Method Article

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna to potężne narzędzie do wykrywania cząsteczek biologicznych in situ oraz monitorowania ich dynamiki i interakcji w czasie rzeczywistym. Oprócz konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej opracowano różne techniki obrazowania, aby osiągnąć określone cele eksperymentalne. Niektóre z szeroko stosowanych technik obejmują transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET), który może zgłaszać zmiany konformacyjne i interakcje molekularne z rozdzielczością angstremów, oraz obrazowanie superrozdzielcze (SR) oparte na detekcji pojedynczych cząsteczek, które może zwiększyć rozdzielczość przestrzenną około dziesięć do dwudziestu razy w porównaniu z mikroskopią o ograniczonej dyfrakcji. Prezentujemy tutaj zaprojektowany przez klienta zintegrowany system, który łączy wiele metod obrazowania w jednym mikroskopie, w tym konwencjonalne obrazowanie epifluorescencyjne, obrazowanie SR oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorową detekcję pojedynczych cząsteczek, w tym obrazowanie smFRET. Różne metody obrazowania można łatwo i powtarzalnie uzyskać poprzez wymianę elementów optycznych. Taka konfiguracja jest łatwa do przyjęcia przez każde laboratorium badawcze w naukach biologicznych, które wymaga rutynowych i zróżnicowanych eksperymentów obrazowych przy zmniejszonych kosztach i przestrzeni w porównaniu z budową oddzielnych mikroskopów do indywidualnych celów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopy fluorescencyjne są ważnymi narzędziami dla nowoczesnych badań biologicznych, a obrazowanie fluorescencyjne jest rutynowo wykonywane w wielu laboratoriach biologicznych. Oznaczając interesujące nas biomolekuły fluoroforami, możemy bezpośrednio wizualizować je pod mikroskopem i rejestrować zależne od czasu zmiany w lokalizacji, konformacji, interakcji i stanie składania in vivo lub in vitro. Konwencjonalne mikroskopy fluorescencyjne mają ograniczoną dyfrakcją rozdzielczość przestrzenną, która wynosi ~200 - 300 nm w kierunku bocznym i ~500 - 700 nm w kierunku osiowym1,2, a zatem są og....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i montaż mikroskopu

  1. Ścieżka wzbudzenia
    UWAGA: Ścieżka wzbudzenia obejmuje lasery, elementy kontrastu różnicowego (DIC), korpus mikroskopu i jego ramię oświetleniowe.
    1. Przygotuj stół optyczny z izolacją drgań. Na przykład tabela tłumienia strukturalnego o wymiarach 48 x 96 x 12 cali zapewnia wystarczająco dużo miejsca na wszystkie komponenty.
      UWAGA: Zbuduj konfigurację w pomieszczeniu z regulacją temperatury (np. 21.4 ± 0.55 °C). Stabilność temperatury ma kluczowe znaczenie dla utrzymania wyrównania optycznego.
    2. Zainstaluj korpus mikroskopu, który jest wyposażony w ramię oświetle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten mikroskop umożliwia elastyczne i powtarzalne przełączanie między różnymi metodami obrazowania. Tutaj pokazujemy przykładowe obrazy zebrane za pomocą każdego modułu obrazowania.

Rysunek 5D pokazuje PSF cząsteczki podczas akwizycji SR. Tysiące takich obrazów jest rekonstruowanych w celu wygenerowania końcowego obrazu SR (Rysunek 5E). Rysunek 5E pok.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten hybrydowy system mikroskopowy eliminuje konieczność zakupu wielu mikroskopów. Całkowity koszt wszystkich części, w tym stołu optycznego, robocizny instalacyjnej stołu, oprogramowania i stacji roboczej, wynosi około 230 000 USD. Części obrabiane na zamówienie, w tym soczewka magnetyczna i soczewka 3D, kosztują około 700 USD (koszt zależy od rzeczywistych opłat w różnych instytutach). Typowe dostępne na rynku zintegrowane systemy do mikroskopii SR opartej na detekcji pojedynczych cząsteczek kosztują ponad 300 000 ~ 400.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.F. dziękuje za wsparcie ze strony Programu Stypendialnego Searle oraz Nagrody Dyrektora NIH dla Nowych Innowatorów. Autorzy przyjmują do wiadomości przydatne sugestie z laboratorium Paula Selvina (University of Illinois, Urbana-Champaign) dotyczące pozycjonowania soczewki 3D.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Statyw mikroskopu Nikon Ti-EObiektyw NikonTi-E
Nikon100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowegoNikonNIS-Elements Advanced Research/HCHC zawiera moduł "JOBS", zaprogramowany moduł akwizycji używany do obrazowania SR.
Ramię oświetlenioweNikonTi-TIRF-EM Zmotoryzowany oświetlacz MTo ramię ma szczelinę na soczewkę powiększającą
Analizuj blokNikonTi-AJest zainstalowany w wieżyczce filtra.
System korekcji dryfu ZNikonPFSTen system składa się z silnika krokowego na końcówce obiektywu, diody LED podczerwieni i detektora.
Blat stołu optycznegoTMC783-655-02R
Podstawy stołu optycznegoTMC14-426-35
Laser 647 nmCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)Modulowana dioda laserowa 647nm 120mW wraz z głowicą laserową, skrzynką sterowniczą CDRH, USB i zasilaczem (Power Supply Unit)
Laser 561 nmLaser Koherentny1280721OBIS 561nm LS 150mW System laserowy
Laser488 nmCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)Modulowana dioda laserowa 488nm 60mW wraz z głowicą laserową, skrzynką kontrolną CDRH, USB i zasilaczem (zasilaczem)
Kryształowieclaserowy 405 nmDL405-025-O405 (+/-5)nm, 25mW, Okrągły , M2 < 1.3, niski poziom szumów, CW, TTL do 20MHz. 2 złącza BNC dla TTL i Regulacja analogowa
RadiatorCobolt11658 (HS-03)Dwie jednostki, Radiator bez wentylatora HS-03, Radiator do laserów 647 nm i 488 nm
RadiatorRadiator Coherent1193289Radiator Obis z wentylatorem, 165 x 50 x 50 mm do lasera 561 nm
CAB-USB-miniUSBCobolt10908Dwie jednostki, komunikacyjny do laserów 647 nm i 488 nm
aluminium do regulacji wysokościMcMaster-Carr9146T35Uniwersalny 6061 Aluminiowy, prostokątny pręt, 4MM X 40MM, 1' Długi do podnoszenia 561 nm laserowe
aluminium do regulacji wysokościMcMaster-Carr8975K248Uniwersalny 6061 Aluminium, 1-1/4" Grubość X 3" Szerokość X 1' Długość do podnoszenia 405 nm laserowy
BNCL-comCC58C-6RG58C koncentryczny, BNC męski / męski, 6.0 ft
Adapter BNCL-comBA1087Adapter koncentryczny, grodzia BNC, uziemiony
adapter SMA na BNCHODSMA-870Lasery Cobolt MLD mają interfejs SMA, więc ten adapter służy do połączenia BNC.
Przejściówka SMB na BNCFairview Kuchenka mikrofalowaFMC1638316-12Wtyczka SMB do żeńskiego grodziowego BNC RG316 12 cali do koherentnych laserów Obis
Karta akwizycji danychNational InstrumentsPCI-672313-bitowy, 32-kanałowy, 800 kS / s Analogowe urządzenie wyjściowe do sterowania laserami, diodami DIC LED itp
Filtr barierowy Kontroler kołaSutter InstrumentLambda 10-BZmieniacz
filtrów optycznychRozdzielacz emisjiCairnOptoSplit III
ChromaT640LPXR-UF2Dichroiczny rozdzielacz wiązki oddzielający emisję czerwoną od zielonej w OptoSplit III
Dichroiczny rozdzielacz wiązkiChromaT565LPXR-UF2Dichroiczny rozdzielacz wiązki oddzielający emisję zieloną i czerwoną od niebieskiej w OptoSplit III
Filtr emisjiChromaET700/75MDwie jednostki, Filtr emisyjny do emisji czerwonej (jak Alexa Fluor 647) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych
Filtr emisyjnyChromaET595/50MDwie sztuki, Filtr emisyjny do emisji żółtego/zielonego (jak Cy3B) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych
Filtremisyjny ChromaET525/50MDwie jednostki, Filtr emisyjny do emisji niebieskiego (jak Alexa Fluor 488/GFP) w OptoSplit III, a także w kole filtrów barierowych
Filtr emisyjnySemrockFF02-447/60-25Filtr emisyjny do emisji fioletu (jak DAPI/Alexa Fluor 405), zainstalowany w kole filtrów barierowych
Dichroiczny rozdzielacz wiązkiChromazt405/488/561/647/752rpc-UF3Wielopasmowy rozdzielacz wiązki dichroicznej do wzbudzeń laserowych 647, 561, 488 i 405 nm wewnątrz korpusu mikroskopu
Zestaw filtrów DAPIChroma49000zainstalowany w korpusie mikroskopu
Nikon laser/TIRF filtercubeChroma91032
590 filtr długoprzepustowyChromaT590LPXR-UF1do łączenia lasera 647 nm i lasera 561 nm
Filtr długoprzepustowy 525ChromaT525LPXR-UF1do łączenia już połączonych laserów 647 nm i 561 nm z laserem 488 nm
Filtr długoprzepustowy 470ChromaT470LPXR-UF1do łączenia już połączonych laserów 647 nm, 561 nm i 488 nm z laserem 405 nm
Filtr do czyszczenia laserowego (647)Chromazet640/20xdo czyszczenia innych długości fal z lasera 647 nm
Filtr laserowy czyszczący (488)SemrockLL01-488-25do czyszczenia innych długości fal z laserowego źródła światła LED 488 nm
ExcelitasX-Cite120LEDużywany tylko do obrazowania DAPI
Mocowanie lustrzaneNewportSU100-F3K
Słupki optyczneNewportPS-2
Miernik mocyNewportPMKITNewport Do pomiaru mocy lasera
Mocowanie łącznika wiązki dichroicznejEdmund Optics58-872C-Mount Kinematic Mount, do mocowania łączników wiązki dichroicznej w zespole wzbudzenia laserowego
Pierścień ustalającyThorlabsCMRRużywany do mocowań łącznika wiązek dichroicznych
Płyta adaptera światłowodowegoThorlabsSM1FCFC/PC Płyta adaptera światłowodowego z zewnętrznym SM1 (1.035"-40)
Gwintowany montaż translacyjny osi Zosi Z ThorlabsSM1Z, 30 mm kompatybilny z klatką
Achromatyczny obiektyw dubletowyThorlabsAC050-008-A-MLØ 5 mm, zamontowane dublety achromatyczne, Powłoka AR: 400 - 700 nm
Płyta klatkiThorlabsCP1TM0930 mm Płyta klatkowa z gwintem wewnętrznym M9 x 0,5, pręt montażowy klatki kranu 8-32
montażowyThorlabsER4, długość 4" i Oslash;
Wspornik montażowy klatkiThorlabsCP02BWspornik montażowy klatki 30 mm
Światłowód jednomodowyThorlabsP5-405BPM-FC-2, PM, FC/PC do FC/APC, 405 nm, Panda,
2 m światłowód wielomodowyThorlabsM42L01Ø 50 &mikro; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC światłowodowy, 1 m
Achromatyczny obiektyw dubletowy (soczewka mag)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø 1/2" Achromatyczny dublet, ARC: 400-700 nm , wklęsła soczewka w "soczewce magnetycznej"
Achromatyczna soczewka dubletowa (soczewka mag)ThorlabsAC127-050-Af=50.0 mm, Ø 1/2" Achromatyczny dublet, ARC: 400-700 nm, wypukła soczewka w "soczewce magnetycznej"
Pierścień ustalającyThorlabsSM05PRRSM05 Plastikowy pierścień ustalający do Ø Tubusy i mocowania obiektywów 1/2", do "soczewek magnetycznych"
Śruba z nylonową końcówkąThorlabsSS3MN6M3 x 0.5 Śruba dociskowa z nylonową końcówką, 6 mm długa, do mocowania "soczewki 3D"
Soczewka 3DCVI Optyka laserowaRCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f=10 m, prostokątny obiektyw cylindryczny Kamera
EMCCDAndoriXon Ultra 888
100 nm wielokanałowe koralikiThermoT7279, mikrosfery
czerwony barwnikThermoAlexa Fluor 647
żółto-zielony barwnikGE HealthcareCy3
zielony barwnikGE HealthcareCy3B
niebieski barwnikThermoAlexa Fluor 488
Dichroiczny rozdzielacz wiązki Widelec mocujący Newport PS-F Uchwyt translacyjny Pręt klatki 6 mm krosowy TetraSpeck

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopySuper Resolution ImagingSingle Molecule FRETMulticolor DetectionEpifluorescence ImagingOptical AlignmentLaser ControlEmission Filter Wheel3D Lens InsertionData Acquisition Card

Related Articles