

Abstract

Regulacja epigenetyczna odgrywa kluczową rolę w ekspresji genów. Od czasu odkrycia modyfikacji histonów w latach 60. XX wieku, ich funkcje fizjologiczne i patologiczne są szeroko badane. Rzeczywiście, pojawienie się głębokiego sekwencjonowania nowej generacji i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) za pomocą specyficznych przeciwciał modyfikujących histony zrewolucjonizowało nasze spojrzenie na regulację epigenetyczną w całym genomie. I odwrotnie, tkanki zazwyczaj składają się z różnych typów komórek, a ich złożona mieszanina stanowi wyzwanie analityczne w badaniu epigenomu w określonym typie komórki. Aby zająć się stanem chromatyny specyficznym dla typu komórki w sposób obejmujący cały genom, niedawno opracowaliśmy sekwencjonowanie immunoprecypitacyjne chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), które opiera się na selektywnym oczyszczaniu chromatyny przez znakowane białka histonowe rdzenia z typów komórek będących przedmiotem zainteresowania, a następnie ChIP-Seq. Celem tego protokołu jest wprowadzenie najlepszych praktyk tChIP-Seq. Technika ta zapewnia wszechstronne narzędzie do badania epigenomu specyficznego dla tkanek w różnych modyfikacjach histonów i organizmach modelowych.

Introduction

Tkanki zwierząt składają się z różnych typów komórek. Regulacja genów w każdej komórce określa typ komórki. Modyfikacje chromatyny - metylacja DNA i modyfikacja histonów - leżą u podstaw specyficzności ekspresji genów dla typu komórki. W związku z tym pomiar regulacji epigenetycznej w każdym typie komórki był pożądany, ale było to wyzwanie techniczne.

Aby zbadać epigenetykę w określonym typie komórki, niedawno opracowano tandemowe sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny (tChIP-Seq) (Rysunek 1)¹. W tChIP znakowane epitopami rdzeń histonowy H2B ulega....

Protocol

Wszystkie metody opisane tutaj zostały zatwierdzone przez dział bezpieczeństwa RIKEN (H27-EP071) i przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. Sekcja tkanek

1. Rozetnij interesujące Cię tkanki na małe kawałki (około <3 mm²) za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych.
   Uwaga: Większe fragmenty tkanek potrzebują więcej czasu na zamrożenie, a mniejsze fragmenty przenoszą większe objętości buforu, co może mieć wpływ na wyniki.
2. Dodaj wypreparowane fragmenty tkanek do czystego pojemnika wypełnionego ciekłym azotem i zbierz je do probówek o pojemności 2 ml (1 sztuka na probówkę) wypełnionych ....

Results

Tutaj opisujemy sekcję tkanek, utrwalanie, lizę komórek, tandemowe oczyszczanie chromatyny i przygotowanie biblioteki DNA dla sekwenatorów nowej generacji. Podczas zabiegów można sprawdzić jakość DNA, która jest kluczem do udanego sekwencjonowania, w wielu krokach (Ryc. 2). Ponieważ pojedynczy nukleosom jest zwykle otoczony DNA o długości 147 pz ⁴, ścięte DNA nie powinno być krótsze niż ten rozmiar. Natychmiast po ultradźwiękach DNA wyizolowano .......

Discussion

Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem neuronów mózgu myszy, w których ekspresja H2B znakowanego FLAG jest indukowana przez wstrzyknięcie tamoksyfenu. Promotory używane do ekspresji H2B, wyjściowe materiały tkankowe i ilość tkanek są kluczowymi parametrami dla udanego tChIP-Seq. W związku z tym optymalizację tych czynników należy rozważyć dla każdego typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania.

Krytycznym krokiem wśród procedur stosowanych w tym protokole jest ścinanie DNA w celu .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka białkowa LoBind, 2 ml	Eppendorf	No  0030108132	Do lizy komórek
Białkowa probówka LoBind, 1,5 ml	Eppendorf	No.  0030108116	Do przygotowania ChIP i biblioteki
Probówka DNA LoBind, 1,5 ml	Eppendorf	No.  0030108051	Do przygotowania ChIP i biblioteki
8-paskowa probówka do PCR	BIO-BIK	3247-00	Do przygotowania ChIP i biblioteki
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Poręczny młynek kriogeniczny do wytwarzania proszku komórkowego do utrwalania
Metalowa kula	TOKKEN	SK-100-DLC10	Akcesorium SK Mill
2 ml rurka ze stali nierdzewnej	TOKKEN	TK-AM5-SUS	Opcja dla ogniwa liza
2 ml uchwyt na probówkę ze stali nierdzewnej	TOKKEN	SK-100-TL	Opcja do lizy komórek
16% formaldehydu (w/v), bez metanolu	Pierce	28906	Do utrwalania komórek. Przygotuj 1% roztwór przed użyciem.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Przygotuj 2,5 M zapas
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	Do mycia lizatu i oczyszczonego DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	Do buforu do lizy 1. Przygotować 1 M, pH 7,5 bulionu.
5 M NaCl, klasa biologii molekularnej	Nacalai Tesque	06900-14	Do buforu do lizy 1, buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, klasa biologii molekularnej	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	Do buforu do lizy 1, buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl
Glicerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	Do buforu do lizy 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	Do buforu do lizy 1
Triton X-100, klasa biologii molekularnej	Nacalai Tesque	12967-32	Do buforu do lizy 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	Do buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl. Przygotować 1 M, wywar o pH 8,0.
0,1 M EGTA pH neutralne	Nacalai Tesque	08947-35	Do koktajlu inhibitorów proteazy Lysis Buffer 2
(100x)	Nacalai Tesque	25955-24	Do blokowania degradacji białka
Bufor RIPA	Thermo Fisher Scientific	89900	Do lizy i mycia
komórek milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Probówka Sonicator. Akcesorium do skoncentrowanego ultrasonografu
Skoncentrowany ultrasonograf	Covaris	S220 lub E220	Aby strawić DNA do odpowiedniej wielkości dla ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	Do buforu elucyjnego ChIP
RNaza A	Nacalai Tesque	30141-14	Do oczyszczania DNA z lizatu
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR	Sigma-Aldrich	3115887001	Do oczyszczania DNA z lizatu
Etanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Przygotować 70% roztwór
Monoklonalne przeciwciało anty-FLAG M2 wytwarzane u myszy	Sigma-Aldrich	F1804	W celu oczyszczenia chromatyny ulegającej ekspresji w komórkach będących przedmiotem zainteresowania
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	Może być stosowany do anty-FLAG IP i anty-H3K4me3 IP
Anty-tri-metylowy histon H3 (K4), mysie przeciwciało monoklonalne	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Każde inne przeciwciało, które działa do analizy ChIP, będzie działać
10x Odczynnik blokujący	Sigma-Aldrich	11096176001	Do blokowania podczas oczyszczania powinowactwa
Denhardt' s roztwór	Nacalai Tesque	10727-74	Do blokowania podczas oczyszczania powinowactwa
Glikogen (5 mg / ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	Do oczyszczania DNA z lizatu
Fluorometr Qubit 2.0	Thermo Fisher Scientific	Q32866	Do oznaczania ilościowego izolowanego DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Do ilościowego oznaczania izolowanego DNA
Probówka 0,5 ml	Axygen	10011-830	Do oznaczania ilościowego za pomocą Qubit
Fenol / chloroform / alkohol izoamylowy (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	Do oczyszczania DNA z lizatu
Koraliki AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Koraliki magnetyczne SPRI do przygotowania biblioteki
Metalowy stojak na lód	Funakoshi	IR-1	Aby utrzymać zamrożony
lizat komórkowyChłodziarka do próbek	New England Biolabs	T7771S	Pomaga naprawiać komórki przy minimalnych uszkodzeniach
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Do sprawdzania jakości izolowanych fragmentów DNA. Można użyć innego analizatora fragmentów.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	dostarczany z zestawem Bioanalyzer
DNA o wysokiej czułości	Agilent Technologies	5067-4626	Aby sprawdzić jakość wyizolowanych fragmentów DNA
Zestaw do przygotowania biblioteki KAPA LTP	Roche	07961898001	Dostarczany z 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase i roztworem PEG/NaCl
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter do przygotowania biblioteki. Dostarczany z adapterami kodów kreskowych DNA i mieszanką podkładów.
Zestaw do wzmacniania biblioteki w czasie rzeczywistym KAPA		07959028001	dostarczany z 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix i wzorcami fluorescencyjnymi
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	Do przygotowania biblioteki. Dodatkowo enzym ten może być wymagany w zestawie do amplifikacji biblioteki w czasie rzeczywistym KAPA
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8,5 do elucji
DNA 386-dołkowa płytka qPCR	Thermo Fisher Scientific	4309849	Do PCR w czasie rzeczywistym
QuantStudio 7 Flex System do PCR w czasie rzeczywistym	Thermo Fisher Scientific	4485701	Do ilościowego oznaczania
optycznej folii samoprzylepnej DNA MicroAmp	Thermo Fisher Scientific	4311971	Do PCR w czasie rzeczywistym
MicroAmp Przezroczysta folia samoprzylepna	Thermo Fisher Scientific	4306311	Do uszczelniania płyt
Mieszanka			Połącz 1,4 i mikro; L z 10x bufor naprawy końca KAPA, 1 i mikro; L mieszanki enzymów naprawy końców KAPA oraz 1,6 i mikro; L z H2O
A-taling master mix			Kombajn 1 i mikro; L bufora ogonowego KAPA A, 0,6 i mikro; L enzymu ogoniastego KAPA A oraz 8,4 i mikro; L H2O
		buforowa do ligacji	Połącz 2 i mikro; L buforu ligacyjnego KAPA i 6 &mikro; L z H2O
Mistrzowska mieszanka			Połącz 5 i mikro; L z 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0,35 i mikro; L mieszanki starterów PCR (10 &mikro; M każdy z przedniego startera AATGATACGGCGACCGAG i odwrotnego startera CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) oraz 3.15 µ L z H2O
PCR master mix			Połącz 10 i mikro; L z 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0,9 i mikro; L PCR Primer Mix oraz 0,6 i mikro; L of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Przeglądarka genomu do wizualizacji danych sekwencjonowania
Olginukleotyd DNA: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		Starter do amplifikacji regionu promotorowego
olginukleotydu GAPDH DNA: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		Starter do amplifikacji regionu promotora GAPDH
SYBR Premix Ex	Taq Takara	RR420L	Do ilościowego określenia DNA odpowiadającego regionowi promotora GADPH
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	Do ilościowego określenia DNA odpowiadającego regionowi promotora GADPH