Method Article

Bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego

DOI:

10.3791/58305

⸱

November 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Cambridge, 2Department of Physics, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół do bezznacznikowej identyfikacji podtypów limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego i algorytmu uczenia maszynowego. Pomiary tomogram 3D indeksu refrakcji limfocytów prezentują informacje morfologiczne i biochemiczne 3D dla poszczególnych komórek, które są następnie analizowane za pomocą algorytmu uczenia maszynowego w celu identyfikacji typów komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj protokół do bezznacznikowej identyfikacji podtypów limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego. Identyfikacja podtypów limfocytów jest ważna dla badań immunologicznych, a także diagnostyki i leczenia różnych chorób. Obecnie standardowe metody klasyfikacji typów limfocytów opierają się na znakowaniu określonych białek błonowych poprzez reakcje antygen-przeciwciało. Jednak te techniki etykietowania niosą ze sobą potencjalne ryzyko zmiany funkcji komórkowych. Opisany tutaj protokół pokonuje te wyzwania, wykorzystując wewnętrzne kontrasty optyczne mierzone za pomocą ilościowego obrazowania fazowego 3D i algorytmu uczenia maszynowego. Pomiar tomogramów 3D współczynnika załamania światła (RI) limfocytów dostarcza ilościowych informacji na temat morfologii 3D i fenotypów poszczególnych komórek. Parametry biofizyczne wyodrębnione z mierzonych tomogramów 3D RI są następnie analizowane ilościowo za pomocą algorytmu uczenia maszynowego, co umożliwia bezznacznikową identyfikację typów limfocytów na poziomie pojedynczej komórki. Mierzymy tomogramy 3D RI limfocytów T B, CD4+ T i CD8+ i zidentyfikowaliśmy ich typy komórek z ponad 80% dokładnością. W tym protokole opisujemy szczegółowe etapy izolacji limfocytów, ilościowego obrazowania fazowego 3D i uczenia maszynowego w celu identyfikacji typów limfocytów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfocyty można podzielić na różne podtypy, w tym B, pomocnicze (CD4+) T, cytotoksyczne (CD8+) T i regulatorowe limfocyty T. Każdy typ limfocytów odgrywa inną rolę w adaptacyjnym układzie odpornościowym; na przykład limfocyty B wytwarzają przeciwciała, podczas gdy limfocyty T wykrywają specyficzne antygeny, eliminują nieprawidłowe komórki i regulują limfocyty B. Funkcja i regulacja limfocytów jest ściśle kontrolowana i związana z różnymi chorobami, w tym nowotworami1, chorobami autoimmunologicznymi2 i infekcjami wirusowymi3. Dlatego identyfikacja typów limfocytów jest ważna, aby zrozumieć ich patofizjologiczne role w takich chorobach i immunoterapii w klinikach.

Obecnie, metody klasyfikacji typów limfocytów opierają się na reakcjach antygen-przeciwciało, celując w specyficzne białka błony powierzchniowej lub markery powierzchniowe4. Celowanie w markery powierzchniowe jest precyzyjną i dokładną metodą określania typów limfocytów. Wymaga to jednak drogich odczynników i czasochłonnych procedur. Ponadto niesie ze sobą ryzyko modyfikacji struktur białek błonowych i zmiany funkcji komórkowych.

Aby sprostać tym wyzwaniom, opisany tutaj protokół wprowadza bezznacznikową identyfikację typów limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego 3D (QPI) i uczenia maszynowego5. Metoda ta umożliwia klasyfikację typów limfocytów na poziomie pojedynczej komórki na podstawie informacji morfologicznych uzyskanych z bezznacznikowego obrazowania 3D poszczególnych limfocytów. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik mikroskopii fluorescencyjnej, QPI wykorzystuje rozkłady indeksu refrakcji (RI) (wewnętrzne właściwości optyczne żywych komórek i tkanek) jako kontrast optyczny6,7. Tomogramy RI poszczególnych limfocytów reprezentują informacje fenotypowe specyficzne dla podtypów limfocytów. W tym przypadku, aby systemowo wykorzystać tomogramy 3D RI poszczególnych limfocytów, wykorzystano nadzorowany algorytm uczenia maszynowego.

Korzystając z różnych technik QPI, tomogramy 3D RI komórek były aktywnie wykorzystywane do badania patofizjologii komórek, ponieważ zapewniają one możliwość obrazowania ilościowego bez znaczników8,9,10,11,12,13. Ponadto rozkłady 3D RI poszczególnych komórek mogą dostarczać morfologicznych, biochemicznych i biomechanicznych informacji o komórkach. Tomogramy 3D RI były wcześniej wykorzystywane w dziedzinach hematologii14,15,16,17, choroby zakaźne18,19,20, immunologia21, biologia komórki22,23, zapalenie24, cancer25, neuroscience26,27, biologia rozwojowa28, toxicology29, and microbiology12,30,31,32.

Chociaż tomogramy 3D RI dostarczają szczegółowych informacji morfologicznych i biochemicznych komórek, klasyfikacja podtypów limfocytów jest trudna do osiągnięcia poprzez proste obrazowanie tomogramów 3D RI5. Aby systematycznie i ilościowo wykorzystać zmierzone tomogramy 3D RI do klasyfikacji typów komórek, wykorzystaliśmy algorytm uczenia maszynowego. Ostatnio opisano kilka prac, w których analizowano ilościowe obrazy fazowe komórek za pomocą różnych algorytmów uczenia maszynowego33, w tym wykrywanie mikroorganizmów34, klasyfikacja rodzaju bakteryjnego35,36, szybkie i bezznacznikowe wykrywanie zarodników wąglika37, automatyczna analiza plemników38, analiza raka cells39,40, oraz wykrywanie aktywacji makrofagów41.

Ten protokół zawiera szczegółowe kroki do przeprowadzenia bezznacznikowej identyfikacji typów limfocytów na poziomie poszczególnych komórek za pomocą 3D QPI i uczenia maszynowego. Obejmuje to: 1) izolację limfocytów z krwi myszy, 2) sortowanie limfocytów za pomocą cytometrii przepływowej, 3) QPI 3D, 4) ilościową ekstrakcję cech z tomogramów 3D RI oraz 5) nadzorowane uczenie się w celu identyfikacji typów limfocytów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt KAIST (KA2010-21, KA2014-01 i KA2015-03). Wszystkie eksperymenty w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

1. Izolacja limfocytów z krwi myszy

  1. Po uśpieniu myszy C57BL/6J poprzez inhalację CO2 należy wprowadzić igłę 26-G do serca myszy i pobrać 0,3 ml krwi. Bezpośrednio umieścić krew w probówce ze 100 j./ml roztworu heparyny rozcieńczonym 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    UWAGA: Alternatywnie można wyizolować limfocyty ze śledziony.
  2. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 0,5 ml buforu lizującego chlorek amonu i potas do probówki i delikatnie odwrócić go kilka razy, aby wymieszać roztwór.
  4. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
  5. Przemyć komórki, dodając 4,5 ml PBS i dwukrotnie odwirowując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl świeżej pożywki RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  7. Dodać 0,1 μg przeciwciała CD16/32 (2,4G2) do probówki w celu zablokowania.
  8. Trzymaj probówkę na lodzie.

2. Cytometria przepływowa i sortowanie podtypów limfocytów

UWAGA: Sortowanie limfocytów w zależności od typu komórki jest niezbędne do ustalenia podstawowych (tj. prawidłowych) etykiet typów komórek do trenowania i testowania klasyfikatora typów komórek w nadzorowanym uczeniu. Cytometria przepływowa, złoty standard, służy do identyfikacji i rozdzielania limfocytów42.

  1. Przygotować mieszaninę przeciwciał barwiących markery powierzchniowe w 100 μl świeżej pożywki RPMI-1640 [z 10% FBS, 0,1 μg CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) i NK1.1 (PK136)] oraz 0,25 μg przeciwciał CD4 (GK1,5) do docelowych limfocytów T, B, CD4+ i CD8+
    2. .
  2. Dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał do zawiesiny komórek (otrzymanej w kroku 1.8).
  3. Inkubować przez 25 minut na lodzie.
  4. Przemyć komórki, dodając 5 ml PBS i dwukrotnie odwirowując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżej pożywki RPMI-1640 z 10% FBS i 2,5 μg DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol).
  6. Zebrać każdy typ limfocytów oddzielnie za pomocą cytometrii przepływowej, używając poziomów fluorescencji markerów opisanych powyżej. Jednocześnie wykluczaj martwe komórki za pomocą sygnałów DAPI.
    UWAGA: Szczegółowe protokoły dotyczące sortowania komórek na podstawie cytometrii przepływowej zostały opisane wcześniej42.

3. 3D Ilościowe obrazowanie fazowe

  1. Trzymaj posortowane limfocyty na lodzie przez cały czas trwania procedur obrazowania, które powinny zostać zakończone w ciągu 5 godzin (od momentu izolacji limfocytów od myszy), aby uniknąć uszkodzenia komórek i zmian biochemicznych.
  2. Wybierz posortowany typ komórek (spośród limfocytów T B, CD4+ T i CD8+) i rozcieńczyć próbkę (uzyskaną w kroku 2.6) do 180 komórek/μl za pomocą pożywki RPMI w celu uzyskania optymalnych warunków obrazowania (tj. jedna komórka na pojedyncze pole widzenia).
  3. Załadować 120 μl rozcieńczonej próbki do komory obrazowania przez powolne wstrzykiwanie. Dokładnie sprawdzić obecność pęcherzyków w komorze obrazowania z próbką. Jeśli są bąbelki, ostrożnie je usuń, ponieważ pogorszą jakość pomiarów.
  4. Uzyskaj tomogramy 3D RI za pomocą komercyjnego ilościowego mikroskopu fazowego 3D lub holotomografii oraz oprogramowania do obrazowania.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat konfiguracji eksperymentalnej można znaleźć w oryginalnym manuskrypcie5.
    1. Umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu mikroskopu.
    2. Umieść komorę obrazowania z próbką na stoliku translacyjnym mikroskopu i dostosuj jej położenie tak, aby próbka zrównała się z soczewką obiektywu.
    3. Dostosuj pozycje osiowe soczewek obiektywu i kondensora, klikając odpowiednio Ostrość i Powierzchnia na karcie "Kalibracja" perspektywy "Mikroskop" w oprogramowaniu do obrazowania.
    4. Wyrównaj soczewki obiektywu i kondensatora, klikając przycisk Auto Mode (Tryb automatyczny). Możesz też użyć trybu skanowania i ręcznie wyregulować soczewki tak, aby wzorce oświetlenia były zlokalizowane w centralnym obszarze pola widzenia.
    5. Wróć do trybu normalnego i dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w polu widzenia.
    6. Znajdź płaszczyznę ogniskowej, regulując położenie osiowe soczewki obiektywu. Idealne ogniskowanie sprawia, że granica próbki wizualizowana na ekranie jest prawie niewidoczna.
    7. Dostosuj etap tłumaczenia, aby znaleźć lokalizację bez komórki.
    8. Kliknij przycisk Kalibruj, aby zmierzyć wiele hologramów 2D o różnych kątach oświetlenia.
    9. Dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w środku pola widzenia.
    10. Przejdź do zakładki "Akwizycja" i kliknij Migawka 3D, aby zmierzyć hologramy komórki o identycznych kątach oświetlenia, jak w kroku 3.4.8.
    11. Gdy pozyskane dane zostaną przedstawione w panelu "Zarządzanie danymi", kliknij prawym przyciskiem myszy na pozyskane dane i kliknij Procesuj, aby zrekonstruować tomogram 3D RI z hologramów zmierzonych w krokach 3.4.8 i 3.4.10, przy użyciu algorytmu tomografii dyfrakcyjnej9,10 zaimplementowanego w oprogramowaniu do obrazowania.
    12. Powtórz kroki 3.4.5-3.4.11, aby zmierzyć więcej niż 100 komórek, aby zapewnić moc statystyczną dla uczenia maszynowego.
    13. Wszystkie obrazy, które są przetwarzane w kroku 3.4.11, mogą być wizualizowane. W panelu "Zarządzanie danymi" kliknij dane prawym przyciskiem myszy i kliknij polecenie Otwórz, aby je zwizualizować. Kliknij RI Tomogram w panelu "Menedżer danych". Na karcie "Preset" kliknij Załaduj i kliknij dwukrotnie "lymphocyte.xml", która jest predefiniowaną funkcją transferu dostarczaną przez oprogramowanie do obrazowania w celu wizualizacji tomogramu zgodnie z rozkładami 3D RI.
  5. Powtórz kroki 3.2-3.4, aby zmierzyć tomogramy 3D RI wszystkich podtypów limfocytów.

4. Ilościowa ekstrakcja cech morfologicznych i biochemicznych z tomogramów 3D RI

  1. Umieść wszystkie zmierzone powyżej dane tomograficzne w jednym folderze. Podziel typy komórek w podfolderach tego folderu. Przygotuj każdy tomogram tak, aby był pojedynczym plikiem .mat.
  2. Otwórz plik uzupełniający 1 — wyodrębnianie cech (napisany dla oprogramowania do przetwarzania obrazu).
  3. Edytuj wiersz 14, aby oznaczyć folder tomogramu przygotowany w kroku 4.1.
  4. Edytuj wiersz 15, aby wyznaczyć folder do zapisywania wyodrębnionych danych elementu.
  5. Opcjonalnie edytuj wiersz 17, aby dostosować parametry progu wystąpień zarezerwowanych dla wyodrębniania obiektów. Opcja domyślna to 20 progów wystąpień zarezerwowanych od 1,340 do 1,378, z przyrostem 0,002, zgodnie z wcześniejszym opisem5.
  6. Wykonaj kod. Dla każdego tomogramu w zbiorze danych kod oblicza pięć cech: pole powierzchni (SA), objętość komórkowa (CV), sferyczność (SI), gęstość białka (PD) i suchą masę (DM), na próg RI. Szczegółowe algorytmy wyodrębniania cech są opisane w innym miejscu5.
  7. Aby monitorować wyodrębnianie cech, podczas wykonywania sprawdź na ekranie wizualizację segmentacji komórek opartej na progach RI.
  8. Sprawdź wyodrębnione dane elementu, jako plik .mat na tomogram, zapisany w folderze wskazanym w kroku 4.4.

5. Nadzorowane uczenie i identyfikacja

  1. Losowo podziel dane funkcji uzyskane w kroku 4.8 na zestawy treningowe (70%) i testowe (30%) z oddzielnymi folderami.
  2. Otwórz plik uzupełniający 2 - Pociąg (napisany dla oprogramowania do przetwarzania obrazu).
  3. Edytuj wiersz 14, aby oznaczyć zestaw treningowy przygotowany w kroku 5.1.
  4. Edytuj wiersz 16, aby wyznaczyć folder do zapisania wytrenowanego klasyfikatora.
  5. Edytuj wiersz 17, aby ustawić nazwę pliku dla klasyfikatora.
  6. Opcjonalnie edytuj wiersz 19, aby wybrać funkcje do trenowania. Domyślna opcja, określona wcześniej5, została użyta do uzyskania reprezentatywnych wyników poniżej.
  7. Wykonaj kod. Korzystając z wybranych funkcji zestawu treningowego, kod trenuje klasyfikator za pomocą algorytmu k-najbliższego sąsiada (k-NN; k = 4), a następnie zapisuje klasyfikator (zgodnie z nazwą w kroku 5.5) w folderze wyznaczonym w kroku 5.4.
  8. Sprawdź na ekranie wizualizację wydajności klasyfikatora i dokładności krzyżowej walidacji.
  9. Opcjonalnie trenuj wiele klasyfikatorów z różnymi kombinacjami funkcji, powtarzając kroki 5.5–5.7. Następnie wybierz klasyfikator o najwyższej dokładności krzyżowej walidacji.
  10. Otwórz plik uzupełniający 3 — test (napisany dla oprogramowania do przetwarzania obrazu).
  11. Edytuj wiersze 14-15, aby wyznaczyć wyszkolony klasyfikator do przetestowania.
  12. Edytuj wiersz 17, aby oznaczyć zestaw testowy przygotowany w kroku 5.1.
  13. Wykonaj kod. Opisany powyżej klasyfikator identyfikuje typy komórek poszczególnych limfocytów w zbiorze testowym.
  14. Sprawdź na ekranie, wizualizując wydajność identyfikacji i dokładność testu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje schematyczny proces całego protokołu. Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, wyizolowaliśmy limfocyty B (n = 149), CD4+ T (n = 95) i CD8+ T (n = 112). Aby uzyskać informacje o fazie i amplitudzie przy różnych kątach oświetlenia, zmierzono wiele hologramów 2D każdego limfocytu, zmieniając kąt oświetlenia (od -60° do 60°). Zazwyczaj do rekonstrukcji tomogramu 3D RI można użyć 50 hologramów, ale liczba hologramów 2D może być dostoso...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół, który umożliwia bezznacznikową identyfikację typów limfocytów z wykorzystaniem ilościowego obrazowania fazowego 3D i uczenia maszynowego. Krytycznymi etapami tego protokołu są ilościowe obrazowanie fazowe i wybór cech. Aby uzyskać optymalne obrazowanie holograficzne, gęstość komórek powinna być kontrolowana w sposób opisany powyżej. Stabilność mechaniczna ogniw jest również ważna dla uzyskania precyzyjnego rozkładu RI 3D, ponieważ pływające lub wibracyjne ruchy komórkowe zakłócają pomiary hologram...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prof. Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim i S. Lee mają udziały finansowe w Tomocube, Inc., firmie, która komercjalizuje optyczne instrumenty do tomografii dyfrakcyjnej i ilościowego obrazowania fazowego i jest jednym ze sponsorów prac.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program KAIST BK21+, Tomocube, Inc. i Narodową Fundację Badawczą Korei (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K000396). Y. Jo dziękuje za wsparcie ze strony Stypendium Prezydenckiego KAIST i Stypendium Nauk Biomedycznych Fundacji Asan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MyszDaehan BiolinkC57BL/6J Dopasowany do płci i wieku, 6 i ndash; 8 tygodni
Stożkowa probówka wirówkowa FalconThermoFisher Scientific14-959-53A15 ml
soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Sigma-Aldrich806544-500ML
Bufor lizujący chlorek amonu i potas ThermoFisher ScientificA1049201
RPMI-1640 pożywkaSigma-AldrichR8758
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher Scientific10438018
PrzeciwciałoBD Biosciences553140 (RRID:AB_394655)CD16/32 (klon 2.4G2)
PrzeciwciałoBD Biosciences555275 (RRID:AB_395699)CD3ε (klon 17A2)
PrzeciwciałoBiolegnd100734 (RRID:AB_2075238)CD8α (Klon 53-6.7)
PrzeciwciałoBD Biosciences557655 (RRID:AB_396770)CD19 (klon 1D3)Przeciwciało
BD Biosciences557683 (RRID:AB_396793)CD45R/B220 (klon RA3-6B2)Przeciwciało
BD Biosciences552878 (RRID:AB_394507)NK1.1 (klon PK136)
PrzeciwciałoeBioscience11-0041-85 (RRID:AB_464893)CD4 (klon GK1.5)
DAPI Roche102362760014,6-diamidino-2-fenyloindol
Cytometria przepływowa BD BiosciencesAria II lub III 
Komora obrazowaniaTomocube, Inc.Holotomografia TomoDish
Tomocube, Inc.HT-1H
Oprogramowanie do obrazowania holotomografiiTomocube, Inc.obrazu TomoStudio
MathWorksMatlab R2017b
Oprogramowanie do wyznawania

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503(2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14(2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328(2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009(2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256(2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827(2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869(2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815(2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210(2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090(2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606(2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546(2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005(2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lymphocyte SubtypesQuantitative Phase ImagingMachine Learning3D Refractive IndexLabel Free IdentificationLymphocyte IsolationFeature ExtractionK Nearest NeighborSingle Cell AnalysisCell Classification

Related Articles