Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58307

⸱

3 października 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wesleyan University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół beztlenowego oczyszczania białek, koncentracji białka beztlenowego i późniejszej charakterystyki kinetycznej za pomocą systemu elektrod tlenowych. Metodę zilustrowano przy użyciu enzymu DesB, enzymu dioksygenazy, który jest bardziej stabilny i aktywny, gdy jest oczyszczany i przechowywany w środowisku beztlenowym.

Streszczenie

Białka wrażliwe na tlen, w tym enzymy, które wykorzystują tlen jako substrat, mogą mieć zmniejszoną stabilność podczas oczyszczania przy użyciu tradycyjnych metod oczyszczania tlenowego. Niniejszy manuskrypt ilustruje szczegóły techniczne związane z procesem oczyszczania beztlenowego, w tym przygotowanie i odczynników, metody chromatografii kolumnowej w komorze rękawicowej oraz odsalanie białka przed kinetyką. Opisano również metody przygotowania i wykorzystania elektrody tlenowej do przeprowadzenia kinetycznej charakterystyki enzymu wykorzystującego tlen. Metody te zilustrowano przy użyciu enzymu dioksygenazy DesB, dioksygenazy galusnowej z bakterii Sphingobium sp. szczep SYK-6.

Wprowadzenie

Enzymy, które wykorzystują żelazo lub inne metale do aktywacji tlenu, są często podatne na inaktywację podczas procesu oczyszczania, ponieważ są usuwane ze środowiska redukującego komórkę. Dlatego białka te muszą być używane jako lizaty komórkowe, poddawane działaniu zewnętrznych środków redukujących lub oczyszczane beztlenowo, aby zapewnić optymalną aktywność enzymatyczną1,2,3,4. W przypadku enzymów, które są wrażliwe na tlen (w szczególności enzymów zawierających żelazo), przeprowadzenie wszystkich etapów oczyszczania i charakterystyki przy jednoczesnym utrzymaniu warunków beztlenowych jest konieczne ich pełne scharakteryzowanie. To skłoniło naukowców do opracowania całych zestawów laboratoryjnych w obrębie komór beztlenowych do badań od ekspresji białek po krystalografię5,6,7,8.

Niniejszym opisujemy metody beztlenowego oczyszczania i kinetycznej charakterystyki enzymu DesB za pomocą systemu elektrod tlenowych. DesB to dioksygenaza galusnowa z bakterii Sphingobium sp. szczep SYK-6, która jest spokrewniona z LigAB, dioksygenazą protokatechianową z tego samego organizmu. Oba enzymy należą do nadrodziny dioksygenazy protokatechuatowej typu II (PCAD), która do tej pory nie została dokładnie przebadana9, prawdopodobnie częściowo ze względu na podatność enzymów z tej nadrodziny na inaktywację po oczyszczeniu przy użyciu standardowych metod tlenowego oczyszczania białek. Ponieważ niektóre enzymy PCAD wykazują rozwiązłość substratów, podczas gdy inne są specyficzne dla substratu2,10, dalsza charakterystyka tej nadrodziny jest konieczna w celu zidentyfikowania determinantów specyficzności. Jak zaobserwowano w kilku nadrodzinach enzymów11,12,13,14,15, małe cząsteczki mogą zmieniać aktywność poprzez bezpośrednie hamowanie konkurencji lub wiązanie cząsteczek w oddzielne kieszenie allosteryczne, co powoduje wzrost lub spadek aktywności enzymatycznej16. Chociaż sama kinetyka nie jest w stanie zróżnicować miejsca wiązania modulatora, określenie wielkości zmiany aktywności jest ważne dla zrozumienia efektów. W związku z tym przedstawiono metody kinetycznej charakterystyki natywnej aktywności DesB i jej aktywności w obecności 4-nitrokatecholu (4NC), związku powszechnie stosowanego do charakteryzowania i hamowania enzymów dioksygenazy2,17,18.

DesB jest w stanie rozbić galusan, związek aromatyczny pochodzący z ligniny, poprzez reakcję dioksygenazy extradiolu (EDO), w której otwarcie pierścienia jest katalizowane przy użyciu tlenu jako jednego z substratów10,19. Ta reakcja enzymatyczna zachodzi w kontekście rozkładu ligniny, aromatycznego heteropolimeru znajdującego się w ścianie komórkowej roślin. Lignina może ulegać depolimeryzacji, co daje różnorodne związki aromatyczne, które mogą być dalej rozkładane na metabolity centralne3,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Dioksygenazy ekstremolowe (EDO) katalizują reakcję otwarcia pierścienia na dihydroksylowanych związkach aromatycznych, w której rozszczepienie następuje w sąsiedztwie diolu skoordynowanego z metalem; w przeciwieństwie do tego, dioksygenazy intradiolu rozszczepiają analogiczne związki aromatyczne między dwiema grupami hydroksylowymi (Rysunek 1). EDO, podobnie jak wiele innych metaloenzymów, mają dwuwartościowe centrum metalu do koordynowania Fe(II) składające się z dwuhistydynowej, jedno-karboksylowej triady9,34,35. Te metaloenzymy ulegają utlenieniu poprzez autooksydację lub inaktywację opartą na mechanizmie, podczas gdy enzym staje się nieaktywny2,36,37,38.

W procedurach eksperymentalnych opisanych w tym manuskrypcie, wykorzystujemy DesB, członka nadrodziny PCAD z bakterii Sphingobium sp. SYK-6, do katalizowania dodawania tlenu przez wiązanie C4-C5 galusanu (Rysunek 2A). Regiochemia tego rozszczepienia jest analogiczna do LigAB, który jest protokatechuat-4,5-dioksygenazą (Rysunek 2B). Dotychczasowe badania tej dioksygenazy galusnowej nie zawierają doniesień o związkach hamujących DesB10,19,39. Dzięki zastosowaniu metod oczyszczania tlenowego DesB wykazywał zmienną aktywność, natomiast przy zastosowaniu metod beztlenowych udało nam się konsekwentnie uzyskać białko o powtarzalnej aktywności. Opisane tu badania kinetyczne pokazują metody beztlenowego oczyszczania DesB, kinetyczną charakterystykę reakcji DesB z galusanem oraz inhibicję DesB przez 4-nitrokatechol (4NC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ogólne materiały i metody

  1. Przygotować wszystkie wymagane podłoża zgodnie z opisem w Tabeli 1. Autoklaw w temperaturze 120 °C przez 15 min. Sterylny roztwór SOC przefiltrować po dodaniu MgCl2 i glukozy, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm. Dostosuj pH roztworu bulionu lizogenicznego Millera (pożywka LB) przed autoklawowaniem. Uzupełnij roztwór pożywki LB-Amp po autoklawowaniu sterylnymi roztworami 0,2 mM L-cysteiny, a następnie 0,1 mM siarczanu żelazowo-amonowego w celu zwiększenia ekspresji i rozpuszczalności białek.
  2. Przygotować bufor Laemmli i bufor bieżący do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), jak opisano w Tabeli 2. Dostosować pH roztworów (używając 1 M HCl i zasady Tris do przygotowania buforu) przed rozcieńczeniem składników do ich końcowych objętości.
  3. Przygotować do oczyszczania białek zgodnie z opisem w Tabeli 3. Dostosować pH roztworów (używając 1 M HCl i zasady Tris do przygotowania buforu) przed rozcieńczeniem składników do ich końcowych objętości.
  4. Przygotowane przenieść do butelki, którą można zamknąć gumowym korkiem z jednym otworem i która zawiera szklaną rurkę.
    1. Użyj węża, aby podłączyć szklaną rurkę w korku do źródła podciśnienia. Pozostawić roztwór do odgazowania pod podciśnieniem przez około 30 minut, mieszając ze średnią prędkością.
    2. Najpierw rozbij uszczelkę próżniową, a następnie wyłącz próżnię. Następnie przebij gumowy korek dwiema igłami 20G (jedną wystarczająco długą, aby sięgnąć dna butelki, i jedną krótszą igłą, która może być używana jako odpowietrznik odprowadzający gaz). Bąbelkować w stałym strumieniu azotu, mieszając ze średnią prędkością przez 30 minut.
    3. Usuń igły i powtórz odgazowywanie i bulgotanie azotu, w sumie przez trzy cykle. Po zakończeniu odpowiednio zamknij butelkę solidnym gumowym korkiem. Następnie zabezpiecz korek folią parafinową i drutem miedzianym (20G) i umieść je w schowku podręcznym.
      UWAGA: Wszystkie materiały umieszcza się w komorze rękawicowej i poddaje 3 cyklom oczyszczania przedsionka, a następnie odsysa tlen i ponownie napełnia go azotem. używane do oczyszczania i zagęszczania mogą być zakorkowane i przechowywane w schowku rękawicowym przez czas nieokreślony.
  5. Przygotować roztwór ditionianu sodu, rozpuszczając około jednej szpatułki (0,31" x 2", mniejszy koniec dwustronnie zakończonej mikrostożkowej szpatułki ze stali nierdzewnej) wypełnionej ditionianem sodu w około 1 ml odgazowanej wody w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Uszczelnij probówkę folią parafinową przed wyjęciem ze schowka.
    UWAGA: Przechowywać stały ditionian sodu w schowku na rękawiczki, aby zapobiec utlenianiu.

2. Przygotowanie kolumny amylozy do oczyszczania białka

  1. Sporządzić zawiesinę z wysokoprzepływowej żywicy amylozowej (15 ml) w połączeniu z 5 objętościami kolumny (75 ml) buforu kolumny amylozy. Przenieś zawiesinę żywicy do dwóch butelek z surowicą o pojemności 50 ml i zamknij każdą butelkę gumową przegrodą. Przebić igłę o wadze 20 G, 305 mm przez przegrody i wprowadzić azot do zawiesiny przez około 1 minutę, aby usunąć tlen z zawiesiny. Przenieść żywicę i roztwór zawierający białko do schowka na rękawiczki.
  2. W schowku na rękawiczki wlej żywicę do kolumny borokrzemianowej o wymiarach 2 x 30 cm wyposażonej w prosty zawór odcinający, który pozwoli żywicy osiąść i utworzyć równe łoże. Opróżnij bufor kolumny i zrównoważ kolumnę z 3 objętościami kolumny (łącznie ~ 30 ml) odgazowanego buforu kolumny amylozy za pomocą gazowego azotu pod ciśnieniem, aby przepchnąć bufor przez żywicę z prędkością około 1 kropli/s lub 5 ml/min, aż rozpuszczalnik znajdzie się tuż nad złożem żywicy.
    UWAGA: Po elucji białka (patrz krok 3.5 poniżej), żywica kolumny amylozy jest regenerowana przez przemywanie 1 objętością kolumny (10 ml) wody, następnie 1 objętością kolumny 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), a na końcu 3 objętościami kolumny (30 ml) wody. Ten krok można wykonać poza schowkiem na rękawiczki. Żywica kolumny jest przechowywana w temperaturze 4 °C w 20% etanolu i może być regenerowana do 5 razy.

3. Ekspresja białka i beztlenowe oczyszczanie DesB

UWAGA: Gen DesB został komercyjnie zsyntetyzowany, po umieszczeniu go w wektorach pET-15b, pET-32a i pMAL- c5x przy użyciu miejsc klonowania ograniczeń NdeI i BamHI.

  1. Wykonaj testy ekspresji białek zgodnie z wytycznymi producenta, aby określić prawidłowe warunki ekspresji na dużą skalę (opisane w skrócie poniżej).
    1. Przekształć plazmidy zawierające DesB w komercyjnie wykonane, chemicznie kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3), zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, rozmrażaj komórki na lodzie przez 10 minut, dodaj około 10-50 ng plazmidowego DNA do mieszaniny komórek, szokuj termicznie komórki w temperaturze 42 °C przez 10 s i inkubuj je na lodzie przez dodatkowe 5 minut. Dodać pożywkę SOC, aby uzyskać końcową objętość 1 ml i pozostawić komórki do wstrząsania (~200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Do płytki LB-Amp dodać i rozprowadzić 100 μl roztworu komórkowego i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Po całonocnej inkubacji wybierz pojedynczą jednostkę tworzącą kolonię z płytki i użyj tej kolonii do zaszczepienia 10 ml pożywki LB-Amp. Hoduj komórki przez noc, wstrząsając (~200 obr./min) w temperaturze 37 °C.
    3. Do 10 ml pożywki dodać 100 μl roztworu do wzrostu przez noc i wstrząsnąć nową pożywką w sposób opisany w kroku 3.1.2 w temperaturze 37 °C. Gdy gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) wynosi między 0,4-0,8, dodać izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG), aby uzyskać końcowe stężenie roztworu 1 mM.
    4. Natychmiast usunąć 1 ml podwielokrotności roztworu i przenieść ją do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z oznaczonym czasem = 0 godzin. Obracaj probówkę o masie 15 000 x g przez 10 minut, aby ogranulować komórki. Po odwirowaniu usunąć supernatant i przechowywać komórki w temperaturze 4 °C.
    5. Usunąć dodatkowe podwielokrotności (po 1 ml każda) w odstępach czasu po dodaniu IPTG (zwykle po 5, 10, 12, 18 i 24 godzinach). Jak opisano w kroku 3.1.4, odwirować każdą probówkę, zdekantować supernatant i przechowywać komórki w temperaturze 4 °C.
    6. Po uzyskaniu wszystkich podwielokrotności ponownie zawieś komórki z każdego punktu czasowego w 30 μl roztworu do ekstrakcji białek bakteryjnych, inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut i odwiruj probówki o masie 15 000 × g przez 5 minut, aby oddzielić rozpuszczalne i nierozpuszczalne białka.
    7. Przenieść rozpuszczalny roztwór białka do nowej probówki do mikrowirówki i ponownie zawiesić pozostałe nierozpuszczalne granulki za pomocą 30 μl roztworu do ekstrakcji białek bakteryjnych.
    8. Połącz 30 μl każdego roztworu (zarówno rozpuszczalne, jak i nierozpuszczalne roztwory dla każdego punktu czasowego) z równą objętością buforu Laemmli, a następnie wyświetl na SDS-PAGE gel40. Należy wybrać warunki odpowiadające pasom zawierającym odpowiednie pasma wielkości we frakcji rozpuszczalnej do ekspresji i oczyszczania białek na dużą skalę.
      UWAGA: Ponieważ minimalna ilość rozpuszczalnego białka została początkowo wygenerowana przy użyciu powyższych warunków, dodano różne suplementy w celu przetestowania wpływu na ekspresję rozpuszczalnego białka, przy czym 0,2 mM L-cysteiny i 0,1 mM siarczanu żelazawo-amonowego wykazują zwiększoną ekspresję białka. Zgodnie z tym badaniem przesiewowym ekspresji białek, odpowiednim wektorem ekspresji do rozpuszczalnej produkcji DesB był wektor pMAL-c5x.
  2. Po przekształceniu w Escherichia coli BL21 (DE3) należy przygotować zapas DesB/pMal-c5x, łącząc 900 μl kultury bakteryjnej (hodowanej przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min i 37 °C) ze 100 μl 80% glicerolu. Przechowywać wywar w temperaturze -80 °C w probówce kriogenicznej.
    UWAGA: Przygotuj nowy zamrożony wywar mniej więcej co 6-8 miesięcy.
  3. Za pomocą końcówki pipety zeskrobać komórki z zamrożonego wywaru i rozpocząć hodowlę bakteryjną, hodując przez noc w 5 ml pożywki LB-Amp w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Zaszczepić 1,5 litra pożywki LB-Amp w kolbie o pojemności 2 litrów w temperaturze 37 °C i 200 obr./min, używając wyhodowanej przez noc kultury bakteryjnej.
    UWAGA: Ze względu na zaobserwowaną wrażliwość białka na tlen stwierdzono, że zmniejszona przestrzeń nad głową w kolbie i umiarkowane prędkości wytrząsania poprawiły wydajność białka przy ekspresji na dużą skalę.
  4. Indukuj ekspresję białka, gdy gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) wynosi od 0,4 do 0,8 przy 1 mM IPTG i uzupełniona 0,2 mM L-cysteiną i 0,1 mM siarczanem żelazowo-amonowym. Obniżyć temperaturę inkubacji do 30 °C i wstrząsnąć z prędkością 200 obr./min. Odwirować komórki przez odwirowanie po 24 godzinach od indukcji w temperaturze 4 700 x g przez 10 minut i wyrzucić zużyte media.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 20 ml buforu kolumny amylozy na każde 1,5 l wzrostu, a następnie dodać 1 mg lizozymu. Mieszaj przez 20 minut na lodzie.
    UWAGA: Można dodać więcej buforu, jeśli roztwór jest zbyt lepki, ponieważ roztwory białek, które są zbyt lepkie, mogą zakłócić następny etap homogenizacji.
  6. Lizować zawieszony roztwór komórkowy poprzez homogenizację wysokociśnieniową z 3-5 przejściami przy około 15 000 psi. Przenieść białko do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przepłukiwać przestrzeń nad wodą azotem przez 1 minutę. Następnie odwirować lizat komórkowy przy 20 000 x g przez 40 minut, aby usunąć nierozpuszczalne zanieczyszczenia.
    UWAGA: Udana homogenizacja powoduje, że białko tworzy miceli, gdy przepływa przez probówkę i do kolby zbiorczej, a roztwór pojawia się jako półprzezroczysty szaro-brązowy kolor. Utrzymuj homogenizowane białko na lodzie przez cały proces.
  7. Po odwirowaniu przenieś supernatant do probówki o pojemności 50 ml (może być konieczne więcej niż jedna), zakryj probówkę gumową przegrodą i igłą o rozmiarze 20 powoli przepuszczaj azot przez roztwór przez 2 minuty, aby wyprzeć tlen. Owinąć przegrodę folią parafinową i dodatkowo zabezpieczyć ją drutem miedzianym, a następnie wprowadzić supernatant do schowka rękawicowego wraz z materiałami kolumny.
  8. Wyrównać kolumnę (patrz krok 2.3) i załadować supernatant białkowy na kolumnę. Zebrać przepływ we frakcjach o objętości 5 ml pod azotem pod umiarkowanym ciśnieniem (1 kropla/sekundę lub około 5 ml/min). Następnie przemyj kolumnę za pomocą kolejnych 3 objętości buforu kolumny amylozy i ręcznie zbierz frakcje 3 ml w szklanych probówkach pod umiarkowanym ciśnieniem azotu (około 5 ml / min). Eluować białko za pomocą 5 objętości kolumny (~50 ml) buforu elucyjnego i ręcznie zbierać 3 ml frakcji pod umiarkowanym ciśnieniem azotu (około 5 ml / min).
    UWAGA: Frakcje można alternatywnie zbierać za pomocą filtracji grawitacyjnej. Należy pobrać około 12 frakcji elucyjnych.
  9. Zebrać 30 μl porcji frakcji i wyjąć je ze schowka na rękawiczki, aby umożliwić wizualizację frakcji zawierających białko za pomocą analizy SDS-PAGE.
    UWAGA: Zebrane frakcje pozostają w schowku rękawicowym przez cały czas trwania tego testu. Oczyszczony DesB zwykle eluuje z kolumny we frakcjach od 3 do 5.

4. Stężenie białka beztlenowego/wymiana buforu

  1. Koncentrator komórek pod ciśnieniem z mieszadłem należy zmontować z filtrem membranowym z odtworzonej celulozy o średnicy 76 mm (odcięcie 10 kDa). Dodaj wystarczającą ilość 20% etanolu do koncentratora, aby membrana była mokra, gdy zmontowany koncentrator jest przenoszony do komory rękawicowej.
    UWAGA: Upewnij się, że w membranie nie ma rozdarć i że O-ring nie jest pomarszczony.
  2. Po przeniesieniu koncentratora komórek z mieszadłem do schowka na rękawiczki, zmyć roztwór etanolu z membrany wodą. Zakryj i zwiększ ciśnienie w mieszanej komórce, aby oczyścić rurkę i membranę z nadmiaru wody.
  3. Dodać wszystkie frakcje zawierające białko zgodnie z SDS-PAGE (Rysunek 3) do koncentratora. Dodać wystarczającą ilość buforu wymiennego, aby uzyskać 150 ml całkowitej objętości roztworu białkowego.
  4. Zwiększyć ciśnienie w mieszanej komorze komórkowej za pomocą zewnętrznej liniiN2 i zagęścić białko do 50 ml z umiarkowaną prędkością mieszania.
    UWAGA: Osiągnięcie stężenia 50 ml zajmuje około 20 minut.
  5. Uzupełnij 100 ml buforu wymiennego 0,1 mM ditiotreitolem (DTT) i 0,1 mM siarczanem żelazawo-amonowym, dodaj roztwór do mieszanej komórki i zagęść białko do całkowitej objętości 50 ml z umiarkowaną prędkością mieszania.
  6. Gdy roztwór osiągnie objętość 50 ml, dodać ponownie uzupełniony bufor wymienny, ale zagęścić roztwór do całkowitej objętości 10 ml z umiarkowaną prędkością mieszania.
  7. Przefiltrować skoncentrowane białko za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,45 μm i podzielić na porcję do pojedynczych probówek reakcji łańcuchowej polimerazy (pcr) o pojemności 0,2 ml (każda zawierająca około 150 μl roztworu białkowego). Wyjąć zakryte porcje ze schowka na rękawiczki i natychmiast błyskawicznie zamrozić je ciekłym azotem. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

5. Odsalanie DesB

  1. Przed użyciem przepłukać worek rękawicowy azotem przez około 1.5 godziny.
  2. Rozmrozić 150 μl porcji oczyszczonego białka DesB wewnątrz worka na rękawiczki na lodzie.
  3. Podczas gdy białko się rozmraża, przygotuj małą grawitacyjną kolumnę odsalającą zawierającą 3 ml gruboziarnistego żelu odsalającego Sephadex G-25 w kolumnie borokrzemianowej o pojemności 9 ml. Przemyć kolumnę 2 objętościami kolumny (~6 ml) odgazowanego buforu odsalającego.
    UWAGA: Wymień żel odsalający, gdy nastąpi zmiana koloru żelu z białego na żółty (po około 7 użyciach).
  4. Załaduj rozmrożony DesB na kolumnę w procesie sterowanym grawitacyjnie. Odrzuć przepływ. Eluować białko za pomocą około 5 ml buforu odsalającego.
    UWAGA: Ciśnienie ze zbiornika gazu stale napełniającego worek rękawicowy będzie miało wpływ na szybkość, z jaką roztwory kapią z kolumny.
  5. W celu wstępnego oznaczenia elucji białek z kolumny, należy zebrać 12 fiolek/elucji (zawierających 3 krople na fiolkę). Uszczelnione gumową przegrodą, wyjąć je z worka rękawicowego i sprawdzić obecność białka bezpośrednio (poprzez analizę żelu SDS-PAGE) lub pośrednio (poprzez badanie aktywności każdej frakcji).
    UWAGA: Zazwyczaj frakcje są testowane indywidualnie pod kątem aktywności, jak opisano w kroku 7.1, przy czym największa aktywność odpowiada frakcji o największym stężeniu aktywnego białka. DesB zwykle eluuje się począwszy od 7 kropli, po czym zbiera się kolejne 9 kropli odsolonego białka. Podwielokrotności białek są przechowywane na lodzie podczas pomiarów kinetyki (kroki 7.1-7.4).

6. Przygotowanie elektrody tlenowej

  1. Wypoleruj srebrny pierścień anodowy i katodę platynową środkiem do czyszczenia elektrod i wilgotną końcówką higieniczną, aż nie będzie widocznych śladów osadów czarnego tlenku.
  2. Za pomocą nożyczek wytnij około jednego 1.5-calowego kwadratu papieru dystansowego (lub bibułki do skręcania papierosów, która działa równie dobrze). Następnie wytnij 1) małe trójkąty na każdej powierzchni kwadratu i 2) nacięcia w rogach, aby ułatwić owijanie elektrody.
  3. Dodaj 5 kropli 50% roztworu KCl na rowek srebrnej anody i połącz je tak, aby tworzyły jeden ciągły pierścień roztworu. Dodaj 2 krople 50% roztworu KCl na wierzch elektrody platynowej. Ostrożnie umieść papier dystansowy na elektrodzie platynowej i wygładź papier dystansowy, aby nie było pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uniknąć rozdarcia papieru dystansowego.
  4. Wytnij kawałek membrany S4 30m PTFE (politetrafluoroetylen) o długości około 2 cali i umieść go na papierze dystansowym. Odetnij krawędzie membrany tak, aby były wyrównane z zewnętrznym pierścieniem elektrody.
  5. Za pomocą aplikatora O-ring nasuń mały O-ring na elektrodę, aby przymocować papier dystansowy i membranę do elektrody. Umieść większy O-ring w okrągłym rowku elektrody, upewniając się, że pod nim nie ma membrany. Wsuń górną komorę elektrody na podstawę i skręć je ze sobą.
    UWAGA: Oba są prawidłowo przykręcone, jeśli żadne pęcherzyki powietrza nie przyklejają się do boków komory.
  6. Umieść zmontowaną elektrodę na jej podstawie i podłącz elektrodę do systemu monitorowania. Zainicjuj program sterowania elektrodą i skalibruj elektrodę, wykonując protokół kalibracji fazy ciekłej (Rysunek 4A). Zmienna temperatury powinna być temperaturą pomieszczenia, w którym przeprowadzany jest eksperyment, a zmienna ciśnienia otoczenia jest zależna od regionu i aktualnych warunków pogodowych.
    UWAGA: Ciśnienie otoczenia można uzyskać z raportu pogodowego dla regionu.
  7. Dodać 1 ml 25 mM buforu Tris do komory elektrody, włożyć tłok, rozpocząć kalibrację roztworu nasyconego tlenem i dostosować prędkość mieszadła do 100. Po ustabilizowaniu się elektrody określa się nastawę kalibracji dla roztworu nasyconego tlenem (Rysunek 4B).
  8. Nie zdejmując tłoka, za pomocą igły 1,2 x 40 mm i strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć około 1 ml roztworu ditionianu sodu do komory, uważając, aby nie dodać żadnych pęcherzyków powietrza (Rysunek 4C). Użyj gumowego korka, aby uszczelnić komorę elektrody natychmiast po dodaniu ditionianu sodu.
  9. Pozwól, aby kalibracja była kontynuowana, aż cały tlen zostanie wykorzystany, a program zostanie zakończony, a następnie zapisz kalibrację (Rysunek 4D). Odessać roztwór z komory i przepłukać tłok i komorę wodą dejonizowaną 5-6 razy, aby zapewnić całkowite usunięcie ditionitianu sodu. Do płukania należy używać plastikowej rurki wyposażonej w końcówkę do pipet, połączonej z kolbą próżniową z bocznym ramieniem. Unikaj uszkodzenia membrany.

7. Testy kinetyczne z użyciem elektrody tlenowej

  1. Zidentyfikować odsolone podwielokrotności zawierające aktywne białko poprzez seryjne badanie 1 μl roztworu enzymatycznego na aktywność w roztworze 25 mM buforu Tris o pH 7,5 i zawierającym 100 μM galusanu. W pozostałych doświadczeniach należy użyć podwielokrotności o największej zaobserwowanej aktywności. (Patrz krok 5.5.1)
  2. Określić szybkość reakcji enzymatycznej, mierząc zużycieO2 za pomocą czułej naO2 elektrody typu Clarka z integracją komputerową za pośrednictwem jednostki sterującej elektrodą.
    1. Dla każdego pomiaru punktu danych kinetyki DesB dodaj 1 ml 25 mM buforu Tris (pH 7,5) do komory elektrody. Dodać obliczoną objętość 25 mM roztworu podstawowego galusanu do buforu Tris, aby uzyskać pożądane końcowe stężenie substratu (0,05-25 mM).
      UWAGA: Codziennie przygotowywać świeże roztwory podstawowe galusanów i związków hamujących z wodą i w razie potrzeby dostosować pH do 7,5 z dodatkiem 0,1 mM NaOH.
    2. Po 10 sekundach mieszania, aby umożliwić wymieszanie roztworu, powoli uszczelnij komorę tłokiem i przykręć górną częścią do dołu. Czysta chusteczka może być użyta do wchłonięcia nadmiaru płynu, który jest wypierany z komory. Pozwól, aby elektroda zrównoważyła się w miejscu, w którym może zapewnić stabilny pomiar stężenia tlenu w roztworze przez co najmniej 1 minutę przed przystąpieniem do dodawania enzymu (wskaźnik zużycia tłaO2 ± 0,5 μM/min).
    3. Za pomocą gazoszczelnej strzykawki o pojemności 10 μl dodać około 1 μl enzymu (około 3-7 μM enzymu) do komory elektrody przez tłok.
      UWAGA: Ilość enzymu może być zwiększana lub zmniejszana w odpowiedzi na obserwowaną aktywność określonej podwielokrotności, aby umożliwić wystarczającą szybkość reakcji.
    4. Obliczyć prędkość reakcji na podstawie nachylenia pierwszych 30 s danych liniowych po dodaniu enzymu i skorygować zużycie tłaO2 przy użyciu danych z 30 s bezpośrednio przed dodaniem enzymu. Szybkość katalizy jest równa szybkości zużyciaO2 (Rysunek 5A).
    5. Po zebraniu danych dotyczących dawki dla danego stężenia substratu, opróżnij komorę elektrody poprzez aspirację za pomocą plastikowej rurki podłączonej do bocznej kolby próżniowej i kilkakrotnie płukaj wodą przez 4-6 cykli. Ustawić roztwór w elektrodzie zgodnie z opisem w kroku 7.2.1, używając nowego stężenia substratu.
    6. Zmieniaj stężenia substratów w nieuporządkowany sposób i powtarzaj w trakcie eksperymentu, aby uwzględnić spadki aktywności enzymu w czasie (Rysunek 5B).
      UWAGA: W przypadku gdy przeprowadza się powtórzenia o określonym stężeniu, które wykazują więcej niż 30% spadek szybkości w porównaniu z wcześniejszą serią, nie należy wykonywać żadnych dodatkowych testów z tą partią enzymu. Zazwyczaj po 30-40 biegach enzym wykazuje 30% spadek aktywności.
    7. Wyznacz parametry kinetyczne, kcat (stała katalityczna dla konwersji substratu w produkt) i Km (stała Michaelisa, operacyjnie zdefiniowana jako stężenie substratu, przy którym szybkość początkowa wynosi połowę prędkości maksymalnej), poprzez dopasowanie danych z każdego ze stężeń substratu do równania Michaelisa-Mentena (Rysunek 6) za pomocą pryzmatu GraphPad.
  3. Dodać 4-nitrokatechol (4NC), aby przetestować jego wpływ na kinetykę dioksygenacji i określić stałą inhibicji (Ki) za pomocą DesB. Dla każdego warunku reakcji roztwory podstawowe Tris (50 mM), galusanu (25 mM) i 4NC (25 mM) łączy się i rozcieńcza wodą, aby uzyskać 2 ml roztworu 25 mM buforu Tris (pH 7,5) z 1 mM galusanem i różnymi stężeniami 4NC. Objętość 4NC zmieniano w celu uzyskania pożądanego końcowego stężenia inhibitora (0,05-20 mM).
    1. Po 10 sekundach mieszania, aby umożliwić wymieszanie roztworu, powoli umieść tłok w komorze i przykręć górną część do dołu. Czysta chusteczka może być użyta do wchłonięcia nadmiaru płynu, który jest wypierany z komory. Pozwól, aby elektroda się zrównoważyła i wykonaj stabilny pomiar stężenia tlenu w roztworze przez co najmniej 1 minutę przed przystąpieniem do dodawania enzymu (wskaźnik zużycia tłaO2 ± 0,5 μM/min).
    2. Jak opisano wcześniej, dodaj białko (krok 7.2.3), określ szybkość reakcji (krok 7.2.4) i zresetuj elektrodę do następnego stanu.
    3. W ramach tej serii eksperymentów należy wielokrotnie określić szybkość reakcji przy braku inhibitora. Określić inhibicję poprzez standaryzację szybkości zużycia tlenu w obecności różnych stężeń inhibitora z substratem 1 mM i brakiem inhibitora (v/vo).
    4. Dopasuj hamowanie dioksygenacji galusanu do równania 7.3A, a następnie dane dotyczące hamowania do równania 7.3B za pomocą programu do tworzenia wykresów (Rysunek 7).
  4. Określ dokładne stężenie enzymu dla każdego eksperymentu, wykonując test Bradforda po zakończeniu wszystkich serii kinetycznych.
    UWAGA: Wszystkie dawki zostały skorygowane o stężenie enzymu. Tego kroku nie trzeba wykonywać w schowku na rękawiczki ani w torbie na rękawiczki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono analizę żelu SDS-PAGE poszczególnych frakcji z oczyszczania białka fuzyjnego DesB-maltose binding protein (MBP) (Rycina 3). Żel wykazuje, że białko jest czyste (MW = 91.22 kDa), z wyjątkiem obecności DesB (MW = 49.22 kDa) i domeny białkowej MBP (42 kDa) odszczepionych od siebie. Do zagęszczenia (krok 4.2) wybrano frakcje E2 i E3.

Powtarzalne wyniki testów kinetycznych DesB zależą od pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe etapy otrzymywania aktywnego, oczyszczonego białka DesB obejmują tworzenie i utrzymywanie zredukowanego miejsca aktywnego Fe(II) w enzymie. W związku z tym prawidłowe przeprowadzenie etapów indukcji, oczyszczania, zagęszczania i odsalania jest niezbędne do pomyślnego uzyskania aktywnego enzymu. Indukowanie ekspresji białka w obecności 1 mM siarczanu żelazawowo-amonowego zapewnia, że Fe(II) jest prawidłowo włączony do miejsca aktywnego DesB. Metoda ta jest inspirowana badaniami, takimi jak te z metaloenzymami ami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Camille Keller z Uniwersytetu Wesleyan za wsparcie techniczne. Specjalne podziękowania dla profesor Lindsay D. Eltis i Jenny K. Capyk z University of British Columbia, a także Christiana Whitmana z University of Texas w Austin, za ich porady dotyczące metod oczyszczania białek beztlenowych i stosowania elektrody czułej naO2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranodyzaZłoto Bio TechnologiesI2481C50
Coomassie Błękit brylantowy R-250Bio-Rad161-0400
Nadsiarczan amonuBio-Rad161-0700
30% AkrylamidBio-Rad161-0158
N,N'tetrametylo-etylenodiaminaBio-Rad161-0801
Żywica amyloza o wysokim przepływieNew England BiolabsE8022S
BL21 (DE3) kompetentne komórki Escherichia coliNew England BiolabsC2527I
L-cysteinaSigma AldrichC7352
kwas galusowySigma AldrichG7384
4-nitrokatecholSigma AldrichN15553
Żelazny Siarczan amonuMallinckrodt5064
Ditionian soduAlfa Aesar33381-22
butelki z serum pszenicznegoFisher Scientific06-406G
Filtr strzykawkowy Acrodisc PF 25 mm z membraną SuporPall Corportation4187
400 mL Koncentrator komórek mieszanych AmiconEMD MilliporeUFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa odcięcie z odcięciem Filtr membranowy z celulozyEMD MilliporePLGC07610
DL-ditiotreitolGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 gruboziarnista kolumna odsalającaGE Healthcare17-0033-01
2 ml Fiolki z zaciśniętym zamknięciemFisher Scientific03-391-38
Jednostkasterująca elektrodą Oxygraph PlusHansatech InstrumentsOXYG1 Plus
Komora Tlenowej ElektrodyHansatech InstrumentsDW1
Dysk elektrodyHansatech InstrumentsS1
PTFE (0,0125 mmX25mm) szpula 30mHansatech InstrumentsS4
Zestaw do czyszczenia elektrodHansatech InstrumentsS16
Papier dystansowyZig Zagdostępne na każdej stacji
Schowek rękawicowy Dri-Lab serii He-Vacuum/ Atmospheres Firma
HE-493 Dri-TrainVacuum/Atmospheres Company
Dwustronna mikrostożkowa szpatułka ze stali nierdzewnejFisher Scientific21-401-10
DWK Nauki Przyrodnicze Kimble Kontes Flex Kolumna ekonomicznaFisher Scientifick420400-1530
10 μ L, Model 701 N SYR, Cementowany NDL 26s ga, 2 cale, strzykawkapunktowa 280300
DWK Nauki przyrodnicze Kimble Kontes Flex Kolumna ekonomicznaFisher ScientificK420401-1505
Homogenizator wysokociśnieniowy Emulsiflex-C5Avestin
B-PER Kompletny odczynnik do ekstrakcji białek bakteryjnychThermo Fisher Scientific89821
Lizozym z białka jaja kurzegoSigma Aldrich12650-88-3
Dodecylosiarczan soduThermo Fisher Scientific151-21-3
ampicylinaSigma Aldrich7177-48-2
TryptonFisher ScientificBP-1421-500
Ekstrakt z drożdżyFisher ScientificBP1422-2
ChloreksoduFisher ScientificS271-10
Chlorek potasuFisher ScientificP217-3
Chlorek magnezuFisher ScientificM33-500
DekstrozaFisher ScientificD16-3
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-1
Chlorowodorek trisFisher ScientificBP153-500
MaltoseFisher ScientificBP684-500
GlicynaFisher ScientificG46-500
benzynowej Hamilton

Bibliografia

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491(2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249(2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469(1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106(2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71(2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1(2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420(2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chromatografia w komorze r kawicowejenzymy wra liwe na tlenchromatografia kolumnowaprocedura odsoleniapomiar zu ycia tlenubadanie inhibicji enzymatycznej
Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.