Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Summary

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Abstract

Mikroskopia fluorescencyjna to potężne narzędzie do wykrywania cząsteczek biologicznych in situ oraz monitorowania ich dynamiki i interakcji w czasie rzeczywistym. Oprócz konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej opracowano różne techniki obrazowania, aby osiągnąć określone cele eksperymentalne. Niektóre z szeroko stosowanych technik obejmują transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET), który może zgłaszać zmiany konformacyjne i interakcje molekularne z rozdzielczością angstremów, oraz obrazowanie superrozdzielcze (SR) oparte na detekcji pojedynczych cząsteczek, które może zwiększyć rozdzielczość przestrzenną około dziesięć do dwudziestu razy w porównaniu z mikroskopią o ograniczonej dyfrakcji. Prezentujemy tutaj zaprojektowany przez klienta zintegrowany system, który łączy wiele metod obrazowania w jednym mikroskopie, w tym konwencjonalne obrazowanie epifluorescencyjne, obrazowanie SR oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorową detekcję pojedynczych cząsteczek, w tym obrazowanie smFRET. Różne metody obrazowania można łatwo i powtarzalnie uzyskać poprzez wymianę elementów optycznych. Taka konfiguracja jest łatwa do przyjęcia przez każde laboratorium badawcze w naukach biologicznych, które wymaga rutynowych i zróżnicowanych eksperymentów obrazowych przy zmniejszonych kosztach i przestrzeni w porównaniu z budową oddzielnych mikroskopów do indywidualnych celów.

Introduction

Mikroskopy fluorescencyjne są ważnymi narzędziami dla nowoczesnych badań biologicznych, a obrazowanie fluorescencyjne jest rutynowo wykonywane w wielu laboratoriach biologicznych. Oznaczając interesujące nas biomolekuły fluoroforami, możemy bezpośrednio wizualizować je pod mikroskopem i rejestrować zależne od czasu zmiany w lokalizacji, konformacji, interakcji i stanie składania in vivo lub in vitro. Konwencjonalne mikroskopy fluorescencyjne mają ograniczoną dyfrakcją rozdzielczość przestrzenną, która wynosi ~200 - 300 nm w kierunku bocznym i ~500 - 700 nm w kierunku osiowym^1,2, a zatem są ograniczone do obrazowania w skali 100 nanometrów na mikrony. Aby ujawnić drobniejsze szczegóły w zespole lub organizacji molekularnej, opracowano różne mikroskopie SR, które mogą przekroczyć granicę dyfrakcji. Strategie stosowane do osiągnięcia SR obejmują nieliniowe efekty optyczne, takie jak mikroskopia wymuszonego zubożenia emisji (STED)^3,4 i mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM)^5,6,7, stochastyczne wykrywanie pojedynczych cząsteczek, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)⁸ oraz mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM)⁹ oraz kombinacja obu, np. MINFLUX¹⁰. Wśród tych mikroskopów SR, mikroskopy SR oparte na detekcji pojedynczych cząsteczek mogą być stosunkowo łatwo modyfikowane z zestawu mikroskopu jednocząsteczkowego. Dzięki powtarzalnej aktywacji i obrazowaniu fotoaktywowalnych białek fluorescencyjnych (FP) lub fotoprzełączalnych barwników oznaczonych na interesujących biomolekułach, rozdzielczość przestrzenna może osiągnąć 10 - 20 nm¹¹. Aby uzyskać informacje na temat oddziaływań molekularnych i dynamiki konformacyjnej w czasie rzeczywistym, wymagana jest rozdzielczość od angstrema do nanometrów. smFRET^12,13 jest jednym ze sposobów osiągnięcia tego rozwiązania. Ogólnie rzecz biorąc, w zależności od interesujących nas kwestii biologicznych, potrzebne są metody obrazowania o różnych rozdzielczościach przestrzennych.

Zazwyczaj, dla każdego rodzaju obrazowania, wymagana jest specyficzna konfiguracja optyczna wzbudzenia i/lub emisji. Na przykład jedną z najczęściej stosowanych metod oświetlenia do wykrywania pojedynczych cząsteczek jest całkowite odbicie wewnętrzne (TIR), w którym należy osiągnąć określony kąt wzbudzenia przez pryzmat lub soczewkę obiektywu. W celu detekcji smFRET emisje zarówno barwników donorowych, jak i akceptorowych muszą być przestrzennie oddzielone i skierowane do różnych części urządzenia zwielokrotniającego elektrony ze sprzężeniem ładunkowym (EMCCD), co można osiągnąć za pomocą zestawu luster i dichroicznych rozdzielaczy wiązki umieszczonych na ścieżce emisji. W przypadku trójwymiarowego (3-D) obrazowania SR komponent optyczny, taki jak soczewka cylindryczna¹⁴, jest potrzebny do wywołania efektu astygmatyzmu na ścieżce emisji. W związku z tym domowe lub dostępne na rynku mikroskopy zintegrowane są zazwyczaj funkcjonalnie wyspecjalizowane dla każdego typu metody obrazowania i nie są elastyczne w przełączaniu się między różnymi metodami obrazowania przy użyciu tej samej konfiguracji. Poniżej przedstawiamy ekonomiczny, hybrydowy system, który zapewnia regulowane i powtarzalne przełączanie między trzema różnymi metodami obrazowania: konwencjonalnym obrazowaniem epi-fluorescencyjnym z rozdzielczością ograniczoną dyfrakcją, obrazowaniem SR opartym na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowym wykrywaniem pojedynczych cząsteczek, w tym obrazowaniem smFRET (Rysunek 1A). W szczególności prezentowana tutaj konfiguracja zawiera sprzężone światłowody lasery wejściowe do wzbudzenia wielokolorowego oraz komercyjne ramię oświetleniowe na ścieżce wzbudzenia, które umożliwia zaprogramowaną kontrolę kąta wzbudzenia, przełączanie między trybem epi a trybem TIR. Na ścieżce emisji w korpusie mikroskopu umieszcza się wyjmowaną cylindryczną kasetę obiektywu do obrazowania 3D SR, a komercyjny rozdzielacz wiązki jest umieszczany przed kamerą EMCCD, którą można selektywnie włączyć do jednoczesnego wykrywania wielu kanałów emisji.

Protocol

1. Projektowanie i montaż mikroskopu

1. Ścieżka wzbudzenia
   UWAGA: Ścieżka wzbudzenia obejmuje lasery, elementy kontrastu różnicowego (DIC), korpus mikroskopu i jego ramię oświetleniowe.
   1. Przygotuj stół optyczny z izolacją drgań. Na przykład tabela tłumienia strukturalnego o wymiarach 48 x 96 x 12 cali zapewnia wystarczająco dużo miejsca na wszystkie komponenty.
      UWAGA: Zbuduj konfigurację w pomieszczeniu z regulacją temperatury (np. 21.4 ± 0.55 °C). Stabilność temperatury ma kluczowe znaczenie dla utrzymania wyrównania optycznego.
   2. Zainstaluj korpus mikroskopu, który jest wyposażony w ramię oświetleniowe do podłączenia światłowodu, 100-krotną soczewkę obiektywu TIRF zanurzoną w oleju i komponenty DIC.
   3. Umieść cztery głowice laserowe (647 nm, 561 nm, 488 nm i 405 nm, otoczone Rysunek 1B) i ich radiatory na stole optycznym i upewnij się, że emitowane wiązki laserowe mają tę samą wysokość i są tak krótkie, jak to możliwe, aby zapewnić dobrą stabilność (np. 3'').
      UWAGA: Jeśli głowica laserowa znajduje się na mniejszej wysokości niż inne lasery, umieść pod nią aluminiową płytkę o odpowiedniej grubości. Zawsze upewnij się, że maksymalny kontakt między radiatorami a stołem optycznym zapewnia najlepsze odprowadzanie ciepła ( Rysunek 1B). Lasery muszą być wystarczająco mocne do obrazowania SR. Zobacz tabelę materiałów. Zaleca się, aby przed laserami diodowymi znajdowały się filtry do czyszczenia laserowego.
   4. Zainstaluj kartę do akwizycji danych za pośrednictwem interfejsu PCI (Peripheral Component Interconnect) w stacji roboczej i podłącz lasery za pomocą tej karty. Kontroluj zachowanie laserów podczas włączania/wyłączania za pomocą wyjścia logiki tranzystorowo-tranzystorowej (TTL) oraz regulację ich mocy za pomocą wyjścia analogowego tej karty (Rysunek 1C). Zainstaluj odpowiednie oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego (komercyjne lub domowe), aby sterować kartą akwizycji danych, a także korpusem mikroskopu.
   5. Zamontuj lustra i dichroiczne rozdzielacze wiązki (filtry długoprzepustowe 590, 525 i 470) do odpowiednich mocowań. Używaj bardzo stabilnych mocowań lusterek do lusterek. Używaj okrągłych rozdzielaczy z pierścieniami ustalającymi, aby uniknąć zginania rozdzielaczy wiązki dichroicznej (Rysunek 1D).
   6. Umieść lustra i rozdzielacze wiązki dichroicznej na stole optycznym, aby połączyć wiązki laserowe (Rysunek 1B). Aby uzyskać najbardziej stabilne wyrównanie, spraw, aby cały układ był tak kompaktowy, jak to tylko możliwe, i użyj słupków optycznych o grubości 1 ''. Ułóż lasery tak, aby lasery o krótszej długości fali znajdowały się bliżej sprzężenia światłowodu (Rysunek 1B), ponieważ światła o krótkiej długości fali rozpraszają się bardziej w powietrzu.
   7. Połącz wiązki laserowe w światłowód jednomodowy. Aby to zrobić, zbuduj łącznik światłowodowy w systemie klatek, wykonując następujące czynności:
      1. Zamontuj płytkę adaptera światłowodowego w uchwycie translacyjnym osi z (Rysunek 1E, skrajny lewy panel).
      2. Zamontuj achromatyczny obiektyw dubletowy (ogniskowa = 7,5 mm) w płycie klatkowej (Rysunek 1E, drugi panel od lewej).
      3. Połącz dwie powyższe części za pomocą prętów przedłużających, aby utworzyć klatkę. Zamontuj klatkę na stole optycznym za pomocą wsporników montażowych na słupkach optycznych o grubości 1'' (Rysunek 1E, panel środkowy).
      4. Najpierw wyrównaj laser 647 nm ze światłowodem jednomodowym (końcówka FC/APC do łącznika).
         UWAGA: Zgrubne wyrównanie przy użyciu światłowodu wielomodowego przed użyciem światłowodu jednomodowego może pomóc w procesie wyrównania. Dostosuj kąty zwierciadeł i dichroicznych rozdzielaczy wiązki ( Rysunek 1D, za pomocą pokręteł regulacyjnych), a także odległość między achromatyczną soczewką dubletową a płytą adaptera światłowodowego (Rysunek 1E, dostosowując mocowanie translacji osi z), aby uzyskać maksymalną moc wyjściową lasera przez światłowód.
      5. Po zakończeniu wyrównania pierwszego lasera tymczasowo zainstaluj parę przysłon i wyrównaj resztę laserów jeden po drugim (Rysunek 1F). Sprawdź wydajność osiowania za pomocą miernika mocy.
      6. Pozostaw jedną przysłonę z przodu płyty adaptera, aby zmniejszyć odbicia laserów.
         UWAGA: Silne odbicia wsteczne mogą skrócić żywotność źródeł laserowych. Opcjonalnie przed każdą głowicą lasera można zainstalować izolator optyczny, aby całkowicie usunąć odbicia.
   8. Podłącz drugi koniec światłowodu do ramienia oświetleniowego mikroskopu ( Rysunek 1H).
   9. Zaprojektuj i zainstaluj "soczewkę powiększającą (soczewkę mag)" wykonując następujące czynności:
      UWAGA: Lasery mogą być używane do obrazowania epifluorescencyjnego próbki, ale wąski rozmiar wiązki każdego lasera ogranicza oświetlany obszar próbki do obszaru kilkakrotnie mniejszego niż rzeczywisty rozmiar odpowiedniego czujnika kamery, szczególnie w przypadku nowszych kamer (o długości przekątnej 18,8 mm w porównaniu z konwencjonalną długością 11,6 mm). Dlatego pożądane jest rozszerzenie wiązki w celu uzyskania większego i bardziej płaskiego oświetlenia próbki.
      1. Zaprojektuj soczewkę magazynkową, która zmieści się w ramieniu oświetleniowym (Rysunek 1H).
         UWAGA: Konstrukcja soczewki magnetycznej zależy od miejsca, w którym zostanie zainstalowana. Rysunek 1H pokazuje przykład instalacji w ramieniu oświetleniowym, ale może być ona zainstalowana w dowolnym miejscu po skolimowaniu wiązek laserowych (patrz Dyskusja). Zaprojektuj go za pomocą oprogramowania do projektowania i kreślenia wspomaganego komputerowo.
      2. Umieść dwie soczewki achromatyczne, jedną wklęsłą (ogniskowa = f₁) i jedną wypukłą (ogniskowa = f₂) w domowej roboty uchwycie obiektywu magnetycznego (Rysunek 2A i 2C), z odległością równą sumie ich ogniskowych, f₁ + f₂ = (-25) + 50 = 25 mm (Rysunek 2B).
         UWAGA: Przy takim wyborze ogniskowych obiektyw magnetyczny rozszerza wiązkę o f₂/|f₁| = 2 krotności. Obiektyw magnetyczny zapewnia wszechstronność. Można go zdjąć, aby wznowić regularne oświetlenie bez rozszerzania wiązek (Rysunek 2D) lub włożyć w odwrotnym kierunku, aby skupić wiązkę laserową w celu uzyskania większej intensywności wzbudzenia.

2. Ścieżka emisji

UWAGA: Ścieżka emisji składa się z wymiennego cylindrycznego obiektywu, koła filtra barierowego, rozdzielacza emisji i kamery EMCCD (Rysunek 1G). Aby uzyskać najlepszą funkcję rozproszenia punktowego (PSF) pojedynczych cząsteczek, pryzmat DIC jest umieszczany z dala od soczewki obiektywu.

1. Zaprojektuj na zamówienie kasetę z cylindryczną soczewką (soczewką 3D), która może zmieścić się w gnieździe wkładki ręcznego analizatora DIC w korpusie mikroskopu (Rysunek 3C).
   UWAGA: Ta konstrukcja nie zagraża analizatorowi DIC, ponieważ blok analizatora można umieścić w wieżyczce filtra.
2. Umieść soczewkę 3D o ogniskowej 10 m w kasecie i włóż ją do ścieżki wiązki emisyjnej, aby uzyskać efekt astygmatyzmu niezbędny do wyodrębnienia współrzędnej z każdej cząsteczki¹⁴.
   UWAGA: Opcjonalnie kasetę obiektywu 3D można umieścić w ścieżce emisji lub poza nią (Rysunek 3C).
3. Zainstaluj wielopasmowy rozdzielacz wiązki dichroicznej w wieżyczce filtra wewnątrz korpusu mikroskopu.
4. Zainstaluj filtry emisji.
   UWAGA: Filtry emisyjne dobierane są w zależności od preferowanych fluoroforów. W zależności od modułu obrazowania, filtry emisyjne umieszczone w różnych lokalizacjach są używane zgodnie z poniższym opisem:
   1. Do sekwencyjnego wielokolorowego obrazowania epi-fluorescencyjnego lub obrazowania SR należy użyć filtrów emisyjnych umieszczonych w kole filtrów barierowych podłączonym obok korpusu mikroskopu, aby zminimalizować wibracje w korpusie mikroskopu podczas przełączania kanałów (rysunek 1G).
   2. W celu jednoczesnego wykrywania wielu kolorów (np. eksperymenty smFRET), umieść inny zestaw filtrów w rozdzielaczu emisji (szczegóły w kroku 4).
      UWAGA: Zazwyczaj komercyjny rozdzielacz emisji ma dwa przełączane tryby (tj. tryb "włączony" lub "obejściowy"). Do chromatycznego rozdzielania świateł emisyjnych w celu jednoczesnego obrazowania wielokolorowego (tryb "włączony"), stosuje się sześcian filtra zawierający dwa dichroiczne rozdzielacze wiązki i trzy filtry emisyjne ("potrójny sześcian", Rysunek 4C i 4D). Pusta szczelina w kole filtra bariery jest używana w połączeniu z potrójną kostką. Z drugiej strony, w przypadku sekwencyjnego obrazowania wielokolorowego, potrójny sześcian jest zastępowany sześcianem, który ma tylko lustro w środku ("bypass cube," Rysunek 4A i 4D).
5. Zainstaluj kamerę EMCCD jako ostatnią część ścieżki emisji. Wykorzystaj połączenie USB-PCI, aby uzyskać dużą liczbę klatek na sekundę.
   UWAGA: Kamera EMCCD jest zalecana do najbardziej czułego wykrywania pojedynczych cząsteczek, ale alternatywą może być zaawansowana kamera sCMOS.

3. Obrazowanie z ograniczoną dyfrakcją z epi-wzbudzeniem

1. Dostosuj kąt padania laserów wzbudzenia do trybu epi w ramieniu oświetleniowym.
2. Odłącz obiektyw 3D, jeśli jest włączony (Rysunek 3C, prawy panel).
3. Włóż kostkę obejściową do rozdzielacza emisji (Rysunek 4A i 4E, dolny panel).
4. (Opcjonalnie) Włóż soczewkę magazynka, aby uzyskać poszerzony obszar oświetlenia (Rysunek 2D, lewy panel).
   UWAGA: Dzięki zastosowaniu soczewki magnetycznej i soczewki obiektywowej 100X zanurzonej w oleju, około 91 x 91 μm² może być równomiernie oświetlone, eliminując konieczność stosowania źródła światła białego i wielu kostek filtrujących.
5. Użyj oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby wykonać zdjęcia wielokanałowe i/lub stos Z i/lub poklatkowe.
   UWAGA: Dostępnych jest wiele programów do obrazowania mikroskopowego, nie tylko od producentów mikroskopów, ale także od firm zewnętrznych lub programistów open source.

4. Wielokanałowe obrazowanie pojedynczych cząsteczek, w tym smFRET

UWAGA: Przesuń do "pustej" pozycji w kole filtra barierowego, tak aby cała emisja o dowolnej długości fali mogła dotrzeć do drugiego zestawu filtrów/rozdzielaczy wiązki dichroicznej w rozdzielaczu emisji.

1. Aby skonfigurować wielokolorową detekcję pojedynczych cząsteczek cząsteczek unieruchomionych powierzchniowo¹⁵ za pomocą wzbudzenia TIRF, w tym pomiaru smFRET, dostosuj kąt przypadkowy laserów wzbudzenia do kąta TIRF. Odłącz obiektyw magnetyczny i obiektyw 3D.
2. Włącz tryb trzykanałowy w rozdzielaczu emisji ( Rysunek 1G), wykonując następujące czynności:
   1. Zastąp kostkę obejściową "kostką kalibracyjną", która pozwala światłu przechodzić przez wszystkie kanały (Rysunek 4B i 4E).
   2. Włącz kamerę w trybie DIC (tj. brak filtra emisji w kole filtrów barierowych) i wyreguluj przysłonę rozdzielacza emisji, aż na ekranie pojawią się trzy całkowicie oddzielone kanały.
      UWAGA: Wykonaj ten krok przy zapalonym świetle w pomieszczeniu, aby wyświetlić wszystkie kanały.
   3. Obróć pokrętła regulacji pionowej/poziomej na rozdzielaczu emisji i z grubsza wyrównaj trzy kanały (Rysunek 4E i 4F).
   4. Wyłącz kamerę i zastąp kostkę kalibracyjną potrójną kostką (Rysunek 4C i 4E).
   5. Umieść próbkę z wielokanałowymi koralikami 100 nm na soczewce obiektywu 100X i skup się na próbce.
   6. Włącz aparat i laser 488 nm, przybliż jeden z jasnych koralików i precyzyjnie wyrównaj trzy kanały, ponownie obracając pokrętła regulacji (Rysunek 4E i 4G).
      UWAGA: Koraliki wielokanałowe 100 nm emitują różne długości fal światła przy wzbudzeniu 488 nm, umożliwiając wyrównanie trzykanałowe.
3. Włącz aparat i lasery, ustaw ostrość i znajdź dobrą pozycję z rozsądną gęstością plamek. Dostosuj moc lasera i czas naświetlania, aby osiągnąć akceptowalne poziomy stosunku sygnału do szumu i fotowybielania. Użyj oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby zrobić zdjęcia poklatkowe.

5. Obrazowanie SR

UWAGA: To jest mikroskopia SR oparta na detekcji pojedynczych cząsteczek.

1. Aby skonfigurować obrazowanie SR, włóż obiektyw 3D i wyjmij obiektyw magnetyczny. Ustaw czas naświetlania kamery w odpowiednich kanałach laserowych (np. 5 - 60 ms). Określ i ręcznie ustaw optymalny kąt padania laserów wzbudzenia jako kąt TIRF.
2. Umieść próbkę w buforze obrazowania SR¹⁶. Pozwól buforowi zrównoważyć się przez co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.
   UWAGA: Bufor obrazowania SR wygasa po około 1 godzinie, więc odpowiednio utwórz nowy bufor obrazowania SR.
3. Wykonaj obraz DIC przed obrazowaniem SR. Aby znaleźć odpowiednią wysokość obiektywu dla SR, która optymalizuje efekt astygmatyzmu, należy użyć obrazowania DIC, aby znaleźć środkową płaszczyznę komórek. Zidentyfikuj płaszczyznę na podstawie wysokości, na której komórki przechodzą z "jasnych" do "ciemnych" obrazów i wydają się być przezroczyste (Rysunek 5A, 5B i 5C). Po określeniu żądanej płaszczyzny ogniskowej włącz system korekcji dryfu z (Rysunek 1A).
4. Przeprowadź obrazowanie SR. Zmień moc lasera 405 nm, aby utrzymać rozsądną gęstość "" plam.
   UWAGA: Chociaż możliwa jest ręczna zmiana lasera 405 nm, wygodniej jest uruchomić zaprogramowany kod akwizycji danych, aby utrzymać gęstość plam "". Oto przykład, w jaki sposób odbywa się to automatycznie. Kod źródłowy jest dostępny na żądanie (Rysunek 6).
   1. Rozpocznij akwizycję obrazowania od mocy fioletowego lasera 0 W/^cm2
   .
   2. Policz liczbę punktów w określonym czasie.
   3. Moduluj moc fioletowego lasera tak, aby liczba punktów była utrzymywana powyżej zdefiniowanego przez użytkownika "progu zliczania" w polu widzenia. Zwiększ moc fioletowego lasera, gdy liczba punktów spadnie poniżej progu zliczania.
   4. Zakończ akwizycję, gdy liczba punktów spadnie poniżej progu zliczania przy użyciu maksymalnej mocy fioletowego lasera.
      UWAGA: Maksimum można ustawić różnie w zależności od próbki jasność, ale nie wyższą niż 130 W/cm². W zależności od rzeczywistego celu obrazowania SR, ten automatyczny kod akwizycji może zostać ręcznie zakończony w dowolnym momencie.
5. Sprawdź migotanie i PSF plamek wkrótce po rozpoczęciu akwizycji.
   UWAGA: Jeśli nie jest idealne, zmień przypadkowy kąt laserów wzbudzenia lub wymień bufor obrazowania. Spodziewaj się próbki "pionowych", "poziomych" i "rombowych" kształtów PSF, reprezentujących fluorofory odpowiednio od dołu, od góry i wewnątrz płaszczyzny ogniskowej (Rysunek 5D). Jeśli większość plamek pokazuje pionowe lub poziome PSF, oznacza to, że płaszczyzna ogniskowej jest odsunięta od środka komórek, więc zakończ eksperyment i ponownie dostosuj płaszczyznę ogniskowej. Obecność pęcherzyków powietrza w olejku immersyjnym lub inne czynniki miejscowe mogą wpływać na jakość poliestrowych włókien odcinkowych, dlatego może być konieczna wymiana oleju lub zmiana obszaru obrazowania próbki na inny.
6. Do analizy danych użyj open source (we wtyczkach NIH ImageJ) lub dostępnych na rynku kodów, aby wykryć centroidy każdego miejsca w każdej ramce obrazowania i wyodrębnić wartości z każdej plamki z szerokości x i y¹⁴.
   UWAGA: W tym raporcie kod źródłowy pierwotnie opracowany w jednym z najwcześniejszych opartych na wykrywaniu pojedynczych cząsteczek SR⁸ został zmodyfikowany pod kątem wykrywania 3-D¹⁶ i został użyty.
7. W przypadku obrazowania dwukolorowego należy zobrazować fluorofor o dłuższej długości fali wzbudzenia, a następnie fluorofor o krótszej długości fali wzbudzenia. Uruchom kod automatycznej akwizycji podobny do opisanego w kroku 5.4, ale z innym laserem obrazującym.
   UWAGA: Aberracja chromatyczna powinna być korygowana między obrazami o różnych fluoroforach (np. barwnik czerwony i barwnik żółto-zielony). Oto kroki.
   1. Unieruchomić wiele wielokanałowych koralików o długości fali 100 nm na szklanym szkiełku nakrywkowym, unikając tworzenia się klastrów.
   2. Zrób ich zdjęcia w różnych kanałach wzbudzenia.
   3. Wyodrębnij ich współrzędne (X, Y, Z) za pomocą oprogramowania (krok 5.6).
   4. Wykres ΔX_i = X_1i - X_2i i ΔY_i = Y_1i - Y_2i (i oznacza różne koraliki, a 1 i 2 to różne kanały kolorów) oddzielnie i dopasuj do nich odpowiednie funkcje. Zapisz funkcje.
      UWAGA: W większości przypadków wystarczające są funkcje liniowe. Po określeniu tych funkcji pomiar ten nie musi być powtarzany za każdym razem podczas obrazowania.
   5. W rzeczywistym dwukolorowym obrazowaniu SR próbki będącej przedmiotem zainteresowania należy zastosować funkcje, aby skorygować aberrację chromatyczną (X, Y). W przypadku aberracji chromatycznej w kierunku z należy ją przeprowadzić, uzyskując ΔZ = Z₁ - Z₂ dla kulek wielokanałowych lub znanych referencyjnych próbek wielokanałowych wysiewanych razem z próbką będącą przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: W przeciwieństwie do aberracji chromatycznej (X, Y), aberracja chromatyczna w kierunku z nie jest dobrze odtwarzalna w każdym eksperymencie, głównie z powodu niepełnego utrzymania ostrości w kierunku z po przełączeniu kanałów. W związku z tym zaleca się każdorazowe przeprowadzanie korekty. ΔZ = Z₁ - Z₂ jest w większości niezależny od (X, Y), więc wystarczy tylko kilka kulek lub próbek referencyjnych na każdy obszar zainteresowania próbki. Narysuj zbudowane końcowe dwukolorowe obrazy SR w oprogramowaniu do wizualizacji 3D i ręcznie sprawdź ΔZ.

Results

Ten mikroskop umożliwia elastyczne i powtarzalne przełączanie między różnymi metodami obrazowania. Tutaj pokazujemy przykładowe obrazy zebrane za pomocą każdego modułu obrazowania.

Rysunek 5D pokazuje PSF cząsteczki podczas akwizycji SR. Tysiące takich obrazów jest rekonstruowanych w celu wygenerowania końcowego obrazu SR (Rysunek 5E). Rysunek 5E pok...

Discussion

Ten hybrydowy system mikroskopowy eliminuje konieczność zakupu wielu mikroskopów. Całkowity koszt wszystkich części, w tym stołu optycznego, robocizny instalacyjnej stołu, oprogramowania i stacji roboczej, wynosi około 230 000 USD. Części obrabiane na zamówienie, w tym soczewka magnetyczna i soczewka 3D, kosztują około 700 USD (koszt zależy od rzeczywistych opłat w różnych instytutach). Typowe dostępne na rynku zintegrowane systemy do mikroskopii SR opartej na detekcji pojedynczych cząsteczek kosztują ponad 300 000 ~ 400...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Statyw mikroskopu Nikon Ti-E	Obiektyw Nikon	Ti-E
Nikon		100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC zawiera moduł "JOBS", zaprogramowany moduł akwizycji używany do obrazowania SR.
Ramię oświetleniowe	Nikon	Ti-TIRF-EM Zmotoryzowany oświetlacz M	To ramię ma szczelinę na soczewkę powiększającą
Analizuj blok	Nikon	Ti-A	Jest zainstalowany w wieżyczce filtra.
System korekcji dryfu Z	Nikon	PFS	Ten system składa się z silnika krokowego na końcówce obiektywu, diody LED podczerwieni i detektora.
Blat stołu optycznego	TMC	783-655-02R
Podstawy stołu optycznego	TMC	14-426-35
Laser 647 nm	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulowana dioda laserowa 647nm 120mW wraz z głowicą laserową, skrzynką sterowniczą CDRH, USB i zasilaczem (Power Supply Unit)
Laser 561 nm	Laser Koherentny	1280721	OBIS 561nm LS 150mW System laserowy
Laser	488 nmCobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulowana dioda laserowa 488nm 60mW wraz z głowicą laserową, skrzynką kontrolną CDRH, USB i zasilaczem (zasilaczem)
Kryształowiec	laserowy 405 nm	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Okrągły , M2 < 1.3, niski poziom szumów, CW, TTL do 20MHz. 2 złącza BNC dla TTL i Regulacja analogowa
Radiator	Cobolt	11658 (HS-03)	Dwie jednostki, Radiator bez wentylatora HS-03, Radiator do laserów 647 nm i 488 nm
Radiator	Radiator Coherent	1193289	Radiator Obis z wentylatorem, 165 x 50 x 50 mm do lasera 561 nm
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Dwie jednostki, komunikacyjny do laserów 647 nm i 488 nm
aluminium do regulacji wysokości	McMaster-Carr	9146T35	Uniwersalny 6061 Aluminiowy, prostokątny pręt, 4MM X 40MM, 1' Długi do podnoszenia 561 nm laserowe
aluminium do regulacji wysokości	McMaster-Carr	8975K248	Uniwersalny 6061 Aluminium, 1-1/4" Grubość X 3" Szerokość X 1' Długość do podnoszenia 405 nm laserowy
BNC	L-com	CC58C-6	RG58C koncentryczny, BNC męski / męski, 6.0 ft
Adapter BNC	L-com	BA1087	Adapter koncentryczny, grodzia BNC, uziemiony
adapter SMA na BNC	HOD	SMA-870	Lasery Cobolt MLD mają interfejs SMA, więc ten adapter służy do połączenia BNC.
Przejściówka SMB na BNC	Fairview Kuchenka mikrofalowa	FMC1638316-12	Wtyczka SMB do żeńskiego grodziowego BNC RG316 12 cali do koherentnych laserów Obis
Karta akwizycji danych	National Instruments	PCI-6723	13-bitowy, 32-kanałowy, 800 kS / s Analogowe urządzenie wyjściowe do sterowania laserami, diodami DIC LED itp
Filtr barierowy Kontroler koła	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Zmieniacz
filtrów optycznychRozdzielacz emisji	Cairn	OptoSplit III
	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroiczny rozdzielacz wiązki oddzielający emisję czerwoną od zielonej w OptoSplit III
Dichroiczny rozdzielacz wiązki	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroiczny rozdzielacz wiązki oddzielający emisję zieloną i czerwoną od niebieskiej w OptoSplit III
Filtr emisji	Chroma	ET700/75M	Dwie jednostki, Filtr emisyjny do emisji czerwonej (jak Alexa Fluor 647) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych
Filtr emisyjny	Chroma	ET595/50M	Dwie sztuki, Filtr emisyjny do emisji żółtego/zielonego (jak Cy3B) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych
Filtr	emisyjny Chroma	ET525/50M	Dwie jednostki, Filtr emisyjny do emisji niebieskiego (jak Alexa Fluor 488/GFP) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych
Filtr emisyjny	Semrock	FF02-447/60-25	Filtr emisyjny do emisji fioletu (jak DAPI/Alexa Fluor 405), zainstalowany w kole filtrów barierowych
Dichroiczny rozdzielacz wiązki	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Wielopasmowy rozdzielacz wiązki dichroicznej do wzbudzeń laserowych 647, 561, 488 i 405 nm wewnątrz korpusu mikroskopu
Zestaw filtrów DAPI	Chroma	49000	zainstalowany w korpusie mikroskopu
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 filtr długoprzepustowy	Chroma	T590LPXR-UF1	do łączenia lasera 647 nm i lasera 561 nm
Filtr długoprzepustowy 525	Chroma	T525LPXR-UF1	do łączenia już połączonych laserów 647 nm i 561 nm z laserem 488 nm
Filtr długoprzepustowy 470	Chroma	T470LPXR-UF1	do łączenia już połączonych laserów 647 nm, 561 nm i 488 nm z laserem 405 nm
Filtr do czyszczenia laserowego (647)	Chroma	zet640/20x	do czyszczenia innych długości fal z lasera 647 nm
Filtr laserowy czyszczący (488)	Semrock	LL01-488-25	do czyszczenia innych długości fal z laserowego źródła światła LED 488 nm
	Excelitas	X-Cite120LED	używany tylko do obrazowania DAPI
Mocowanie lustrzane	Newport	SU100-F3K
Słupki optyczne	Newport	PS-2
Miernik mocy	Newport	PMKIT	Newport Do pomiaru mocy lasera
Mocowanie łącznika wiązki dichroicznej	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, do mocowania łączników wiązki dichroicznej w zespole wzbudzenia laserowego
Pierścień ustalający	Thorlabs	CMRR	używany do mocowań łącznika wiązek dichroicznych
Płyta adaptera światłowodowego	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Płyta adaptera światłowodowego z zewnętrznym SM1 (1.035"-40)
Gwintowany montaż translacyjny osi Z	osi Z Thorlabs	SM1Z	, 30 mm kompatybilny z klatką
Achromatyczny obiektyw dubletowy	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø 5 mm, zamontowane dublety achromatyczne, Powłoka AR: 400 - 700 nm
Płyta klatki	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Płyta klatkowa z gwintem wewnętrznym M9 x 0,5, pręt montażowy klatki kranu 8-32
montażowy	Thorlabs	ER4	, długość 4" i Oslash;
Wspornik montażowy klatki	Thorlabs	CP02B	Wspornik montażowy klatki 30 mm
Światłowód jednomodowy	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	, PM, FC/PC do FC/APC, 405 nm, Panda,
2 m światłowód wielomodowy	Thorlabs	M42L01	Ø 50 &mikro; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC światłowodowy, 1 m
Achromatyczny obiektyw dubletowy (soczewka mag)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø 1/2" Achromatyczny dublet, ARC: 400-700 nm , wklęsła soczewka w "soczewce magnetycznej"
Achromatyczna soczewka dubletowa (soczewka mag)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø 1/2" Achromatyczny dublet, ARC: 400-700 nm, wypukła soczewka w "soczewce magnetycznej"
Pierścień ustalający	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Plastikowy pierścień ustalający do Ø Tubusy i mocowania obiektywów 1/2", do "soczewek magnetycznych"
Śruba z nylonową końcówką	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0.5 Śruba dociskowa z nylonową końcówką, 6 mm długa, do mocowania "soczewki 3D"
Soczewka 3D	CVI Optyka laserowa	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, prostokątny obiektyw cylindryczny Kamera
EMCCD	Andor	iXon Ultra 888
100 nm wielokanałowe koraliki	Thermo	T7279, mikrosfery
czerwony barwnik	Thermo	Alexa Fluor 647
żółto-zielony barwnik	GE Healthcare	Cy3
zielony barwnik	GE Healthcare	Cy3B
niebieski barwnik	Thermo	Alexa Fluor 488