Kwantyfikacja odległości międzybłonowych za pomocą szeregowych dylatacji obrazu

Summary

Celem tego algorytmu jest ciągłe mierzenie odległości między dwoma dwuwymiarowymi krawędziami za pomocą szeregowych dylatacji obrazu i odnajdywania ścieżek. Algorytm ten można zastosować w różnych dziedzinach, takich jak biologia strukturalna serca, biologia naczyniowa i inżynieria lądowa.

Abstract

Niedawno opisana zewnątrzkomórkowa nanodomena, zwana perynecytami, została zamieszana w sprzężenie ephaptyczne, które jest alternatywnym mechanizmem przewodnictwa elektrycznego między kardiomiocytami. Obecna metoda ilościowego określania tej przestrzeni za pomocą ręcznej segmentacji jest powolna i ma niską rozdzielczość przestrzenną. Opracowaliśmy algorytm, który wykorzystuje szeregowe dylatacje obrazu konturu binarnego do zliczania liczby pikseli między dwiema przeciwległymi krawędziami 2-wymiarowymi. Algorytm ten wymaga mniej roboczogodzin i ma wyższą rozdzielczość przestrzenną niż metoda ręczna, przy jednoczesnym zachowaniu powtarzalności procesu ręcznego. W rzeczywistości doświadczeni i początkujący badacze byli w stanie podsumować wyniki poprzedniego badania za pomocą tego nowego algorytmu. Algorytm jest ograniczony przez wkład ludzki potrzebny do ręcznego nakreślenia krocza i moc obliczeniową obciążoną głównie przez istniejący wcześniej algorytm znajdowania ścieżki. Jednak wysoka przepustowość, wysoka rozdzielczość przestrzenna i odtwarzalność algorytmu sprawiają, że jest to wszechstronne i solidne narzędzie pomiarowe do użytku w różnych zastosowaniach wymagających pomiaru odległości między dowolnymi krawędziami 2-wymiarowymi (2D).

Introduction

Następujący algorytm został opracowany do pomiaru odległości międzybłonowej między dwoma strukturalnie sprzężonymi kardiomiocytami w punkcie, w którym oddzielają się od siebie na krawędzi płytki połączenia szczelinowego w nanodomenie zwanej perinexus¹, która została zamieszana w sprzężenie ehaptyczne^2,3,4,5. W procesie analizy setek obrazów perynexiowego mikroskopu elektronowego (TEM) przy użyciu metody ręcznej segmentacji w poprzednim badaniu⁶, zidentyfikowano potrzebę zastosowania metody o wyższej przepustowości, która próbkowałaby szerokość okołokończynową w wyższej rozdzielczości przestrzennej, zachowując dokładność poprzedniego procesu segmentacji ręcznej Podczas segmentacji ręcznej linie są rysowane w odstępach 15 nm, w przybliżeniu prostopadły do linii środkowej, w celu zmierzenia szerokości krocza. Nowy algorytm bierze binarny kontur o grubości jednego piksela składający się z dwóch równoległych linii i wykorzystuje szeregowe dylatacje obrazu do zliczenia liczby pikseli między dwiema membranami. Podczas gdy dylatacje obrazu są powszechnie używane w niezliczonych aplikacjach do przetwarzania obrazu, w tym w wykrywaniu konturów lub krawędzi^7,8, ten algorytm wykorzystuje dylatacje jako mechanizm zliczania. Linia środkowa jest następnie izolowana za pomocą algorytmu odnajdywania ścieżki⁹, a szerokość krocza jest następnie mierzona z rozdzielczością na całej długości perinexus równą rozdzielczości obrazu. Różnica w rozdzielczości w tym przypadku wynosi 1 pomiar na 15 nm w przypadku segmentacji ręcznej i 1 pomiar na 0,34 nm w przypadku nowego algorytmu, co oznacza 44-krotny wzrost częstotliwości próbkowania przestrzennego. Co więcej, ta zwiększona częstotliwość próbkowania jest osiągana w około 1/5 czasu potrzebnego na ręczną segmentację.

Ten algorytm będzie używany w swojej obecnej formie do pomiaru szerokości krocza w konwencjonalnym zakresie 0-150 nm od krawędzi płytki skrzyżowania szczeliny⁵ (GJ), a także w określonym obszarze zainteresowania, gdzie orbita kroczowa wynosi od 30 do 105 nm^2,3,10. Zwiększona częstotliwość próbkowania zmniejsza zmienność w poszczególnych pomiarach krocza w porównaniu z ręczną segmentacją i znacznie skraca czas analizy, pozwalając na sprawne przetwarzanie dużych zbiorów danych. Jednak ten program nie ogranicza się do nanoskalowych obrazów TEM interkalowanych dysków sercowych. To samo podejście można zastosować do ilościowego określenia średnicy naczyń krwionośnych, frakcji wyrzutowej komór, a nawet zjawisk niebiologicznych, takich jak erozja rzek lub powodzie. Algorytm ten jest odpowiedni do ilościowego określania odległości między dowolnymi dwiema quasi-równoległymi krawędziami.

Protocol

UWAGA: Wymagane oprogramowanie to ImageJ (lub podobne oprogramowanie do modyfikacji obrazów) i Matlab R2015. Użytkownik może napotkać problemy ze zgodnością z innymi wersjami Matlaba.

1. Wstępne przetwarzanie obrazów

1. W przypadku dowolnego obrazu w skali szarości upewnij się, że maksymalna wartość intensywności danego piksela wynosi <255. Zazwyczaj odbywa się to poprzez odjęcie wartości 1 od obrazu w niestandardowym programie Matlab "ImageSub.m", zawartym w pliku uzupełniającym S1.

2. Zarys Perinexus

1. Obrysuj perinexus w ImageJ lub innym oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
2. Upewnij się, że kontur ma grubość jednego piksela i jest ustawiony na najwyższą wartość intensywności obrazu (255 w przypadku obrazu w skali szarości od 0 do 255).
3. Zidentyfikuj GJ na podstawie jego struktury pentalaminarnej^11,12 i zdefiniuj początek perinexus jako punkt, w którym dwie przeciwstawne dwuwarstwy błony komórkowej rozchodzą się, jak pokazano w Rysunek 1A. Rozpocznij ~ 200 nm od krawędzi GJ, śledząc wzdłuż wewnętrznej błony pierwszej komórki i z powrotem wzdłuż wewnętrznej błony drugiej komórki. W obrazie ImageJ zwolnij pióro, aby automatycznie zamknąć kontur. To sztuczne zamknięcie zostanie później wycięte.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby obrysować krocze z dużą starannością przy jak największym powiększeniu, ponieważ nawet niewielkie błędy w zastosowaniu konturu mogą spowodować błąd o kilka nanometrów w końcowym pomiarze.

3. Ustawianie algorytmu i wybieranie interesującego użytkownika

UWAGA: Algorytm odnajdywania ścieżek wymaga, aby funkcje AutoGraph, Edge, Graph, Node i Pathfinding⁹ znajdowały się w tym samym katalogu, co plik m MembraneSepDist. Wszystkie pliki można znaleźć w pliku uzupełniającym S1.

1. Wybierz lokalizacje zapisywania danych i rysunków. Są one obecnie zakodowane na stałe w m-file.
   UWAGA: Pierwszy wiersz programu to funkcja do czyszczenia wszystkich zmiennych, zamykania wszystkich okien i czyszczenia okna poleceń. Zapisz dowolne zmienne lub rysunki przed uruchomieniem m-file.
   UWAGA: Zrzuty ekranu oprogramowania znajdują się w pliku uzupełniającym S2 dla wszystkich zakodowanych na stałe wartości.
2. Uruchom program "MembraneSepDist.m".
3. Ustaw parametry.
   UWAGA: Pojawi się graficzny interfejs użytkownika z domyślnymi parametrami progu gradientu, skali, obszaru zainteresowania i ręcznego uruchamiania. Wartości domyślne można zmienić w pliku m lub można je zmienić dla każdego obrazu z osobna.
   1. Ustaw próg gradientu pochodnej przestrzennej.
      UWAGA: Im wyższe wartości, tym więcej punktów jest zaznaczonych w izolacji linii środkowej. Zbyt wysokie lub zbyt niskie wartości (poza zakresem około 3,0-7,9) mogą skutkować nieefektywnością obliczeniową lub nieprecyzyjnym wyborem punktów linii środkowej, co skutkuje nieprecyzyjną izolacją linii środkowej (patrz Rysunek 2A-C).
   2. Ustaw skalę w pikselach/jednostkach skali.
   3. Ustaw dolną i górną granicę przestrzenną dla obszaru zainteresowania.
      UWAGA: Zgodnie z konwencją naszego laboratorium, zdefiniowany obszar zainteresowania znajduje się w odległości od 30 do 105 nm od krawędzi GJ^2,3,10.
   4. Ustaw starty automatyczne/ręczne. W większości przypadków algorytm dokładnie wykrywa punkt początkowy, w którym kończy się skrzyżowanie szczelinowe, a zaczyna perinexus. Jednak w niektórych przypadkach perinexi o nieregularnym kształcie użytkownik musi ręcznie zidentyfikować punkt początkowy. Ustaw tę wartość na 0 dla automatycznego, 1 dla ręcznego.
4. Wybierz żądany obraz.
   UWAGA: Folder wyboru pliku można zmienić w pliku m.
5. Przytnij obraz, aby wybrać interesujący Cię perinexus.
   1. Gdy pojawi się obraz, kursor automatycznie zmieni się w krzyżyk. Przytnij obraz, przeciągając ramkę wokół interesującego Cię krocza (patrz Rysunek 3). Pole przycinania można dostosować za pomocą kwadratów na rogach i bokach, aby je powiększyć lub pomniejszyć.
   2. Podczas przycinania upewnij się, że "otwarty" koniec krocza (najbardziej oddalony od GJ, patrz Rysunek 3) jest przycięty tak, aby dwa kontury błony sięgały krawędzi przyciętego obrazu.
      UWAGA: Zaleca się, aby obraz był pełnoekranowy, aby łatwiej zobaczyć interesujący Cię perinexus i odpowiednio przyciąć.
6. Wybierz końcowe kadrowanie, klikając dwukrotnie kursorem między przeciwległymi krawędziami, które mają być mierzone.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dwukrotne kliknięcie zostało wykonane wewnątrz mięśnia kroczowego. Jeśli program nie zidentyfikuje linii środkowej, uruchom ponownie program i upewnij się, że kliknięcie następuje w mięśniu prostym.
7. Obserwuj końcową linię środkową po pojawieniu się wszystkich dylatacji i nadżerek, aby uzyskać ostateczną ocenę skuteczności programu przez użytkownika.
   UWAGA: Podczas działania programu na ekranie pojawi się okno dialogowe informujące użytkownika, że Matlab nie będzie w stanie przetworzyć żadnych dodatkowych poleceń, dopóki program nie zostanie zakończony. To, jak długo trwa ten proces, zależy od rozmiaru tablicy (obrazu) i mocy obliczeniowej komputera.
8. Jeśli włączony jest ręczny punkt początkowy, obserwuj obraz linii środkowej wyskakujący nad oryginalnym obrazem anatomicznym, wraz z kursorem krzyżyka (patrz Rysunek 2E). Wybierz punkt na zewnątrz perinexus w pobliżu żądanego punktu początkowego.
   UWAGA: Program znajdzie punkt linii środkowej znajdujący się najbliżej wybranego piksela i użyje go jako punktu początkowego.
9. Rejestruj dane.
   UWAGA: Po zakończeniu programu program zwróci zmapowaną linię środkową, wykres szerokości krocza w funkcji odległości od krawędzi GJ. Dodatkowo program zwróci średnią szerokość perineksjalu do 150 nm od krawędzi GJ, a także średnią z określonego obszaru zainteresowania w wierszu poleceń Matlaba. Wartości W_p i odległości od GJ są przechowywane w zmiennej "WpList" lub użytkownik może je ręcznie rejestrować oddzielnie.

4. Rozwiązywanie problemów z algorytmem

1. Jeśli linia środkowa nie jest prawidłowo zidentyfikowana (Rysunek 2A), otwórz rysunek "Gmag" i użyj indeksu, aby zidentyfikować odpowiedni próg gradientu (Rysunek 2C).
2. Jeśli punkt początkowy nie jest prawidłowo zidentyfikowany, należy ustawić punkt początkowy ręcznie (patrz Protokół 3.8).

Results

Metody statystyczne: Dokonano porównań między grupami eksperymentalnymi za pomocą testów t-Studenta. Wartość p < 0,05 jest uważana za istotną, a wszystkie wartości są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe.

Ręczna segmentacja. Kwantyfikacja szerokości nanodomeny krocza przylegającej do GJ (W_p) jest zwykle realizowana przez ręczną segmentację. Ten ręczny proces segmentacji jest pokazany w Rysunek 1A i został opisany wcześniej⁶. Obserwator identyfikuje krawędź GJ (Rysunek 1, czerwona kropka), mierzy 5 nm wzdłuż środka wędrownego i mierzy odległość między błonami w tym punkcie. Proces ten jest następnie powtarzany przy 10, 15, 30 i co 15 nm do 150 nm. Ta technika, choć skuteczna, ma ograniczenia czasowe i przestrzenne niedostateczne próbkowanie na całej długości mięśnia kroczowego.

Średnie pomiary_{W p} z poprzednich badań mogą wahać się od około 10 do 20 nm^2,3,10, a 3 nm wydaje się być średnią różnicą potrzebną do wykrycia istotności statystycznej, która jest znacznie wyższa od przestrzennej częstotliwości Nyquista wynoszącej 0,7 nm na pomiar opartej na rozdzielczości międzypikselowej 0,34 nm. Dlatego, chociaż ręczna segmentacja jest czasochłonna, metoda ta jest wystarczająca do zmierzenia różnic w_{W p} związanych z interwencją lub stanem chorobowym.

Seryjne dylatacje obrazów. W celu szybszego, powtarzalnego pomiaru mięśnia kroczowego z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną, opracowaliśmy program oparty na szeregowych dylatacjach obrazu do zliczania pikseli między dwiema ręcznie śledzonymi błonami, które można zobaczyć w Rysunek 1B.

Proces szeregowego dylatacji jest zilustrowany w Rysunek 4. Gdy obraz binarny jest rozszerzany (Rysunek 4A-4D), ta dylatacja jest następnie odwracana i dodawana do obrazu roboczego - niebinarnej formy oryginalnego konspektu (Rysunek 4E-4H). Proces jest powtarzany, aż konspekt zostanie całkowicie wypełniony (Rysunek 4D). W tym momencie końcowy obraz roboczy (Rysunek 4H) to liczba przypadków, w których dany piksel pozostał nierozszerzony. W związku z tym wartości w pobliżu obrysu błon komórkowych są bardzo niskie, podczas gdy wartości w środku są najwyższe. Zliczając liczbę dylatacji do wypełnienia obszaru w każdym punkcie, można obliczyć odległość między krawędziami membrany. Kolejnym wyzwaniem jest zidentyfikowanie i wyizolowanie linii środkowej w celu ilościowego określenia szerokości okołooksowej w funkcji odległości od GJ, co odbywa się poprzez zastosowanie najpierw pochodnej przestrzennej do końcowego obrazu roboczego ( Rysunek 2 - ostatni obraz i Rysunek 5A). Drugi przykład perinexus o bardziej nieregularnym kształcie można znaleźć w pliku uzupełniającym S3.

Identyfikacja linii środkowej. Gradient końcowego obrazu roboczego można określić ilościowo za pomocą pochodnej przestrzennej, ponieważ wartości liczby dylatacji od krawędzi do krawędzi zmieniają się z wysokiej na niską do wysokiej (Rysunek 5A od lewej do prawej). Biorąc pod uwagę tylko wielkość pochodnej przestrzennej (Rysunek 5B), kontur i linia środkowa, zaznaczone białymi strzałkami, są natychmiast identyfikowalne jako obszary nieciągłości. W tych lokalizacjach kierunek nachylenia zmienia się z rosnącego na malejący lub odwrotnie. Zastosowanie progu (Rysunek 5C) tworzy binarny obraz linii środkowej i konturu, a odjęcie oryginalnego konturu daje izolowaną linię środkową (Rysunek 5D). Chociaż ta metoda izolowania linii środkowej jest wydajna obliczeniowo, próg zastosowany do pochodnej przestrzennej tworzy przerwy w wynikowej linii środkowej. Te luki (Rysunek 5D, wstaw) muszą być wypełnione, aby zapewnić dokładny pomiar odległości od GJ i zapewnić, że perinexus jest mierzony w całości. Najpierw linia środkowa jest rozszerzana w celu wypełnienia wszelkich luk (Rysunek 5E), po której następuje erozja (Rysunek 5F) i funkcja "bwmorph" (operacja = 'skel', n = inf) w celu wyeliminowania jak największej liczby punktów, pozostawiając ciągłą linię środkową, zwiększając w ten sposób wydajność obliczeniową kolejnego algorytmu odnajdywania ścieżki opracowanego przez Wasit Limprasert i dostępnego na MATLAB Central⁹. Ta funkcja dylatacji-erozji tworzy ukończoną linię środkową, która jest połączona z końcowym obrazem roboczym (Rysunek 5G). Jednak ta linia środkowa ma często grubość większą niż jeden piksel i dlatego nie jest precyzyjną izolacją linii środkowej.

Algorytm odnajdywania ścieżki Wasit Limprasert służy do wyznaczania linii środkowej mięśnia prostego. Algorytm odnajdywania ścieżki jest w stanie śledzić najwyższe wartości - w tym przypadku wartości znajdujące się najbliżej środka, które pozostały nierozszerzone przez większość iteracji wzdłuż linii środkowej (Rysunek 5G, wstaw). Wynikiem jest automatyczny ślad linii środkowej, jak pokazano na rysunku Rysunek 6. Izolując linię środkową, szerokość okołokształtu można przedstawić jako funkcję odległości od końca GJ, jak pokazano w Rysunek 6B (u góry), lub jako średnią szerokość określonego obszaru zainteresowania.

Analiza jądra. Ważne jest, aby pamiętać, że zdigitalizowane obrazy są oparte na tablicach kwadratowych, a jądra dylatacji są również oparte na matrycach kwadratowych. Oznacza to, że odległość dylatacji po przekątnej jest większa niż ortogonalna. W związku z tym staraliśmy się następnie ustalić, czy jądro wpłynęło na wyniki algorytmu. W celu ilościowego określenia zmienności specyficznej dla jądra, przeanalizowano pięć różnych kształtów jądra: "Plus" (kształt użyty w powyższych analizach), "X", "Pudełko" i "Linia", zgodnie z opisem w Rysunek 7A. Jądro jest stosowane w każdym niezerowym punkcie obrazu binarnego. Gwiazda w każdym jądrze Rysunek 7A reprezentuje środek, gdzie biały to wartość 1, a to wartość 0 dla jądra dylatacji.

Wpływ każdego jądra na średni pomiar W_p pojedynczego przybliżenie poziomego obrazu perinexal (Rysunek 7B, góra), określony ilościowo przez doświadczonego użytkownika, został określony przez obrócenie obrazu za pomocą polecenia "imrotate" Matlaba i obliczenie W_p w krokach co 10°. Wartości pomiarowe W_p (Rysunek 7B, na dole) zmieniają się wraz z orientacją obrazu w rektyfikowany sinusoidalny sposób z jądrem w kształcie plusa. Najniższe wartości występują, gdy stosunkowo prosty krocz jest zorientowany pionowo lub poziomo. Ani jądra X, Box, ani Line nie zapewniały żadnej przewagi nad jądrem o kształcie plusa. Jądra X i Box dały identyczne wyniki, ale wartości średniego W_p były przesunięte w fazie z jądrem Plus o 45°. Jądro Line nie było w stanie w pełni rozszerzyć obrazu pod pewnymi kątami, co widać po braku danych w zielonym śladzie dla obrazów obróconych o mniej niż 30 lub więcej niż 145°. Tak więc ortogonalne jądro o dylatacji Plus przeszacowało separację błony podczas rozszerzania krocza z osią zorientowaną po przekątnej, na przykład pod kątem około 45°, a jądra X i Box nie doszacowały średniej W_p, gdy długa oś perinexusa również znajdowała się pod kątem 45°. Na podstawie tej analizy opracowaliśmy współczynnik korekcyjny stosowany do wartości uzyskanych w wyniku dylatacji jądrem w kształcie plusa. Aby uwzględnić przeszacowanie separacji membrany związanej z orientacją obrazu, ten współczynnik korekcyjny mnoży się przez zmierzoną wartość szerokości w zależności od orientacji obrazu (równanie 1).

Jeśli θ <45°
W_{p skorygowane} = cosd(θ) * W_{p zmierzone}
Jeżeli θ ≥45°
W_{p skorygowane} = cosd(θ) * W_{p zmierzone} (równanie 1)

W tym równaniu zmierzona wartość W_p jest pierwotną wartością W_p wygenerowaną przez powyższy algorytm, a θ jest kątem obliczonym od poziomu, w stopniach. θ oblicza się, biorąc odwrotność tangensa całkowitej zmiany w kierunku poziomym podzielonej przez całkowitą zmianę kierunku pionowego linii środkowej perinexal. Powyższa poprawka przybliża średni kąt, względem poziomu, krocza (Rysunek 8A, lewy górny) i daje w wyniku pomiar tak, jakby uzyskano go z poziomego perinexus (Rysunek 8A, lewy dół). Uzasadnienie tego równania wynika z faktu, że jądro w kształcie plusa (Rysunek 7A) to zasadniczo dwa jądra w kształcie linii ułożone prostopadle do siebie. W związku z tym poniżej 45° (bliżej poziomu) dylatacje zachodzą w pionie, a zatem pomnożenie przez cosinus kąta daje prawidłowy pomiar. I odwrotnie, dla kątów powyżej 45° (bliżej pionu) dylatacje zachodzą poziomo, a sinus służy do określenia prawidłowego pomiaru. Dokładnie pod kątem 45° sinus i cosinus są równe. Plik uzupełniający S4 zawiera opis tej koncepcji. Należy pamiętać, że ta poprawka jest oparta na kącie średnim i należy zachować ostrożność podczas analizowania kształtów zasadniczo nieliniowych. Proces ten powtórzono na 20 losowo wybranych perinexi, a skorygowane pomiary silnie korelowały z pomiarami uzyskanymi przez ręczne obracanie i ponowną analizę obrazów (Rysunek 8A, po prawej). Aby potwierdzić dokładną korekcję orientacji obrazu, wygenerowano dwa zestawy krawędzi fantomowych (Rysunek 8B, po lewej) i obrócono o 180°. Dzięki korekcie trygonometrycznej algorytm dokładnie zwrócił poprawną wartość w każdej orientacji, niezależnie od rozdzielczości przestrzennej lub rozmiaru obrazu (Rysunek 8B, po prawej).

Aplikacja analityczna i odtwarzalność z korektą orientacji. Przypominając, że poprzednie badania z zastosowaniem ręcznej segmentacji wykazały statystycznie istotne średnie różnice W_p większe lub równe 3 nm, ważne było ustalenie, czy algorytm ten może być wykorzystany do podsumowania poprzednich wyników przy użyciu pełnego zestawu danych. Korzystając z nowego algorytmu, dwóch obserwatorów - jeden doświadczony i jeden niedoświadczony w analizie okołokończynowej (odpowiednio Obs. 1 i Obs. 2) - przeanalizowało te same obrazy z poprzedniego badania⁶, które obejmowało 12 pacjentów, u których zdiagnozowano migotanie przedsionków (AF) przed pobraniem tkanek i 29 pacjentów, którzy nie mieli wcześniej istniejącego migotania przedsionków (No-AF). Doświadczony użytkownik stwierdził, że W_p było znacznie szersze u pacjentów z migotaniem przedsionków niż bez AF (odpowiednio 21,9±2,5 i 18,4±2,0 nm, Ryc. 9A). Wartości te z zastosowanym współczynnikiem korygującym są podobne do wartości podanych wcześniej (odpowiednio 24,4±2,2 nm i 20,7±2,4 nm)⁶. Co ważne, niedoświadczony użytkownik znalazł taką samą istotną różnicę (odpowiednio 22,1±2,8 nm i 20,1±2,6 nm) między stanami chorobowymi z automatycznym programem. Dodatkowo odchylenie standardowe wartości W_p nie zmieniło się wraz ze współczynnikiem korekcyjnym, co wskazuje, że odchylenie standardowe 2-3 nm nie jest artefaktem algorytmu, ale samej struktury i przetwarzania tkankowego. Wyniki te pokazują, że proponowana zautomatyzowana metoda jest w stanie podsumować wyniki poprzednich badań.

Co ważne, perinexus jest niedawno zdefiniowaną strukturą i nie osiągnięto konsensusu co do zakresu bezwzględnych wartości separacji membran przylegających do GJ^2,3. Ponieważ szerokość GJ między błonami zewnętrznymi była wcześniej szacowana na 20 nm¹³, staraliśmy się określić skuteczność algorytmu, mierząc również szerokość GJ. Obaj obserwatorzy nie znaleźli istotnej różnicy między szerokościami połączeń szczelinowych (GJW) u pacjentów z wcześniej istniejącym migotaniem przedsionków lub bez niego (Ryc. 9B). Bezwzględne wartości GJW dla pacjentów z migotaniem przedsionków i bez migotania przedsionków wynosiły odpowiednio 20,5 ± 2,5 nm i 20,3 ± 1,9 nm dla doświadczonego obserwatora oraz 21,0 ± 3,1 nm i 20,0 ± 2,2 nm dla niedoświadczonego obserwatora, podobnie jak wcześniej zgłaszano.

Aby ustalić, czy automatyczny algorytm wymagał mniej czasu na analizę danych niż ręczna segmentacja, zarówno doświadczony, jak i niedoświadczony użytkownik zarejestrował czas potrzebny do ilościowego określenia zestawu treningowego składającego się z 10 obrazów (plik uzupełniający S5). Tabela 1 pokazuje, że doświadczony i niedoświadczony użytkownik skrócił czas analizy odpowiednio o 4,7 i 8,3 razy przy użyciu algorytmu automatycznego w porównaniu z ręcznym podejściem segmentacyjnym, przy około 43-krotnym wzroście rozdzielczości przestrzennej wzdłuż krocza.

Rozwiązywanie problemów z algorytmem. Najczęstszy błąd podczas uruchamiania algorytmu występuje, gdy końcowa linia środkowa nie kończy się na krawędzi obrazu. W takich przypadkach nie wybrano wystarczającej liczby punktów z pochodnej przestrzennej, co powodowało awarię programu i wyświetlanie komunikatu o błędzie informującego użytkownika o wybraniu większego obszaru uprawy lub zwiększeniu progu pochodnej przestrzennej. Narysowanie większego pola kadrowania poprawi niezawodność programu w niektórych przypadkach, ponieważ pochodna przestrzenna zmienia się drastycznie w pobliżu krawędzi figury, co może zakłócić algorytmy znajdowania ścieżki lub wykrywania krawędzi.

Możliwe jest również, że algorytm odnajdywania ścieżki nie zidentyfikuje prawidłowo linii środkowej, nawet jeśli linia środkowa dochodzi do krawędzi obrazu, szczególnie jeśli próg gradientu jest zbyt niski (Rysunek 2A). Jeśli próg nachylenia zostanie ustawiony zbyt wysoko, w algorytmie odnajdywania ścieżki pojawi się więcej niepotrzebnych punktów (Rysunek 2B), co zmniejszy wydajność obliczeniową. Jeśli użytkownik nie jest w stanie określić odpowiedniego progu, tablica obrazów "GMag" (Rysunek 2C), która jest generowana przez program i znajduje się w obszarze roboczym, może pomóc użytkownikowi w określeniu progu. Znajdź punkty wzdłuż linii środkowej i ustaw próg nieco powyżej ich wartości indeksu, aby upewnić się, że te punkty są zaznaczone. W podanym przykładzie odpowiedni próg byłby powyżej ~5,1 (Rysunek 2C, wstaw).

Punkt początkowy może również nie dotrzeć do początku perinexus (Rysunek 2D). W takim przypadku uruchom ponownie program i ustaw wartość Manual Start (Start ręczny) na 1. Po wyizolowaniu linii środkowej użytkownik wybiera punkt poza perinexus, a punkt linii środkowej znajdujący się najbliżej wybranego piksela (Rysunek 2E, czerwony kwadrat) zostanie ustawiony jako punkt początkowy. Wynikiem jest pełna linia środkowa (Rysunek 2F).

Rysunek 1: Obrazy TEM z procesami kwantyfikacji. Proces ręcznej segmentacji (A) wymaga od użytkownika wykonania 12 indywidualnych pomiarów międzybłonowych przy jednoczesnym oszacowaniu linii środkowej. Proces automatyczny (B) wymaga ręcznego, ciągłego śledzenia konturu mięśnia kręgowego. Czerwona kropka na każdym obrazie reprezentuje zidentyfikowany przez użytkownika koniec GJ i początek perinexus. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rozwiązywanie problemów z linią środkową. Dwa podstawowe tryby niepowodzenia identyfikacji linii środkowej i ich rozwiązań: Każdy obraz jest oznaczony nazwą tablicy w Matlabie. Jeśli próg nachylenia jest zbyt niski (A, próg 0,2), algorytm linii środkowej może zakończyć się niepowodzeniem. Ustawienie zbyt wysokiego progu (B, próg 70) może zmniejszyć wydajność obliczeniową algorytmu odnajdywania ścieżki. Odpowiedni próg gradientu można określić na podstawie tablicy GMag (C, insert). Jeśli linia środkowa nie dotrze do początkowej krawędzi krocza (D), użytkownik może zdecydować się na ręczny wybór punktu początkowego. Po ustawieniu opcji "Punkt początkowy" na 1 w otwierającym graficznym interfejsie użytkownika, użytkownik wybiera punkt poza interesującym go perinexus (E). Efektem końcowym powinna być linia środkowa, która dokładnie przedstawia całość mięśnia kroczowego (F). Wszystkie etykiety w cudzysłowach (A-F) odpowiadają nazwom zmiennych w Matlabie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wybór Perinexus. Aby przyciąć perinexus, kliknij i przytrzymaj, aby przeciągnąć wokół niego ramkę (narzędzie do przycinania jest wybierane automatycznie), jak pokazano niebieską strzałką. To pudełko można regulować za pomocą kwadratów po bokach i rogach, aby je powiększyć lub pomniejszyć. Zielona strzałka reprezentuje koniec mięśnia kroczowego, który użytkownik powinien upewnić się, że pozostaje "otwarty". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Rozszerzenia obrazu szeregowego. Kontur binarny jest wielokrotnie rozszerzany w krokach co jeden piksel (A-D) i dodawany do obrazu roboczego (niebinarna forma obrazu, E-H) po każdym rozszerzeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Izolacja linii środkowej i odnajdywanie ścieżki. Pochodna przestrzenna jest obliczana na podstawie końcowego obrazu roboczego (A), a wielkość tej pochodnej przestrzennej (B) jest używana do wyodrębnienia konturu i linii środkowej (białe strzałki). Zdefiniowany przez użytkownika próg identyfikuje kontur i linię środkową, a odjęcie oryginalnego konturu daje linię środkową (D). Jednak w wyniku progu pojawiają się przerwy w linii środkowej (D - wstaw). Aby wytworzyć ciągłą linię środkową, na izolowanej linii środkowej (E) przeprowadza się wtórną dylatację, po której następuje wtórna erozja w celu zwiększenia wydajności obliczeniowej kolejnego algorytmu znajdowania ścieżki. Ten zerodowany obraz (F) jest następnie łączony z końcowym obrazem roboczym, co pozwala na identyfikację ciągłej linii środkowej o grubości jednego piksela (G - insert). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Końcowa prezentacja danych. Program wyprowadza ostateczny kontur na oryginalny obraz TEM (A). Linia jest oznaczona kolorem zielonym dla 0-150 nm, niebieskim dla zdefiniowanego przez użytkownika obszaru zainteresowania i czerwonym dla obszaru powyżej 150 nm. Dodatkowo program wyprowadza podobnie oznaczony kolorami wykres przedstawiający W_p w funkcji odległości od początku perinexus i dla obszaru zainteresowania (B), a także średnią W_p (wstawka na odpowiednim wykresie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Analiza kształtu jądra dylatacji. Kształty jąder dylatacji (A): gwiazda w środku reprezentuje rozszerzone piksele. Białe pola to piksele, na które wpływa dylatacja, w kształcie plusa, X, ramki lub linii. W przybliżeniu poziomy perinexus (B, góra, z czerwoną linią wskazującą 0°) był obracany zgodnie z ruchem wskazówek zegara od 0 do 180° w krokach co 10° i wielokrotnie rozszerzany przy użyciu różnych kształtów jądra (B, dół). Jądra w kształcie plusa i linii dają podobne wyniki, chociaż jądro liniowe ulega uszkodzeniu w pewnych orientacjach, podczas gdy jądra w kształcie pudełka i litery X są przesunięte w fazie o 45°. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Korekcja orientacji obrazu. Aby skorygować orientację obrazu, średni kąt krocza oblicza się na podstawie położenia punktu początkowego i końcowego (A, po lewej, początek i koniec czarnej linii). Odwrotność tangensa zmiany kierunku y (A, w lewo, zielona linia) podzielona przez zmianę w kierunku x (A, w lewo, czerwona linia) daje kąt korekcji, θ (A, w lewo, żółty). Celem jest następnie skorygowanie średniej wartości_Wp, aby uzyskać minimalną odległość między krawędziami, tak jakby perinexus został zobrazowany w przybliżeniu poziomo (A, po lewej poniżej). Zastosowanie współczynnika korekcyjnego opisanego w równaniu 1 porównano z ręcznym obracaniem każdego z 15 losowo wybranych obrazów za pomocą obliczonego θ przed analizą. Skorygowane wartości silnie skorelowane z wartościami obróconego obrazu (R² = 0,991, A, po prawej), co wskazuje, że równanie 1 jest prawidłowym współczynnikiem korekcji dla orientacji obrazu. Aby potwierdzić, że współczynnik korekcyjny jest odpowiedni, wygenerowano dwa fantomy o idealnie równoległych krawędziach o znanej odległości między nimi (B, po lewej). Phantom 1 i Phantom 2 mają rozdzielczość przestrzenną odpowiednio 2,833 piksela/mm i 71,6 piksela/cal. Jak pokazują niebieskie romby i czerwone kwadraty w B, po prawej, algorytm dokładnie oblicza ich szerokość w zakresie obrotu obrazu o 180 stopni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Powtarzalność algorytmu. Korzystając z automatycznego procesu z korekcją orientacji obrazu, zarówno doświadczony, jak i niedoświadczony obserwator odkrył znaczące różnice między grupami AF i bez AF (A), zgodne z poprzednim badaniem, wykrywając minimalną różnicę 2,6 nm. Dodatkowo żaden z obserwatorów nie stwierdził istotnej różnicy w DMC (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ręcznie Automatyczne Czas - Obs. 1 (s) 205±11 Księga 44±14 Czas - Obs. 2 (s) 248±18 30±5 Rozdzielczość przestrzenna (pomiary/nm) 0,08 pkt. Godzina 3,45

Tabela 1: Porównanie procesów ręcznych i automatycznych. Obaj obserwatorzy potrzebowali mniej czasu na prześledzenie konturu na obraz niż na wykonanie ręcznego procesu segmentacji dla zestawu treningowego składającego się z 10 obrazów. Dodatkowo proces automatyczny ma wyższą częstotliwość próbkowania, rejestrując 3,45 pomiarów na nm, w porównaniu do średnio 1 pomiaru co 12,5 nm w przypadku procesu ręcznego. Obrazy zestawu treningowego można znaleźć w pliku uzupełniającym S5, wraz z konturami i pomiarami wykonanymi przez doświadczonego użytkownika.

Discussion

Algorytm wykorzystuje szeregowe dylatacje obrazu do zliczania liczby pikseli między dwiema przeciwległymi krawędziami 2D w obrazie binarnym, co w tym przypadku jest separacją międzybłonową krocza ^2,3,14. Pochodna przestrzenna i algorytm znajdowania ścieżki są następnie używane do izolowania linii środkowej, po której następuje wtórna sekwencja dylatacji i erozji w celu wypełnienia luk w linii środkowej, podobnie jak to miało miejsce przed¹⁵. Linia środkowa jest następnie łączona z końcowym obrazem dylatacji, aby przedstawić szerokość krocza w funkcji odległości od początku separacji krawędzi, w tym przypadku końca GJ i początku mięśnia kroczącego¹⁶.

Cztery podstawowe parametry są definiowane przez użytkownika w graficznym interfejsie użytkownika na początku programu:

1. Próg nachylenia
2. Skala
3. Zakres obszaru zainteresowania
4. Metoda wyboru punktu początkowego (automatyczna lub ręczna)

Najczęstszym mechanizmem niepowodzenia algorytmu jest niemożność dotarcia linii środkowej do krawędzi obrazu, czyli w jaki sposób określa się punkt końcowy dla algorytmu odnajdywania ścieżki. Aby rozwiązać taki problem, użytkownik może zwiększyć próg nachylenia opisany w kroku 3.3.1, co spowoduje, że program wybierze więcej punktów z obrazu pochodnej przestrzennej, co wydłuży czas obliczeń wymagany przez algorytm odnajdywania ścieżki. W związku z tym algorytm ten wymaga kompromisu między szybkością obliczeń a integralnością linii środkowej. Należy zauważyć, że tak długo, jak wszystkie punkty linii środkowej są identyfikowane z pochodnej przestrzennej, wraz z odpowiednim punktem początkowym, próg pochodnej przestrzennej nie będzie miał wpływu na pomiar separacji krawędzi.

Orientacja obrazu wydaje się wpływać na wartości dylatacji, ponieważ jądro rozszerza się w krokach co 90 stopni, co może wprowadzić błąd, jeśli większość obszaru zainteresowania znajduje się pod kątem 45° do osi macierzy dylatacji. W związku z tym liczba dylatacji nie zawsze musi być dokładnym odwzorowaniem przestrzeni między krawędziami. To ograniczenie zostało rozwiązane przez trygonometryczny współczynnik korekcyjny, ale może zostać zignorowane, jeśli wszystkie obrazy w zestawie danych są wyrównane w tej samej orientacji. Ponadto należy zachować ostrożność przy interpretacji wyników, ponieważ możliwe jest, że płaszczyzny przekroju nie są idealnie prostopadłe do dwóch membran. Na rysunku 9B używamy GJW, aby zasugerować, że nasze obrazy perinexus były w płaszczyźnie. Mimo to konieczne jest, aby rozmiary próbek były wystarczająco duże, aby uwzględnić wszelkie różnice w sekcjach między obrazami. Dodatkowo, nasze pomiary szerokości krocza nie powinny być interpretowane jako odzwierciedlające przestrzenie in vivo , ale to podejście jest używane do pomiaru średnich różnic w szerokości krocza w stosunku do jakiejś interwencji lub stanu choroby.

Obecny algorytm wymaga również ręcznie obrysowanego konturu krawędzi jako danych wejściowych. Należy zauważyć, że tak długo, jak skala jest ustawiona prawidłowo, rozdzielczość przestrzenna nie ma wpływu na pomiary algorytmu, o czym świadczą różne rozdzielczości obrazów na rysunku 6 i dodatkowy obraz o niskiej rozdzielczości w pliku uzupełniającym S6. Kolejnym krokiem w ulepszaniu algorytmu jest usunięcie ingerencji człowieka z generowania konspektu wraz z narzędziem, które może wybrać obszar zainteresowania. Te funkcje prawdopodobnie zwiększyłyby precyzję pomiaru i zmniejszyłyby stronniczość użytkownika.

Ten wydajny obliczeniowo algorytm zapewnia szybszą metodę, wymagającą około jednej piątej roboczogodzin, ilościowego oznaczania pierdomy bez wykrywalnego uszczerbku dla odtwarzalności w porównaniu z ręcznym procesem segmentacji. Ponadto proces ręcznej segmentacji wykorzystuje jeden pomiar co 15 nanometrów w celu ilościowego określenia szerokości okołokończynowej, co może prowadzić do niedostatecznego pobierania próbek, ponieważ separacja błony krocza może się znacznie zmienić w tym zakresie 15 nm. W przeciwieństwie do tego, zautomatyzowany program ma rozdzielczość przestrzenną równą rozdzielczości metody obrazowania, w tym przypadku 2,9 piksela na nanometr wzdłuż długości mięśnia kroczowego, zapewniając w ten sposób bardziej precyzyjnie rozdzielczą średnią szerokość krocza.

Chociaż zastosowania w dziedzinie biologii strukturalnej serca są obiecujące i ekscytujące, zastosowania tego algorytmu nie ograniczają się do obrazów TEM. Każda dziedzina wymagająca precyzyjnego pomiaru w wysokiej rozdzielczości dwóch quasi-równoległych krawędzi 2D może korzystać z tego algorytmu. Algorytm może być używany do śledzenia wszystkiego, od erozji brzegów rzek i wzorców powodziowych na zdjęciach satelitarnych po rozwój naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii jasnego pola lub fluorescencji. Jednym z najbardziej obiecujących potencjalnych zastosowań jest kardiologia i pomiar komorowej frakcji wyrzutowej (EF) za pomocą echokardiografii serca w miejscu opieki nad pacjentem. Obecnie standardową techniką jest metoda dwupłaszczyznowa dysków¹⁷, chociaż nowszy algorytm, AutoEF, jest obecnie najnowocześniejszą metodą kwantyfikacji EF^18,19. W przypadku metody dwupłatowej dysków, dana komora jest ręcznie śledzona i określana ilościowo przy użyciu zmodyfikowanej metody Simpsona, w której całkowita objętość jest automatycznie obliczana przez zsumowanie ułożonych w stos dysków eliptycznych. Głównym ograniczeniem tej metody jest to, że może ona zwrócić tylko całkowite pole przekroju poprzecznego żądanej komory, bez rozdzielczości pozwalającej zidentyfikować określone obszary zainteresowania, a także wymaga znacznego wkładu ludzkiego i wiedzy specjalistycznej. Nowsza metoda, AutoEF, identyfikuje i wyznacza krawędź komory za pomocą algorytmu plamkowania 2D, a następnie oblicza pole przekroju poprzecznego komory. Proces ten, choć precyzyjny i skuteczny w pomiarze dużej powierzchni komorowej, ma również podobne nieodłączne ograniczenie polegające na pomiarze tylko całkowitego pola przekroju poprzecznego. Ta podstawowa wada ogranicza możliwości diagnostyczne i terapeutyczne klinicystów. W przeciwieństwie do tego, algorytm przedstawiony w tym manuskrypcie może zidentyfikować linię środkową i ma rozdzielczość równą rozdzielczości metody obrazowania, aby wskazać określone obszary zainteresowania. Jest to ważne, ponieważ skanery ultradźwiękowe z mikrometryczną rozdzielczością przestrzenną są dostępne na rynku^20,21, co oznacza, że algorytm ten może wykrywać zlokalizowane nieprawidłowości ruchu ścian z rozdzielczością mikrometrów, a nie centymetrów. Chociaż ta aplikacja musi zostać zweryfikowana eksperymentalnie, jest to jedno z najbardziej obiecujących zastosowań tego algorytmu. W rzeczywistości można go łatwo połączyć z możliwościami śledzenia plamek AutoEF lub ręcznymi śladami wykorzystywanymi w ręcznej planimetrii, aby zapewnić informacje o wyższej rozdzielczości równolegle z konwencjonalnymi danymi EF.

Choć obecny algorytm jest wszechstronny i możliwy do zastosowania, został opracowany z myślą o obrazach 2D. Jednak wraz z ciągłym doskonaleniem technologii obrazowania rośnie zapotrzebowanie na technologie kwantyfikacji 3 i 4D. Dlatego kolejną iteracją algorytmu jest dostosowanie tego samego podejścia, polegającego na szeregowym rozszerzaniu obrazu binarnego, do obiektu trójwymiarowego, w którym automatyczne definiowanie linii środkowej jest obecnie poza możliwościami obecnych programów do obrazowania. Taki algorytm miałby szerokie zastosowanie zarówno klinicznie, jak i eksperymentalnie w samej dziedzinie serca, w tym echokardiogramy 3D^22,23, mikroskopia elektronowa 3D 24,25,26 i obrazowanie rezonansu magnetycznego 3D 27,28,29.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Monitor z ekranem dotykowym	Dell	S2240T	Wymaga rysika z miękką końcówką
Komputer stacjonarny	Dell	Precision T1650	8 GB pamięci RAM
System operacyjny	Microsoft	Windows 7 Enterprise	64-bitowy system operacyjny
Platforma programu	Mathworks	Matlab R2015b	Program może być niekompatybilny z nowszymi/starszymi wersjami Matlaba