Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Egzosomy są najmniejszym podzbiorem EV, o średnicy 50–200 nm i mają wiele funkcji biologicznych w zróżnicowanym zakresie procesów sygnalizacyjnych^1,2,3,4,5. Regulują homeostazę komórkową i tkankową przede wszystkim poprzez ułatwianie komunikacji międzykomórkowej poprzez cząsteczki ładunku, takie jak lipidy, białka i kwasy nukleinowe^6,7,8,9. Jednym z kluczowych etapów badań nad pojazdami elektrycznymi jest proces izolacji. Ultrawirowanie różnicowe (UC), z wirowaniem w gradionym gradiencie gęstości lub bez niego (DGC), jest uważane za złoty standard, ale ta metoda niesie ze sobą poważne ograniczenia, w tym nieefektywne wskaźniki odzysku EV i niską skalowalność^10,11,12, które ograniczają jej najlepsze wykorzystanie do próbek o większej objętości, takich jak supernatant do hodowli komórkowych lub próbki o wysokiej produkcji egzosomów. Zalety i wady innych metod, takich jak wykluczanie wielkości za pomocą ultrafiltracji lub chromatografii, izolacja powinowactwa immunologicznego za pomocą kulek lub kolumn oraz mikrofluidyka, są dobrze opisane, a nowoczesne procedury uzupełniające zostały opracowane w celu przezwyciężenia i zminimalizowania ograniczeń technicznych w każdym podejściu^{11,12,13,14,15}. Inni wykazali, że wirowanie ultrafiltracyjne (UFC) z nanoporowatą membraną w jednostce filtrującej jest alternatywną techniką, która zapewnia czystość porównywalną do metody UC^16,17,18. Technikę tę można uznać za jedną z alternatywnych metod izolacji.

Płyn popłuczynowo-oskrzelowo-pęcherzykowy (BALF) zawiera EVs, które posiadają liczne funkcje biologiczne w różnych stanach układu oddechowego^19,20,21,22. Badanie EV pochodzących z BALF wiąże się z pewnymi wyzwaniami ze względu na inwazyjność procedury bronchoskopii u ludzi, a także ograniczoną ilość odzyskiwania płynu z płukania. U małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy, tylko kilka mililitrów można odzyskać w normalnych warunkach płuc, a jeszcze mniej w płucach objętych stanem zapalnym lub zwłóknieniowym²³. W związku z tym zebranie wystarczającej ilości BALF do izolacji pojazdów elektrycznych za pomocą ultrawirowania różnicowego do dalszych zastosowań może nie być wykonalne. Jednak wyizolowanie prawidłowych populacji EV jest kluczowym czynnikiem w badaniu funkcji biologicznych EV. Delikatna równowaga między wydajnością a skutecznością nadal stanowi wyzwanie w dobrze znanych metodach izolacji pojazdów elektrycznych.

W tym obecnym badaniu wykazujemy, że ultrafiltracja odśrodkowa, wykorzystująca nanomembranowy filtr o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO), jest odpowiednia dla próbek biologicznych o małej objętości, takich jak BALF. Technika ta jest prosta, wydajna i zapewnia wysoką czystość i skalowalność, aby wspierać badanie pojazdów elektrycznych pochodzących z BALF.

Wykorzystanie zwierząt i wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Medycznym Cedars-Sinai (CSMC).

1. Mysie płyny do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) Pobieranie i przygotowanie

1. Kolekcja BALF
   1. Eutanazja myszy za pomocą koktajlu ketaminy (300 mg / kg) i ksylazyny (30 mg / kg) drogą dootrzewnową, a następnie zwichnięciem szyjki macicy.
   2. Wprowadzić angiocewnik 22 G do tchawicy. Podłącz strzykawkę insulinową zawierającą 1 ml (ml) lodowatego sterylnego buforu fosforanowego Dulbecco z soli fizjologicznej (DPBS) i wkraplaj 1 ml DBPS do obu płuc przez angiocewnik.
   3. Powoli wyjąć tłok strzykawki w celu pobrania BALF i dozować BALF do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Utrzymuj BALF na lodzie.
   4. Powtórz kroki 1.1.2 i 1.1.3 3x (łącznie 4x w każdej myszy).
      Uwaga: Zwykle pobiera się około 0,8 ml na mililitr wkroplenia. Poniższe kroki można również wykonać dla pojedynczych myszy (tj. 3 ml BALF), ale łączenie wielu próbek BALF pozwoli na izolację większej partii EV w celu zapewnienia spójności w dalszych eksperymentach.
2. Przygotowanie BALF
   1. Zbierz BALF z 25 myszy i podziel go na dwa równe zestawy (~35 ml na podwielokrotność).
   2. Odwirować BALF w temperaturze 400 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut, w celu usunięcia komórek i innych zanieczyszczeń komórkowych oraz zebrania supernatantu.
   3. Odwirować supernatant w temperaturze 1 500 x g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut, w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać supernatant i przejść do etapów izolacji EV.

2. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego

UWAGA: W tym badaniu, dwie techniki izolacji EV, a mianowicie UFC i ultrawirowanie z pływalnością, służyły do izolowania EV od BALF. Szczegółowy protokół każdej metody jest opisany poniżej.

1. Metoda wzbogacania metodą wirowania ultrafiltracyjnego (UFC)
   UWAGA: Ta metoda została zmodyfikowana na podstawie wcześniej opisanego protocol¹⁰.
   1. Przefiltrować supernatant z kroku 1.2.3 przez sterylny filtr strzykawkowy 0,2 μm i utrzymać przefiltrowany BALF na lodzie.
      UWAGA: Jest to etap wykluczania wielkości, w którym zbierane są tylko pęcherzyki mniejsze niż 200 nm.
   2. Równoważyć filtr odśrodkowy MWCO o mocy 100 kDa sterylnym DPBS przez 10 minut. Odwirować jednostkę odśrodkową przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby wyrzucić DPBS.
      UWAGA: Gdy membrana w urządzeniu filtrującym zostanie zrównoważona z DPBS, membrana musi być mokra przez cały czas, aż urządzenie zostanie użyte.
   3. Napełnić jednostkę filtrującą 15 ml próbki BALF z kroku 2.1.1 i odwirować przy 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przepływowy BALF można wyrzucić lub zebrać do oddzielnej probówki kanonicznej i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
   4. Powtórzyć krok 2.1.3 dla pozostałego BALF.
      z filtrem 0,2 μm Uwaga: Potrzeba było trzech powtórzeń wirowania, aby wystarczająco skoncentrować BALF EV z pierwotnej objętości wyjściowej 35 ml. W ten sposób uzyskano 1–1,5 ml retentatu.
   5. Przemyć retentat 14 ml jałowego DPBS, delikatnie pipetując. Odwirować jednostkę filtrującą przy 3 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 30 minut, w celu usunięcia DPBS i zagęszczenia retentatu EV.
   6. Zebrać skoncentrowane EV pochodzące z BALF z urządzenia filtrującego, wkładając pipetor do dolnej części urządzenia filtrującego i pobierając próbkę ruchem zamiatania z boku na bok, aby zapewnić całkowite odzysk.
   7. Podwielokrotnić EV pochodzące z BALF i przechowywać je w temperaturze -80 °C w celu dalszej kwantyfikacji i charakterystyki cząstek (patrz krok 3).
2. Ultrawirowanie (UC) z wirowaniem w gradionym gradimencie gęstości wyporu (DGC)
   UWAGA: Następujący protokół został zmodyfikowany w stosunku do wcześniej opisanego protocol²⁴.
   1. Przenieść supernatant z etapu 2.1.1 do probówki ultrawirówkowej o pojemności 37 ml i odwirować próbkę o sile 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki. Zebrać sklarowany osad i odwirować w temperaturze 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Podczas gdy granulki EV są odwirowywane, należy przygotować różne stężenia gradientu gęstości wyporu (tabela 1) dla kroku 2.2.3.
   2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 200 μl DPBS.
   3. Zmieszać zawiesinę EV z 300 μl 50% roztworu roboczego jodixanolu (Tabela 1) i przenieść do probówki ultrawirówki o pojemności 15 ml. Na wierzch 50% zawiesiny mieszaniny jodiksanolu-EV ułóż kolejno następujący roztwór buforowy w kolejności od dołu do góry: 30% jodiksanolu (4,5 ml), 25% jodiksanolu (3 ml), 15% jodiksanolu (2,5 ml) i 5% jodiksanolu (6 ml). Wirować przy 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 230 min.
      UWAGA: Gradient gęstości wyporu opiera się na procentowym skalowaniu jodiksanolu od najwyższego stężenia (50%) na dole do najniższego stężenia (5%) na górze. Aby wytworzyć różne stężenia jodiksanolu, różne ilości pożywki homogenizacyjnej (tabela 1) zmieszano z roztworem roboczym (50% jodiksanolu).
   4. Zebrać frakcję 15% i 25% i rozcieńczyć je w sterylnym DPBS, aby zwiększyć objętość do 15 ml. Przenieść je do nowej małej probówki do ultrawirówki i wirować przy 100 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 60 minut.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki EV w 50 μl sterylnego DPBS w celu dalszej charakterystyki.

3. Kwantyfikacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

UWAGA: Wydajność odzysku EV pochodząca z BALF jest mierzona za pomocą dwóch wskaźników.

1. Pomiar w analizie śledzenia nanocząstek (NTA)
   1. Rozcieńczyć próbkę EV w stosunku 1:200–1:500 w 1 ml DPBS i załadować próbkę do strzykawki insulinowej. Podłączyć strzykawkę z próbką do pompy strzykawkowej i rozpocząć pomiar liczby cząstek i wielkości (patrz Tabela materiałów).
   2. Ustaw poziom kamery na 14, a próg wykrywania na 1 dla wszystkich pomiarów próbki. Dla każdej próbki zarejestrowano pięć powtarzających się pomiarów z 1500 klatkami w ciągu 30 sekund, z opóźnieniem 20 s między odczytami. Połącz i uśrednij dane w końcowych raportach stężeń i rozmiarów.
      UWAGA: Aby uzyskać dokładne uchwycenie wszystkich cząstek, dostosuj odpowiednio poziom kamery, aby uwidocznić wszystkie cząstki i użyj podobnych ustawień dla wszystkich pomiarów próbki w każdym eksperymencie.
2. Kwantyfikacja białka
   UWAGA: Test białka kwasu bicinchoninowego (BCA) został użyty do pomiaru stężenia białka w EV pochodzących z BALF.
   1. Rozpuść próbki EV w 1x buforze do lizy.
   2. Określ ilościowo ilość białka w EV pochodzących z BALF zgodnie ze standardowym protokołem BCA za pomocą detekcji kolorymetrycznej, mierząc absorbancję przy 560 nm w czytniku płytek.

4. Wykrywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z BALF

UWAGA: Powszechnie znane białka markerów powierzchniowych egzosomów (TSG101, CD63, CD81 i CD9) zostały użyte do weryfikacji odzysku EV za pomocą SDS-PAGE oraz analizy immunoblottingu i cytometrii przepływowej.

1. SDS-PAGE i immunoblotting
   1. Rozpuścić równą ilość białek EV w każdej próbce za pomocą buforu ładującego blotting (dodecylosiarczan litu) i 50 mM ditiotreitolu (DTT) w probówce o pojemności 1,6 ml. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
   2. Załaduj próbki z kroku 4.1.1 do 4–12% żelu akrylowego Bis-Tris Plus i uruchom elektroforezę (150 V, 35 mA) przez 35 minut.
   3. Przenieś białka do membrany nitrocelulozowej metodą suchego transferu.
   4. Zablokuj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem na 60 minut, kołysząc w temperaturze pokojowej (RT).
   5. Inkubować błonę z przeciwciałem przeciwko markerowi białka powierzchniowego EV, genowi podatności guza 101 (TSG101), w rozcieńczeniu 1:500 w 5% BSA w buforowanym trisem roztworze soli fizjologicznej Tween-20 (TBST) w temperaturze 4 °C, kołysząc przez noc.
   6. Następnego dnia przemyć membranę 3 razy po 10 minut każde płukanie w buforze TBST i inkubować ją z anty-króliczą IgG, przeciwciałem sprzężonym z HRP, w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Umyj membranę 3x po 10 minut każde pranie w buforze TBST. Opracować membranę za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika do wykrywania przeciwciał HRP i obrazu (patrz Tabela materiałów systemu obrazowania).
2. Cytometria przepływowa
   1. Rozcieńczyć EV pochodzące z BALF w 49 μl buforu barwiącego PEB (PBS + 5 mM EDTA + 0,5% BSA, przefiltrowane przez membranę filtracyjną strzykawkową 0,1 μm).
   2. Dodaj każde z następujących przeciwciał do każdej pojedynczej próbki: 1) szczurze przeciwciało przeciwko mysiemu PE CD63 (100 ng na reakcję); 2) szczurzy PE CD81 przeciw myszom (500 ng); 3) szczurzy anty-mysz FITC CD9 (200 ng). Inkubować w temperaturze 4 °C, kołysząc się przez 60 minut w ciemności.
   3. Rozcieńczyć próbki 450 μl przefiltrowanego membranowo buforu barwiącego PEB i poddać próbki analizie metodą cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów)²⁵.
   4. Dostosuj ustawienia cytometru przepływowego w następujący sposób: 1) ustaw wszystkie kanały w hyper log (hlog); 2) ustawić spust na SSC na 4; 3) Wyłącz dodatkowy spust. Uruchom próbki w ustawieniu niskiej prędkości i uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń w każdej próbce.
   5. Przeprowadzić analizę danych z niskiej cytometrii w każdej próbce za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).

Tego samego dnia przeprowadziliśmy izolację EV od mysiego BALF-a przy użyciu metod izolacji UFC i UC-DGC. Metoda UFC wymagała około 2,5-3 godzin, podczas gdy technika UC-DGC wymagała 8 godzin czasu przetwarzania. Nie obejmowało to i czasu przygotowania odczynników. Należy zauważyć, że niektóre inne zadania mogą być wykonywane podczas długich okresów wirowania. Niemniej jednak cała procedura trwała prawie cały dzień w przypadku techniki izolacji UC-DGC.

EV pochodzące z BALF od normalnych myszy wyizolowanych metodą UFC wykazywały mniejszy rozmiar i bardziej jednolity rozkład rozmiarów (148,8 ± 1,1 nM, Rysunek 1A) w porównaniu do EV UC-DGC (176,7 ± 7,8 nM, Rysunek 1B). Technika UFC charakteryzowała się 65-krotnie większą całkowitą liczbą cząstek w porównaniu z izolacją UC-DGC (29,4 ± 18,4 vs. 0,5 ± 0,1 x10 10 cząstek; p < 0,05; Tabela 2 i Rysunek 1C). Całkowity odzysk białka (w μg) w UFC EV był również wyższy (3 136 ± 1 860 vs. 73,7 ± 38,3 μg; p < 0,05; Tabela 2 i Rysunek 1D). W ten sposób UFC jest efektywne pod względem czasu i wysiłku oraz zapewnia wyższą wydajność pojazdów elektrycznych.

Aby dokładniej scharakteryzować fenotypowo populacje EV pochodzące z BALF, zbadaliśmy obecność powszechnie znanych markerów białka powierzchniowego egzosomów: CD63, CD9 i CD81 za pomocą cytometrii przepływowej oraz TSG101 za pomocą immunoblottingu. Korzystając z analizy cytometrii przepływowej, wykazaliśmy, że zarówno UFC EV, jak i UC-DGC EV wyrażają CD63 (Rysunek 2A - 2C), CD9 ( Rysunek 2D - 2F) i CD81 ( Rysunek 2G - 2I). Wyrażenie średniej geometrycznej (gMFI) CD63, CD9 i CD81 zostało określone ilościowo i nie różniło się statystycznie między tymi dwoma warunkami (Rysunek 3A - 3F).

Następnie zbadaliśmy inny marker białka EV, TSG101, metodą immunoblottingu. Wykazaliśmy, że 20 μg próbki przepływowej UFC (UFC-FT) nie zawierało białek TSG101, co sugeruje, że technika izolacji UFC skutecznie wybrała i zachowała populację EV z próbki BALF (Rysunek 4). Po załadowaniu równych ilości białka całkowitego (20 μg) z próbki BALF-EV stwierdziliśmy, że pojazdy elektryczne UFC wyrażały wyższy poziom TSG101 niż pojazdy elektryczne UC-DGC (Rysunek 4). Wykazaliśmy również, że czystość białka UFC-EV była akceptowalna, co wykazano za pomocą pojedynczego izolowanego pasma białkowego.

Dla wszystkich wyników, test t-Studenta został użyty do porównania dwóch grup. Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM (błąd standardowy średniej), a p < 0,05 uznano za istotne.

Rysunek 1: Ultrafiltracja wirowania mysich płynów do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) EV wykazała bardziej jednorodny rozkład wielkości niż ultrawirowanie z wirowaniem w gradieniu gęstości mysich EV pochodzących z BALF i miała znacznie wyższą całkowitą liczbę cząstek i zawartość białka. Rozkład wielkości cząstek EV mierzono za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), a całkowitą zawartość białka mierzono za pomocą testu kwasu bicinchoninowego. (A) Wykres rozkładu rozmiarów NTA UFC-BALF EV. (B) Wykres rozkładu wielkości pojazdów elektrycznych UC-DGC-BALF. (C) Całkowita liczba cząstek w podziale na NTA (średnia ± SEM x 1010 cząstek; * p < 0,05). (D) Całkowita zawartość białka (w μg, * p < 0,05). Dane pochodziły z trzech niezależnych eksperymentów. UFC: wirowanie ultrafiltracyjne; UC-DGC: ultrawirowanie z wirowaniem w gradiencie gęstości; EVs: pęcherzyki zewnątrzkomórkowe; SD: odchylenie standardowe; Stężenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Mysie EV pochodzące z płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego wyizolowane przez ultrafiltrację, wirowanie i ultrawirowanie metodami wirowania w gradieniu gęstości z ekspresją białek tetraspaniny CD63, CD9 i CD81. Pokazano procenty EV zabarwionych pozytywnie przez techniki izolacji UFC i UC-DCG, zilustrowane wykresami pseudokolorowymi, dla (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9 i (G - I) PE-CD9. Dane pochodzą z trzech niezależnych eksperymentów. UFC = wirowanie ultrafiltracyjne; UC-DGC = ultrawirowanie z wirowaniem w gradiencie gęstości; EVs = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe; SSC-A = analiza rozproszenia bocznego; PE = fikoerytryna; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Izolowane przez ultrafiltrację odwirowujące, mysie EV pochodzące z płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego wyrażały podobną gęstość fluorescencyjną białek tetraspaniny jak EV izolowane ultrawirówkowo. (A i D) Histogram i wyrażenie średniej geometrycznej (gMFI) EV barwionych PE-CD63+. (B i E) Histogram i gMFI EV barwionych FITC-CD9+. (C i F) Histogram i gMFI EV barwionych PE-CD81+. Dane te pochodzą z trzech niezależnych eksperymentów. UFC: wirowanie ultrafiltracyjne; UC-DGC = ultrawirowanie z wirowaniem w gradiencie gęstości; EVs: pęcherzyki zewnątrzkomórkowe; SSC-A: analiza rozproszenia bocznego; PE: fikoerytryna; FITC: izotiocyjanian fluoresceiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Mysie EV pochodzące z płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego wyizolowane przez ultrafiltrację, wirowanie i ultrawirowanie metodami wirowania w gradiencie gęstości, wyrażały białko powierzchniowe egzosomu, TSG101. Panel ten pokazuje immunoblotting mysich EV pochodzących z BALF dla przeciwciała TSG101 (47 kDa). UFC = wirowanie ultrafiltracyjne; UC-DGC = ultrawirowanie z wirowaniem w gradiencie gęstości; EVs = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe; FT = przepływowy; TSG = gen podatności nowotworu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: gradientu gęstości wyporu. Poniższa tabela przedstawia skład i stosunek buforowy każdego roztworu gradientowego, który został użyty do oczyszczenia populacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mysich płuc oskrzelowo-pęcherzykowych wyizolowanych techniką ultrawirowania. * Roztwór roboczy składał się z 50% jodiksanolu (25 ml pożywki o gradiencie gęstości [patrz tabela materiałów] + 5 ml roztworu rozcieńczalnika [pH 7,4 0,25 M sacharozy + 120 mM HEPES + 0,9 M NaCl]). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 M sacharozy + 20 mM HEPES). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 M sacharozy + 20 mM HEPES]). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 M sacharozy + 20 mM HEPES]). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 M sacharozy + 20 mM HEPES]). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 M sacharozy + 20 mM HEPES). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 M, sacharoza + 20 mM HEPES]). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 M sacharozy + 20 mM HEPES]). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 M sacharozy + 20 mM HEPES]). ** Pożywka homogenizacyjna: (pH 7,4 0,25 T + 150 mM NaCl)

Tabela 2: Metoda izolacji metodą wirowania ultrafiltracji zapewniła wysoką wydajność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z płynu płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Stężenie cząstek i całkowitą liczbę cząstek mierzono za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Stężenie białka i całkowitą ilość białka mierzono za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego. * Stężenie cząstek BALF EVs (średnia ± SEM x 108/μL z trzech niezależnych eksperymentów). † Całkowita cząstka BALF EVs (średnia ± SEM x 1010 cząstek z trzech niezależnych eksperymentów). ‡ Stężenie białka w BALF EVs (średnia ± SEM μg/μL z trzech niezależnych eksperymentów). § Całkowite białko BALF EVs (średnia ± SEM mg z trzech niezależnych doświadczeń).
UFC: wirowanie ultrafiltracyjne; UC-DGC: ultrawirowanie z wirowaniem w gradiencie gęstości; Stężenie: stężenie; NTA: analiza śledzenia nanocząstek; SEM: błąd standardowy średniej.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.