Kwantyfikacja odległości międzybłonowych za pomocą szeregowych dylatacji obrazu

Podsumowanie

Celem tego algorytmu jest ciągłe mierzenie odległości między dwoma dwuwymiarowymi krawędziami za pomocą szeregowych dylatacji obrazu i odnajdywania ścieżek. Algorytm ten można zastosować w różnych dziedzinach, takich jak biologia strukturalna serca, biologia naczyniowa i inżynieria lądowa.

Streszczenie

Niedawno opisana zewnątrzkomórkowa nanodomena, zwana perynecytami, została zamieszana w sprzężenie ephaptyczne, które jest alternatywnym mechanizmem przewodnictwa elektrycznego między kardiomiocytami. Obecna metoda ilościowego określania tej przestrzeni za pomocą ręcznej segmentacji jest powolna i ma niską rozdzielczość przestrzenną. Opracowaliśmy algorytm, który wykorzystuje szeregowe dylatacje obrazu konturu binarnego do zliczania liczby pikseli między dwiema przeciwległymi krawędziami 2-wymiarowymi. Algorytm ten wymaga mniej roboczogodzin i ma wyższą rozdzielczość przestrzenną niż metoda ręczna, przy jednoczesnym zachowaniu powtarzalności procesu ręcznego. W rzeczywistości doświadczeni i początkujący badacze byli w stanie podsumować wyniki poprzedniego badania za pomocą tego nowego algorytmu. Algorytm jest ograniczony przez wkład ludzki potrzebny do ręcznego nakreślenia krocza i moc obliczeniową obciążoną głównie przez istniejący wcześniej algorytm znajdowania ścieżki. Jednak wysoka przepustowość, wysoka rozdzielczość przestrzenna i odtwarzalność algorytmu sprawiają, że jest to wszechstronne i solidne narzędzie pomiarowe do użytku w różnych zastosowaniach wymagających pomiaru odległości między dowolnymi krawędziami 2-wymiarowymi (2D).

Wprowadzenie

Następujący algorytm został opracowany do pomiaru odległości międzybłonowej między dwoma strukturalnie sprzężonymi kardiomiocytami w punkcie, w którym oddzielają się od siebie na krawędzi płytki połączenia szczelinowego w nanodomenie zwanej perinexus¹, która została zamieszana w sprzężenie ehaptyczne^2,3,4,5. W procesie analizy setek obrazów perynexiowego mikroskopu elektronowego (TEM) przy użyciu metody ręcznej segmentacji w poprzednim badaniu⁶, zidentyfikowano potrzebę zastosowania metody o wyższej przepustowości, która próbkowałaby szerokość okołokończynową w wyższej rozdzielczości przestrzennej, zachowując dokładność poprzedniego procesu segmentacji ręcznej Podczas segmentacji ręcznej linie są rysowane w odstępach 15 nm, w przybliżeniu prostopadły do linii środkowej, w celu zmierzenia szerokości krocza. Nowy algorytm bierze binarny kontur o grubości jednego piksela składający się z dwóch równoległych linii i wykorzystuje szeregowe dylatacje obrazu do zliczenia liczby pikseli między dwiema membranami. Podczas gdy dylatacje obrazu są powszechnie używane w niezliczonych aplikacjach do przetwarzania obrazu, w tym w wykrywaniu konturów lub krawędzi^7,8, ten algorytm wykorzystuje dylatacje jako mechanizm zliczania. Linia środkowa jest następnie izolowana za pomocą algorytmu odnajdywania ścieżki⁹, a szerokość krocza jest następnie mierzona z rozdzielczością na całej długości perinexus równą rozdzielczości obrazu. Różnica w rozdzielczości w tym przypadku wynosi 1 pomiar na 15 nm w przypadku segmentacji ręcznej i 1 pomiar na 0,34 nm w przypadku nowego algorytmu, co oznacza 44-krotny wzrost częstotliwości próbkowania przestrzennego. Co więcej, ta zwiększona częstotliwość próbkowania jest osiągana w około 1/5 czasu potrzebnego na ręczną segmentację.

Ten algorytm będzie używany w swojej obecnej formie do pomiaru szerokości krocza w konwencjonalnym zakresie 0-150 nm od krawędzi płytki skrzyżowania szczeliny⁵ (GJ), a także w określonym obszarze zainteresowania, gdzie orbita kroczowa wynosi od 30 do 105 nm^2,3,10. Zwiększona częstotliwość próbkowania zmniejsza zmienność w poszczególnych pomiarach krocza w porównaniu z ręczną segmentacją i znacznie skraca czas analizy, pozwalając na sprawne przetwarzanie dużych zbiorów danych. Jednak ten program nie ogranicza się do nanoskalowych obrazów TEM interkalowanych dysków sercowych. To samo podejście można zastosować do ilościowego określenia średnicy naczyń krwionośnych, frakcji wyrzutowej komór, a nawet zjawisk niebiologicznych, takich jak erozja rzek lub powodzie. Algorytm ten jest odpowiedni do ilościowego określania odległości między dowolnymi dwiema quasi-równoległymi krawędziami.

Protokół

UWAGA: Wymagane oprogramowanie to ImageJ (lub podobne oprogramowanie do modyfikacji obrazów) i Matlab R2015. Użytkownik może napotkać problemy ze zgodnością z innymi wersjami Matlaba.

1. Wstępne przetwarzanie obrazów

1. W przypadku dowolnego obrazu w skali szarości upewnij się, że maksymalna wartość intensywności danego piksela wynosi <255. Zazwyczaj odbywa się to poprzez odjęcie wartości 1 od obrazu w niestandardowym programie Matlab "ImageSub.m", zawartym w pliku uzupełniającym S1.

2. Zarys Perinexus

1. Obrysuj perinexus w ImageJ lub innym oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
2. Upewnij się, że kontur ma grubość jednego piksela i jest ustawiony na najwyższą wartość intensywności obrazu (255 w przypadku obrazu w skali szarości od 0 do 255).
3. Zidentyfikuj GJ na podstawie jego struktury pentalaminarnej^11,12 i zdefiniuj początek perinexus jako punkt, w którym dwie przeciwstawne dwuwarstwy błony komórkowej rozchodzą się, jak pokazano w Rysunek 1A. Rozpocznij ~ 200 nm od krawędzi GJ, śledząc wzdłuż wewnętrznej błony pierwszej komórki i z powrotem wzdłuż wewnętrznej błony drugiej komórki. W obrazie ImageJ zwolnij pióro, aby automatycznie zamknąć kontur. To sztuczne zamknięcie zostanie później wycięte.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby obrysować krocze z dużą starannością przy jak największym powiększeniu, ponieważ nawet niewielkie błędy w zastosowaniu konturu mogą spowodować błąd o kilka nanometrów w końcowym pomiarze.

3. Ustawianie algorytmu i wybieranie interesującego użytkownika

UWAGA: Algorytm odnajdywania ścieżek wymaga, aby funkcje AutoGraph, Edge, Graph, Node i Pathfinding⁹ znajdowały się w tym samym katalogu, co plik m MembraneSepDist. Wszystkie pliki można znaleźć w pliku uzupełniającym S1.

1. Wybierz lokalizacje zapisywania danych i rysunków. Są one obecnie zakodowane na stałe w m-file.
   UWAGA: Pierwszy wiersz programu to funkcja do czyszczenia wszystkich zmiennych, zamykania wszystkich okien i czyszczenia okna poleceń. Zapisz dowolne zmienne lub rysunki przed uruchomieniem m-file.
   UWAGA: Zrzuty ekranu oprogramowania znajdują się w pliku uzupełniającym S2 dla wszystkich zakodowanych na stałe wartości.
2. Uruchom program "MembraneSepDist.m".
3. Ustaw parametry.
   UWAGA: Pojawi się graficzny interfejs użytkownika z domyślnymi parametrami progu gradientu, skali, obszaru zainteresowania i ręcznego uruchamiania. Wartości domyślne można zmienić w pliku m lub można je zmienić dla każdego obrazu z osobna.
   1. Ustaw próg gradientu pochodnej przestrzennej.
      UWAGA: Im wyższe wartości, tym więcej punktów jest zaznaczonych w izolacji linii środkowej. Zbyt wysokie lub zbyt niskie wartości (poza zakresem około 3,0-7,9) mogą skutkować nieefektywnością obliczeniową lub nieprecyzyjnym wyborem punktów linii środkowej, co skutkuje nieprecyzyjną izolacją linii środkowej (patrz Rysunek 2A-C).
   2. Ustaw skalę w pikselach/jednostkach skali.
   3. Ustaw dolną i górną granicę przestrzenną dla obszaru zainteresowania.
      UWAGA: Zgodnie z konwencją naszego laboratorium, zdefiniowany obszar zainteresowania znajduje się w odległości od 30 do 105 nm od krawędzi GJ^2,3,10.
   4. Ustaw starty automatyczne/ręczne. W większości przypadków algorytm dokładnie wykrywa punkt początkowy, w którym kończy się skrzyżowanie szczelinowe, a zaczyna perinexus. Jednak w niektórych przypadkach perinexi o nieregularnym kształcie użytkownik musi ręcznie zidentyfikować punkt początkowy. Ustaw tę wartość na 0 dla automatycznego, 1 dla ręcznego.
4. Wybierz żądany obraz.
   UWAGA: Folder wyboru pliku można zmienić w pliku m.
5. Przytnij obraz, aby wybrać interesujący Cię perinexus.
   1. Gdy pojawi się obraz, kursor automatycznie zmieni się w krzyżyk. Przytnij obraz, przeciągając ramkę wokół interesującego Cię krocza (patrz Rysunek 3). Pole przycinania można dostosować za pomocą kwadratów na rogach i bokach, aby je powiększyć lub pomniejszyć.
   2. Podczas przycinania upewnij się, że "otwarty" koniec krocza (najbardziej oddalony od GJ, patrz Rysunek 3) jest przycięty tak, aby dwa kontury błony sięgały krawędzi przyciętego obrazu.
      UWAGA: Zaleca się, aby obraz był pełnoekranowy, aby łatwiej zobaczyć interesujący Cię perinexus i odpowiednio przyciąć.
6. Wybierz końcowe kadrowanie, klikając dwukrotnie kursorem między przeciwległymi krawędziami, które mają być mierzone.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dwukrotne kliknięcie zostało wykonane wewnątrz mięśnia kroczowego. Jeśli program nie zidentyfikuje linii środkowej, uruchom ponownie program i upewnij się, że kliknięcie następuje w mięśniu prostym.
7. Obserwuj końcową linię środkową po pojawieniu się wszystkich dylatacji i nadżerek, aby uzyskać ostateczną ocenę skuteczności programu przez użytkownika.
   UWAGA: Podczas działania programu na ekranie pojawi się okno dialogowe informujące użytkownika, że Matlab nie będzie w stanie przetworzyć żadnych dodatkowych poleceń, dopóki program nie zostanie zakończony. To, jak długo trwa ten proces, zależy od rozmiaru tablicy (obrazu) i mocy obliczeniowej komputera.
8. Jeśli włączony jest ręczny punkt początkowy, obserwuj obraz linii środkowej wyskakujący nad oryginalnym obrazem anatomicznym, wraz z kursorem krzyżyka (patrz Rysunek 2E). Wybierz punkt na zewnątrz perinexus w pobliżu żądanego punktu początkowego.
   UWAGA: Program znajdzie punkt linii środkowej znajdujący się najbliżej wybranego piksela i użyje go jako punktu początkowego.
9. Rejestruj dane.
   UWAGA: Po zakończeniu programu program zwróci zmapowaną linię środkową, wykres szerokości krocza w funkcji odległości od krawędzi GJ. Dodatkowo program zwróci średnią szerokość perineksjalu do 150 nm od krawędzi GJ, a także średnią z określonego obszaru zainteresowania w wierszu poleceń Matlaba. Wartości W_p i odległości od GJ są przechowywane w zmiennej "WpList" lub użytkownik może je ręcznie rejestrować oddzielnie.

4. Rozwiązywanie problemów z algorytmem

1. Jeśli linia środkowa nie jest prawidłowo zidentyfikowana (Rysunek 2A), otwórz rysunek "Gmag" i użyj indeksu, aby zidentyfikować odpowiedni próg gradientu (Rysunek 2C).
2. Jeśli punkt początkowy nie jest prawidłowo zidentyfikowany, należy ustawić punkt początkowy ręcznie (patrz Protokół 3.8).

Wyniki

Metody statystyczne: Porównania między grupami eksperymentalnymi przeprowadzono za pomocą testów t-Studenta. Wartość p < 0,05 uznano za istotną, a wszystkie wartości przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe.

Segmentacja manualna. Kwantyfikacja szerokości nanodomeny perineksusu sąsiadującej z GJ (W_p) jest zazwyczaj przeprowadzana za pomocą segmentacji manualnej. Proces tej segmentacji manualnej przedstawiono na Rysunku 1A i opisano go wcześniej⁶. Obserwator wyznacza krawędź GJ (Rysunek 1, czerwona kropka), odmierza 5nm wzdłuż osi perineksusu, a następnie mierzy odległość między błonami w tym punkcie. Proces ten jest następnie powtarzany w odstępach 10, 15, 30 oraz co 15 nm aż do 150 nm. Technika ta, choć skuteczna, posiada ograniczenia czasowe oraz wiąże się z niedostatecznym próbkowaniem przestrzennym wzdłuż długości perineksusu.

Średnie pomiary W_p z poprzednich badań mogą się różnić w zakresie od około 10 do 20 nm^2,3,10, a wartość 3 nm wydaje się być średnią różnicą niezbędną do wykrycia istotności statystycznej, co znacznie przekracza przestrzenną częstotliwość Nyquista wynoszącą 0,7 nm na pomiar, przy rozdzielczości interpikselowej 0,34 nm. Zatem, mimo że segmentacja manualna jest czasochłonna, metoda ta jest wystarczająca do pomiaru różnic w W_p związanych z interwencją lub stanem chorobowym.

Seryjne rozszerzanie obrazu. W celu szybszego i powtarzalnego pomiaru perineksusu z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną opracowaliśmy program oparty na seryjnych rozszerzeniach obrazu do zliczania pikseli pomiędzy dwiema ręcznie obrysowanymi błonami, co przedstawiono na Rysunku 1B.

Proces seryjnej dylatacji przedstawiono na Rysunku 4. W miarę jak obraz binarny jest dylatowany (Rysunek 4A-4D), wynik dylatacji jest następnie odwracany i dodawany do obrazu roboczego – niebinarnej formy oryginalnego obrysu (Rysunek 4E-4H). Proces ten jest powtarzany do momentu całkowitego wypełnienia obrysu (Rysunek 4D). W tym punkcie końcowy obraz roboczy (Rysunek 4H) stanowi sumę liczby razy, w których dany piksel pozostał niedylatowany. W związku z tym wartości w pobliżu obrysu błon komórkowych są bardzo niskie, natomiast wartości w centrum są najwyższe. Poprzez zliczenie liczby dylatacji potrzebnych do wypełnienia obszaru w każdym punkcie, można obliczyć odległość między krawędziami błon. Kolejnym wyzwaniem jest identyfikacja i izolacja linii środkowej w celu ilościowego określenia szerokości perineksusu w funkcji odległości od GJ, co odbywa się poprzez zastosowanie pochodnej przestrzennej do końcowego obrazu roboczego (Rysunek 2-ostatni obraz oraz Rysunek 5A). Drugi przykład perineksusu o bardziej nieregularnym kształcie znajduje się w pliku uzupełniającym S3.

Identyfikacja linii środkowej. Gradient końcowego obrazu roboczego można określić za pomocą pochodnej przestrzennej, ponieważ wartości liczby dylatacji od krawędzi do krawędzi zmieniają się z wysokich na niskie, a następnie ponownie na wysokie (Rycina 5A, od lewej do prawej). Biorąc pod uwagę wyłącznie moduł pochodnej przestrzennej (Rycina 5B), obrys i linia środkowa, zaznaczone białymi strzałkami, są natychmiast identyfikowalne jako obszary nieciągłości. W tych miejscach kierunek gradientu zmienia się ze wzrostowego na malejący lub odwrotnie. Zastosowanie progu (Rycina 5C) pozwala uzyskać obraz binarny linii środkowej i obrysu, a odjęcie oryginalnego obrysu daje wyizolowaną linię środkową (Rycina 5D). Choć ta metoda izolacji linii środkowej jest wydajna obliczeniowo, próg zastosowany do pochodnej przestrzennej tworzy luki w powstałej linii środkowej. Luki te (Rycina 5D, wstawka) muszą zostać wypełnione, aby zapewnić dokładny pomiar odległości od GJ i zagwarantować pomiar całego obszaru perineksusu. Najpierw linię środkową dylatuje się w celu wypełnienia wszelkich luk (Rycina 5E>), następnie przeprowadza erozję (Rycina 5F>) oraz stosuje funkcję „bwmorph” (operation = 'skel', n = inf), aby wyeliminować jak najwięcej punktów, pozostawiając jednocześnie ciągłą linię środkową, co zwiększa wydajność obliczeniową następnego algorytmu wyznaczania ścieżki opracowanego przez Wasita Limpraserta i dostępnego w MATLAB Central⁹. Ta funkcja dylatacji-erozji generuje kompletną linię środkową, która jest łączona z końcowym obrazem roboczym (Rycina 5G). Jednak ta linia środkowa często ma grubość większą niż jeden piksel, w związku z czym nie stanowi precyzyjnej izolacji linii środkowej.

Algorytm wyznaczania ścieżki Wasita Limpraserta jest wykorzystywany do określenia linii środkowej perineksusa. Algorytm ten pozwala na śledzenie najwyższych wartości – w tym przypadku wartości najbliższych centrum, które pozostały niedylatowane przez największą liczbę iteracji wzdłuż linii środkowej (Rysunek 5G, wstawka). Wynikiem jest automatyczny obrys linii środkowej, jak pokazano na Rysunku 6. Poprzez wyizolowanie linii środkowej, szerokość perineksalną można przedstawić jako funkcję odległości od końca GJ, jak pokazano na Rysunku 6B (góra), lub jako średnią szerokość określonego obszaru zainteresowania.

Analiza jądra. Należy zauważyć, że obrazy cyfrowe opierają się na tablicach kwadratowych, a jądra dylatacji są analogicznie oparte na macierzach kwadratowych. Oznacza to, że odległość dylatacji wzdłuż przekątnej jest większa niż w kierunku ortogonalnym. W związku z tym postanowiono sprawdzić, czy rodzaj jądra wpływa na wyniki działania algorytmu. Aby określić zmienność specyficzną dla jądra, przeanalizowano pięć różnych kształtów jądra: „Plus” (kształt użyty w powyższych analizach), „X”, „Box” oraz „Line”, jak opisano na Rysunku 7A. Jądro jest stosowane w każdym punkcie obrazu binarnego o wartości różnej od zera. Gwiazdka w każdym jądrze na Rysunku 7A reprezentuje środek, gdzie dla jądra dylatacji kolor biały odpowiada wartości 1, a czarny wartości 0.

Wpływ każdego jądra na średnią W_p pomiar pojedynczego obrazu perineksalnego w orientacji w przybliżeniu poziomej (Rycina 7B, góra), określona ilościowo przez doświadczonego użytkownika, została wyznaczona poprzez obrót obrazu za pomocą polecenia „imrotate” w programie Matlab i obliczenie W_p w etapach 10°. W_p wartości pomiarowe (Rycina 7B, dół) fluktuują wraz z orientacją obrazu w sposób sinusoidalnie sprostowany z Plus ukształtowane jądro. Najniższe wartości występują, gdy stosunkowo prosty perineksus jest zorientowany pionowo lub poziomo. Żaden z X, Pudełkoani Linia jądra nie zapewniały żadnej przewagi nad jądrem w kształcie krzyża. X i Pudełko jądra dały identyczne wyniki, ale wartości średniej W_p były przesunięte w fazie względem_e Plus jądro przez 45°. The Linia jądro nie zdołało w pełni rozszerzyć obrazu pod pewnymi kątami, co widać po braku danych w zielonym śladzie dla obrazów obróconych o mniej niż 30 lub więcej niż 145°Zatem ortogonalny Plus jądro dylatacji przeszacowało separację błon podczas dylatacji perineksusa o osi zorientowanej ukośnie, na przykład w przybliżeniu 45°, oraz X i Pudełko jądra niedoszacowały średniej W_p gdy oś podłużna perineksusa znajdowała się również w 45°Na podstawie tej analizy opracowano współczynnik korekcji stosowany do wartości uzyskanych podczas dylatacji za pomocą jądra w kształcie krzyża. Aby uwzględnić zawyżenie dystansu między błonami związane z orientacją obrazu, współczynnik korekcji ten mnoży zmierzoną wartość szerokości w zależności od orientacji obrazu (równanie 1).

Jeśli θ <45°
     W_{p corrected} = cosd(θ) * W_{p measured}
Jeśli θ ≥45°
     W_{p corrected} = cosd(θ) * W_{p measured}     (Równanie 1)

W tym równaniu zmierzona wartość W_p to pierwotna wartość W_p wygenerowana przez powyższy algorytm, a θ to obliczony kąt względem poziomu, wyrażony w stopniach. Kąt θ oblicza się, przyjmując arcus tangens całkowitej zmiany w kierunku poziomym podzielonej przez całkowitą zmianę w kierunku pionowym linii środkowej perineksusu. Powyższa korekta przybliża średni kąt perineksusu względem poziomu (Rycina 8A, lewa góra) i prowadzi do uzyskania pomiaru takiego, jak gdyby pochodził on z poziomego perineksusu (Rycina 8A, lewa dół). Uzasadnienie tego równania wynika z faktu, że jądro w kształcie krzyża (Rycina 7A) to w zasadzie dwa jądra w kształcie linii ułożone ortogonalnie względem siebie. W związku z tym, poniżej 45° (bliżej poziomu), dylatacje zachodzą pionowo, zatem mnożenie przez cosinus kąta daje poprawny pomiar. I odwrotnie, dla kątów powyżej 45° (bliżej pionu), dylatacje zachodzą poziomo i do wyznaczenia poprawnego pomiaru używa się sinusa. Przy dokładnie 45° sinus i cosinus są sobie równe. Plik uzupełniający S4 zawiera przedstawienie tej koncepcji. Należy pamiętać, że korekta ta opiera się na średnim kącie i należy zachować ostrożność podczas analizy kształtów wyraźnie nieliniowych. Proces ten powtórzono na 20 losowo wybranych perineksusach, a skorygowane pomiary silnie korelowały z pomiarami uzyskanymi poprzez ręczną rotację i ponowną analizę obrazów (Rycina 8A, prawa). Aby potwierdzić dokładność korekty orientacji obrazu, wygenerowano dwa zestawy krawędzi fantomowych (Rycina 8B, lewa) i obrócono je o 180°. Dzięki korekcie trygonometrycznej algorytm precyzyjnie zwracał poprawną wartość dla każdej orientacji, niezależnie od rozdzielczości przestrzennej lub rozmiaru obrazu (Rycina 8B, prawa).

Zastosowanie analityczne i powtarzalność z korekcją orientacji. Biorąc pod uwagę, że poprzednie badania z wykorzystaniem segmentacji ręcznej wykazały statystycznie istotne różnice w średniej wartości W_p większe lub równe 3 nm, istotne było ustalenie, czy algorytm może zostać użyty do odtworzenia wcześniejszych wyników przy użyciu pełnego zestawu danych. Z zastosowaniem nowego algorytmu dwóch obserwatorów – jeden doświadczony i jeden niedoświadczony w analizie perineksalnej (odpowiednio Obs. 1 i Obs. 2) – przeanalizowało te same obrazy z poprzedniego badania⁶, które obejmowało 12 pacjentów zdiagnozowanych z migotaniem przedsionków (AF) przed pobraniem tkanek oraz 29 pacjentów bez istniejącego AF (No-AF). Użytkownik doświadczony stwierdził, że W_p była istotnie szersza u pacjentów z AF niż u pacjentów bez AF (odpowiednio 21,9±2,5 i 18,4±2,0 nm, Rysunek 9A). Wartości te po zastosowaniu współczynnika korekcji są zbliżone do wartości raportowanych wcześniej (odpowiednio 24,4±2,2 nm i 20,7±2,4 nm)⁶. Co ważne, użytkownik niedoświadczony przy użyciu programu zautomatyzowanego stwierdził taką samą istotną różnicę (odpowiednio 22,1±2,8 nm i 20,1±2,6 nm) między stanami chorobowymi. Dodatkowo odchylenie standardowe wartości W_p nie zmieniło się po zastosowaniu współczynnika korekcji, co wskazuje, że odchylenie standardowe wynoszące 2-3 nm nie jest artefaktem algorytmu, lecz wynika z samej struktury i obróbki tkanki. Wyniki te dowodzą, że proponowana metoda zautomatyzowana jest w stanie odtworzyć wyniki poprzednich badań.

Ważne jest, że perineksus jest strukturą zdefiniowaną niedawno i nie osiągnięto konsensusu co do zakresu wartości bezwzględnych separacji błon w sąsiedztwie GJ^2,3. Ponieważ szerokość GJ mierzona od zewnętrznej błony do zewnętrznej błony była wcześniej szacowana na 20 nm¹³, postanowiliśmy określić skuteczność algorytmu, mierząc również szerokość GJ. Obaj obserwatorzy nie stwierdzili istotnych różnic w szerokościach połączeń szczelinowych (GJW) u pacjentów z istniejącym AF lub bez niego (Rycina 9B). Bezwzględne wartości GJW dla pacjentów z AF i bez AF wynosiły odpowiednio 20,5 ± 2,5 nm oraz 20,3 ± 1,9 nm dla doświadczonego obserwatora oraz 21,0 ± 3,1 nm i 20,0 ± 2,2 nm dla niedoświadczonego obserwatora, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami.

Aby określić, czy algorytm zautomatyzowany wymagał mniej czasu na analizę danych niż segmentacja ręczna, zarówno doświadczony, jak i niedoświadczony użytkownik zarejestrowali czas potrzebny na kwantyfikację zestawu treningowego składającego się z 10 obrazów (Plik uzupełniający S5). Tabela 1 wykazuje, że użytkownik doświadczony i niedoświadczony skrócili czas analizy odpowiednio 4,7- i 8,3-krotnie, stosując algorytm zautomatyzowany w porównaniu do podejścia opartego na segmentacji ręcznej, przy jednoczesnym około 43-krotnym zwiększeniu rozdzielczości przestrzennej wzdłuż perineksusu.

Rozwiązywanie problemów z algorytmem. Najczęstszy błąd podczas uruchamiania algorytmu występuje, gdy końcowa linia środkowa nie kończy się na krawędzi obrazu. W takich przypadkach z mapy pochodnej przestrzennej wybrano zbyt mało punktów, co powoduje awarię programu i wyświetlenie komunikatu o błędzie zalecającego użytkownikowi wybranie większego obszaru przycięcia lub zwiększenie progu pochodnej przestrzennej. Narysowanie większego pola przycięcia poprawi w niektórych przypadkach niezawodność programu, ponieważ pochodna przestrzenna gwałtownie zmienia się w pobliżu krawędzi figury, co może zakłócić działanie algorytmów wyznaczania ścieżki lub detekcji krawędzi.

Możliwe jest również, aby algorytm wyznaczania ścieżki nie zidentyfikował prawidłowo linii środkowej, nawet jeśli dociera ona do krawędzi obrazu, szczególnie gdy próg gradientu jest zbyt niski (Rycyna 2A). Jeśli próg gradientu zostanie ustawiony zbyt wysoko, do algorytmu wyznaczania ścieżki zostanie włączonych więcej niepotrzebnych punktów (Rycyna 2B), co obniży wydajność obliczeniową. Jeśli użytkownik nie jest w stanie określić odpowiedniego progu, pomocna może być tablica obrazu „GMag” (Rycyna 2C), generowana przez program i dostępna w sekcji Workspace. Należy odnaleźć punkty wzdłuż linii środkowej i ustawić próg nieco powyżej ich wartości Index, aby zapewnić wybór tych punktów. W podanym przykładzie odpowiedni próg wynosiłby powyżej ~5,1 (Rycyna 2C, wstawka).

Punkt startowy może również nie dotrzeć do początku perineksusu (Rysunek 2D). W takim przypadku należy ponownie uruchomić program i ustawić wartość Manual Start na 1. Po wyizolowaniu linii środkowej użytkownik wybiera punkt poza perineksusem, a punkt linii środkowej położony najbliżej wybranego piksela (Rysunek 2E, czerwony kwadrat) zostanie ustawiony jako punkt startowy. Wynikiem jest pełna linia środkowa (Rysunek 2F).

Rysunek 1: Obrazy TEM z procesami kwantyfikacji. Proces segmentacji manualnej (A) wymaga od użytkownika wykonania 12 pojedynczych pomiarów międzybłonowych przy jednoczesnym szacowaniu linii środkowej. Proces automatyczny (B) wymaga ręcznego, ciągłego obrysowania konturu perineksusa. Czerwona kropka na każdym obrazie reprezentuje zidentyfikowany przez użytkownika koniec GJ i początek perineksusa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rozwiązywanie problemów z linią środkową. Dwa główne tryby błędów w identyfikacji linii środkowej oraz ich rozwiązania: Każdy obraz jest opisany nazwą tablicy w programie Matlab. Jeśli próg gradientu jest zbyt niski (A, próg 0.2), algorytm linii środkowej może zawieść. Zbyt wysokie ustawienie progu (B, próg 70) może zmniejszyć wydajność obliczeniową algorytmu wyznaczania ścieżki. Odpowiedni próg gradientu można określić na podstawie tablicy GMag (C, wstawka). Jeśli linia środkowa nie dotrze do krawędzi początkowej perineksusa (D), użytkownik może zdecydować się na ręczny wybór punktu startowego. Po ustawieniu opcji „Start Point” na 1 w początkowym GUI, użytkownik wybiera punkt poza analizowanym perineksusem (E). Wynikiem końcowym powinna być linia środkowa, która dokładnie odwzorowuje cały perineksus (F). Wszystkie etykiety w cudzysłowie (A-F) odpowiadają nazwom zmiennych w programie Matlab. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wybór perineksusu. Aby wyciąć fragment z perineksusem, należy kliknąć i przytrzymać przycisk myszy, a następnie przeciągnąć ramkę wokół niego (narzędzie przycinania jest wybierane automatycznie), zgodnie ze wskazaniem niebieskiej strzałki. Ramkę tę można dostosować, używając kwadratów na bokach i w narożnikach, aby ją powiększyć lub pomniejszyć. Zielona strzałka oznacza koniec perineksusu, który użytkownik powinien pozostawić „otwarty”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 4: Seryjne dylatacje obrazu. Obrys binarny jest wielokrotnie dylatowany w przyrostach jednopikselowych (A-D) i dodawany do obrazu roboczego (niebinarna forma obrazu, E-H) po każdej dylatacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Izolacja linii środkowej i wyznaczanie ścieżki. Z końcowego obrazu roboczego (A) obliczana jest pochodna przestrzenna, a amplituda tej pochodnej (B) służy do wyodrębnienia obrysu i linii środkowej (białe strzałki). Zdefiniowany przez użytkownika próg pozwala zidentyfikować obrys i linię środkową, a odjęcie pierwotnego obrysu daje linię środkową (D). Jednakże, w wyniku zastosowania progu, w linii środkowej pojawiają się przerwy (D – wstawka). Aby uzyskać ciągłą linię środkową, przeprowadza się wtórną dylatację wyizolowanej linii środkowej (E), a następnie wtórną erozję w celu zwiększenia wydajności obliczeniowej następującego po niej algorytmu wyznaczania ścieżki. Ten obraz po erozji (F) jest następnie łączony z końcowym obrazem roboczym, co pozwala na identyfikację ciągłej linii środkowej o grubości jednego piksela (G – wstawka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6: Końcowa prezentacja danych. Program generuje końcowy obrys nałożony na oryginalny obraz TEM (A). Linia jest zakodowana kolorami: zielonym dla zakresu 0-150 nm, niebieskim dla zdefiniowanego przez użytkownika obszaru zainteresowania oraz czerwonym dla obszaru powyżej 150 nm. Dodatkowo program generuje podobnie zakodowany kolorystycznie wykres przedstawiający W_p jako funkcję odległości od początku perineksusu oraz dla obszaru zainteresowania (B), a także średnią wartość W_p (wstawka na odpowiednim wykresie). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 7: Analiza kształtu jądra dylatacji. Kształty jąder dylatacji (A): gwiazdka w środku reprezentuje piksele rozszerzone. Białe kwadraty to piksele podlegające dylatacji w kształcie plusa, X, kwadratu lub linii. Przybliżony poziomy perinexus (B, góra, z czerwoną linią wskazującą 0°) był obracany zgodnie z ruchem wskazówek zegara od 0 do 180° w krokach co 10° i wielokrotnie poddawany dylatacji przy użyciu różnych kształtów jąder (B, dół). Jądra w kształcie plusa i linii dają podobne wyniki, choć jądro liniowe zawodzi przy niektórych orientacjach, natomiast jądra w kształcie kwadratu i X są przesunięte w fazie o 45°. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 8: Korekcja orientacji obrazu. W celu skorygowania orientacji obrazu, średni kąt perineksusu oblicza się na podstawie pozycji punktów początkowego i końcowego (A, lewo, początek i koniec czarnej linii). Tangens odwrotny zmiany w kierunku y (A, lewo, zielona linia) podzielony przez zmianę w kierunku x (A, lewo, czerwona linia) daje kąt korekcji, θ (A, lewo, żółty). Celem jest następnie skorygowanie średniej wartości W_p, aby uzyskać minimalną odległość między krawędziami, tak jakby perineksus został zobrazowany w orientacji w przybliżeniu poziomej (A, lewo poniżej). Zastosowanie współczynnika korekcji opisanego w Równaniu 1 porównano z ręcznym obracaniem każdego z 15 losowo wybranych obrazów o obliczony kąt θ przed analizą. Wartości skorygowane silnie korelowały z wartościami z obrazów obróconych (R² = 0.991, A, prawo), co wskazuje, że Równanie 1 jest prawidłowym współczynnikiem korekcji orientacji obrazu. Aby potwierdzić poprawność współczynnika korekcji, wygenerowano dwa fantomy z idealnie równoległymi krawędziami o znanej odległości między nimi (B, lewo). Fantom 1 i Fantom 2 mają rozdzielczości przestrzenne odpowiednio 2,833 pixels/mm oraz 71,6 pixels/in. Jak pokazują niebieskie romby i czerwone kwadraty w B, prawo, algorytm dokładnie oblicza ich szerokości w zakresie 180 stopni obrotu obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 9: Powtarzalność algorytmu. Stosując zautomatyzowany proces z korekcją orientacji obrazu, zarówno doświadczony, jak i niedoświadczony obserwator stwierdzili istotne różnice między grupami AF i No-AF (A), co jest zgodne z poprzednim badaniem i pozwala na wykrycie minimalnej różnicy wynoszącej 2.6 nm. Ponadto żaden z obserwatorów nie stwierdził istotnej różnicy w GJW (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

	Instrukcja	Automatyczny
Czas – Obs. 1 (s)	205±11	44±14
Czas – Obserwacja 2 (s)	248±18	30±5
Rozdzielczość przestrzenna (pomiary/nm)	0.08	3.45

Tabela 1: Porównanie procesów ręcznych i automatycznych. Obaj obserwatorzy potrzebowali mniej czasu na obrysowanie konturu pojedynczego obrazu niż na przeprowadzenie procesu segmentacji ręcznej dla zestawu treningowego składającego się z 10 obrazów. Ponadto proces automatyczny charakteryzuje się wyższą częstotliwością próbkowania, rejestrując 3,45 pomiarów na nm, w porównaniu do średnio 1 pomiaru co 12,5 nm w przypadku procesu ręcznego. Obrazy z zestawu treningowego wraz z konturami i pomiarami wykonanymi przez doświadczonego użytkownika znajdują się w Pliku Uzupełniającym S5.

Dyskusja

Algorytm wykorzystuje szeregowe dylatacje obrazu do zliczania liczby pikseli między dwiema przeciwległymi krawędziami 2D w obrazie binarnym, co w tym przypadku jest separacją międzybłonową krocza ^2,3,14. Pochodna przestrzenna i algorytm znajdowania ścieżki są następnie używane do izolowania linii środkowej, po której następuje wtórna sekwencja dylatacji i erozji w celu wypełnienia luk w linii środkowej, podobnie jak to miało miejsce przed¹⁵. Linia środkowa jest następnie łączona z końcowym obrazem dylatacji, aby przedstawić szerokość krocza w funkcji odległości od początku separacji krawędzi, w tym przypadku końca GJ i początku mięśnia kroczącego¹⁶.

Cztery podstawowe parametry są definiowane przez użytkownika w graficznym interfejsie użytkownika na początku programu:

1. Próg nachylenia
2. Skala
3. Zakres obszaru zainteresowania
4. Metoda wyboru punktu początkowego (automatyczna lub ręczna)

Najczęstszym mechanizmem niepowodzenia algorytmu jest niemożność dotarcia linii środkowej do krawędzi obrazu, czyli w jaki sposób określa się punkt końcowy dla algorytmu odnajdywania ścieżki. Aby rozwiązać taki problem, użytkownik może zwiększyć próg nachylenia opisany w kroku 3.3.1, co spowoduje, że program wybierze więcej punktów z obrazu pochodnej przestrzennej, co wydłuży czas obliczeń wymagany przez algorytm odnajdywania ścieżki. W związku z tym algorytm ten wymaga kompromisu między szybkością obliczeń a integralnością linii środkowej. Należy zauważyć, że tak długo, jak wszystkie punkty linii środkowej są identyfikowane z pochodnej przestrzennej, wraz z odpowiednim punktem początkowym, próg pochodnej przestrzennej nie będzie miał wpływu na pomiar separacji krawędzi.

Orientacja obrazu wydaje się wpływać na wartości dylatacji, ponieważ jądro rozszerza się w krokach co 90 stopni, co może wprowadzić błąd, jeśli większość obszaru zainteresowania znajduje się pod kątem 45° do osi macierzy dylatacji. W związku z tym liczba dylatacji nie zawsze musi być dokładnym odwzorowaniem przestrzeni między krawędziami. To ograniczenie zostało rozwiązane przez trygonometryczny współczynnik korekcyjny, ale może zostać zignorowane, jeśli wszystkie obrazy w zestawie danych są wyrównane w tej samej orientacji. Ponadto należy zachować ostrożność przy interpretacji wyników, ponieważ możliwe jest, że płaszczyzny przekroju nie są idealnie prostopadłe do dwóch membran. Na rysunku 9B używamy GJW, aby zasugerować, że nasze obrazy perinexus były w płaszczyźnie. Mimo to konieczne jest, aby rozmiary próbek były wystarczająco duże, aby uwzględnić wszelkie różnice w sekcjach między obrazami. Dodatkowo, nasze pomiary szerokości krocza nie powinny być interpretowane jako odzwierciedlające przestrzenie in vivo , ale to podejście jest używane do pomiaru średnich różnic w szerokości krocza w stosunku do jakiejś interwencji lub stanu choroby.

Obecny algorytm wymaga również ręcznie obrysowanego konturu krawędzi jako danych wejściowych. Należy zauważyć, że tak długo, jak skala jest ustawiona prawidłowo, rozdzielczość przestrzenna nie ma wpływu na pomiary algorytmu, o czym świadczą różne rozdzielczości obrazów na rysunku 6 i dodatkowy obraz o niskiej rozdzielczości w pliku uzupełniającym S6. Kolejnym krokiem w ulepszaniu algorytmu jest usunięcie ingerencji człowieka z generowania konspektu wraz z narzędziem, które może wybrać obszar zainteresowania. Te funkcje prawdopodobnie zwiększyłyby precyzję pomiaru i zmniejszyłyby stronniczość użytkownika.

Ten wydajny obliczeniowo algorytm zapewnia szybszą metodę, wymagającą około jednej piątej roboczogodzin, ilościowego oznaczania pierdomy bez wykrywalnego uszczerbku dla odtwarzalności w porównaniu z ręcznym procesem segmentacji. Ponadto proces ręcznej segmentacji wykorzystuje jeden pomiar co 15 nanometrów w celu ilościowego określenia szerokości okołokończynowej, co może prowadzić do niedostatecznego pobierania próbek, ponieważ separacja błony krocza może się znacznie zmienić w tym zakresie 15 nm. W przeciwieństwie do tego, zautomatyzowany program ma rozdzielczość przestrzenną równą rozdzielczości metody obrazowania, w tym przypadku 2,9 piksela na nanometr wzdłuż długości mięśnia kroczowego, zapewniając w ten sposób bardziej precyzyjnie rozdzielczą średnią szerokość krocza.

Chociaż zastosowania w dziedzinie biologii strukturalnej serca są obiecujące i ekscytujące, zastosowania tego algorytmu nie ograniczają się do obrazów TEM. Każda dziedzina wymagająca precyzyjnego pomiaru w wysokiej rozdzielczości dwóch quasi-równoległych krawędzi 2D może korzystać z tego algorytmu. Algorytm może być używany do śledzenia wszystkiego, od erozji brzegów rzek i wzorców powodziowych na zdjęciach satelitarnych po rozwój naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii jasnego pola lub fluorescencji. Jednym z najbardziej obiecujących potencjalnych zastosowań jest kardiologia i pomiar komorowej frakcji wyrzutowej (EF) za pomocą echokardiografii serca w miejscu opieki nad pacjentem. Obecnie standardową techniką jest metoda dwupłaszczyznowa dysków¹⁷, chociaż nowszy algorytm, AutoEF, jest obecnie najnowocześniejszą metodą kwantyfikacji EF^18,19. W przypadku metody dwupłatowej dysków, dana komora jest ręcznie śledzona i określana ilościowo przy użyciu zmodyfikowanej metody Simpsona, w której całkowita objętość jest automatycznie obliczana przez zsumowanie ułożonych w stos dysków eliptycznych. Głównym ograniczeniem tej metody jest to, że może ona zwrócić tylko całkowite pole przekroju poprzecznego żądanej komory, bez rozdzielczości pozwalającej zidentyfikować określone obszary zainteresowania, a także wymaga znacznego wkładu ludzkiego i wiedzy specjalistycznej. Nowsza metoda, AutoEF, identyfikuje i wyznacza krawędź komory za pomocą algorytmu plamkowania 2D, a następnie oblicza pole przekroju poprzecznego komory. Proces ten, choć precyzyjny i skuteczny w pomiarze dużej powierzchni komorowej, ma również podobne nieodłączne ograniczenie polegające na pomiarze tylko całkowitego pola przekroju poprzecznego. Ta podstawowa wada ogranicza możliwości diagnostyczne i terapeutyczne klinicystów. W przeciwieństwie do tego, algorytm przedstawiony w tym manuskrypcie może zidentyfikować linię środkową i ma rozdzielczość równą rozdzielczości metody obrazowania, aby wskazać określone obszary zainteresowania. Jest to ważne, ponieważ skanery ultradźwiękowe z mikrometryczną rozdzielczością przestrzenną są dostępne na rynku^20,21, co oznacza, że algorytm ten może wykrywać zlokalizowane nieprawidłowości ruchu ścian z rozdzielczością mikrometrów, a nie centymetrów. Chociaż ta aplikacja musi zostać zweryfikowana eksperymentalnie, jest to jedno z najbardziej obiecujących zastosowań tego algorytmu. W rzeczywistości można go łatwo połączyć z możliwościami śledzenia plamek AutoEF lub ręcznymi śladami wykorzystywanymi w ręcznej planimetrii, aby zapewnić informacje o wyższej rozdzielczości równolegle z konwencjonalnymi danymi EF.

Choć obecny algorytm jest wszechstronny i możliwy do zastosowania, został opracowany z myślą o obrazach 2D. Jednak wraz z ciągłym doskonaleniem technologii obrazowania rośnie zapotrzebowanie na technologie kwantyfikacji 3 i 4D. Dlatego kolejną iteracją algorytmu jest dostosowanie tego samego podejścia, polegającego na szeregowym rozszerzaniu obrazu binarnego, do obiektu trójwymiarowego, w którym automatyczne definiowanie linii środkowej jest obecnie poza możliwościami obecnych programów do obrazowania. Taki algorytm miałby szerokie zastosowanie zarówno klinicznie, jak i eksperymentalnie w samej dziedzinie serca, w tym echokardiogramy 3D^22,23, mikroskopia elektronowa 3D 24,25,26 i obrazowanie rezonansu magnetycznego 3D 27,28,29.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monitor z ekranem dotykowym	Dell	S2240T	Wymaga rysika z miękką końcówką
Komputer stacjonarny	Dell	Precision T1650	8 GB pamięci RAM
System operacyjny	Microsoft	Windows 7 Enterprise	64-bitowy system operacyjny
Platforma programu	Mathworks	Matlab R2015b	Program może być niekompatybilny z nowszymi/starszymi wersjami Matlaba