Artykuł metodologiczny

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

DOI:

10.3791/58310

⸱

9 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wirowanie ultrafiltracji i ultrawirowanie z wirowaniem gradientu gęstości, aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z próbek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mysiego płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą obu metod są określane ilościowo i charakteryzowane.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nowo odkryte subkomórkowe składniki, które odgrywają ważną rolę w wielu biologicznych funkcjach sygnalizacyjnych podczas stanów fizjologicznych i patologicznych. Izolacja pojazdów elektrycznych nadal stanowi poważne wyzwanie w tej dziedzinie, ze względu na ograniczenia nieodłącznie związane z każdą techniką. Ultrawirowanie różnicowe z metodą wirowania w gradionym gradimencie gęstości jest powszechnie stosowanym podejściem i jest uważane za złoty standard procedury izolacji EV. Jednak procedura ta jest czasochłonna, pracochłonna i zazwyczaj skutkuje niską skalowalnością, co może nie być odpowiednie w przypadku próbek o małej objętości, takich jak płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Wykazaliśmy, że metoda izolacji wirowania ultrafiltracji jest prosta, efektywna czasowo i pracochłonnie, a jednocześnie zapewnia wysoką wydajność i czystość odzysku. Proponujemy, aby ta metoda izolacji mogła być alternatywnym podejściem, które jest odpowiednie do izolacji EV, szczególnie w przypadku próbek biologicznych o małej objętości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy są najmniejszym podzbiorem EV, o średnicy 50–200 nm i mają wiele funkcji biologicznych w zróżnicowanym zakresie procesów sygnalizacyjnych1,2,3,4,5. Regulują homeostazę komórkową i tkankową przede wszystkim poprzez ułatwianie komunikacji międzykomórkowej poprzez cząsteczki ładunku, takie jak lipidy, białka i kwasy nukleinowe6,7,8,9. Jednym z kluczowych etapów badań nad pojazdami elektrycznymi jest proces izolacji. Ultrawirowanie różnicowe (UC), z wirowaniem w gradionym gradiencie gęstości lub bez niego (DGC), jest uważane za złoty standard, ale ta metoda niesie ze sobą poważne ograniczenia, w tym nieefektywne wskaźniki odzysku EV i niską skalowalność10,11,12, które ograniczają jej najlepsze wykorzystanie do próbek o większej objętości, takich jak supernatant do hodowli komórkowych lub próbki o wysokiej produkcji egzosomów. Zalety i wady innych metod, takich jak wykluczanie wielkości za pomocą ultrafiltracji lub chromatografii, izolacja powinowactwa immunologicznego za pomocą kulek lub kolumn oraz mikrofluidyka, są dobrze opisane, a nowoczesne procedury uzupełniające zostały opracowane w celu przezwyciężenia i zminimalizowania ograniczeń technicznych w każdym podejściu11,12,13,14,15. Inni wykazali, że wirowanie ultrafiltracyjne (UFC) z nanoporowatą membraną w jednostce filtrującej jest alternatywną techniką, która zapewnia czystość porównywalną do metody UC16,17,18. Technikę tę można uznać za jedną z alternatywnych metod izolacji.

Płyn popłuczynowo-oskrzelowo-pęcherzykowy (BALF) zawiera EVs, które posiadają liczne funkcje biologiczne w różnych stanach układu oddechowego19,20,21,22. Badanie EV pochodzących z BALF wiąże się z pewnymi wyzwaniami ze względu na inwazyjność procedury bronchoskopii u ludzi, a także ograniczoną ilość odzyskiwania płynu z płukania. U małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy, tylko kilka mililitrów można odzyskać w normalnych warunkach płuc, a jeszcze mniej w płucach objętych stanem zapalnym lub zwłóknieniowym23. W związku z tym zebranie wystarczającej ilości BALF do izolacji pojazdów elektrycznych za pomocą ultrawirowania różnicowego do dalszych zastosowań może nie być wykonalne. Jednak wyizolowanie prawidłowych populacji EV jest kluczowym czynnikiem w badaniu funkcji biologicznych EV. Delikatna równowaga między wydajnością a skutecznością nadal stanowi wyzwanie w dobrze znanych metodach izolacji pojazdów elektrycznych.

W tym obecnym badaniu wykazujemy, że ultrafiltracja odśrodkowa, wykorzystująca nanomembranowy filtr o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO), jest odpowiednia dla próbek biologicznych o małej objętości, takich jak BALF. Technika ta jest prosta, wydajna i zapewnia wysoką czystość i skalowalność, aby wspierać badanie pojazdów elektrycznych pochodzących z BALF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt i wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Medycznym Cedars-Sinai (CSMC).

1. Mysie płyny do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) Pobieranie i przygotowanie

  1. Kolekcja BALF
    1. Eutanazja myszy za pomocą koktajlu ketaminy (300 mg / kg) i ksylazyny (30 mg / kg) drogą dootrzewnową, a następnie zwichnięciem szyjki macicy.
    2. Wprowadzić angiocewnik 22 G do tchawicy. Podłącz strzykawkę insulinową zawierającą 1 ml (ml) lodowatego sterylnego buforu fosforanowego Dulbecco z soli fizjologicznej (DPBS) i wkraplaj 1 ml DBPS do obu płuc przez angiocewnik.
    3. Powoli wyjąć tłok strzykawki w celu pobrania BALF i dozować BALF do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Utrzymuj BALF na lodzie.
    4. Powtórz kroki 1.1.2 i 1.1.3 3x (łącznie 4x w każdej myszy).
      Uwaga: Zwykle pobiera się około 0,8 ml na mililitr wkroplenia. Poniższe kroki można również wykonać dla pojedynczych myszy (tj. 3 ml BALF), ale łączenie wielu próbek BALF pozwoli na izolację większej partii EV w celu zapewnienia spójności w dalszych eksperymentach.
  2. Przygotowanie BALF
    1. Zbierz BALF z 25 myszy i podziel go na dwa równe zestawy (~35 ml na podwielokrotność).
    2. Odwirować BALF w temperaturze 400 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut, w celu usunięcia komórek i innych zanieczyszczeń komórkowych oraz zebrania supernatantu.
    3. Odwirować supernatant w temperaturze 1 500 x g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut, w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać supernatant i przejść do etapów izolacji EV.

2. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego

UWAGA: W tym badaniu, dwie techniki izolacji EV, a mianowicie UFC i ultrawirowanie z pływalnością, służyły do izolowania EV od BALF. Szczegółowy protokół każdej metody jest opisany poniżej.

  1. Metoda wzbogacania metodą wirowania ultrafiltracyjnego (UFC)
    UWAGA: Ta metoda została zmodyfikowana na podstawie wcześniej opisanego protocol10.
    1. Przefiltrować supernatant z kroku 1.2.3 przez sterylny filtr strzykawkowy 0,2 μm i utrzymać przefiltrowany BALF na lodzie.
      UWAGA: Jest to etap wykluczania wielkości, w którym zbierane są tylko pęcherzyki mniejsze niż 200 nm.
    2. Równoważyć filtr odśrodkowy MWCO o mocy 100 kDa sterylnym DPBS przez 10 minut. Odwirować jednostkę odśrodkową przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby wyrzucić DPBS.
      UWAGA: Gdy membrana w urządzeniu filtrującym zostanie zrównoważona z DPBS, membrana musi być mokra przez cały czas, aż urządzenie zostanie użyte.
    3. Napełnić jednostkę filtrującą 15 ml próbki BALF z kroku 2.1.1 i odwirować przy 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przepływowy BALF można wyrzucić lub zebrać do oddzielnej probówki kanonicznej i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
    4. Powtórzyć krok 2.1.3 dla pozostałego BALF.
      z filtrem 0,2 μm Uwaga: Potrzeba było trzech powtórzeń wirowania, aby wystarczająco skoncentrować BALF EV z pierwotnej objętości wyjściowej 35 ml. W ten sposób uzyskano 1–1,5 ml retentatu.
    5. Przemyć retentat 14 ml jałowego DPBS, delikatnie pipetując. Odwirować jednostkę filtrującą przy 3 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 30 minut, w celu usunięcia DPBS i zagęszczenia retentatu EV.
    6. Zebrać skoncentrowane EV pochodzące z BALF z urządzenia filtrującego, wkładając pipetor do dolnej części urządzenia filtrującego i pobierając próbkę ruchem zamiatania z boku na bok, aby zapewnić całkowite odzysk.
    7. Podwielokrotnić EV pochodzące z BALF i przechowywać je w temperaturze -80 °C w celu dalszej kwantyfikacji i charakterystyki cząstek (patrz krok 3).
  2. Ultrawirowanie (UC) z wirowaniem w gradionym gradimencie gęstości wyporu (DGC)
    UWAGA: Następujący protokół został zmodyfikowany w stosunku do wcześniej opisanego protocol24.
    1. Przenieść supernatant z etapu 2.1.1 do probówki ultrawirówkowej o pojemności 37 ml i odwirować próbkę o sile 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki. Zebrać sklarowany osad i odwirować w temperaturze 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Podczas gdy granulki EV są odwirowywane, należy przygotować różne stężenia gradientu gęstości wyporu (tabela 1) dla kroku 2.2.3.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 200 μl DPBS.
    3. Zmieszać zawiesinę EV z 300 μl 50% roztworu roboczego jodixanolu (Tabela 1) i przenieść do probówki ultrawirówki o pojemności 15 ml. Na wierzch 50% zawiesiny mieszaniny jodiksanolu-EV ułóż kolejno następujący roztwór buforowy w kolejności od dołu do góry: 30% jodiksanolu (4,5 ml), 25% jodiksanolu (3 ml), 15% jodiksanolu (2,5 ml) i 5% jodiksanolu (6 ml). Wirować przy 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 230 min.
      UWAGA: Gradient gęstości wyporu opiera się na procentowym skalowaniu jodiksanolu od najwyższego stężenia (50%) na dole do najniższego stężenia (5%) na górze. Aby wytworzyć różne stężenia jodiksanolu, różne ilości pożywki homogenizacyjnej (tabela 1) zmieszano z roztworem roboczym (50% jodiksanolu).
    4. Zebrać frakcję 15% i 25% i rozcieńczyć je w sterylnym DPBS, aby zwiększyć objętość do 15 ml. Przenieść je do nowej małej probówki do ultrawirówki i wirować przy 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 60 minut.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 50 μl sterylnego DPBS w celu dalszej charakterystyki.

3. Kwantyfikacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

UWAGA: Wydajność odzysku EV pochodząca z BALF jest mierzona za pomocą dwóch wskaźników.

  1. Pomiar w analizie śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Rozcieńczyć próbkę EV w stosunku 1:200–1:500 w 1 ml DPBS i załadować próbkę do strzykawki insulinowej. Podłączyć strzykawkę z próbką do pompy strzykawkowej i rozpocząć pomiar liczby cząstek i wielkości (patrz Tabela materiałów).
    2. Ustaw poziom kamery na 14, a próg wykrywania na 1 dla wszystkich pomiarów próbki. Dla każdej próbki zarejestrowano pięć powtarzających się pomiarów z 1500 klatkami w ciągu 30 sekund, z opóźnieniem 20 s między odczytami. Połącz i uśrednij dane w końcowych raportach stężeń i rozmiarów.
      UWAGA: Aby uzyskać dokładne uchwycenie wszystkich cząstek, dostosuj odpowiednio poziom kamery, aby uwidocznić wszystkie cząstki i użyj podobnych ustawień dla wszystkich pomiarów próbki w każdym eksperymencie.
  2. Kwantyfikacja białka
    UWAGA: Test białka kwasu bicinchoninowego (BCA) został użyty do pomiaru stężenia białka w EV pochodzących z BALF.
    1. Rozpuść próbki EV w 1x buforze do lizy.
    2. Określ ilościowo ilość białka w EV pochodzących z BALF zgodnie ze standardowym protokołem BCA za pomocą detekcji kolorymetrycznej, mierząc absorbancję przy 560 nm w czytniku płytek.

4. Wykrywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z BALF

UWAGA: Powszechnie znane białka markerów powierzchniowych egzosomów (TSG101, CD63, CD81 i CD9) zostały użyte do weryfikacji odzysku EV za pomocą SDS-PAGE oraz analizy immunoblottingu i cytometrii przepływowej.

  1. SDS-PAGE i immunoblotting
    1. Rozpuścić równą ilość białek EV w każdej próbce za pomocą buforu ładującego blotting (dodecylosiarczan litu) i 50 mM ditiotreitolu (DTT) w probówce o pojemności 1,6 ml. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    2. Załaduj próbki z kroku 4.1.1 do 4–12% żelu akrylowego Bis-Tris Plus i uruchom elektroforezę (150 V, 35 mA) przez 35 minut.
    3. Przenieś białka do membrany nitrocelulozowej metodą suchego transferu.
    4. Zablokuj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem na 60 minut, kołysząc w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Inkubować błonę z przeciwciałem przeciwko markerowi białka powierzchniowego EV, genowi podatności guza 101 (TSG101), w rozcieńczeniu 1:500 w 5% BSA w buforowanym trisem roztworze soli fizjologicznej Tween-20 (TBST) w temperaturze 4 °C, kołysząc przez noc.
    6. Następnego dnia przemyć membranę 3 razy po 10 minut każde płukanie w buforze TBST i inkubować ją z anty-króliczą IgG, przeciwciałem sprzężonym z HRP, w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Umyj membranę 3x po 10 minut każde pranie w buforze TBST. Opracować membranę za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika do wykrywania przeciwciał HRP i obrazu (patrz Tabela materiałów systemu obrazowania).
  2. Cytometria przepływowa
    1. Rozcieńczyć EV pochodzące z BALF w 49 μl buforu barwiącego PEB (PBS + 5 mM EDTA + 0,5% BSA, przefiltrowane przez membranę filtracyjną strzykawkową 0,1 μm).
    2. Dodaj każde z następujących przeciwciał do każdej pojedynczej próbki: 1) szczurze przeciwciało przeciwko mysiemu PE CD63 (100 ng na reakcję); 2) szczurzy PE CD81 przeciw myszom (500 ng); 3) szczurzy anty-mysz FITC CD9 (200 ng). Inkubować w temperaturze 4 °C, kołysząc się przez 60 minut w ciemności.
    3. Rozcieńczyć próbki 450 μl przefiltrowanego membranowo buforu barwiącego PEB i poddać próbki analizie metodą cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów)25.
    4. Dostosuj ustawienia cytometru przepływowego w następujący sposób: 1) ustaw wszystkie kanały w hyper log (hlog); 2) ustawić spust na SSC na 4; 3) Wyłącz dodatkowy spust. Uruchom próbki w ustawieniu niskiej prędkości i uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń w każdej próbce.
    5. Przeprowadzić analizę danych z niskiej cytometrii w każdej próbce za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tego samego dnia przeprowadziliśmy izolację EV od mysiego BALF-a przy użyciu metod izolacji UFC i UC-DGC. Metoda UFC wymagała około 2,5-3 godzin, podczas gdy technika UC-DGC wymagała 8 godzin czasu przetwarzania. Nie obejmowało to i czasu przygotowania odczynników. Należy zauważyć, że niektóre inne zadania mogą być wykonywane podczas długich okresów wirowania. Niemniej jednak cała procedura trwała prawie cały dzień w przypadku techniki izolacji UC-DGC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad naukowcy odkryli znaczenie pojazdów elektrycznych w homeostazie komórkowej. Co ważniejsze, EV odgrywają główną rolę w wielu procesach chorobowych, modulując sąsiednie i odległe komórki za pomocą ich bioaktywnych cząsteczek ładunkowych 1,21,22,26,27,28,29,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca jest wspierana przez granty NHLBI/NIH HL103868 (dla P.C.) i HL137076 (dla P.C.), American Heart Association Grant-in-Aid (dla P.C.) oraz Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (dla P.C.). Chcielibyśmy wyrazić nasze wielkie uznanie dla Smidt Heart Institute w Cedars-Sinai Medical Center, który dostarcza nam maszynę Nanosight do analizy śledzenia nanocząstek EV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 Ultracel-100KSigma-Millipore, St. Louis, MOUFC910024
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
SacharozaSigma-Millipore, St. Louis, MOEMD8550
HEPESResearch Products International, Prospect, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Manassas, VA46-034-CI
Chlorek soduSigma-Millipore, St. Louis, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, St. Louis, MOMKCD9753 Gradient gęstości Średnia
ketaminaVetOne, Boise, ID13985-702-10
XylazineAkorn Animal Health, Lake Forest, IL59399-110-20
Strzykawka 1 mlBD Strzykawka, Franklin Lakes, NJ309656
Angiocewnik 20 gBD Strzykawka, Franklin Lakes, NJ381703
Probówki wirówkowe 15 mlVWR, Radnor, PA89039-666
Probówki wirówkowe 50 mlCorning Cellgro, Manassas, VA430828
Test białka kwasu bicunchonowego (BCA)Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
Przeciwciało przeciw myszom TSG101królika AbCam, Cambridge, MAAB125011
Szczurze przeciwciało anty-mysie PE-CD63 Biolegend, San Diego, Kalifornia143904
CD81
CD9
Przeciwciało anty-królicze IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRP, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x Środek redukujący (Bolt)
10x Bufor do lizy (Bolt)Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus żel akrylamidowyInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 Mini stosy nitrocelulozyInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
Chemiluminescencyjny odczynnik do wykrywania przeciwciał HRP HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
Probówki do ultrawirówek 17 mlBeckman Coulter, Pasadena, CA337986
Probówki do ultrawirówek 38,5 mlBeckman Coulter, Pasadena, CA326823
Filtry strzykawkowe Corning SFCA 0,2 i mikro; m poreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
Equipment
WirówkaEppendorf, Hamburg,Niemcy-Ultrawirówka
Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight
(NS300)Malvern, Worcestershire, WielkaBrytania-Dopomiaru rozkładu wielkości cząstek i stężenie cząstek
MACSQuant Analyzer 10 cytometr przepływowyMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Niemcy-iBlot
Aparat do przenoszeniaThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP System obrazowaniaBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10Oprogramowanie analityczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389(2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297(2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404(2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581(2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019(2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ultracentryfugacja w gradiencie g sto ciizolacja EVanaliza ledzenia cz stekcytometria przep ywowaWestern blotCD63 CD9 CD81p yn BAL myszy

Powiązane artykuły